Die Rolle der SoxC-Proteine im sich entwickelnden zentralen und sympathischen Säuger-Nervensystem Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Michaela Potzner aus Forchheim
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Die Rolle der SoxC-Proteine im sich
entwickelnden zentralen und sympathischen
Säuger-Nervensystem
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Michaela Potzner
aus Forchheim
II
Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der
1.2.3 Myelinbildung in oligodendroglialen Zellen 7
1.3 Die Entwicklung des sympathischen Nervensystems 9
1.3.1 Die sympathoadrenale Zell-Population des sympathischen Nervensystems 10
1.3.2 Spezifizierung sympathoadrenaler Zellen 11
1.3.3 Differenzierung sympathoadrenaler Zellen 12
1.4 Die Familie der Sox-Proteine 16
1.4.1 Die Gruppe C der Sox-Proteine 17
1.4.1.1 Sox4 18 1.4.1.2 Sox11 20 1.4.1.3 Sox12 21
2 PROBLEMSTELLUNG 23
3 ERGEBNISSE 24
3.1 Funktionelle Analyse der SoxC-Proteine im zentralen Nervensystem der Maus 24
3.1.1 Entwicklung oligodendroglialer Zellen im Rückenmark von Sox11-defizienten Mäusen 25
3.1.2 Überexpressionsstudien der Sox-Proteine der Gruppe C in oligodendroglialen Zellen 27
3.1.2.1 Generierung MBP-Sox4-transgener Mäuse 28 3.1.2.2 Expression des MBP-Sox4-Transgens im zentralen Nervensystem 30 3.1.2.3 Analyse des Phänotyps MBP-Sox4-transgener Mäuse 33
3.2 Funktionelle Analyse der SoxC-Proteine im sympathischen Nervensystem der Maus 42
3.2.1 Expression von Sox4 und Sox11 im sympathischen Nervensystem 43
3.2.2 Zelltypspezifische Expression von Sox4 und Sox11 45
3.2.3 Induktion der Sox4-Expression durch den Faktor Sox11 47
Inhaltsverzeichnis
VI
3.2.4 Analyse des sympathoadrenalen Phänotyps SoxC-defizienter Tiere 49
3.2.4.1 Untersuchung der Gangliengröße in SoxC-defizienten Tieren 49 3.2.4.2 Untersuchung der Differenzierung sympathischer Neurone in SoxC-defizienten Tieren 52 3.2.4.3 Untersuchung der Proliferation im sympathischen Nervensystem SoxC-defizienter Tiere 57 3.2.4.4 Untersuchung der Apoptose im sympathischen Nervensystem SoxC-defizienter Tiere 59
3.2.5 Auswirkung der SoxC-Protein-Defizienz im sympathischen Nervensystem adulter Tiere 61
4 DISKUSSION 63
4.1 Das MBP-Sox4-transgene Mausmodell 63
4.1.1 Expression des Sox4-Transgens in terminal differenzierenden Oligodendrozyten 64
4.1.2 Der MBP-Sox4-transgene Phänotyp im Vergleich zu Mausmutanten mit ähnlichem Erscheinungsbild 66
4.1.3 Bedeutung von Sox4 für die Reifung der Oligodendrozyten 67
4.2 Deletion von Sox4 und Sox11 im sympathischen Nervensystem 70
4.2.1 Regulation der Sox4- und Sox11-Expression in den sympathischen Ganglien 70
4.2.3 Bedeutung von Sox4 und Sox11 für die Proliferation und Apoptose sympathoadrenaler Zellen 73
4.2.3.1 Sox11 beeinflusst früh-embryonal die Proliferation sympathischer Vorläuferzellen 74 4.2.3.2 Sox4 bedingt spät-embryonal das Überleben sympathischer Neurone 75
5 MATERIAL 78
5.1 Mausstämme 78
5.2 Chemikalien und allgemeine Reagenzien 78
5.3 Zusammensetzung der Puffer und Lösungen 79
5.4 Oligonukleotide 81
5.5 In situ Sonden 82
5.6 Antikörper 83
5.6.1 Primärantikörper 83
5.6.2 Sekundärantikörper 85
6 METHODEN 86
6.1 Tierhaltung 86
6.2 Standardmethoden 86
Inhaltsverzeichnis
VII
6.3 Isolierung und Analytik von Nukleinsäuren 87
6.3.1 Isolierung von genomischer DNA aus Schwanz- oder Choriongewebe 87
6.3.2 Präparation von Gesamt-RNA 87
6.3.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Amplifikation von DNA-Fragmenten 88
6.3.4 Genotypisierungs-PCR 89
6.3.5 Reverse-Transkription und RT-PCR-Analyse 90
6.3.6 Herstellung von DIG-markierten cRNA-Sonden mittels in vitro Transkription 91
6.4 Histologische Methoden 92
6.4.1 Präparation embryonaler und postnataler Gewebe 92
6.4.2 PPD-Färbungen und Elektronenmikroskopie 93
6.4.3 In situ Hybridisierung 94
6.4.4 Immunhistochemie auf Gefrierschnitten 95
6.4.5 BrdU-Färbung 96
6.4.6 TUNEL-Färbung 96
7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 98
8 LITERATURVERZEICHNIS 101
PUBLIKATIONEN 118
PRÄSENTATIONEN 118
LEBENSLAUF 119
DANKSAGUNG 120
Abbildungsverzeichnis
VIII
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Die Domänenstruktur des ventralen Rückenmarks. ..................................................... 2
Abb. 2: Schematische Darstellung der Oligodendrozyten-Entwicklung ................................... 6
Abb. 3: Entstehung der sympathoadrenalen Zell-Population................................................... 11
Abb. 4: Schematische Darstellung der Entwicklung noradrenerger Neurone ......................... 13
Abb. 5: Die Gruppe C der Sox-Proteine .................................................................................. 18
Abb. 6: Spezifische Expression von Sox4 und Sox11 in oligodendroglialen Zellen............... 25
Abb. 7: Quantifizierung oligodendroglialer Zellen im Sox11-defizienten Rückenmark......... 26
Abb. 8: Schematische Darstellung des MBP-Sox4-Transgen-Konstrukts............................... 28
Abb. 9: Southern-Blot Analyse von Wildtyp- und MBP-Sox4-transgenen Tieren.................. 29
Abb. 10: Quantitative RT-PCR zum Nachweis der Sox4-Expression im ZNS. ...................... 30
Abb. 11: Das postnatale Expressionsmuster des MBP-Sox4-Transgens im ZNS. .................. 31
Abb. 12: Zelltypspezifische Expression des MBP-Sox4-Transgens........................................ 33
Abb. 13: Expression von MBP und PLP im Rückenmark MBP-Sox4-transgener Tiere......... 34
Abb. 14: Expression des MBP-Proteins im Rückenmark transgener Tiere. ............................ 35
Abb. 15: Oligodendrogliale Parameter im Rückenmark MBP-Sox4-transgener Tiere. .......... 36
Abb. 16: Mikrogliale Parameter im Kleinhirn MBP-Sox4-transgener Tiere........................... 37
Abb. 17: Expression des MBP-Proteins in den Transgen-exprimierenden Gehirn-Regionen. 38
Abb. 18: Myeliniserung der Axone im Rückenmark MBP-Sox4-trangener Tiere. ................. 39
Abb. 19: Die Myelin-Ultrastruktur im Rückenmark MBP-Sox4-transgener Tiere. ................ 40
Abb. 20: Die g-Ratio im Rückenmark MBP-Sox4-transgener Tiere. ...................................... 41
Abb. 21: Expression von Sox4 und Sox11 in den sympathischen Ganglien. .......................... 43
Abb. 22: Zelltypspezifische Expression von Sox4 und Sox11. ............................................... 46
Abb. 23: Expression von Sox4 und Sox11 in SoxC-defizienten sympathischen Ganglien. .... 48
Abb. 24: Die Größe sympathischer Ganglien in SoxC-defizienten Tieren.............................. 50
Abb. 25: Analyse der Fläche und Zellzahl SoxC-defizienter sympathischer Ganglien........... 51
Abb. 26: Expression noradrenerger Marker in den sympathischen Ganglien SoxC- defizienter Tiere........................................................................................................ 53
Abb. 27: Expression noradrenerger und neuronaler Marker in den sympathischen Ganglien SoxC-defizienter Tiere.............................................................................................. 55
Abb. 28: Proliferation in den sympathischen Ganglien SoxC-defizienter Tiere...................... 57
Abb. 29: Bestimmung der Proliferation in den sympathischen Ganglien SoxC-defizienter Tiere.......................................................................................................................... 58
Abb. 30: Bestimmung der Apoptose in sympathischen Ganglien SoxC-defizienter Tiere ..... 60
Abb. 31: Phänotyp adulter Mäuse mit spezifischen Sox4- und Sox11-Deletionen im sympathischen Nervensystem................................................................................... 62
Zusammenfassung
IX
Zusammenfassung
Während der Embryonalentwicklung übernehmen die Transkriptionsfaktoren der Sox-
Proteinfamilie in unterschiedlichen Geweben und Zelltypen wichtige regulatorische
Aufgaben. Die beiden Sox-Proteine der Untergruppe C Sox4 und Sox11 weisen im sich
entwickelnden zentralen und peripheren Nervensystem ein stark überlappendes Expressions-
muster auf. Dennoch konnten, vermutlich aufgrund funktioneller Redundanz zwischen den
SoxC-Proteinen, in Sox4- oder Sox11-defizienten Tieren keine neuralen Defekte nach-
gewiesen werden.
Um Einblicke in die Funktion der SoxC-Proteine im entstehenden Säuger-Nervensystem zu
erhalten, wurde im Rahmen dieser Arbeit zunächst die Rolle von Sox4 nach Überexpression
in terminal differenzierenden Oligodendrozyten genauer untersucht. Zu diesem Zweck
wurden transgene Mäuse generiert, die das Sox4-Transgen unter dem MBP-Promotor
exprimierten. In diesen Tieren traten postnatal auffällig unkontrollierte Zitterbewegungen und
dyskinetische Reaktionen auf, die mit schweren Myelin-Defekten im zentralen Nervensystem
verbunden waren. Die Hypomyelinisierung im Rückenmark und Gehirn konnte durch das
Verharren postmitotischer Oligodendrozyten in einem prä-myelinisierenden Zustand erklärt
werden. Demzufolge wirken die Sox-Proteine der Gruppe C Differenzierungsprozessen in
glialen Zellen entgegen und tragen zum zeitlich korrekten Einsetzen der terminalen
Differenzierung bei.
Zur Aufklärung der funktionellen Redundanz zwischen Sox4 und Sox11 wurden im zweiten
Teil der Arbeit beide SoxC-Gene spezifisch in den zukünftigen noradrenergen und adrenergen
Neuronen des sympathischen Nervensystems deletiert. In SoxC-doppelt-defizienten Mäusen
wurde während der Embryogenese eine stark reduzierte Gangliengröße festgestellt. Dieser
Phänotyp wird durch frühe Defekte in der Proliferation sympathoadrenaler Zellen und einer
späten Zunahme apoptotischer Neurone ausgelöst. Aufgrund der zeitlich versetzten
Expression von Sox4 und Sox11 in den sich entwickelnden Ganglien konnte für beide
Transkriptionsfaktoren ein sequenzieller Bedarf aufgezeigt werden. Sox11 kontrolliert
vorwiegend die frühe Proliferation sympathoadrenaler Zellen, während Sox4 hauptsächlich
für das Überleben sympathischer Neurone verantwortlich ist. Für die noradrenerge Differen-
zierung hingegen spielen Sox4 und Sox11 eine eher untergeordnete Rolle. Dies kontrastiert
mit dem Einfluss der SoxC-Proteine auf die Differenzierung glialer Zellen und beweist, dass
die Funktion von Sox4 und Sox11 Gewebe- und Kontext-abhängig ist.
Summary
X
Summary
Transcription factors of the Sox protein family have important regulatory functions in
different tissues and cell types during embryogenesis. The SoxC proteins Sox4 and Sox11
show a strong overlapping expression pattern in the central and peripheral nervous systems.
However, mice with a Sox4 or Sox11 deletion show no neural phenotype presumably because
of functional redundancy among SoxC proteins.
To gain insight into the possible functions of SoxC proteins in the developing mammalian
nervous system, the role of Sox4 was initially studied following overexpression in terminal
differentiating oligodendrocytes. For this purpose, transgenic mice were generated in which
the Sox4 transgene was expressed under the control of the MBP promotor. Postnatally, these
animals developed tremors and dyskinetic behaviours combined with severe myelin defects in
the central nervous system. The significant hypomyelination of white matter tracts in the
spinal cord and brain could be explained by the persistence of postmitotic oligodendrocytes in
a premyelinating or early myelinating state. Sox proteins of the group C thus prevent terminal
differentiation of glial precursors and contribute to the temporally precise initiation of the
final developmental stage.
To elucidate the functional redundancy between Sox4 and Sox11, both SoxC genes were
specifically deleted in prospective noradrenergic and adrenergic neurons of the sympathetic
nervous system. As a consequence, sympathetic ganglia in SoxC double deficient mice were
strongly reduced in size during embryogenesis. This phenotype arises from an early
proliferation defect of sympathoadrenal cells followed by an increase in apoptosis of
sympathetic neurons during later stages. Due to the temporal difference in the expression of
SoxC proteins in sympathetic ganglia, a sequential requirement of Sox4 and Sox11 could be
demonstrated during development of the sympathetic nervous system. Sox11 is primarily
responsible for the proliferation of tyrosine hydroxylase expressing cells in early sympathetic
ganglia, whereas Sox4 ensures the survival of sympathetic neurons during later
developmental stages. In contrast, Sox4 and Sox11 play only a minor role for noradrenergic
differentiation. This contrasts with the strong impact of SoxC proteins on glial differentiation
and demonstrates that the function of Sox4 and Sox11 is context, as well as cell type and
tissue dependent.
Einleitung
1
1 Einleitung
1.1 Die Entwicklung des zentralen Nervensystems
In der Maus wird die Neurulation ektodermalen Gewebes (Neuroektoderm) am Embryonaltag
7,5 durch die Chorda dorsalis (Notochord) und das seitlich benachbarte paraxiale Mesoderm
induziert (Kelly & Melton, 1995). Daran beteiligt sind die zur TGF-β-Superfamilie gehören-
den BMP-Proteine (bone morphogentic proteins) BMP-2 und BMP-4 sowie die endogenen
BMP-Antagonisten Noggin und Chordin (Thomsen, 1997). Durch komplexe Einsenkungs-,
Faltungs- und Aufwölbungsvorgänge des Neuroektoderms entsteht das Neuralrohr aus dem
letztendlich das zentrale Nervensystem (ZNS) mit seinen beiden Komponenten Gehirn und
Abb. 1: Die Domänenstruktur des ventralen Rückenmarks. Die dorso-ventrale Polarisierung des zukünftigen Rückenmarks wird durch die entgegengesetzt gerichteten Gradienten der Signalmoleküle Shh und BMP bestimmt, die von der ventralen Bodenplatte (FP) bzw. der dorsalen Deckplatte (RP) abgegeben werden. Anschließend entstehen durch die spezifische Expression verschiedener HD-Proteine der Klasse I und II genau definierte Vorläufer-domänen (p0, p1, p2, pMN, p3) aus denen zunächst verschiedene neuronale Subklassen (V0, V1, V2, MN, V3) und später auch gliale Zellen (Astro, Oligo) hervorgehen. Abbildung entnommen aus (Anderson, 2001).
Einleitung
3
Daneben spezifiziert die p2-Domäne sowohl V2-Interneurone als auch Astrozyten (Briscoe et
al., 2000; Jessell, 2000). Die dorsalen Vorläuferdomänen entstehen zusätzlich durch die
Expression der induktiven Signalproteine aus der BMP-, FGF- und Wnt-Familie (Lee &
Jessell, 1999; Muroyama et al., 2002; Caspary & Anderson, 2003).
Durch die Auswanderung der neuronalen Subtypen aus der Ventrikulärzone formiert sich
während der neuralen Entwicklung die Mantelzone des Rückenmarks, die später auch als
graue Substanz bezeichnet wird. Diese Schicht enthält vor allem die Zellkörper der Neurone,
die ihre Axone nach außen senden. Dadurch entsteht eine weitere Lage des Rückenmarks, die
Marginalzone. Die charakteristische Färbung dieser später so genannten weißen Substanz ist
auf den hohen Anteil an Myelin zurückzuführen, der von der Oligodendroglia gebildet wird.
1.2 Die glialen Zell-Populationen des zentralen Nerven-
systems
Rudolph Virchow führte 1856 den Begriff der Neuroglia ein und bezeichnete damit gliale
Zellen als Teil des Bindegewebes, die den Neuronen als so genannter “Nervenkitt” dienen.
Heutzutage ist allerdings bekannt, dass die Neuroglia aus unterschiedlichen glialen Zell-
Populationen besteht, die wichtige Funktionen für Proliferation, Differenzierung und das
Überleben von Neuronen übernehmen (Volterra & Meldolesi, 2005). Dazu gehören im
zentralen Nervensystem die Astrozyten und Oligodendrozyten, die beide ähnlich den
Neuronen dem Neuroektoderm entstammen und als Makroglia bezeichnet werden (Miller,
2002; Rowitch, 2004).
Fibrilläre Astrozyten tauchen zuerst in der Marginalzone des Rückenmarks auf und werden
oftmals durch das Intermediärfilamentprotein GFAP (glial fibrillary acidic protein), das
während der Zelldifferenzierung exprimiert wird, nachgewiesen (Eng et al., 1971; Bignami et
al., 1972). Morphologisch gesehen können die sternenförmigen Astrozyten in zwei Haupt-
klassen unterteilt werden: Die S100β-positiven protoplasmatischen Astrozyten und die
GFAP-positiven fibrillären Astrozyten. Dabei sind protoplasmatische Astrozyten bereits ab
dem Embryonaltag 14,5 in der Mantelzone aufzufinden, während fibrilläre Astrozyten sich
überwiegend in der weißen Substanz befinden.
Einleitung
4
Neben den Astrozyten sind die Oligodendrozyten die zweite Hauptklasse glialer Zelltypen im
zentralen Nervensystem. Sie besitzen kleine, runde Zellkerne mit einem hohen Anteil an
Heterochromatin. Ihre zellulären Fortsätze bilden Markscheiden aus Myelin, die die Axone
der Neurone spiralförmig umhüllen und dadurch elektrisch isolieren (Norton, 1984; Salzer,
2003). Somit kann eine schnelle saltatorische Erregungsleitung an den Ranvierschen
Schnürringen gewährleistet werden. Terminal differenzierte Oligodendrozyten sind in der
Lage, mehrere Axone in der weißen Substanz des zentralen Nervensystems zu isolieren,
wohingegen die Schwannzellen als myelinisierende Glia des peripheren Nervensystems
(PNS) jeweils nur ein Axon ummanteln.
Die Mikroglia ist dagegen mesodermalen Ursprungs und ihre hämatopoetischen, mono-
cytischen Vorläuferzellen wandern in das zentrale Nervensystem ein. Dort besitzen sie als
Immunzellen antigenpräsentierende Eigenschaften und sind in der Lage, sich in phago-
(Abb. 2). Ungefähr ein bis zwei Tage vor der Geburt der Maus befindet sich diese Zell-
Population in der Marginalzone des Rückenmarks und zeigt ein erhöhtes Expressionsniveau
der Proteine Nkx2.2 (Fu et al., 2002) und Sox10 (Stolt et al., 2002). Im Rückenmark von
Sox10-, Nkx2.2- oder Olig1-defizienten Mäusen konnte trotz einer relativ normalen
Entwicklung der Pro-Oligodendrozyten eine starke Beeinträchtigung der terminalen Differen-
zierung und der Expression von Myelingenen in den postmitotische Oligodendrozyten
nachgewiesen werden (Qi et al., 2001; Lu et al., 2002; Stolt et al., 2002; Xin et al., 2005).
Abb. 2: Schematische Darstellung der Oligodendrozyten-Entwicklung. In den Vertebraten spezifizieren sich ausgehend von den neuroepithelialen Vorläuferzellen zunächst oligodendrogliale Vorläufer, die sich über die Pro-Oligodendrozyten zu den prä-myelinisierenden und letztendlich zu den terminal differenzierten Oligodendrozyten entwickeln. Dabei exprimieren die Oligodendrozyten verschiedene Markerproteine, die ihr jeweiliges Entwicklungsstadium kennzeich-nen. Abbildung entnommen und leicht verändert aus (Woodruff et al., 2001).
Einleitung
7
Aufgrund des ähnlichen Phänotyps der Sox10-, Nkx2.2- und Olig1-Mausmutanten ist
anzunehmen, dass diese Proteine mit hoher Wahrscheinlichkeit während der oligodendro-
glialen Differenzierung miteinander kooperieren (Liu et al., 2007). Neben Sox10 beeinflusst
auch Sox8, aus der Gruppe E der Sox-Proteine, die Differenzierung der Oligodendrozyten. So
konnte an früh-postnatalen Stadien in den terminal differenzierenden Oligodendrozyten Sox8-
defizienter Mäuse eine reduzierte Expression der beiden Myelingene MBP und PLP
festgestellt werden (Stolt et al., 2004).
Ferner ist auch das HLH-Protein Mash1/Ascl1 (Mammalian achaete scute homolog 1/
Achaete-scute complex homolog 1) sowohl für die Spezifizierung (Parras et al., 2004) als auch
für die terminale Differenzierung der Oligodendrozyten von Bedeutung (Battiste et al., 2007;
Sugimori et al., 2008). Folglich zeigten Ascl1-Überexpressionsstudien, dass dieses Protein
mit den beiden Faktoren Olig2 und Nkx2.2 kooperiert, und Ascl1-defiziente Mäuse wiesen
zum Zeitpunkt ihrer Geburt einen Differenzierungsdefekt in den myelinbildenden
Oligodendrozyten auf (Sugimori et al., 2007; Sugimori et al., 2008).
1.2.3 Myelinbildung in oligodendroglialen Zellen
Der Myelinisierungsprozess oligodendroglialer Zellen beginnt mit der Geburt und findet
hauptsächlich während der ersten drei postnatalen Wochen statt (Frank et al., 1999). Bereits in
der späten embryonalen Entwicklungsphase der Maus exprimieren differenzierte Oligoden-
drozyten das basische Myelinprotein (MBP) und das Proteolipidprotein (PLP) mit seiner
Isoform DM-20 (Abb. 2). Neben diesen beiden Hauptvertretern der Myelinproteine werden
auch Glykoproteine wie das Myelin-assozierte Glykoprotein (MAG) und das Myelin-Oligo-
dendrozyten-Glykoprotein (MOG) von reifen myelinisierenden Oligodendrozyten exprimiert.
Ein wichtiger Faktor, der die Myelinisierung im zentralen Nervensystem reguliert, ist der
Transkriptionsfaktor Sox10. Durch die Bindung von Sox10 als Monomer oder Dimer an regu-
latorische Elemente in den Promotorbereichen verschiedener Myelingene, wie beispielsweise
MBP oder PLP, kann das Myelinisierungsprogramm direkt in den Oligodendrozyten induziert
werden (Stolt et al., 2002). Weiterhin ist Sox10 zusammen mit Sox8 in der Lage als Hetero-
dimer an Konsensussequenzen im MBP-Promotorbereich zu binden und die MBP-Expression
zu aktivieren (Stolt et al., 2004). Im Zebrafisch findet die transkriptionelle Aktivierung der
Expression von MBP durch einen Olig1/Sox10-Komplex statt, der ebenfalls an ein
Einleitung
8
konserviertes DNA-Motiv im MBP-Promotorbereich bindet (Li et al., 2007). Ein weiterer
Faktor, der verschiedene Myelingene reguliert und spezifisch von postmitotischen Oligo-
dendrozyten exprimiert wird, ist der vor kurzem entdeckte Myelin-Genregulatorische-Faktor
(MRF/Gm98) (Cahoy et al., 2008). Mittels MRF/Gm98-Überexpressionsstudien konnte eine
verstärkte Myelin-Genexpression in Oligodendrozytenvorläufer-Zellkulturen gezeigt werden.
Dagegen sind die prä-myelinisierenden Oligodendrozyten von MRF-defizienten Mäusen nicht
in der Lage, die Expression spezifischer Myelinproteine (MBP und PLP) zu aktivieren, um
dann die Axone zu myelinisieren. Infolgedessen tritt eine schwere Dysmyelinisierung des
zentralen Nervensystems auf (Emery et al., 2009).
Spezifische Myelinisierungsdefekte des zentralen Nervensystems konnten durch die shiverer-
Maus analysiert werden. Anhand einer spontanen Deletion der Exons 3-7 im MBP-Gen
kommt es zu einem kompletten Verlust aller MBP-Isoformen (Roach et al., 1983; Roach et
al., 1985; Molineaux et al., 1986), was zu einer schweren Dysmyelinisierung des zentralen
Nervensystems führt. Die Axone der Neurone sind äußerst gering oder gar nicht myelinisiert
und die einzelnen Myelinlamellen weisen in der Ultrastruktur eine unvollständige Kompak-
tierung auf. Homozygote Tiere dieser natürlichen MBP-Nullmutante zeigen im postnatalen
Stadium einen starken Tremor verbunden mit Ataxien und krampfartigen Anfällen
(Rosenbluth, 1980; Shen et al., 1985). Aufgrund dieses schweren Phänotyps ist die
Lebenserwartung der shiverer-Maus auf drei bis sechs Monate reduziert.
Einleitung
9
1.3 Die Entwicklung des sympathischen Nervensystems
Neben dem Parasympathikus und dem enterischen Nervensystem bildet das sympathische
Nervensystem (SNS) die dritte Komponente des autonomen Nervensystems. Die Vorläufer-
zellen des Sympathikus sowie der beiden anderen Teilsysteme entstehen aus migrierenden
multipotenten Stammzellen, den Neuralleistenzellen (LaBonne & Bronner-Fraser, 1998). Die
prä-migratorische Neuralleiste entsteht als transiente Struktur am Übergang zwischen dem
Oberflächen- und Neuroektoderm und durchläuft eine epitheliale-mesenchymale Transition
(EMT). Diese morphologische Zell-Veränderung wird durch die Wnt6-Expression der
Epidermis und die BMP-Signale des zukünftigen Neuralrohrs initiiert (LaBonne & Bronner-
Fraser, 1999; Garcia-Castro et al., 2002). Noch vor dem Verlassen des Zellverbands im
dorsalen Neuralrohr exprimieren diese wanderungsfähigen Zellen bestimmte Transkriptions-
faktoren und Oberflächenmoleküle, die sie von den umgebenden ektodermalen Zellen
unterscheiden. Dazu gehören FoxD3 (Kos et al., 2001), Slug (Nieto et al., 1994), Snail und
Sox9 (Cheung et al., 2005) sowie verschiedene Cadherine und Zelladhäsionsmoleküle (Pla et
al., 2001). Am Embryonaltag 8,5 der Maus lösen sich diese determinierten Neuralleisten-
zellen von der dorsalen Region des Neuralrohrs ab, um entlang der rostro-caudalen Achse auf
definierten Migrationspfaden in die Peripherie auszuwandern (Garcia-Castro & Bronner-
Fraser, 1999). Dort angelangt differenzieren sie zu unterschiedlichen Zelltypen und Geweben.
Es ist vom Zeitpunkt der Auswanderung, vom rostro-caudalen Ursprungsort der multi-
potenten Neuralleistenzellen sowie von intrinsischen und extrinsischen Faktoren während
ihrer Migration abhängig, welche der verschiedenen Neuralleisten-Derivate aus den
Vorläufern generiert werden. Folglich wird die Neuralleiste in vier verschiedene Bereiche
eingeteilt: einen kranialen, einen Rumpf-, einen sakralen und einen vagalen Abschnitt
(Anderson, 1997). Die Neuralleistenzellen aus dem Rumpf entwickeln sich zum Beispiel zu
sensorischen und sympathischen Neuronen, zu chromaffinen Zellen der Nebenniere, zu extra-
adrenalen Paraganglien (z.B. das Organ von Zuckerkandl), zu Melanozyten, zu Schwann-
zellen und zu Satellitenglia in den Ganglien (Huber, 2006).
Die sympathischen Neurone lassen sich in prä- und postganglionäre Neurone einteilen, aus
denen das sympathische Nervensystem aufgebaut ist. Die Zellkörper der präganglionären
Neurone sind im oberen Brust- und Lendenbereich des Rückenmarks lokalisiert. Die Axone
dieser Neurone verlassen das Rückenmark über die Vorderwurzel und ziehen zu den
außerhalb des Rückenmarks in der Peripherie liegenden sympathischen Ganglien. Dort
Einleitung
10
angelangt bilden sie Synapsen mit postganglionären Neuronen. Ein Großteil der
sympathischen Ganglien ist paarweise rechts und links in den jeweiligen Segmenten der
Wirbelsäule angeordnet und über Nervenstränge miteinander zu Ganglienketten verbunden.
Diese Grenzstrangganglien, auch Paravertebralganglien genannt, werden ihrer Lage nach in
Hals-, Brust-, Bauch- und Steißganglien eingeteilt. Zu den Grenzstrangganglien gehören das
Ganglion im oberen Halsbereich (superior cervical ganglion), von dem die gesamte
sympathische Innervierung des Kopfes ausgeht, das Brustbeinganglion (stellate ganglion) und
die sympathische Kette. Präganglionäre sympathische Nervenfasern können aber auch ohne
Umschaltung durch die Grenzstrangganglien direkt die sekundären Prävertebralganglien
ansteuern, zu denen die Ganglien der oberen (superior mesenteric ganglion) und unteren
(inferior mesenteric ganglion) Bauchhöhle gehören. Von dort aus ziehen die Nervenfasern zu
den inneren Organen (Glebova & Ginty, 2005).
1.3.1 Die sympathoadrenale Zell-Population des sympathischen
Nervensystems
Neuralleistenzellen, die für Sox10 positiv sind, migrieren von der Rumpfregion in
segmentaler Organisation durch die anterioren Teile der Somiten am Notochord vorbei und
sammeln sich vorerst dorso-lateral in engem Kontakt zur Aorta (Loring & Erickson, 1987;
Teillet et al., 1987; Britsch et al., 1998; Perris & Perissinotto, 2000; Krull, 2001). Diese Zell-
Population entwickelt sich zu den sympathoadrenalen (SA) Zellen und bildet zunächst die
primäre sympathische Ganglienkette (Abb. 3). Mit einer zweiten Zell-Wanderung entstehen
die endgültigen sympathischen Ganglien sowie die Anlagen des Nebennierenmarks. Infolge
intrinsischer und extrinsischer Signale differenzieren die sympathoadrenalen Zellen zu
sympathischen Neuronen, die die Gene für die beiden katecholaminergen Enzyme TH
(Tyrosine hydroxylase) und DBH (Dopamine-β-hydroxylase) exprimieren, sowie zu endo-
krinen chromaffinen Zellen der Nebenniere. Dabei sind TH und DBH in den sympathischen
Neuronen essentiell für die Synthese des noradrenergen Transmitters Noradrenalin. Die
chromaffinen Zellen sind zusätzlich positiv für PNMT (Phenylethanolamin-N-methyltrans-
ferase), das letzte Enzym der Adrenalinsynthese, und bilden die typischen großen chrom-
affinen Vesikel aus (Anderson et al., 1991; Le Douarin et al., 2004; Huber, 2006). Daneben
stellen die SIF (small intensely fluorescent)-Zellen, bezogen auf ihre Morphologie, eine
Einleitung
11
Zwischenform der beiden oben genannten Zelllinien dar. Ähnlich den chromaffinen Zellen
besitzt diese intermediäre Zell-Population einerseits Vesikel zur Speicherung von
Katecholaminen und ist andererseits in der Lage durch die Ausbildung von Neuriten einen
neuronalen Phänotyp anzunehmen. Somit fungieren SIF-Zellen möglicherweise als endokrine
Zellen oder als Interneurone (Jew, 1985; Matthews, 1989) und sind oftmals in sympathischen
Ganglien anzutreffen (Tanaka & Chiba, 1996).
Abb. 3: Entstehung der sympathoadrenalen Zell-Population. Die Neuralleistenzellen aus der Rumpfregion sammeln sich an der dorsalen Aorta und bilden dort die primäre sympathische Ganglienkette (spg). Durch die induktiven BMP-Signale der dorsalen Aorta findet eine Spezifizierung der Neuralleistenzellen zu den sympathoadrenalen (SA)-Zellen statt. Diese exprimieren die pan-neuronalen Marker NF und SCG10 sowie die beiden Gene TH und DBH, die differenzierte noradrenerge Neurone kennzeichnen. Mit einer zweiten Zell-Wanderung entstehen die endgültigen sympathischen Ganglien (sg) und die Nebennieren-Anlagen (ag). Nt: Neuralrohr; no: Notochord. Abbildung entnommen aus (Huber, 2006).
1.3.2 Spezifizierung sympathoadrenaler Zellen
Unter dem Einfluss der BMPs (in der Maus BMP-2 und BMP-4), die aus der Wand der
dorsalen Aorta sezerniert werden, spezifizieren sich die Vorläuferzellen in den primären
sympathischen Ganglien zu den sympathoadrenalen Zellen (Shah et al., 1996). Mittels in vivo
Experimenten konnte im Huhn gezeigt werden, dass durch die induzierende Wirkung von
BMP-4 und BMP-7 die Anzahl an Zellen, die Neurofilament 160 (NF160) sowie TH bzw.
DBH exprimieren, erhöht werden kann. Noggin inhibiert hingegen die BMP-4-Signal-
Einleitung
12
transduktion und unterdrückt somit die Produktion sympathoadrenaler Zellen (Reissmann et
al., 1996; Schneider et al., 1999). Neben der fundamentalen Rolle der BMPs bei der
Spezifizierung dieser Zell-Population sind diese Signalmoleküle auch für die Entwicklung
parasympathischer Neurone von Bedeutung (Muller & Rohrer, 2002). Daher scheinen noch
weitere unbekannte Faktoren an der Bildung sympathoadrenaler Zellen beteiligt zu sein.
Beispielsweise exprimieren aviäre migrierende Neuralleistenzellen aus der Rumpfregion den
für die Subpopulationen des autonomen Nervensystems spezifischen Transkriptionsfaktor
Cash-1 (Chicken Achaete-Scute homolog 1), bevor BMP-4 von der Wand der dorsalen Aorta
sezerniert und der BMP-Rezeptor aktiviert wird (Ernsberger et al., 1995; McPherson et al.,
2000). Auch könnten Signale von den Somiten, dem ventralen Neuralrohr und dem Noto-
chord mit den BMPs kooperieren, um die Spezifizierung sympathoadrenaler Zellen zu
gewährleisten. Ferner exprimieren diese Vorläufer frühe neuronale Marker wie zum Beispiel
NF160 und das Neuronen-spezifische Tubulin-β-III sowie den HD-Transkriptionsfaktor
Phox2b (Paired-Like Homeobox 2B) (Pattyn et al., 1999).
1.3.3 Differenzierung sympathoadrenaler Zellen
Nach der Spezifizierung der sympathoadrenalen Vorläuferzellen in den primären Ganglien
wandern diese Zellen ein zweites Mal und gelangen in ihre Zielgebiete: Die sekundären
sympathischen Ganglien und das Mark der Nebenniere (Anderson et al., 1991). Dort ist ihre
terminale Differenzierung zu den sympathischen Neuronen, den SIF-Zellen und den chrom-
affinen Zellen zunächst von lokalen Umgebungssignalen wie zum Beispiel den Wachstums-
faktoren FGF (fibroblast growth factor) und NGF (nerve growth factor) abhängig. Weiterhin
wird in den prä- und paravertebralen sympathischen Ganglien die Ausprägung des nor-
adrenergen neuronalen Phänotyps der postganglionären sympathischen Neurone durch ein ko-
Letztendlich werden in den terminal differenzierten noradrenergen Neuronen die für die
Katecholaminsynthese verantwortlichen Enzyme TH und DBH aktiviert (Goridis & Rohrer,
2002).
Abb. 4: Schematische Darstellung der Entwicklung noradrenerger Neurone. Neuralleistenzellen werden durch die BMP-Signalmoleküle zu sympathischen Vorläufern spezifiziert. Diese Zell-Population exprimiert eine Reihe von verschiedenen Transkriptionsfaktoren (Mash1, Phox2b, Hand2, Gata3), die sowohl die Expression der noradrenergen Marker TH und DBH als auch die der neuronalen Faktoren NF160 und SCG10 kontrollieren. Aufgrund lokaler Umgebungssignale und bestimmter Transkriptionsfaktoren differenzieren sympathische Vorläufer zu postmitotischen noradrenergen Neuronen. Abbildung entnommen und leicht verändert aus (Goridis & Rohrer, 2002).
Der pro-neuronale bHLH-Transkriptionsfaktor Mash1 bestimmt sehr früh in der Entwicklung
neuronale Differenzierungsprozesse (Guillemot et al., 1993; Mao & Nadal-Ginard, 1996; Ma
et al., 1997) und wird u.a. in den Vorläuferzellen der sympathischen, parasympathischen und
enterischen Neurone transient exprimiert (Lo et al., 1991; Guillemot & Joyner, 1993). Seine
Expression beginnt mit der Ansammlung der sympathoadrenalen Vorläufer in den primären
sympathischen Ganglien und endet mit der Bildung der sekundären sympathischen Ganglien.
Die Überexpression von Mash1 in Zellkulturen klonaler muriner Neuralleistenzellen ist
ausreichend, um initiale Schritte noradrenerger Differenzierung in den sympathoadrenalen
Vorläufern auszulösen (Lo et al., 1998). Mash1-defiziente Mäuse zeigen hingegen keine
Phox2a-Expression in den sympathischen Vorläuferzellen, was letztlich zu einem Verlust der
noradrenerg differenzierten Zell-Population führt. In diesen Mäusen entwickelt sich ein
Großteil der sympathoadrenalen Vorläufer in den sympathischen Ganglien nur bis zum
Stadium der frühen Neuroblasten. Dennoch scheint die Expression früher neuronaler Marker
Einleitung
14
wie Phox2b, Hand2 und Tubulin-β-III nicht gestört zu sein (Sommer et al., 1995). Somit wird
Mash1 für den Übergang von der Vorläuferzelle zur differenzierten, noradrenergen Zelle
benötigt (Huber et al., 2002; Huber, 2006).
In den Vertebraten wird der HD-Transkriptionsfaktor Phox2b in den noradrenergen Neuronen
des zentralen Nervensystems und in den neuronalen Zellen des peripheren Nervensystems
exprimiert (Pattyn et al., 1999). Ähnlich wie Mash1 ist Phox2b in den sympathoadrenalen
Zellen ab dem Zeitpunkt ihrer Aggregation an der dorsalen Aorta nachweisbar. Obwohl im
Huhn der zu Mash1 homologe Faktor Cash-1 der Phox2b-Expression vorausgeht (Ernsberger
et al., 1995), konnte in Mash1-defizienten Mäusen gezeigt werden, dass Phox2b unabhängig
von Mash1 exprimiert werden kann (Hirsch et al., 1998; Huber et al., 2002). Im Vergleich zu
Mash1-defizienten Mäusen bleiben die sympathoadrenalen Zellen in den Phox2b-defizienten
Tieren in einem noch unreiferen Zustand. Dieser Defekt ist äußerst schwerwiegend und wird
bereits an den früh-embryonalen Zeitpunkten offensichtlich. So sind am Embryonaltag 13,5
keine sympathischen Ganglien aufzufinden und die terminale Differenzierung sympathischer
Vorläuferzellen unterbleibt (Morin et al., 1997; Pattyn et al., 1999). Mit Hilfe von in vitro
Studien konnte eine direkte Bindung von Phox2b an die Promotorregion der Gene TH und
DBH gezeigt werden (Kim et al., 1998; Lo et al., 1999; Adachi et al., 2000). Das mit Phox2b
eng verwandte HD-Protein Phox2a (Valarche et al., 1993; Morin et al., 1997; Pattyn et al.,
1997) aktiviert Phox2b und ist an der autonomen Neurogenese beteiligt (Stanke et al., 1999).
Trotzdem ist Phox2a für die Entwicklung sympathischer Neurone verzichtbar oder durch
Phox2b ersetzbar. Die einzige beobachtbare Anomalie in Phox2a-defizienten Mäusen ist eine
veränderte Morphologie des oberen zervikalen Ganglions (Morin et al., 1997).
Neben den beiden Transkriptionsfaktoren Mash1 und Phox2b ist der bHLH-Faktor Hand2
(dHand) zusätzlich an der Ausprägung des BMP-induzierten noradrenergen Phänotyps
beteiligt (Howard et al., 2000). Zeitlich gesehen wird Hand2 infolge von Phox2b exprimiert
und spielt somit eine Rolle bei der transkriptionellen Regulation der Expression von TH und
DBH, die die katecholaminerge Differenzierung kennzeichnen (Howard et al., 1999; Howard
et al., 2000; Morikawa et al., 2005; Lucas et al., 2006; Morikawa et al., 2007). DBH-
Promotorstudien konnten zeigen, dass Hand2 über Protein-Protein-Wechselwirkungen mit
Phox2a und anderen transkriptionellen Regulatoren interagiert und somit die DBH-
Expression reguliert (Rychlik et al., 2003; Xu et al., 2003). Sowohl Hand2-defiziente
Einleitung
15
Zebrafische als auch spezifische Deletionen von Hand2 in murinen Neuralleistenzellen zeigen
eine reduzierte Genexpression für TH und DBH in den frühen sympathischen Ganglien
(Lucas et al., 2006; Morikawa et al., 2007; Hendershot et al., 2008). Somit ist der
Transkriptionsfaktor Hand2 essentiell für die Expression von TH bzw. DBH.
Ein weiterer wichtiger Faktor noradrenerger Differenzierung in den sympathischen Neuronen
ist der murine Zinkfinger-Transkriptionsfaktor Gata3, der im Huhn als Gata2 bezeichnet wird.
An den frühen Entwicklungszeitpunkten der sympathoadrenalen Zell-Population taucht Gata3
in den primären sympathischen Ganglien auf und später in den sympathischen Neuronen
sowie in den chromaffinen Zellen. Gata3-defiziente Mäuse sind embryonal letal und sterben
am Embryonaltag 11 aufgrund eines erheblichen Mangels an Noradrenalin (Pandolfi et al.,
1995). Bedingt durch die starke Beeinträchtigung in der Entwicklung noradrenerger Gewebe
werden TH und DBH kaum mehr exprimiert, was zum Verlust der sympathoadrenalen Zellen
führt (Lim et al., 2000; Moriguchi et al., 2006). In Gata3-defizienten Tieren wird zudem
Mash1 nicht wie üblicherweise am Embryonaltag 14,5 abgeschaltet, sondern verstärkt ex-
primiert, was zu einem Differenzierungsdefekt der sympathoadrenalen Zellen führt. Gata3 ist
somit essentiell für die Aktivierung der TH- und DBH-Expression und der damit verbundenen
Differenzierung sowie dem Überleben sympathoadrenaler Zell-Derivate (Moriguchi et al.,
2006). Ferner konnte gezeigt werden, dass die Gata2/3-Expression in den sympathischen
Ganglien nach derjenigen von Mash1, Phox2b und Hand2 einsetzt und durch Phox2b
induziert wird (Tsarovina et al., 2004). Weiterhin wirkt Gata3 regulierend auf die Faktoren
Mash1, Phox2b und Hand2 zurück. Somit scheinen die an der Differenzierung sympathischer
Neurone beteiligten Transkriptionsfaktoren über ein regulatorisches Netzwerk und nicht über
eine lineare Signalkaskade zu wirken (Tsarovina et al., 2004; Moriguchi et al., 2006).
Zusätzlich greifen weitere Transkriptionsfaktoren wie zum Beispiel AP-2β, Trim11 oder
Insm1 aktiv in die transkriptionelle Regulation der Ausbildung des noradrenergen Phänotyps
sympathischer Neurone mit ein (Hong et al., 2008a; Hong et al., 2008b; Wildner et al., 2008).
Einleitung
16
1.4 Die Familie der Sox-Proteine
Im Jahr 1990 entdeckten John Gubbay und Andrew Sinclair den geschlechtsbestimmenden
Transkriptionsfaktor SRY (sex-determining region on Y chromosome) als erstes Mitglied der
Sox-Proteinfamilie (Gubbay et al., 1990; Sinclair et al., 1990). SRY ist auf dem Y-Chromo-
som der Säugetiere kodiert und enthält als DNA-Bindedomäne eine so genannte SRY-Box,
von der sich der Name der Sox-Proteine ableitet. Die Sox-Proteine gehören zur Superfamilie
der HMG (high mobility group)-Proteine, deren DNA-Bindedomäne in vielen verschiedenen
Proteinen identifiziert wurde. Die aus ca. 80 Aminosäuren bestehende HMG-Domäne des
SRY-Faktors ist zu mindestens 50 Prozent in den Sox-Proteinen konserviert. Aufgrund dieser
Sequenz-Homologie in der HMG-Box bilden SRY und die Sox (Sry-related HMG-box)-
Proteine eine Untergruppe der HMG-Box-Superfamilie. Sox-Proteine binden mit ihrer HMG-
Domäne sequenzspezifisch über die kleine Furche der DNA-Doppelhelix an die ihnen
Zu den Sox-Proteinen der Gruppe C gehören die Vertreter Sox4, Sox11 und Sox12, die vor
allem im Menschen, der Maus und auch in den meisten anderen Vertebraten vorkommen
(Abb. 5). Evolutionär gesehen entstanden sie bereits sehr früh durch Genduplikations-
vorgänge, da sowohl in Drosophila melanogaster als auch in anderen Invertebraten nur ein
einziges SoxC-Gen nachgewiesen werden konnte (Cremazy et al., 2001; Guth & Wegner,
2008). Die Gene der SoxC-Untergruppe besitzen, wie die Mitglieder der Gruppe B, keine
Exon-Intron-Struktur und werden jeweils von einem einzelnen Exon kodiert. Die DNA-
Bindedomäne (HMG-Box) der SoxC-Proteine befindet sich im N-terminalen Drittel und ist
innerhalb der drei Mitglieder hoch konserviert (Jay et al., 1995; Kuhlbrodt et al., 1998a;
Maschhoff et al., 2003). Zudem konnte im C-terminalen Drittel der drei Transkriptions-
faktoren ein weiterer sequenzhomologer Bereich als Transaktivierungsdomäne identifiziert
werden (Wegner, 1999; Bowles et al., 2000; Schepers et al., 2002). Aufgrund ihres hohen
Verwandtschaftsgrades werden den drei SoxC-Proteinen Sox4, Sox11 und Sox12 ähnliche
biochemische Eigenschaften zugedacht. Folglich können sie bei örtlich und zeitlich
gemeinsamer Expression in einem Gewebe den Verlust des jeweiligen anderen Proteins
kompensieren und weisen aus diesem Grund eine funktionelle Redundanz auf. Alle drei
SoxC-Proteine zeigen ein stark überlappendes Expressionsmuster im sich entwickelnden
Nervensystem und scheinen daher eine wichtige Rolle bei neuronalen Reifungsprozessen zu
spielen (Cheung et al., 2000; Hoser et al., 2008).
Einleitung
18
Abb. 5: Die Gruppe C der Sox-Proteine. Sox4 und Sox11 aus der Maus (mo-Sox4, mo-Sox11), Sox12 aus dem Menschen (hu-Sox12) und Sox24 aus der Regenbogenforelle (tr-Sox24) besitzen keine Introns (ni) und weisen im N-terminalen Drittel eine HMG-Box (schwarze Box) und im C-terminalen Drittel eine Transaktivierungsdomäne (TA: hellgrauer Kasten mit roter Umrandung) auf. Weiße Box: hoch konservierter Bereich; hellblaue Raute: serinreiche Sequenz; gelbe Form: saure Region; dunkelblaues Rechteck: prolin-glutaminreicher Bereich. Abbildung entnommen und leicht verändert aus (Bowles et al., 2000).
1.4.1.1 Sox4
Der Transkriptionsfaktor Sox4, der von einem 4,9 kb großen einzelnen Exon kodiert wird
(Schilham et al., 1993), zeigt eine transaktivierende Kapazität auf die Transkription. Die dafür
verantwortliche Transaktivierungsdomäne ist im serinreichen Bereich des C-Terminus
lokalisiert. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass Sox4 in den T- und B-Lymphozyten
von adultem Thymusgewebe sowie in den Gonaden und im fötalen Gehirn der Maus
exprimiert wird (van de Wetering et al., 1993). In der frühen Embryogenese konnten Sox4-
Transkripte in den Branchialbögen, der Trachea und dem Ösophagus detektiert werden
(Schilham et al., 1996; Ya et al., 1998). An spät-embryonalen Zeitpunkten wird Sox4 dagegen
in der Epiphysenfuge der sich entwickelnden Knochen exprimiert und über das Parathyroid-
hormon und seinen Rezeptor reguliert (Reppe et al., 2000). Daher scheint Sox4, ähnlich den
Transkriptionsfaktoren Sox5, Sox6 und Sox9, eine Rolle in der Chondrozyten-Entwicklung
einzunehmen (Sekiya et al., 2002). Ferner konnte auch gezeigt werden, dass Sox4 postnatal
an der Knochenbildung beteiligt ist (Nissen-Meyer et al., 2007). Weitere Sox4-Expressions-
orte in der Maus sind sowohl die neuronalen als auch die glialen Vorläuferzellen (Cheung et
al., 2000; Bergsland et al., 2006; Hoser et al., 2007; Potzner et al., 2007), die Endokardkissen
und Endokardleisten des Herzens am Embryonaltag 13 (Schilham et al., 1996), sowie die
Einleitung
19
endokrinen Zellen des Pankreas im Zebrafisch und in der Maus (Lioubinski et al., 2003;
Mavropoulos et al., 2005; Wilson et al., 2005). Daneben konnte in bestimmten malignen
Tumorarten wie dem klassischen Medulloblastom (Lee et al., 2002) oder dem Prostatakrebs
(Liu et al., 2006) eine Überexpression von Sox4 nachgewiesen werden. Durch induzierte
Repression von Sox4 mittels RNA-Interferenz konnte in den Prostata-Krebszellen eine
erhöhte Apoptose und somit eine anti-apoptotische Wirkung von Sox4 gezeigt werden (Liu et
al., 2006; Pramoonjago et al., 2006). Dagegen übt Sox4 einen pro-apoptotischen Effekt in
hepatozellulären Karzinomzellen aus (Ahn et al., 2002; Hur et al., 2004). Somit scheint Sox4
in Abhängigkeit vom jeweiligen Gewebe den kontrollierten Zelltod zu beeinflussen.
Mittels Mausmutanten, in denen die kodierende Sequenz für Sox4 deletiert wurde, konnte die
Funktion dieses Proteins analysiert werden. Dabei demonstrieren histologische Unter-
suchungen von Sox4-defizienten Mäusen sowohl Fehlbildungen der Herzklappen als auch
schwere Missbildungen der Ausstrombahn des Herzens. Darüber hinaus wird die Entwicklung
der Lymphozyten auf dem pro-B-Zellstadium angehalten. Aufgrund der Herzklappen-
insuffizienz sterben diese Tiere am Embryonaltag 14 (Schilham et al., 1996).
Die Analyse des Expressionsmusters von Sox4 im sich entwickelnden zentralen Nerven-
system von Wildtyp-Tieren zeigt, dass Sox4 in den neuralen Vorläuferzellen, die aus der
proliferierenden Ventrikulärzone des Neuralrohrs auswandern, verstärkt exprimiert wird. Im
weiteren Verlauf differenzieren die Vorläufer zu reifen Neuronen, in denen die Sox4-
Expression abgeschaltet wird (Cheung et al., 2000). Weiterhin finden sich größere Mengen an
Sox4-Transkripten in bestimmten Regionen des sich entwickelnden Gehirns. Zu diesen
Bereichen gehören der zerebrale Kortex, der Thalamus, der Hippokampus und der cerebelläre
Kortex. Trotz dieser starken Sox4-Expression im Gehirn sowie im Rückenmark zeigen Sox4-
defiziente Embryonen keine abnorme Entwicklung im zentralen Nervensystem bis zum
Zeitpunkt ihres Todes an 14 dpc. Ein möglicher Grund hierfür ist die nahe biochemische
Verwandtschaft von Sox4 zu dem Protein Sox11, sowie ein ähnliches embryonales
Expressionsmuster beider Transkriptionsfaktoren. Deshalb könnte Sox11 den Funktions-
verlust von Sox4 an den frühen Zeitpunkten der Entwicklung im zentralen Nervensystem
kompensieren (Cheung et al., 2000).
Einleitung
20
1.4.1.2 Sox11
Neben Sox4 konnte mit Sox11 ein weiterer Vertreter der Gruppe C in der Maus identifiziert
werden (Gubbay et al., 1990). Durch Aminosäure-Sequenzanalysen konnten im C-terminalen
Bereich Homologien zwischen dem humanen SOX11, das auf dem kurzen Arm des
Chromosoms 2 (2p25) lokalisiert ist, und dem murinen sowie dem aviären Sox11 festgestellt
werden. In den carboxyterminalen Regionen von Sox4 und Sox11 wurden erhebliche
Ähnlichkeiten festgestellt, denn beide Sox-Proteine enthalten eine serinreiche Domäne und
zeigen eine 82%-ige Übereinstimmung in den letzten 34 Aminosäuren. Auch Sox11 besitzt,
wie bereits schon für Sox4 gezeigt, in dieser Region eine stark transaktivierende Funktion
(van de Wetering et al., 1993; Kuhlbrodt et al., 1998a; Dy et al., 2008; Hoser et al., 2008). In
den drei Organismen Maus, Huhn und Mensch können Sox11-Transkripte in den reifenden
Neuronen des sich entwickelnden zentralen sowie peripheren Nervensystems detektiert
werden, deren Vorkommen im weiteren Verlauf der Entwicklung wieder abnimmt (Jay et al.,
1995; Uwanogho et al., 1995). Daneben weisen Xenopus-Studien darauf hin, dass Sox11
durch die Expression von Chordin induziert wird, mit der Nemo-like Kinase (NLK) kooperiert
und dabei die neurale Entwicklung stimuliert (Hyodo-Miura et al., 2002).
Durch Analysen in der eigenen Arbeitsgruppe konnten Sox4- und Sox11-Transkripte in
oligodendroglialen Vorläuferzellen, nicht aber in terminal differenzierten Oligodendrozyten
nachgewiesen werden (Kuhlbrodt et al., 1998a). Zudem wird Sox11 in verschiedenen murinen
Organen und Geweben während der Embryonalentwicklung exprimiert. Dazu gehören
beispielsweise das Riechepithel, die Epithelien der Speiseröhre, des Magens, des Pankreas
und der Speicheldrüsen sowie die Branchialbögen, die Ohren, die Augen, die Gaumenplatte,
die Lunge, die Niere, die Milz und die Extremitäten (Jay et al., 1995; Hargrave et al., 1997).
Ferner wird Sox11 sowohl in neuronalen Vorläuferzellen als auch in unreifen Neuronen
während der adulten Neurogenese exprimiert. Durch die zeitgleiche Ko-Expression mit dem
Mikrotubulus-assozierten Protein Doublecortin (DCX), das postmitotische unreife Neurone
charakterisiert, wird Sox11 eine mögliche regulative Rolle in der Differenzierung neuronaler
Zellen im adulten zentralen Nervensystem zugeordnet (Haslinger et al., 2009). Ähnlich wie
bereits für Sox4 gezeigt, kann eine starke Sox11-Expression auch zu malignen embryonalen
Medulloblastomen führen (Lee et al., 2002). Somit können beide Transkriptionsfaktoren,
Sox4 und Sox11, zu einem malignen Phänotyp beitragen, indem sie Wachstum und
Proliferation entarteter Zellen fördern.
Einleitung
21
Anhand von Sox11-defizienten Mausmutanten, die in der eigenen Arbeitsgruppe generiert
wurden, konnte die Funktion von Sox11 während der Embryogenese genauer untersucht
werden (Sock et al., 2004). Diese Mäuse sterben aufgrund einer kongenitalen Zyanose kurz
nach ihrer Geburt. Neben pulmonaler Insuffizienz bedingt durch eine Lungenhypoplasie
führen kardiovaskuläre Fehlbildungen zu schweren Herzfehlern. Die Ursachen für diese
Entwicklungsdefekte sind vielschichtig. Einerseits konnte eine unvollständige Trennung der
Scheidewand zwischen der rechten und linken Herzkammer beobachtet werden und
andererseits entspringen sowohl die Aorta als auch die Lungenarterie aus dem rechten
Ventrikel. Außerdem fand oftmals keine Trennung der Ausstrombahn des Herzens in Aorta
und Truncus pulmonalis statt. Neben den komplexen Herzdefekten treten in 70 Prozent der
Sox11-defizienten Tiere Lippen-Kiefergaumenspalten und Verschlussdefekte der Bauchhöhle
sowie des Augenlids auf. Außerdem zeigen die abdominalen Organe wie der Magen und der
Pankreas eine hypomorphe Struktur, wohingegen die Milz vollständig fehlt. Weitere
phänotypische Merkmale der Sox11-Mausmutanten sind Ossifikationsdefekte des Schädels
und Skelettfehlbildungen. Trotz dieser zahlreichen Schäden lassen sich keine signifikanten
Störungen in der neuronalen Entwicklung des zentralen und peripheren Nervensystems in den
Sox11-defizienten Mäusen erkennen (Sock et al., 2004). Auch in diesem Fall könnte der
ausbleibende neuronale Phänotyp mit der weit reichenden Ko-Expression von Sox4 und
Sox11 erklärt werden. Ferner zeigte die Arbeitsgruppe um Jonas Muhr anhand von Elektro-
porationsstudien in das frühe Neuralrohr des Huhns das potenzielle Zusammenwirken der
beiden SoxC-Proteine bei der Differenzierung pro-neuraler Zellen. Dabei werden beide
Transkriptionsfaktoren für die Expression pan-neuronaler Gene, wie zum Beispiel von
Tubulin-β-III (Tubb3) benötigt. Das Gen Tubb3 wurde in dieser Studie als ein mögliches
direktes Zielgen von Sox-Proteinen der Gruppe C identifiziert (Bergsland et al., 2006).
1.4.1.3 Sox12
Sox12 ist das dritte Mitglied der Gruppe C und wurde bei seiner Entdeckung zunächst als
Sox22 bezeichnet (Jay et al., 1997). Im menschlichen Embryo wird SOX12 in zahlreichen
mesodermalen und vereinzelt in entodermalen Derivaten exprimiert (Jay et al., 1997).
Während der Embryogenese der Maus konnte ein weitgehend überlappendes Expressions-
muster von Sox12 mit den beiden anderen SoxC-Proteinen, Sox4 und Sox11, in den
Einleitung
22
verschiedenen Geweben und im sich entwickelnden Nervensystem aufgezeigt werden (Hoser
et al., 2008). Im Vergleich zu Sox4 und Sox11 liefert Sox12 ein sehr gleichförmiges, aber
deutlich schwächeres Expressionssignal. Auch das dritte Mitglied der Sox-Proteine besitzt
transaktivierende Kapazitäten, die allerdings im Vergleich zu denjenigen von Sox11 sehr viel
geringer sind (Dy et al., 2008; Hoser et al., 2008). Überraschenderweise entwickeln sich
Sox12-defiziente Mäuse normal und zeigen keine offensichtlichen phänotypischen Ver-
änderungen im Gegensatz zu den oben beschriebenen schweren Entwicklungsdefekten der
Sox4- bzw. Sox11-defizienten Mäuse (Schilham et al., 1996; Sock et al., 2004; Hoser et al.,
2008). Diese Beobachtungen sprechen dafür, dass die beiden Proteine Sox4 und Sox11 den
Verlust von Sox12 kompensieren können, während Sox12 die fehlende Sox4- oder Sox11-
Expression scheinbar nicht ersetzen kann. Somit könnte es sich bei dem dritten Mitglied der
Gruppe C der Sox-Proteine, um eine nichtreziproke funktionelle Redundanz zwischen Sox12
und den beiden anderen SoxC-Proteinen handeln.
Problemstellung
23
2 Problemstellung
Die Transkriptionsfaktoren der Sox-Proteinfamilie sind entscheidend an der Regulation
verschiedener Entwicklungsprozesse beteiligt. Die starke und überlappende Expression von
Sox4 und Sox11 in neuralen Geweben deutet auf eine wichtige funktionelle Rolle dieser
beiden SoxC-Proteine im sich entwickelnden Nervensystem hin. Dennoch konnten nach
Deletion von Sox4 oder Sox11 keine neuralen Defekte in den entsprechenden Maus-Modellen
nachgewiesen werden. Dies lässt eine gegenseitige Kompensation von Sox4 und Sox11
vermuten, bedingt durch die hohe Übereinstimmung der Aminosäuresequenzen beider SoxC-
Proteine und den daraus resultierenden vergleichbaren biochemischen Eigenschaften.
Daher sollte im ersten Teil dieser Arbeit die Funktion der SoxC-Proteine im zentralen
Nervensystem mittels Überexpressionsstudien untersucht werden. Für die Analyse sollten
transgene Mäuse generiert werden, die den Transkriptionsfaktor Sox4 unter dem MBP-
Promotor in terminal differenzierenden Oligodendrozyten exprimieren. Mittels histologischer
Methoden sollte an postnatalen Entwicklungsstadien MBP-Sox4-transgener Tiere die zelltyp-
spezifische Expression des Sox4-Transgens und die Auswirkungen auf die Entwicklung
oligodendroglialer Zellen analysiert werden.
Darüber hinaus sollte mittels Gendeletionsstudien die Funktion von Sox4 und Sox11 im sich
entwickelnden sympathischen Nervensystem untersucht werden. Um mögliche kompensato-
rische Effekte zwischen den beiden SoxC-Proteinen zu vermeiden, sollten im zweiten Teil
dieser Arbeit Sox4/Sox11-doppelt-defiziente Embryonen generiert werden. Dafür sollten
Tiere mit einer konstitutiven Deletion des Sox11-Gens im gesamten Organismus und einer
spezifischen Sox4-Deletion in den sympathoadrenalen Vorläuferzellen der sich entwickelnden
sympathischen Ganglien verwendet werden. Durch immunhistochemische Färbungen und In
situ Hybridisierungen von pan-neuronalen sowie noradrenergen Marker und Regulatorgenen
sollten mögliche Effekte auf die Entwicklung sympathoadrenaler Zellen in Sox4/Sox11-
doppelt-defizienten sympathischen Ganglien analysiert werden. Zusätzlich sollten Pro-
liferationsstudien Aufschluss über die Teilungsraten sympathoadrenaler Zellen geben und das
Überleben sympathischer Neurone in den SoxC-defizienten Tieren mittels Apoptosestudien
untersucht werden. Durch die Analyse der Aufgaben von Sox4 und Sox11 in verschiedenen
Zelltypen des Nervensystems sollte geklärt werden, ob die SoxC-Proteine immer gleichartige
oder unterschiedliche, den Entwicklungsabläufen angepasste Funktionen ausüben.
Ergebnisse
24
3 Ergebnisse
3.1 Funktionelle Analyse der SoxC-Proteine im zentralen
Nervensystem der Maus
Die beiden Transkriptionsfaktoren Sox4 und Sox11 werden wie viele andere Sox-Proteine
während der murinen Entwicklung in verschiedenen Geweben exprimiert. Darunter befinden
sich Neuralleistenderivate, Neurone, Astrozyten und Oligodendrozyten (Schilham et al.,
1996; Kuhlbrodt et al., 1998a; Bergsland et al., 2006; Hoser et al., 2007). Trotz des stark
überlappenden Expressionsmusters beider Transkriptionsfaktoren im sich entwickelnden
zentralen Nervensystem konnten bisher weder in Sox4- noch in Sox11-defizienten Mäusen
neurale Defekte nachgewiesen werden (Cheung et al., 2000; Sock et al., 2004). Der Grund
hierfür könnte die angenommene funktionelle Redundanz beider Faktoren sein, bedingt durch
den hohen Grad der Übereinstimmung in der Aminosäuresequenz beider SoxC-Proteine und
den daraus resultierenden analogen biochemischen Eigenschaften.
Da konstitutive Sox4-defiziente Tiere während der Embryogenese und Sox11-defiziente
Mäuse spätestens zum Zeitpunkt der Geburt versterben (Schilham et al., 1996; Sock et al.,
2004) sollte im ersten Teil der Arbeit die Rolle der SoxC-Proteine im zentralen Nervensystem
mittels Überexpressionsstudien analysiert werden. Dazu wurden transgene Mäuse generiert,
die entweder Sox4 oder Sox11 spezifisch unter dem MBP-Promotor in den sich terminal
differenzierenden Oligodendrozyten exprimieren.
Ergebnisse
25
3.1.1 Entwicklung oligodendroglialer Zellen im Rückenmark von
Sox11-defizienten Mäusen
Zu Beginn der Studie konnte zuerst die spezifische Expression beider SoxC-Proteine in den
oligodendroglialen Zellen des Rückenmarks reproduziert werden (Kuhlbrodt et al., 1998a).
Dazu wurden immunhistochemische Färbungen mit Antikörpern gegen Sox4 (Abb. 6G und H)
bzw. Sox11 (Abb. 6J und K) und die Oligodendrozyten spezifischen Transkriptionsfaktoren
Sox10 (Abb. 6A und D) bzw. Olig2 (Abb. 6B und E) auf transversalen Gefrierschnitten der
Herzregion von 18,5 dpc (days post coitum) Wildtyp-Embryonen durchgeführt. Sowohl Sox4
als auch Sox11 zeigten zu diesem Zeitpunkt eine deutliche Ko-Expression mit den beiden
Faktoren Sox10 bzw. Olig2 in den Pro-Oligodendrozyten der Marginalzone des dorsalen
Rückenmarks (Abb. 6M, N, P und Q). Dagegen konnte mit dem basischen Myelinprotein
MBP und den beiden Mitgliedern der Gruppe C, Sox4 und Sox11, kein überlappendes
Expressionsmuster detektiert werden (Abb. 6C, F, I, L, O und R).
Abb. 6: Spezifische Expression von Sox4 und Sox11 in oligodendroglialen Zellen. Auf transversalen Schnitten von 18,5 dpc Wildtyp-Embryonen wurden immunhistochemische Färbungen durchgeführt. Die Fluoreszenzaufnahmen der oben gezeigten Bilder sind aus der Marginal-zone des dorsalen Rückenmarks. Die Antikörper gegen Sox4 (G, H und I) bzw. Sox11 (J, K und L) sind in grün und die Antikörper gegen Sox10 (A und D), Olig2 (B und E) bzw. MBP (C und F) in rot gezeigt. Die Ko-Expression von Sox4 oder Sox11 mit den oligodendroglialen Markern Sox10 bzw. Olig2 ist durch ein gelbes Signal gekennzeichnet (M, N, P und Q). Zusätzlich wurden die Zellkerne mit dem Fluoreszenzfarbstoff DAPI (4`, 6`-diamidino-2-phenylindol) in blau markiert (O und R).
Ergebnisse
26
Das Myelin-Strukturprotein MBP ist kennzeichnend für die Zell-Population terminal
differenzierter Oligodendrozyten. Daher weisen die oben gezeigten Ko-Expressionsanalysen
(Abb. 6M-R) darauf hin, dass beide Transkriptionsfaktoren der Gruppe C nur in den oligoden-
droglialen Vorläufern exprimiert (Abb. 6M, ,N, P und Q) und bei beginnender Differenzierung
herunterreguliert werden (Abb. 6O und R). Bisher konnte die funktionelle Rolle der beiden
SoxC-Proteine im zentralen Nervensystem im Allgemeinen und speziell in der Entwicklung
oligodendroglialer Zellen nicht bis ins Detail analysiert werden. Für derartige Studien können
Sox4-defiziente Mäuse nicht herangezogen werden, da die Embryonen bereits an 14 dpc
absterben (Schilham et al., 1996) und zu diesem Zeitpunkt die Oligodendrozyten-Entwicklung
erst begonnen hat. In Sox11-defizienten Mäusen ist der Embryonaltag 18,5 das letztmögliche
analysierbare Stadium, da Sox11-Nullmutanten aufgrund einer kongenitalen Zyanose
perinatal letal sind (Sock et al., 2004). Untersuchungen des Rückenmarks von Sox11-
defizienten Mäusen an 18,5 dpc ergaben keine signifikanten Unterschiede bezüglich der
Verteilung und Anzahl von Sox10-positiven Zellen (Abb. 7A, B und E). Dabei kennzeichnet
der Transkriptionsfaktor Sox10 zu diesem spät-embryonalen Entwicklungszeitpunkt vor allem
oligodendrogliale Vorläufer sowie erste terminal differenzierende Oligodendrozyten.
Abb. 7: Quantifizierung oligodendroglialer Zellen im Sox11-defizienten Rückenmark. Auf transversalen Rückenmarksschnitten von Wildtyp (wt)- (A und C) und Sox11lacZ/lacZ (ko)- Embryonen (B und D) wurden am Embryonaltag 18,5 sowohl immunhistochemische Färbungen mit dem Oligodendrozyten spezifischen Marker Sox10 (A und B), als auch In situ Hybridisierungen mit DIG-markierten cRNA-Sonden gegen MBP (C und D) und PLP (nicht gezeigt) durchgeführt. Die Anzahl der MBP-, PLP- und Sox10-positiven Zellen wurde in den Rückenmarkshälften von mindestens 15 verschiedenen Schnitten (10 µm bzw. 20 µm) aus der thorakalen Rumpfregion von jeweils zwei unabhängigen Embryonen pro Genotyp ausgezählt. Die Ergebnisse wurden als Säulendiagramm ± Standardabweichung dargestellt (E).
Ergebnisse
27
Um festzustellen, ob die terminale Differenzierung in den Sox11-defizienten Tieren
zeitgemäß einsetzt, wurden In situ Hybridisierungen mit spezifischen RNA-Sonden gegen die
beiden Myelingen-Transkripte MBP und PLP auf 18,5 dpc transversalen Rückenmarks-
schnitten durchgeführt (Abb. 7C und D). Auch hier waren die Quantifizierungen von MBP-
und PLP-exprimierenden Oligodendrozyten in dem Sox11-defizienten Rückenmark mit
denjenigen in den Wildtyp-Tieren vergleichbar (Abb. 7E). Somit kann davon ausgegangen
werden, dass die terminale Differenzierung trotz des Fehlens von Sox11 planmäßig beginnt.
Dennoch besteht die Möglichkeit der Maskierung eines Sox11-spezifischen Defekts durch die
Ko-Expression des vermutlich redundanten SoxC-Proteins Sox4 in den oligodendroglialen
Zellen des Sox11-defizienten Rückenmarks (Cheung et al., 2000).
3.1.2 Überexpressionsstudien der Sox-Proteine der Gruppe C in
oligodendroglialen Zellen
Da mit Hilfe der zur Verfügung stehenden Mausmutanten eine weiterführende Analyse nicht
möglich war, sollten neue Erkenntnisse über die Funktionalität der beiden SoxC-Proteine im
zentralen Nervensystem durch Sox4- und Sox11-Überexpressionsstudien in den differen-
zierenden Oligodendrozyten des postnatalen Rückenmarks transgener Mauslinien gewonnen
werden. Zur Herstellung der transgenen Tiere wurden die offenen Leserahmen von Sox4 bzw.
Sox11 unter die Kontrolle eines MBP-Promotor-Fragments gebracht. Frühere Studien
konnten zeigen, dass durch diesen Promotor die Expression des LacZ-Transgens in den sich
terminal differenzierenden Oligodendrozyten mit Beginn der Myelinisierung spezifisch
angeschaltet wird (Foran & Peterson, 1992). Aufgrund absinkender Aktivität dieses MBP-
Promotors zu späteren postnatalen Entwicklungsphasen, wurde eine transiente Expression der
beiden SoxC-Transgene erwartet. Das Einbringen der MBP-Sox4- und MBP-Sox11-Plasmid-
konstrukte in befruchtete Oozyten brachte in beiden Fällen Tiere hervor, die das Transgen im
Genom integriert hatten. Dabei wiesen allerdings die Nachkommen der MBP-Sox11
transgenen Tiere keine Expression des Sox11-Transgens auf. Daher konnte die funktionelle
Analyse der Überexpression der SoxC-Proteine im zentralen Nervensystem nur an verschie-
denen postnatalen Entwicklungsstadien MBP-Sox4-transgener Mäuse durchgeführt werden.
Ergebnisse
28
3.1.2.1 Generierung MBP-Sox4-transgener Mäuse
Zur Generierung MBP-Sox4-transgener Mäuse wurde zuerst ein 3,1 kb großes Promotor-
Fragment des murinen MBP-Gens (von Position -3109 bis +31) zusammen mit einer EGFP-
Poly(A)-Kassette aus dem pIRES-EGFP-Vektor (Clontech; Heidelberg, Deutschland) in den
pWHERE-Vektor (Invitrogen; San Diego, CA) eingefügt. Dies erfolgte über die Pac1
Restriktionsschnittstelle zwischen zwei hintereinander liegende H19 Isolatorsequenzen. Diese
Elemente sollten die Expression des Sox4-Transgens von möglichen Einflüssen
regulatorischer Bereiche an der Integrationsstelle abschirmen. Anschließend wurde ein 2 kb
großes Fragment des Sox4-Gens aus der Ratte (Rattus norvegicus; Genbank-Ref.
XM_344594) mit dem vollständigen offenen Leserahmen von Sox4 über die EcoRI-
Restriktionsschnittstelle zwischen dem MBP-Promotor-Fragment und der IRES-EGFP-
Poly(A)-Kassette eingesetzt (Abb. 8). Somit konnte die Expression des Sox4-Transgens über
die Ko-Expression mit EGFP und der damit verbundenen Autofluoreszenz detektiert werden.
Abb. 8: Schematische Darstellung des MBP-Sox4-Transgen-Konstrukts. Das MBP-Sox4-Transgen, eingefasst von den H19 Isolatorsequenzen, besteht aus dem murinen MBP-Promotor-Fragment (Positionen -3109 bis +31), dem offenen Leserahmen von Sox4 aus der Ratte und einer IRES-EGFP-Poly(A)-Kassette. Daneben sind die Restriktionsschnittstellen für Pac1 (P) und EcoRI (E) in diesem Konstrukt enthalten. pA: Poly-(A)-Signal, H19ins: H19 Isolator. Mit freundlicher Genehmigung von E. Sock.
Zur Erzeugung der transgenen Tiere wurde das MBP-Sox4-Konstrukt über die Pac1
Restriktionsschnittstelle aus dem pWHERE-Vektor isoliert, aufgereinigt und in Zusammen-
arbeit mit M. Bösl (MPI für Neurobiologie, Martinsried) in den männlichen Pronukleus
befruchteter FVB/N Oozyten mikroinjiziert. Als Ergebnis wurden zehn transgene Weibchen
und neun transgene Männchen (Founder-Tiere) erhalten, wobei nur die Nachkommen von
zwei transgenen Weibchen das MBP-Sox4-Transgen exprimierten. Es stellte sich heraus, dass
Ergebnisse
29
die H19 Isolatoren zu epigenetischen Prägungen führten, die die Transgen-Expression bei der
Vererbung über die männliche Keimbahn still legten. Daher konnte das Sox4-Transgen nur
über die weibliche Keimbahn weitergegeben werden. Die MBP-Sox4-transgenen Tiere
wurden mittels PCR-Analysen genotypisiert und ergaben mit den gewählten Primern für das
Sox4-Transgen ein 566 bp langes DNA-Produkt. Ferner wurde die Anzahl der transgenen
Sox4-Kopien, die in das Genom integriert waren, durch Southern-Blot Analyse bestimmt
(Abb. 9). Dazu wurde die von EcoRI geschnittene genomische DNA mit einer radioaktiv
markierten, 0,6 kb langen Sonde hybridisiert. Aufgrund ihrer spezifischen Bindung an den
HMG-Domänen-kodierenden Bereich des Sox4-Gens konnte für das endogene Sox4-Gen ein
3,4 kb großes und für das transgene Sox4-Gen ein 2 kb großes Fragment detektiert werden
(Abb. 9). Die Berechnung der Anzahl integrierter transgener Sox4-Kopien in das murine
Genom erfolgte über die Bestimmung des Verhältnisses der Bandenintensitäten zwischen dem
endogenen Sox4-Gen und dem MBP-Sox4-Transgen im Phospho-Imager. In zwei MBP-Sox4
exprimierenden Founder-Weibchen konnten 11 bzw. 13 Kopien nachgewiesen werden (Abb.
9 und nicht gezeigte Daten), die mit hoher Rate an die Nachkommen weitergegeben wurden.
Die folgende Analyse wurde an den Jungtieren des Founder-Weibchens mit der geringeren
Kopienanzahl des Transgens durchgeführt. Die Nachkommen des zweiten transgenen Weib-
chens wiesen einen ähnlichen, aber mehr ausgeprägten Phänotyp auf (nicht gezeigte Daten).
Abb. 9: Southern-Blot Analyse von Wildtyp- und MBP-Sox4-transgenen Tieren. Die genomische DNA von Wildtyp (wt)- und MBP-Sox4-transgenen (tg)-Nachkommen des in der Analyse verwendeten weiblichen Founder-Tiers wurde mit EcoRI geschnitten und mit einer Sox4-spezifischen Sonde hybridisiert. Die Größen für das endogene sowie für das transgene Sox4-Gen sind am linken Rand des Blots in kb angegeben. wt: 3,4 kb; tg: 2,0 kb. Die Kopienzahl des Transgens wurde mit einem Phospho-Imager bestimmt und unterhalb der Spur angegeben. Mit freundlicher Genehmigung von E. Sock.
Ergebnisse
30
3.1.2.2 Expression des MBP-Sox4-Transgens im zentralen Nervensystem
Zu Beginn der funktionellen Analyse Sox4-transgener Mäuse sollte die Sox4-Expression in
den MBP-Sox4 Tieren mit derjenigen in den Wildtyp-Mäusen, während postnataler
Entwicklungsphasen, verglichen werden. Um die Menge an Sox4-Transkripten für beide
Genotypen im zentralen Nervensystem zu bestimmen, wurde zunächst Gesamt-RNA aus
Gehirn und Rückenmark an verschiedenen postnatalen Stadien isoliert. Mittels quantitativer
reverser Transkriptions-PCR (RT-PCR) konnte in den analysierten Geweben transgener
Nachkommen zum postnatalen Zeitpunkt P7 eine zwei bis dreifach erhöhte Menge von Sox4-
Transkripten gegenüber der endogenen Sox4-Expression in den Wildtyp-Geweben festgestellt
werden (Abb. 10). Dennoch lieferte dieser geringe Unterschied in der relativen Sox4-
Genexpression transgener Mäuse bezüglich der Wildtyp-Kontrolltiere, einen Hinweis auf eine
starke Expression des MBP-Sox4-Transgens in den oligodendroglialen Zellen. Der Grund
hierfür ist die weit verbreitete sowie hohe endogene Expression von Sox4 in den verschie-
denen Zellen des zentralen Nervensystems an den frühen postnatalen Stadien (Cheung et al.,
2000). Im weiteren Verlauf der Entwicklung wird die endogene Sox4-Expression im zentralen
Nervensystem stark herunterreguliert (Kuhlbrodt et al., 1998a), wohingegen diejenige des
MBP-Sox4-Transgens erhalten bleibt. Dies zeigte sich an einer sieben- bis achtfachen Menge
an Sox4-Transkripten in den transgenen Mäusen am Postnataltag 14 relativ zu der Sox4-
Expression in den neuralen Geweben der Wildtyp-Mäuse (Abb. 10).
Abb. 10: Quantitative RT-PCR zum Nachweis der Sox4-Expression im ZNS. Aus Gehirn und Rückenmark von MBP-Sox4-transgenen Tieren sowie Wildtyp-Mäusen unter-schiedlicher postnataler Entwicklungsstadien (P7, P14 und Adult) wurde Gesamt-RNA isoliert. Als Nachweis für die Sox4-Expression wurden quantitative RT-PCR Analysen mit der hergestellten cDNA durchgeführt. Die Werte wurden auf β-Actin normiert und als ein Vielfaches der Wildtyp-Werte ± Standardabweichung dargestellt. wt: Wildtyp; P: Postnataltag.
Ergebnisse
31
Aufgrund der nachlassenden MBP-Promotor-Aktivität an den späten postnatalen
Entwicklungsphasen (Foran & Peterson, 1992) waren die endogene und die transgene Sox4-
Expression der adulten Tiere miteinander vergleichbar (Abb. 10).
Anhand der EGFP-Autofluoreszenz sowie durch immunhistochemische Färbungen gegen
EGFP konnte das postnatale Expressionsmuster des MBP-Sox4-Transgens im zentralen
Nervensystem mit zellulärer Auflösung analysiert werden (Abb. 11). Bereits einen Tag nach
der Geburt, am Postnataltag 1, wurden auf Gefrierschnitten des Rückenmarks transgener
Tiere wenige vereinzelte EGFP-exprimierende Zellen in der zukünftigen weißen Substanz des
Rückenmarks nachgewiesen (Abb. 11A). In diesem Gewebe nahm die Anzahl der EGFP-
positiven Zellen im Laufe der postnatalen Entwicklung von P7, über P14 bis hin zu P29
kontinuierlich zu (Abb. 11B-D). Dagegen konnte in den vier Monate (4 Mo) alten transgenen
Tieren keine sichtbare EGFP-Expression mehr gezeigt werden (Abb. 11E). Mit zunehmendem
Alter wurden die durch EGFP markierten Zellen nicht nur in der Marginalzone, sondern auch
in der grauen Substanz des Rückenmarks detektiert (Abb. 11C und D). Die zeitliche und
lokale Expression EGFP-positiver Zellen deuten darauf hin, dass das MBP-Sox4-Transgen
selektiv in den sich differenzierenden Oligodendrozyten exprimiert wird.
Abb. 11: Das postnatale Expressionsmuster des MBP-Sox4-Transgens im ZNS. Auf transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks (A-E), des Vorderhirns (L-O) sowie auf sagittalen Schnitten des Kleinhirns (G-J) von MBP-Sox4-transgenen Mäusen wurden am Postnataltag 1 (A), 7 (B, G und L), 14 (C, H und M), 29 (D, I und N) und nach vier Monaten (4 Mo) (E, J und O) immunhistochemische Färbungen mit Antikörpern gegen EGFP durchgeführt. Der mit einem Rechteck markierte Bereich in den Hämatoxylin-Eosin-Übersichtsfärbungen des Kleinhirns in F und des Vorderhirns in K ist in G-J sowie in L-O vergrößert dargestellt.
Ergebnisse
32
Ein dem Rückenmark ähnliches Expressionsmuster für das Sox4-Transgen zeigten auch zwei
weitere Regionen des zentralen Nervensystems: Die weiße Substanz des Kleinhirns (Abb.
11G-J) und der im Vorderhirn liegende Corpus callosum Fasertrakt (Abb. 11L-O). Dabei
konnten in den Fasertrakten des Kleinhirns bzw. im Corpus callosum erstmals ab dem
Postnataltag 7 positive EGFP-Signale detektiert werden (Abb. 11G und L). Diese relativ spät
beginnende EGFP-Expression in den beiden Gehirn-Regionen im Vergleich zum Rückenmark
(Abb. 11A), erfolgte gemäß dem zeitlich versetzten Start der Oligodendrozyten-Differen-
zierung in den verschiedenen Bereichen des zentralen Nervensystems. Ferner wurden, wie im
Rückenmark bereits gezeigt (Abb. 11E), sowohl in der weißen Substanz des Kleinhirns als
auch im Corpus callosum von vier Monate alten MBP-Sox4-transgenen Tieren nur noch
wenige EGFP-positive Zellen nachgewiesen (Abb. 11J und O).
Im Gegensatz zum zentralen Nervensystem zeigten Untersuchungen an Gefrierschnitten von
Ischiasnerven des peripheren Nervensystems transgener Mäuse keine EGFP-Autofluoreszenz
(nicht gezeigte Daten). Der Grund hierfür ist, dass der verwendete MBP-Promotor die für die
MBP-Expression in den Schwannzellen des peripheren Nervensystems verantwortlichen
regulatorischen Elemente nicht enthält. Somit wird das MBP-Sox4-Transgen spezifisch in den
sich differenzierenden Oligodendrozyten des zentralen Nervensystems exprimiert.
In weiterführenden Experimenten sollte mittels immunhistochemischer Färbungen auf trans-
versalen Gefrierschnitten des postnatalen Rückenmarks der Stadien P3 (Abb. 12 A-H) und P7
(Abb. 12 I-P) die zelltypspezifische Expression des MBP-Sox4-Transgens aufgeklärt werden.
Dabei exprimierten EGFP-positive Zellen gleichzeitig den Oligodendrozyten-Marker Sox10
(Abb. 12A-D), wohingegen mit dem Astrozyten-Marker GFAP (Abb. 12 I-L) oder mit dem
pan-neuronalen-Marker NeuN (Abb. 12M-P) keine deutlich überlappende Expression gezeigt
werden konnte. Auch exprimierte am postnatalen Stadium P3 ein bestimmter Anteil EGFP-
positiver Zellen in der Marginalzone des frühen Rückenmarks das basische Myelinprotein
MBP (Abb. 12 E-H). Ähnliche Ergebnisse wurden ebenfalls auf transversalen Gefrierschnitten
des Vorderhirns erzielt (nicht gezeigte Daten). Auch hier konnten im Corpus callosum
Sox10/EGFP- bzw. MBP/EGFP-exprimierende Zellen detektiert werden. Anhand der defini-
tiven Ko-Expression EGFP-positiver Zellen mit Sox10 sowie mit dem basischen Myelin-
protein MBP am Postnataltag 3 wurde das MBP-Sox4-Transgen selektiv in den sich differen-
zierenden Oligodendrozyten nachgewiesen (Abb. 12D und H).
Ergebnisse
33
Abb. 12: Zelltypspezifische Expression des MBP-Sox4-Transgens. Auf transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks von MBP-Sox4-transgenen Tieren der Entwicklungsstadien P3 (A-H) und P7 (I-P) wurden immunhistochemische Färbungen mit Anti-körpern gegen EGFP (A, E, I und M) (alle in grün), Sox10 (Oligodendrozyten-Marker) (B), MBP (Myelin-Marker) (F), GFAP (Astrozyten-Marker) (J) und NeuN (pan-neuronaler-Marker) (N) (alle in rot) durchgeführt. Die beiden rechten vertikalen Bilderreihen zeigen die Überlagerungen EGFP-exprimierender Zellen jeweils mit den zelltypspezifischen Antikörpern Sox10 (C und D), MBP (G und H), GFAP (K und L) und NeuN (O und P). Ko-Expressionen sind als gelbes Signal gekenn-zeichnet. Der mit einem Rechteck markierte Bereich in C, G, K und O ist in D, H, L und P vergrößert dargestellt.
3.1.2.3 Analyse des Phänotyps MBP-Sox4-transgener Mäuse
Die Nachkommen der zwei MBP-Sox4-Founder-Weibchen entwickelten zu Beginn der
zweiten postnatalen Woche auffällige, unkontrollierte Zitterbewegungen. Diese Verhaltens-
weise erinnerte stark an den beschriebenen Phänotyp der shiverer-Maus, die Myelin-Defekte
im zentralen Nervensystem aufweist (Shen et al., 1985). Zusätzlich zeigten die MBP-Sox4-
transgenen Tiere eine Reihe dyskinetischer Reaktionen, wie krampfartige Anfälle mit
ausgeprägten Krümmungs- und Streckungs-Bewegungen des Rumpfes und der Gliedmaßen.
Der Schweregrad dieses Phänotyps verstärkte sich bis zum Ende der vierten postnatalen
Woche. Im weiteren Verlauf der Entwicklung erholten sich die MBP-Sox4-transgenen Tiere
sukzessiv von ihren Krankheitssymptomen, so dass sie im Alter von zwei Monaten nicht mehr
von den Wildtyp-Geschwistertieren zu unterscheiden waren. Im Hinblick auf die zelltyp-
Ergebnisse
34
spezifische Expression des MBP-Sox4-Transgens in den sich terminal differenzierenden
Oligodendrozyten und aufgrund des sichtbaren Phänotyps der Mausmutanten wurden schwere
Myelinisierungsdefekte im zentralen Nervensystem vermutet. Daher sollte anhand von In situ
Hybridisierungen mit spezifischen RNA-Sonden gegen MBP und PLP die Expression dieser
beiden Myelingene in der weißen Substanz des postnatalen Rückenmarks genau analysiert
werden (Abb. 13). Bereits am Postnataltag 1 waren in den MBP-Sox4-transgenen Mäusen die
MBP- und PLP-positiven Zellen in der Marginalzone des Rückenmarks im Vergleich zu den
Wildtyp-Tieren stark reduziert (Abb. 13B und D zu A und C). Diese reduzierte Menge an
Myelingen-Transkripten in den MBP-Sox4-transgenen Tieren konnte auch an den folgenden
Stadien P7, P14 und P29 beobachtet werden (Abb. 13E-P).
Abb. 13: Expression von MBP und PLP im Rückenmark MBP-Sox4-transgener Tiere. Auf transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks von Wildtyp (wt)- (A, C, E, G, I, K, M und O) sowie MBP-Sox4-transgenen (tg)-Tieren (B, D, F, H, J, L, N und P) der Stadien P1 (A-D), P7 (E-H), P14 (I-L) und P29 (M-P) wurden In situ Hybridisierungen mit DIG-markierten cRNA-Sonden gegen MBP (A, B, E, F, I, J, M und N) bzw. PLP (C, D, G, H, K, L, O und P) durchgeführt.
Ergebnisse
35
Dennoch nahm die MBP- bzw. PLP-Expression im Rückenmark während der postnatalen
Entwicklung mit zunehmendem Alter der MBP-Sox4 Tiere stetig zu (Abb. 13 F, H, J, L, N
und P). Die Anzahl der MBP- bzw. PLP-exprimierenden Zellen in den transgenen Tieren war
im Vergleich zu derjenigen in den Wildtyp-Geschwistertieren geringer (Abb. 13F, H, J, L, N,
und P zu E, G, I, K, M und O). Der Unterschied in der Expression beider Myelingene
zwischen den Sox4-transgenen Tieren und den Wildtyp-Mäusen war an späteren
Entwicklungsstadien wie P29 kleiner als an den früh postnatalen Zeitpunkten P7 und P14.
Der Nachweis der Myelinisierung auf Proteinebene mittels immunhistochemischer Färbungen
mit Antikörpern gegen MBP führte zu ähnlichen Ergebnissen (Abb. 14). Auch in diesem Fall
war die Zahl MBP-positiver Zellen in der Marginalzone des transgenen Rückenmarks
verglichen mit der Anzahl in den Wildtyp-Geschwistertieren schon am Postnataltag 1
reduziert (Abb. 14A und F). An den späteren postnatalen Entwicklungsstadien nahm die Zahl
MBP-exprimierender Zellen unabhängig vom jeweiligen Genotyp stark zu, so dass einzelne
MBP-positive Zellen nicht mehr voneinander unterschieden werden konnten (Abb. 14B-E und
G-J). Vielmehr war die MBP-Protein-Expression in der weißen Rückenmarkssubstanz von
Wildtyp- und MBP-Sox4-transgenen Tieren flächendeckend. Dabei war an den beiden
Stadien P7 und P14 der MBP-positive Bereich in der Marginalzone des transgenen Rücken-
marks, verglichen mit den analogen Regionen in den Wildtyp-Mäusen, wesentlich schmaler
und die Signalstärke der MBP-positiven Zellen war deutlich unregelmäßiger (Abb. 14B und C
zu G und H).
Abb. 14: Expression des MBP-Proteins im Rückenmark transgener Tiere. Auf transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks von MBP-Sox4-transgenen (tg)- (A-E) und Wildtyp (wt)-Tieren (F-J) wurden an den Postnataltagen 1 (A und F), 7 (B und G), 14 (C und H) und 29 (D und I) sowie nach vier Monaten (4 Mo) (E und J) immunhistochemische Färbungen mit Antikörpern gegen MBP durchgeführt.
Ergebnisse
36
Am Postnataltag 29 war der Unterschied in der MBP-Expression zwischen den transgenen-
und Wildtyp-Tieren weniger offensichtlich (Abb. 14D und I) und in den adulten, vier Monate
alten MBP-Sox4 Tieren kaum mehr erkennbar (Abb. 14E und J). Somit zeigten MBP und PLP
In situ Hybridisierungen sowie immunhistochemische Färbungen gegen MBP, dass die redu-
zierte Myelingenexpression im Rückenmark MBP-Sox4-transgener Tiere eine verminderte
MBP-Protein-Expression zur Folge hatte.
Aufgrund der geringeren Myelinprotein-Produktion in den MBP-Sox4-transgenen Mäusen
wurden zunächst Veränderungen in der Oligodendrozyten-Population vermutet. Daher sollten
Färbungen mit Antikörpern gegen den Oligodendrozyten spezifischen Marker Sox10 auf
postnatalen transgenen Rückenmarksschnitten der Stadien P1, P7 und P14 durchgeführt und
die Anzahl der Sox10-positiven Zellen bestimmt werden. Die erhaltenen Resultate lieferten
allerdings keine wesentlichen numerischen Veränderungen der analysierten Zell-Population
im Vergleich zu den Wildtyp-Geschwistertieren (Abb. 15A). Somit schien die Oligodendro-
zyten-Population im Rückenmark beider Genotypen weitgehend konstant zu bleiben.
Daneben zeigten auch Proliferationsstudien mit den Markern Ki67 oder PCNA keine
deutliche Veränderung der Zahl proliferierender Oligodendrozyten im Rückenmark von
transgenen Tieren der Entwicklungsstadien P1, P7 und P14 (Abb. 15B und nicht gezeigte
Daten). Weiterhin wurden in den transgenen Mäusen keine Ko-Expressionen der EGFP-
positiven Zellen mit den beiden Proliferationsmarkern Ki67 bzw. PCNA nachgewiesen, was
auf eine postmitotische, oligodendrogliale Expression des Sox4-Transgens hinweist.
Abb. 15: Oligodendrogliale Parameter im Rückenmark MBP-Sox4-transgener Tiere. (A) Die Anzahl der Sox10-positiven Zellen wurde in den Rückenmarkshälften von Wildtyp (wt)- und MBP-Sox4-transgenen (tg)-Tieren an den Postnatalstadien P1, P7 und P14 bestimmt. (B) Berechnung des prozentualen Anteils der Sox10 und Ki67 ko-exprimierenden Zellen an der Gesamtzahl Sox10-positiver Zellen im Rückenmark von Wildtyp (wt)- und MBP-Sox4-transgenen (tg)-Mäusen der Stadien P1, P7 und P14 ± Standardabweichung.
Ergebnisse
37
Die reduzierte Zahl MBP- und PLP-exprimierender Zellen könnte auch auf eine erhöhte Rate
apoptotischer Zellen hinweisen. Dies würde möglicherweise mit einer Zunahme an aktivierter
Mikroglia einhergehen. Tatsächlich wurden morphologisch veränderte mikrogliale Zellen
zusammen mit EGFP-exprimierenden Oligodendrozyten in der weißen Substanz transgener
Kleinhirne detektiert (Abb. 16A und B zu C und D). Dennoch konnte die zu erwartende er-
höhte Apoptoserate in den Bereichen aktivierter Mikroglia mittels TUNEL- und Caspase-3-
Experimenten nicht bestätigt werden (nicht gezeigte Daten). Insgesamt zeigte die Analyse der
oligodendroglialen und mikroglialen Parameter neben den bisher beobachteten Myelinisie-
rungsdefekten im zentralen Nervensystem der Sox4-transgenen Mäuse, dass die MBP-Sox4-
exprimierenden, oligodendroglialen Zellen in einem postmitotischen, prämyelinisierenden
Entwicklungszustand arretiert werden und nicht zu myelinisierenden Oligodendrozyten
differenzieren.
Abb. 16: Mikrogliale Parameter im Kleinhirn MBP-Sox4-transgener Tiere. Immunhistochemische Färbungen mit Antikörpern gegen den mikroglialen Marker Iba-1 und EGFP-Autofluoreszenz auf transversalen Gefrierschnitten von MBP-Sox4-transgenen (tg)- (A und B) und Wildtyp (wt)- (C und D) Kleinhirnen am Postnataltag 7. Der mit einem Rechteck markierte Bereich in A und C ist in B und D vergrößert dargestellt.
Ergebnisse
38
Ebenso wie im Rückenmark wurde auch in zwei weiteren Bereichen des zentralen Nerven-
systems, der bereits angesprochenen weißen Substanz des Kleinhirns und im Corpus callosum
des Vorderhirns, eine Reduktion der Myelinproteine in den transgenen Mäusen im Vergleich
zu den Wildtyp-Tieren nachgewiesen (Abb. 17). Im Gegensatz zu der wesentlich früheren
MBP-Protein-Expression in der Marginalzone des Rückenmarks an P1 treten im Klein- und
Vorderhirn erste Myelinisierungsprozesse am Postnataltag 7 auf. Daher wurde an den beiden
Entwicklungsstadien P7 und P14 in den MBP-Sox4-transgenen Fasertrakten des Gehirns
gegenüber den Wildtyp-Tieren erstmals eine verminderte MBP-Expression offensichtlich
(Abb. 17A-H). Auch konnte in den untersuchten Gehirn-Regionen der MBP-Sox4-transgenen
Tiere für die spät-postnatalen und adulten Stadien (P29 und 4 Mo) eine reduzierte Menge an
MBP-positiven Zellen bestätigt werden (Abb. 17I, K, M und O). Im Vergleich zu der eher
homogenen MBP-Expression im Corpus callosum von Wildtyp-Gehirnen am Entwicklungs-
zeitpunkt P29, wurden in den transgenen Tieren immer noch einzelne MBP-exprimierende
Zellen detektiert (Abb. 17L zu K).
Abb. 17: Expression des MBP-Proteins in den Transgen-exprimierenden Gehirn-Regionen. Auf sagittalen Kleinhirn- sowie transversalen Corpus callosum-Gefrierschnitten von MBP-Sox4-transgenen (tg)- (A, C, E, G, I, K, M und O) und Wildtyp (wt)-Tieren (B, D, F, H, J, L, N und P) an den Postnataltagen 7 (A-D), 14 (E-H), 29 (I-L) und nach vier Monaten (4 Mo) (M-P) wurden immun-histochemische Färbungen mit Antikörpern gegen MBP durchgeführt.
Ergebnisse
39
Ferner zeigte ein vier Monate alter Corpus callosum in MBP-Sox4-transgenen Mäusen ein
deutlich schwächeres MBP-Signal und eine wesentlich schmalere Gesamtbreite des Faser-
trakts im Vergleich zu den Wildtyp-Tieren (Abb. 17O zu P). Die reduzierte und verzögerte
Expression der beiden Myelingene MBP und PLP könnte Abnormalitäten in der Myelin-
struktur zur Folge haben. Daher wurden zunächst auf Rückenmarksschnitten MBP-Sox4-
transgener Tiere an verschiedenen postnatalen Entwicklungsstadien (P7, P14, P29 und 4 Mo)
PPD (Para-Phenylendiamin)-Färbungen durchgeführt (Abb. 18). Das Ziel dieser Unter-
suchungen war es, einen genaueren Einblick in die Myelinisierung der Axone in der weißen
Substanz des Rückenmarks von transgenen Mäusen und Wildtyp-Tieren zu erhalten. Augen-
scheinlich war an P7, P14 und P29 die Anzahl myelinisierter Axone in der Marginalzone des
Rückenmarks MBP-Sox4-transgener Tiere stark reduziert (Abb. 18A, B und C) und die
Myelinschicht deutlich dünner ausgeprägt als im Rückenmark der Wildtyp-Geschwistertiere
(Abb. 18A-C zu E-G). Lediglich im adulten transgenen Rückenmark wurde eine zu Wildtyp-
Mäusen vergleichbare Anzahl und Verteilung myelinisierter Axone sowie eine ähnliche
Schichtdicke der Myelinscheiden beobachtet (Abb. 18D zu H). Der Grund für die Regenera-
tion der Myelinschicht zu diesem späten Stadium ist der Verlust der transgenen Sox4-Ex-
pression in den Oligodendrozyten, bedingt durch die aufgehobene MBP-Promotor-Aktivität.
Abb. 18: Myeliniserung der Axone im Rückenmark MBP-Sox4-trangener Tiere. Auf transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks von MBP-Sox4-transgenen (tg)- (A-D) und Wildtyp (wt)-Tieren (E-H) an den Postnataltagen 7 (A und E), 14 (B und F), 29 (C und G) und nach vier Monaten (4 Mo) (D und H) wurden PPD (Para-Phenylendiamin)-Färbungen durchgeführt, um die Myelinscheiden um die Axone darzustellen.
Ergebnisse
40
Abschließend konnte durch elektronenmikroskopische (EM) Aufnahmen die Myelin-
Ultrastruktur in der Marginalzone des Rückenmarks transgener Tiere an den postnatalen
Stadien P14 und P29 genauer analysiert werden (Abb. 19). Mit dieser Methode konnte die
Hypomyelinisierung transgener Axone als Ergebnis der PPD-Färbung bestätigt werden.
Abb. 19: Die Myelin-Ultrastruktur im Rückenmark MBP -Sox4-transgener Tiere. Elekronenmikroskopische Aufnahmen von ultradünnen (50 nm) transversalen Rückenmarksschnitten MBP-Sox4-transgener (tg)- und Wildtyp (wt)-Tiere an den Postnatalstadien P14 (A und B) und P29 (C und D). Die Balkenlänge in A entspricht 1 µm.
Durch die Berechnung der g-Ratio myelinisierter Axone in den in Abb. 19 gezeigten EM-
Abbildungen ließ sich der Unterschied in der Stärke der Myelinschicht bei Axonen des
Rückenmarks von MBP-Sox4- und Wildtyp-Tieren quantifizieren (Abb. 20A und B). Die g-
Ratio wird durch das Verhältnis zwischen dem eigentlichen Durchmesser der Axone zu dem
Durchmesser der Axone inklusive ihrer Myelinschicht bestimmt. Somit liegen die Werte der
g-Ratio zwischen null und eins, wobei Axone mit dicker Myelinschicht die niedrigsten Werte
aufweisen. An den beiden untersuchten postnatalen Entwicklungsstadien P14 und P29
verlagerte sich die durchschnittliche g-Ratio von niedrigen Werten in den Wildtyp-Tieren
(P14: 0,79 ± 0.06 und P29: 0,76 ± 0,07) hin zu einem hohen Wert (0,93 ± 0,04) in den
transgenen Tieren. Die Statistiken der analysierten Stadien und Genotypen zeigten, dass die
Axone mit einer durchschnittlich höheren g-Ratio, also mit dünnen Myelinscheiden,
bevorzugt in der weißen Substanz des Rückenmarks MBP-Sox4-transgener Tiere vorkamen.
Dagegen waren die Axone mit niedriger g-Ratio ausschließlich in den Wildtyp-Tieren
anzutreffen (Abb. 20A und B). Dabei war das Ausmaß der Hypomyelinisierung unabhängig
vom jeweiligen Durchmesser der betroffenen Axone (Abb. 20C und D).
Ergebnisse
41
Abb. 20: Die g-Ratio im Rückenmark MBP-Sox4-transgener Tiere. Die Statistiken (A und B) zeigen den prozentualen Anteil von Axonen mit einer g-Ratio von 1,0 bis 0,55 für die Entwicklungsstadien P14 (A) bzw. P29 (B) sowie für Wildtyp (wt) und Transgenen (tg) Genotyp. Dagegen geben die Scatter-Blots (C und D) die g-Ratio als Funktion des entsprechenden Axon-Durchmessers an. Dabei sind sowohl kleine als auch große Axone gleichermaßen von der Hypomyelinisierung betroffen. In Zusammenarbeit mit C. Griffel und A.N. Garratt (MDC für Molekulare Medizin, Berlin).
Ergebnisse
42
3.2 Funktionelle Analyse der SoxC-Proteine im sympa-
thischen Nervensystem der Maus
Neben der im ersten Teil der Arbeit aufgezeigten reprimierenden Wirkung der Sox4-
Expression auf die Differenzierung sich entwickelnder Oligodendrozyten wurde in ähnlichen
Studien der negative Einfluss von Sox4 auf die Differenzierung von Radialgliazellen und
Astrozyten des zentralen Nervensystems bestätigt (Hoser et al., 2007). Dagegen konnte die
Arbeitsgruppe um Jonas Muhr durch Elektroporationsstudien von Sox4 und Sox11 in das
Neuralrohr des Huhns vorzeitige Differenzierungsprozesse in den neuronalen Vorläuferzellen
induzieren (Bergsland et al., 2006). Somit wurde nachgewiesen, dass die SoxC-Proteine
während der Entwicklung des zentralen Nervensystems sowohl eine aktivierende als auch
reprimierende Funktion auf die Differenzierung neuronaler bzw. glialer Zellen ausüben.
Ob Sox4 und Sox11 neben ihrer Rolle als Differenzierungsfaktoren im zentralen
Nervensystem eine ähnliche Funktion in den Zellen des sich entwickelnden sympathischen
Nervensystems übernehmen, sollte im zweiten Teil der Arbeit untersucht werden. Potenziell
auftretende Kompensationseffekte zwischen Sox4 und Sox11, bedingt durch ihre Ko-
Expression in den sympathischen Ganglien (Hoser et al., 2008), sollten durch die
gleichzeitige Deletion beider Gene ausgeschlossen werden. Dafür wurden Sox4/Sox11-
doppelt-defiziente Tiere mit einer konstitutiven Deletion des Sox11-Gens im gesamten
Organismus und einer spezifischen Sox4-Deletion in den sympathoadrenalen Vorläuferzellen
des sich entwickelnden sympathischen Nervensystems generiert. Es besteht allerdings die
Möglichkeit, dass Sox12 als dritter Transkriptionsfaktor der Gruppe C der Sox-Proteine
aufgrund seiner stark überlappenden Expression mit Sox4 und Sox11 zur funktionellen
Kompensation in den sich entwickelnden sympathischen Ganglien beiträgt. Die bisherigen
Analysen zur Funktion von Sox12 sprechen aber im Vergleich zu Sox4 und Sox11 für einen
geringeren Einfluss dieses Faktors auf die Entwicklung neuraler Gewebe (Hoser et al., 2008).
Ergebnisse
43
3.2.1 Expression von Sox4 und Sox11 im sympathischen
Nervensystem
Um den Zeitraum der Expression von Sox4 und Sox11 in den sich entwickelnden
sympathischen Ganglien zu analysieren, wurden zunächst immunhistochemische Färbungen
mit Antikörpern gegen Sox4 und Sox11 auf Gefrierschnitten von murinen Wildtyp-
Embryonen an den Stadien 11,5 dpc bis 18,5 dpc durchgeführt (Abb. 21). Dabei ließ sich am
Embryonaltag 11,5 nur in 15% aller Zellen des Ganglions ein schwach positives Sox4-Signal
nachweisen (Abb. 21A und I). Im Gegensatz dazu wurde an diesem frühen Zeitpunkt der
Transkriptionsfaktor Sox11 bereits wesentlich stärker und nahezu in der Hälfte (46%) aller
Zellen in den sympathischen Ganglien exprimiert (Abb. 21E und I). Am Embryonalstadium
12,5 nahmen sowohl die Signalstärke als auch die Zahl der Sox4-exprimierenden Zellen
deutlich zu (Abb. 21B) und beide Parameter erreichten an 14.5 dpc ihr Maximum (Abb. 21C).
Abb. 21: Expression von Sox4 und Sox11 in den sympathischen Ganglien. Auf transversalen Gefrierschnitten aus dem Herzbereich von murinen Wildtyp-Embryonen der Entwicklungsstadien 11,5 dpc (A und E), 12,5 dpc (B und F), 14,5 dpc (C und G) und 18,5 dpc (D und H) wurden immunhistochemische Färbungen mit Antikörpern gegen Sox4 (A-D) und Sox11 (E-H) durchgeführt. Die mit einem weiß umrandeten Rechteck markierten Bereiche an 12,5 dpc und 14,5 dpc zeigen Vergrößerungen sympathischer Zellen von Sox11+/lacZ-Embryonen, die mit Antikörpern gegen Sox4 (in rot) und β-Gal (in grün) gefärbt wurden. Die Ko-Expression beider Marker ist als gelbes Signal dargestellt. (I) Die Statistik zeigt die Anzahl Sox4- (weißer Balken) und Sox11- (schwarzer Balken) positiver Zellen in den sympathischen Ganglien von Wildtyp-Embryonen am Stadium 11,5 dpc relativ zu der Gesamtzahl Dapi-positiver Zellkerne.
Ergebnisse
44
Zu diesem Zeitpunkt ging aber die Signalstärke und damit die Proteinmenge des
Transkriptionsfaktors Sox11 in den Zellen der sympathischen Ganglien zurück (Abb. 21G)
und an dem spät-embryonalen Stadium 18,5 dpc wurden nur noch wenige Sox11-positive
Zellen detektiert (Abb. 21H). Im Vergleich dazu konnte zu diesem Zeitpunkt der Entwicklung
eine deutliche Anzahl Sox4-exprimierender Zellen in den Ganglien beobachtet werden (Abb.
21D). Dagegen wurden in den adulten Ganglien weder Sox4- noch Sox11-positive Zellen
nachgewiesen (nicht gezeigte Daten).
Aufgrund des sich stark überlappenden Expressionsprofils der SoxC-Proteine in den
sympathischen Ganglien stellte sich nun die Frage, ob beide Faktoren in unterschiedlichen
Zell-Populationen oder in denselben Zellen exprimiert werden. Da für Sox4 und Sox11 nur
Antikörper aus der gleichen Spezies zur Verfügung standen, konnten die folgenden Ko-
Expressionsstudien nicht auf Wildtyp-Embryonen durchgeführt werden. Daher wurden
transversale Gefrierschnitten von Sox11+/lacZ-Embryonen herangezogen, in denen ein Sox11-
Allel durch das lacZ-Gen ersetzt wurde. Diese Tiere entwickeln keinen von Wildtyp-Tieren
abweichenden Phänotyp und konnten somit für die folgenden Untersuchungen verwendet
werden (Sock et al., 2004). Als äquivalenter Marker für die Sox11-Expression in den
sympathischen Ganglien der Sox11+/lacZ-Embryonen wurde ein Antikörper gegen β-Galacto-
sidase (β-Gal) verwendet, der an den beiden analysierten embryonalen Stadien 12,5 dpc und
14,5 dpc eine ausgeprägte Ko-Lokalisation mit dem Antikörper gegen Sox4 aufwies (Abb. 21
weiß umrandete Rechtecke zwischen B und F sowie C und G). Am Entwicklungszeitpunkt
12,5 dpc exprimierten nahezu alle β-Gal-positiven Zellen im sympathischen Ganglion Sox4
(Abb. 21 weiß umrandetes Rechteck zwischen B und F), wohingegen an 14,5 dpc ein Großteil
der Sox4-exprimierenden Zellen zusätzlich für den Marker β-Gal positiv waren (Abb. 21 weiß
umrandetes Rechteck zwischen C und G). Durch In situ Hybridisierungen mit DIG-markierten
cRNA-Sonden gegen Sox4 und Sox11 wurden auch auf mRNA-Ebene ähnliche Ergebnisse
im Expressionsprofil beider SoxC-Transkriptionsfaktoren erzielt (nicht gezeigte Daten). An
dem früh-embryonalen Stadium 12,5 dpc konnte eine im Vergleich zu Sox4 vermehrte
Expression an Sox11-Transkripten in den Zellen der sympathischen Ganglien nachgewiesen
werden, die zum späteren Stadium 18,5 dpc im Verhältnis zur Sox4-Genexpression erniedrigt
war. Eine vergleichbare Expressionsstärke zeigten beide SoxC-Gene nur am Embryonaltag
14,5. Neben der in Abb. 21 gezeigten Expression der beiden SoxC-Transkriptionsfaktoren in
den sympathischen Ganglien von Wildtyp-Mausembryonen wurden in Zusammenarbeit mit
der Arbeitsgruppe von H. Rohrer (MPI, Frankfurt) Sox4- und Sox11-Transkripte auch in den
Ergebnisse
45
sympathischen Ganglien von Hühner-Embryonen detektiert. Die beiden Transkriptions-
faktoren konnten nach Beginn der Phox2b-Expression und vor dem Expressionsstart der
noradrenergen Differenzierungsmarker TH und SCG10 in den sympathischen Ganglien
detektiert werden. Die Expression beider SoxC-Gene überlappt zeitlich gesehen mit der von
Gata2 und setzt kurz nach der von Hand2 ein (Tsarovina et al., 2004 und nicht gezeigte
Daten). Die Expression von Sox4 und Sox11 wurde während der gesamten Beobachtungs-
phase bis hin zum Embryonaltag zehn (E10) nachgewiesen.
Die Analyse von Sox4 und Sox11 in den sich entwickelnden Ganglien von Maus und Huhn
ergab ein leicht unterschiedliches Expressionsprofil der beiden Transkriptionsfaktoren in den
untersuchten Organismen. In der Maus ist die Expression von Sox11 an den früh-
embryonalen Stadien im Vergleich zu derjenigen von Sox4 stärker ausgeprägt (Abb. 21E und
F zu A und B), wobei zu den späteren Entwicklungsphasen die Expression von Sox11 im
Verhältnis zu Sox4 schneller abnimmt (Abb. 21G und H zu C und D). Im Gegensatz dazu sind
in den sich entwickelnden sympathischen Ganglien des Huhns die Expressionsstärken von
Sox11 und Sox4 miteinander vergleichbar.
3.2.2 Zelltypspezifische Expression von Sox4 und Sox11
In den sympathischen Ganglien befinden sich zu bestimmten Entwicklungszeitpunkten
verschiedene Zelltypen, die aufgrund der Expression spezifischer Gene voneinander unter-
schieden werden können. Der HMG-Transkriptionsfaktor Sox10 wird sowohl in undifferen-
zierten Neuralleistenzellen als auch in Gliazellen exprimiert (Britsch et al., 2001; Kim et al.,
2003; Reiprich et al., 2008). Spezifizierte sympathoadrenale Vorläuferzellen exprimieren den
Transkriptionsfaktor Phox2b und differenzierende katecholaminerge Neurone sind durch die
Expression des Enzyms Tyrosinhydroxylase (TH) charakterisiert. Um herauszufinden, in
welchen Zellen die beiden Faktoren Sox4 und Sox11 in den sympathischen Ganglien ex-
primiert werden, wurden immunhistochemische Färbungen mit spezifischen Antikörpern auf
transversalen Gefrierschnitten verschiedener Embryonalstadien von Wildtyp-Mäusen durch-
geführt (Abb. 22). Dabei konnte zu keinem Zeitpunkt der Entwicklung des sympathischen
Nervensystems eine überlappende Expression zwischen dem Transkriptionsfaktor Sox10 und
Sox4 oder Sox11 festgestellt werden (Abb. 22A, F und nicht gezeigte Daten).
Ergebnisse
46
Abb. 22: Zelltypspezifische Expression von Sox4 und Sox11. Auf transversalen Gefrierschnitten aus dem Herzbereich von Wildtyp-Embryonen der Entwicklungs-stadien 12,5 dpc (A-C und F-H) und 14,5 dpc (D, E, I und J) wurden immunhistochemische Färbungen durchgeführt. Dabei verwendete Antikörper waren Sox4 (A-E) und Sox11 (F-J) (beide in grün), die mit Antikörpern gegen Sox10 (A und F) (Marker für Glia und Neuralleistenzellen), Phox2b (B, D, G und I) (Marker für sympathoadrenale Vorläufer) und TH (C, E, H und J) (noradrenerger neuronaler Marker) (alle in rot) kombiniert wurden. Ko-Expressionen sind als gelbes Signal erkennbar.
Somit sind weder die Stammzellen der Neuralleiste noch die gliale Zell-Population die vor-
wiegenden Expressionsorte von Sox4 und Sox11. Dagegen wiesen beide Transkriptions-
faktoren an den untersuchten Entwicklungsstadien 12,5 dpc und 14,5 dpc ein deutlich
überlappendes Expressionssignal mit dem Homeodomänen-Faktor Phox2b auf (Abb. 22B, D,
G und I). Ebenso konnten an beiden Entwicklungszeitpunkten Ko-Expressionen der SoxC-
Proteine mit dem Enzym TH nachgewiesen werden, das unreife sowie reife sympathische
Neurone charakterisiert (Abb. 22C, E, H und J). Dennoch exprimierte ein bestimmter Anteil
sympathoadrenaler Zellen ausschließlich den katecholaminergen Differenzierungsmarker TH
(Abb. 22C und E). Im Laufe der Entwicklung sympathischer Ganglien nahm die Zahl der
Zellen, die nur TH, aber nicht Sox4 oder Sox11 exprimierten, zu. Bei diesen Zellen handelt es
sich vermutlich um reifende noradrenerge Neurone (nicht gezeigte Daten). Während diesem
Prozess scheint die Expression der Faktoren der Gruppe C herunterreguliert zu werden.
Ergebnisse
47
3.2.3 Induktion der Sox4-Expression durch den Faktor Sox11
Aufgrund des deutlich überlappenden Expressionsmusters der beiden Sox-Proteine der
Gruppe C (siehe Abb. 21) in den sympathoadrenalen Vorläufern sympathischer Ganglien
könnte sowohl Sox4 als auch Sox11 die Expression des jeweils anderen Transkriptionsfaktors
beeinflussen. Zur Überprüfung einer gegenseitigen Regulation der SoxC-Proteine wurden die
folgenden Experimente an Mausembryonen mit einer Deletion des Sox4 oder des Sox11 Gens
durchgeführt. Die Deletion von Sox11 (Sox11lacZ/lacZ) war konstitutiv im gesamten Embryo,
wobei das Sox11-Gen durch das Marker-Gen lacZ ersetzt wurde. Die Deletion von Sox4
wurde mit Hilfe des Cre-loxP-Systems spezifisch in den sympathoadrenergen Zellen erreicht
(Sox4loxP/loxP). Um zu gewährleisten, dass Sox4 nur in den Zellen des sympathischen
Nervensystems ausgeschaltet ist, wurde das DBH::Cre-Transgen verwendet (Parlato et al.,
2007). Unter der Kontrolle des Promotors des Dopamin-β-Hydroxylase Gens (DBH) wird die
Expression der Cre-Rekombinase bereits an früh-embryonalen Zeitpunkten aktiviert und
demzufolge wird Sox4 in den zukünftigen noradrenergen und adrenergen Neuronen des
zentralen sowie peripheren Nervensystems deletiert. Durch immunhistochemische Färbungen
mit Antikörpern gegen Sox4 konnte auf transversalen Schnitten von Sox4loxP/loxP, DBH::Cre-
Mäusen (im Folgenden als Sox4∆/∆ bezeichnet) der Stadien 12,5 dpc und 14,5 dpc die
spezifische Sox4-Deletion in den sympathischen Ganglien nachgewiesen werden (Abb. 23A
und B). Trotz der fehlenden Sox4-Expression in den sympathoadrenalen Zellen der
analysierten Ganglien, wurden keine Unterschiede in der Sox11-Expression festgestellt (Abb.
23C und D zu Abb. 21 F und G). Ferner konnte weder ein direkter Einfluss von Sox4 auf die
Sox11 exprimierenden Zellen noch eine verstärkte Expression von Sox11 in Abwesenheit von
Sox4 beobachtet werden. Dies führte zu der Annahme, dass der Transkriptionsfaktor Sox4 zu
den analysierten Zeitpunkten der frühen Embryonalentwicklung für die Sox11-Expression in
den sympathischen Ganglien keine Rolle spielt. Dagegen wurden am Embryonaltag 12,5 dpc
in den Sox11-defizienten sympathischen Ganglien keine Sox4-positiven Zellen detektiert
(Abb. 23E). Dies steht im Gegensatz zu den Ergebnissen bei Wildtyp-Geschwistertieren, wo
Sox4 bereits an 11,5 dpc detektiert wurde (Abb. 21A). Erst drei Tage später, an 14,5 dpc,
konnten schließlich wenige Sox4-positive Zellen in den Sox11-defizienten sympathischen
Ganglien nachgewiesen werden (Abb. 23F).
Ergebnisse
48
Abb. 23: Expression von Sox4 und Sox11 in SoxC-defizienten sympathischen Ganglien. Auf transversalen Gefrierschnitten aus dem Herzbereich von Sox4∆/∆- (A-D) und Sox11lacZ/lacZ- (E-H) Embryonen der Entwicklungsstadien 12,5 dpc (A, C, E und G) sowie 14,5 dpc (B, D, F und H) wurden immunhistochemische Färbungen mit Antikörpern gegen Sox4 (A, B, E und F) und Sox11 (C, D, G und H) durchgeführt. Die sympathischen Ganglien wurden mit Antikörpern gegen TH detektiert und mit einer weißen Linie umrandet.
Dabei ließ die Lokalisierung der Sox4-positiven Zellen am äußeren Rand der Sox11-
defizienten Ganglien auf den Einfluss bestimmter Umgebungssignale schließen, die an der
Sox4-Induktion beteiligt sein könnten (Abb. 23F). Allerdings normalisierte sich an den späten
Stadien der Embryonalentwicklung die Sox4-Expression in den Sox11-defizienten Ganglien
und war mit derjenigen in Wildtyp-Embryonen vergleichbar (nicht gezeigte Daten). Dieses
Expressionsmuster deutete auf eine zeitlich begrenzte zellintrinsische Induktion der Sox4-
Expression durch den Faktor Sox11 während der frühen Entwicklung des sympathischen
Nervensystems hin.
Ergebnisse
49
3.2.4 Analyse des sympathoadrenalen Phänotyps SoxC-defizienter
Tiere
In den nun folgenden Untersuchungen sollten neue Erkenntnisse hinsichtlich der
funktionellen Rolle der SoxC-Proteine im sympathischen Nervensystem erzielt werden. Unter
3.2.3 konnte bereits gezeigt werden, dass die Sox11-Expression in Sox4-defizienten
sympathischen Ganglien unverändert war und dass umgekehrt die Sox4-Expression in Sox11-
defizienten Ganglien nach verzögerter Induktion ein normales Niveau erreichen konnte (siehe
Abb. 23C, D und E, F). In den Sox4∆/∆-Einzelmutanten liegt also in einem dem Wildtyp
entsprechenden Zeitraum der Embryonalentwicklung das Protein Sox11 und in den
Sox11lacZ/lacZ-Embryonen ab dem Zeitpunkt 14,5 dpc der Faktor Sox4 in den sympathischen
Ganglien vor. Diese Ergebnisse und die hohe Übereinstimmung der biochemischen
Eigenschaften, sprechen für potenziell kompensatorische Effekte zwischen den
Transkriptionsfaktoren Sox4 und Sox11 während der Entwicklung sympathischer Ganglien.
Daher sollten neben den Sox4∆/∆- und den Sox11lacZ/lacZ-Einzelmutanten ebenso SoxC-
doppelt-defiziente Tiere (Sox4∆/∆, Sox11lacZ/lacZ; auch als dko bezeichnet) in die Analyse der
sympathischen Ganglien mit aufgenommen werden.
3.2.4.1 Untersuchung der Gangliengröße in SoxC-defizienten Tieren
Der augenscheinlichste Phänotyp der SoxC einfach- sowie doppelt-defizienten Mäuse im
Vergleich zu Wildtyp-Tieren war die reduzierte Gangliengröße, die durch immunhisto-
chemische Färbungen mit Antikörpern gegen TH dargestellt werden konnte (Abb. 24). Bereits
am Embryonaltag 11,5 wurden im Herzbereich der Sox11lacZ/lacZ- und der dko-Tiere auffällig
kleine sympathische Ganglien beobachtet (Abb. 24 C und D zu A). Zu diesem Zeitpunkt
entsprach die Fläche der TH-positiven Zellen in den Sox11- bzw. doppelt-defizienten Tieren
ungefähr einem Drittel verglichen mit der Ganglien-Fläche in den Wildtyp-Mäusen (Abb.
25A). Der nahezu identische Phänotyp in Tieren dieser Genotypen kann vermutlich dadurch
erklärt werden, dass Sox11 an 11,5 dpc der vorherrschende Faktor ist und die Sox4-
Expression an den frühen Entwicklungszeitpunkten von Sox11 abhängig ist (siehe Abb. 21E
und Abb. 23E). Daher ist in der Summe die Expression der SoxC-Proteine an 11,5 dpc in
Ergebnisse
50
Sox11lacZ/lacZ- und doppelt-defizienten Embryonen vergleichbar niedrig. Dagegen waren die
sympathischen Ganglien an 11,5 dpc in den Sox4∆/∆-Tieren nur geringfügig kleiner als die
entsprechenden Ganglien der Wildtyp-Tiere (Abb. 24B zu A). Mit zunehmender Sox4-
Expression in den sympathischen Ganglien der Wildtyp-Mäuse am Embryonaltag 14,5 (Abb.
21C) wurde auch die Auswirkung der Sox4-Deletion auf die Gangliengröße in den Sox4∆/∆-
Tieren deutlicher (Abb. 24E zu F). Denn zu diesem Entwicklungszeitpunkt entsprach die
Größe der Sox4-defizienten Ganglien nur noch 75% derjenigen von Wildtyp-Tieren (Abb.
25A). Im Vergleich zum Wildtyp ist die Größe der Ganglien in Sox11lacZ/lacZ- und dko-
Embryonen an 14,5 dpc auf weniger als die Hälfte reduziert (Abb. 24G und H zu E sowie Abb.
25A). Im weiteren Verlauf der Entwicklung nahm die Größe der sympathischen Ganglien in
den doppelt-defizienten Mäusen noch weiter ab, so dass sie an 18,5 dpc nur noch ein Viertel
der Größe in den Wildtyp-Tieren umfassten (Abb. 24L zu I sowie Abb. 25A).
Abb. 24: Die Größe sympathischer Ganglien in SoxC-defizienten Tieren. Auf transversalen Gefrierschnitten aus dem Herzbereich von Wildtyp (wt)- (A, E und I), Sox4∆/∆- (B, F, und J), Sox11lacZ/lacZ- (C, G und K) und Sox4∆/∆, Sox11lacZ/lacZ (dko)- (D, H und L) Embryonen der Entwicklungsstadien 11,5 dpc (A-D), 14,5 dpc (E-H) und 18,5 dpc (I-L) wurden immunhisto-chemische Färbungen mit Antikörpern gegen TH durchgeführt.
Ergebnisse
51
Die Größe der Ganglien in den Sox11lacz/lacz-Tieren nahm im Laufe der Entwicklung des
sympathischen Nervensystems zu und erreichte an 18,5 dpc nahezu den Umfang der Wildtyp-
Ganglien (Abb. 24K zu I sowie Abb. 25 A). Demgegenüber waren die sympathischen Ganglien
in den Sox4∆/∆-Tieren in dieser spät-embryonalen Entwicklungsphase stark reduziert (Abb.
24J zu I). Sie wiesen keine Größenzunahme zwischen 14,5 dpc und 18,5 dpc auf (Abb. 24F zu
J) und ihre Ganglienfläche entsprach ungefähr zwei Dritteln derjenigen in den Wildtyp-Tieren
(Abb. 25A). Der sichtbare Größenunterschied der sympathischen Ganglien in den SoxC-
defizienten Tieren ging auch einher mit Veränderungen der Zellzahl im Ganglion (Abb. 25B).
Im Vergleich zu den Wildtyp-Tieren war die Anzahl an Dapi-positiven Zellen in den Sox11-
sowie doppelt-defizienten Ganglien bereits am Entwicklungsstadium 11,5 dpc reduziert,
während die Sox4∆/∆-Tiere erst am Embryonaltag 14,5 betroffen waren. Entsprechend der
Regeneration der Gangliengröße in den Sox11lacZ/lacZ-Mäusen an 18,5 dpc normalisierte sich
auch die Zellzahl der sympathischen Ganglien (Abb. 25B). Übereinstimmend mit der
reduzierten Fläche TH-positiver Zellen am Entwicklungszeitpunkt 18,5 dpc in den Sox4-
sowie doppelt-defizienten sympathischen Ganglien war auch die Anzahl Dapi-positiver
Zellen an diesem Stadium geringer (Abb. 25A und B).
Abb. 25: Analyse der Fläche und Zellzahl SoxC-defizienter sympathischer Ganglien. (A) Der Mittelwert der TH-positiven Fläche sympathischer Ganglien wurde in den Wildtyp (wt)-, Sox4∆/∆-, Sox11lacZ/lacZ- und dko-Embryonen an den Embryonaltagen 11,5 (weiße Balken), 14,5 (graue Balken) und 18,5 (schwarze Balken) quantifiziert. Die relativen Werte der Ganglienflächen ver-schiedener Genotypen sowie Stadien wurden in Relation zur Größe der Wildtyp-Ganglien an 18,5 dpc bestimmt, deren Mittelwert auf 100% gesetzt wurde. Für alle Gangliengrößen konnten bezogen auf die Wildtyp-Ganglien an 18,5 dpc, mit Ausnahme der Sox11lacZ/lacZ-Ganglien an diesem Stadium, statistisch signifikante Unterschiede ermittelt werden (p<0,001). (B) Der Mittelwert der Gesamt-zellzahl sympathischer Ganglien verschiedener Genotypen und Stadien wurde durch Quanti-fizierungen der Dapi-positiven Kerne bestimmt. Mit dem Students t-Test konnten für alle Ganglien bezogen auf die Wildtyp-Ganglien gleichen Alters mit Ausnahme der Sox4∆/∆-Ganglien an 11,5 dpc und 14,5 dpc sowie der Sox11lacZ/lacZ-Ganglien an 18,5 dpc statistisch signifikante Unterschiede gezeigt werden (p<0,001). Daten in (A) und (B) sind als Mittelwerte ± Standardfehler dargestellt.
Ergebnisse
52
Somit beeinflussen die SoxC-Transkriptionsfaktoren, in Abhängigkeit von ihrem
Expressionsmaximum, zu unterschiedlichen Zeitpunkten die Entwicklung der sympathischen
Ganglien. An den früh-embryonalen Stadien übernimmt der Faktor Sox11 eine entscheidende
Rolle in der Ganglien-Entwicklung, während Sox4 an spät-embryonalen Zeitpunkten zum
Tragen kommt.
3.2.4.2 Untersuchung der Differenzierung sympathischer Neurone in SoxC-
defizienten Tieren
Neben einer reduzierten Gangliengröße in den Sox4-, Sox11- und doppelt-defizienten Mäusen
zu unterschiedlichen embryonalen Entwicklungszeitpunkten sollte nun im Folgenden die
Bedeutung von Sox4 und Sox11 bezüglich der Differenzierung sympathischer Neurone
genauer analysiert werden. Die Daten aus dem ersten Teil dieser Arbeit sowie frühere in vivo
bzw. in vitro Studien konnten zeigen, dass Sox4 und Sox11 sowohl neuronale als auch gliale
Differenzierungsprozesse im zentralen Nervensystem beeinflussen (Bergsland et al., 2006;
Hoser et al., 2007). Nina Tsarovina vom MPI in Frankfurt konnte nach Überexpression von
Sox4 und Sox11 in Primärkulturen von Spinalganglien fünf Tage alter Hühnchen-Embryonen
Hinweise auf eine vermehrte neuronale, nicht aber noradrenerge Zell-Differenzierung erhal-
ten. Mittels Immunhistochemie wurde für die mit den Sox4- und Sox11-Expressionsplasmi-
den transfizierten Zellen eine deutliche Zunahme in der Expression der pan-neuronalen
Marker Tuj1 und HuC/D im Vergleich zur GFP-Transfektionskontrolle detektiert. Diese
Ergebnisse konnten durch Quantifizierungen bestätigt werden, wobei die beiden Marker Tuj1
und HuC/D in 60-70% der Sox4- bzw. Sox11-transfizierten Zellen erhöht waren gegenüber
den GFP-transfizierten Zellen. Allerdings konnte keine erhöhte Expression des noradrenergen
Markers TH in den Sox4- oder Sox11-transfizierten Zellen dorsaler Wurzelganglien nach-
gewiesen werden. Demzufolge konnte für die beiden Sox-Proteine der Gruppe C kein Effekt
auf die Induktion der noradrenergen Differenzierung sympathischer Neurone erzielt werden,
wohl aber auf die Expression neuronaler Marker. Die Ergebnisse der in vitro Transfektions-
experimente von Nina Tsarovina wurden auch in vivo bestätigt. In Hühnchen-Embryonen
wurden Neuralleistenzellen kurz nach ihrer Auswanderung am Embryonaltag zwei (E2) auf
Schulter-Ebene mit RCAS-Viren, die entweder Sox4 oder Sox11 exprimierten, infiziert. Trotz
erfolgreicher Sox4- bzw. Sox11-Infektionsraten wurden jedoch in den neuen Untersuchungen
Ergebnisse
53
nur wenige TH- oder SCG10-positive Zellen entlang des Brachialnervs detektiert. Dennoch
wurde weder in vitro noch in vivo eine vermehrte Induktion noradrenerger Differenzierungs-
marker durch die Überexpression von Sox4 oder Sox11 ausgelöst.
Zur Überprüfung dieser Ergebnisse wurde in der Maus zunächst die Expression verschiedener
Transkriptionsfaktoren, die nachweislich zum frühen regulatorischen Netzwerk der noradre-
nergen Differenzierung gehören (Goridis & Rohrer, 2002), in den sympathischen Ganglien
von SoxC doppelt-defizienten Tieren analysiert. An den Entwicklungsstadien 11,5 dpc und
14,5 dpc wurde mittels In situ Hybridisierungen sowie durch immunhistochemische
Färbungen die spezifische Expression von Mash1, Gata3, Hand2 und Insm1 in den
sympathischen Ganglien der Sox4∆/∆, Sox11lacZ/lacZ-Tiere nachgewiesen (Abb. 26). Insofern ist
die Expression wichtiger Regulatoren der noradrenergen Differenzierung in den sym-
pathischen Ganglien der doppelt-defizienten Tiere intakt.
Abb. 26: Expression noradrenerger Marker in den sympathischen Ganglien SoxC-defizienter Tiere. Auf transversalen Gefrierschnitten aus dem Herzbereich von Wildtyp (wt)- (A, C, E, G, I, K, M und O), und Sox4∆/∆, Sox11lacZ/lacZ (dko)-Embryonen (B, D, F, H, J, L, N und P) am Embryonal-tag 11,5 und 14,5 wurden sowohl In situ Hybridisierungen mit spezifischen DIG-markierten cRNA-Sonden gegen Mash1 (A-D), Gata3 (E-H) und Hand2 (I-L) als auch immunhistochemische Färbungen mit Antikörpern gegen Insm1 (M-P) durchgeführt. Die mit einem grau umrandeten Rechteck markierten Bereiche in A und B zeigen In situ Hybridisierungen mit spezifischen DIG-markierten cRNA-Sonden gegen Mash1 an 12,5 dpc.
Ergebnisse
54
Im Folgenden sollte nun die Expression verschiedener Transkriptionsfaktoren, die in der
noradrenergen Differenzierung eine Rolle spielen, im Detail analysiert werden. Für die
Untersuchung wurden Sox4 sowie Sox11 einfach- und doppelt-defiziente Tiere an den
Entwicklungsstadien 11,5 dpc und 14,5 dpc verwendet (Abb. 27 und nicht gezeigte Daten).
Anhand immunhistochemischer Färbungen mit Antikörpern gegen Phox2b, Phox2a und TH
auf transversalen Gewebsschnitten aus dem Herzbereich von Tieren verschiedener Genotypen
konnte gezeigt werden, dass alle analysierten Marker in den sympathischen Ganglien SoxC-
defizienter Mäuse an beiden Zeitpunkten exprimiert wurden (Abb. 27A-L und nicht gezeigte
Daten). Dabei kennzeichnen Phox2b und Phox2a sympathoadrenale Vorläufer, wohingegen
der katecholaminerge Marker TH differenzierende, noradrenerge Neurone charakterisiert.
Ferner wurde auch der Faktor Tuj1, der panneuronale Differenzierung anzeigt, in den
Ganglien aller verwendeten Genotypen an 11,5 dpc und 14,5 dpc nachgewiesen (Abb. 27M-P
und nicht gezeigte Daten).
Im Vergleich zu den Wildtyp-Ganglien war die Anzahl der Phox2b-, Phox2a-, TH- und Tuj1-
exprimierenden Zellen in den sympathischen Ganglien der drei SoxC-defizienten Genotypen
an den analysierten Embryonaltagen 11,5 und 14,5 reduziert. Die Abnahme der noradrenergen
Marker schien sich proportional zur jeweiligen reduzierten Größe und Gesamtzellzahl der
Ganglien entsprechender mutanter Tiere zu verhalten (vergl. Abb. 27Q und R mit Abb. 25B).
In den sympathischen Ganglien der Sox4∆/∆, Sox11lacZ/lacZ-defizienten Mäuse wurde an den
Entwicklungsstadien 11,5 dpc, 14,5 dpc und 18,5 dpc im Verhältnis zu den Wildtyp-Ganglien
eine reduzierte Zahl der Phox2b- und TH-exprimierenden Zellen festgestellt. Dabei war die
Relation der TH- zu den Phox2b-positiven Zellen, mit Werten im Bereich von 0,8 bis 1,1 in
den doppelt-defizienten sympathischen Ganglien mit derjenigen in den Wildtyp-Ganglien
vergleichbar (Abb. 27Q und R).
Dagegen war die Situation in den sympathischen Ganglien der Sox4∆/∆-Embryonen weitaus
schwerer zu fassen. Am Embryonaltag 11,5 blieb das Verhältnis der TH- zu den Phox2b-
positiven Zellen in den mutanten Ganglien im Vergleich zu demjenigen in den Wildtyp-
Tieren nahezu unverändert. Im Gegensatz dazu waren am Entwicklungszeitpunkt 14,5 dpc die
TH-exprimierenden Zellen stark reduziert, so dass das Verhältnis zur Phox2b-Zellzahl einen
Wert von 0,6 ergab. Am letztmöglichen analysierbaren Embryonalstadium 18,5 dpc entsprach
die Relation der TH- zu den Phox2b-exprimierenden Zellen in den sympathischen Ganglien
der Sox4∆/∆-Embryonen wieder der Situation in den Wildtyp-Mäusen gleichen Alters (Abb.
27Q und R). Infolgedessen deuteten diese Ergebnisse darauf hin, dass der Faktor Sox4 einen
Ergebnisse
55
potenziellen, aber transienten Einfluss auf die noradrenerge Differenzierung im Rahmen der
Entwicklung des sympathischen Nervensystems ausübt.
Daneben war in den Sox11lacZ/lacZ-Tieren am Embryonaltag 11,5 sowohl die Zahl der TH- als
auch der Phox2b-positiven Zellen in den sympathischen Ganglien im Vergleich zu den
Wildtyp-Tieren reduziert. Das Verhältnis von TH- zu Phox2b-exprimierenden Zellen ent-
sprach aber dem von den Wildtyp-Ganglien. Im weiteren Verlauf der Embryonalentwicklung
blieben die TH- und Phox2b-exprimierenden Zellen an 14,5 dpc in den Sox11-defizienten
sympathischen Ganglien reduziert. Im Vergleich zu der Situation in den Wildtyp-Ganglien
Abb. 27: Expression noradrenerger und neuronaler Marker in den sympathischen Ganglien SoxC-defizienter Tiere. (A-P) Immunhistochemische Färbungen mit Antikörpern gegen Phox2b (A-D), Phox2a (E-H), TH (I-L) und Tuj1 (M-P) auf transversalen Gefrierschnitten aus der Herzregion von Wildtyp (wt)- (A, E, I und M) , Sox4∆/∆- (B, F, J und N), Sox11lacZ/lacZ- (C, G, K und O) und Sox4∆/∆, Sox11lacZ/lacZ (dko)- (D, H, L und P) Tieren am Embryonaltag 14,5. (Q-S) Darstellung der absoluten Zahlen Phox2b- (Q), TH- (R) und Sox10- (S) positiver Zellen in den sympathischen Ganglien von Wildtyp (wt)-, Sox4∆/∆-, Sox11lacZ/lacZ- und Sox4∆/∆, Sox11lacZ/lacZ (dko)-Tieren an den Stadien 11,5 dpc (weiße Balken), 14,5 dpc (graue Balken) und 18,5 dpc (schwarze Balken). Dabei konnten mit dem Students t-Test statistisch signifikante Unterschiede für die reduzierte Zahl an Phox2b- und TH-positiven Zellen in den mutanten Ganglien relativ zu der Zellzahl in den gleichaltrigen Wildtyp-Ganglien ermittelt werden (p<0,001). Die Menge Sox10-positiver Zellen in den sympathischen Ganglien aller Genotypen war miteinander vergleichbar (S). Die Pfeilspitzen in (R) markieren signifikant abweichende Werte der TH- zu den Phox2b-positiven Zellen in den sympathischen Ganglien der mutanten Genotypen bezogen auf die Wildtyp-Werte. Die Daten in (Q-S) sind als Mittelwerte ± Standardfehler dargestellt.
Ergebnisse
56
nahm am Embryonaltag 14,5 das Verhältnis der TH- zu Phox2b-exprimierenden Zellen in den
Ganglien der Sox11lacZ/lacZ-Tiere auf den Wert von 0,6 ab, bedingt durch die geringe Zahl TH-
positiver Zellen. Trotz der Zunahme an Phox2b-positiven Zellen am Embryonaltag 18,5 blieb
die Zahl der TH-exprimierenden Zellen sowie das Verhältnis der TH- zu den Phox2b-
positiven Zellen mit einem Wert von 0,5 signifikant kleiner als in den Wildtyp-Mäusen (Abb.
27Q und R). Die Quantifizierungen der Gesamtzellzahl (Abb. 25B), der TH-positiven Fläche
(Abb. 25A) und der Anzahl der Phox2b-exprimierenden Zellen (Abb. 27Q) in den sym-
pathischen Ganglien von Sox11lacZ/lacZ-Embryonen am Entwicklungszeitpunkt 18,5 dpc
zeigten eine Annäherung der Zellzahl sowie der Gangliengröße an die der Wildtyp-Tiere.
Dabei charakterisieren die Phox2b-positiven, aber TH-negativen Zellen in den sympathischen
Ganglien Sox11-defizienter Tiere Vorläuferzellen, die sich noch nicht im Reifungsprozess zu
sympathischen Neuronen befinden. Aufgrund der Überrepräsentation Phox2b-exprimierender
Zellen sowie der deutlich geringeren Anzahl TH-positiver Zellen in Sox4- und Sox11-Einzel-
mutanten an den Embryonalstadien 14,5 dpc und 18,5 dpc konnte eine vorübergehende
Verzögerung der Entwicklung des sympathischen Nervensystems beobachtet werden. Ferner
wurde in vorangegangenen Experimenten nachgewiesen, dass die Sox10-exprimierenden
Zellen in den sympathischen Ganglien weder für Sox4 noch für Sox11 positiv waren (siehe
Abb. 22). Somit wurden im Vergleich zu den Wildtyp-Tieren in den Ganglien der drei
mutanten Genotypen zu den analysierten Embryonalstadien 11,5 dpc, 14,5 dpc und 18,5 dpc
keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl Sox10-exprimierender Zellen gemessen (Abb.
27S). Dies bestätigte die Annahme, dass die Entwicklung der Neuralleisten- und Gliazellen
des sympathischen Nervensystems beim Fehlen von Sox4 und Sox11 nicht gestört ist.
Die Daten der in Abb. 27 gezeigten immunhistochemischen Färbungen sowie die Ergebnisse
der in vitro bzw. in vivo Transfektionsstudien im Huhn zeigten, dass die SoxC-Proteine
Einfluss auf die Differenzierung der sympathoadrenalen Zellen zu sympathischen Neuronen
nehmen. Dennoch scheinen die beiden Faktoren Sox4 und Sox11 im sympathischen Nerven-
system nicht die gleichen Funktionen auszuüben wie in den sich differenzierenden Neuronen
und glialen Zellen des zentralen Nervensystems (Bergsland et al., 2006; Hoser et al., 2007;
Potzner et al., 2007).
Ergebnisse
57
3.2.4.3 Untersuchung der Proliferation im sympathischen Nervensystem
SoxC-defizienter Tiere
Die reduzierte Gangliengröße in den einfach sowie doppelt SoxC-defizienten Tieren könnte
durch den Einfluss der Transkriptionsfaktoren Sox4 und Sox11 auf die Proliferation in den
sympathischen Ganglien erklärt werden. Daher sollte der Anteil an aktiv proliferierenden
Zellen über den Einbau des Thymidin-Analogons BrdU innerhalb eines Zeitraums von einer
Stunde in die DNA sich teilender Zellen bestimmt werden. Die folgende Analyse der sympa-
thischen Ganglien von Wildtyp- sowie SoxC-defizienten Mäusen wurde zu den embryonalen
Zeitpunkten 11,5 dpc bis 16,5 dpc durchgeführt. Entsprechend den Daten aus der Literatur
konnte nach Verabreichung des Nucleosid-Analogons eine deutliche Menge BrdU-markierter
Zellen in den Ganglien der Wildtyp-Tiere an den analysierten Embryonalstadien detektiert
werden mit einer maximalen Anzahl BrdU-positiver Zellen an 14,5 dpc (Abb. 28A-F und Abb.
29A). Als Folge davon nahm die Größe der Ganglien von 11,5 dpc bis 18,5 dpc zu (siehe Abb.
24A, E und I). Dennoch verringerte sich während dieser Entwicklungsphase die
Proliferationsrate, die durch die Anzahl BrdU-positiver Zellen in Relation zu der
Gesamtzellzahl in den sympathischen Ganglien der Wildtyp-Tiere bestimmt wird (Abb. 29B).
Abb. 28: Proliferation in den sympathischen Ganglien SoxC-defizienter Tiere. Immunhistochemische Färbungen mit Antikörpern gegen BrdU (A-L) (in grün), Sox10 (A, C, E, G, I und K) und TH (B, D, F, H, J und L) (beide in rot) auf transversalen Gefrierschnitten aus dem Herzbereich von Wildtyp (wt)- (A-F) und Sox4∆/∆, Sox11lacZ/lacZ (dko)- (G-L) Embryonen der Entwicklungsstadien 11,5 dpc (A, B, G und H), 12,5 dpc (C, D, I und J) sowie 14,5 dpc (E, F, K und L) . Die Ko-Expressionen von BrdU mit Sox10 oder TH sind als gelbes Signal dargestellt und die sympathischen Ganglien in A und K wurden mit einer weißen Linie umrandet.
Ergebnisse
58
Ferner exprimierte die Mehrheit an BrdU-positiven Zellen den noradreneregen Marker TH
(Abb. 28B, D und F) und nur vereinzelte Sox10-exprimierende Zellen waren zusätzlich für
BrdU positiv (Abb. 28A, C und E). Diese Beobachtungen führten zu der Annahme, dass
während der Entwicklung des sympathischen Nervensystems der überwiegende Anteil
proliferierender Zellen in den Wildtyp-Ganglien unreife sympathische Neurone sind. Im
Vergleich zu den am Embryonaltag 11,5 zahlreich vorhandenen proliferierenden Zellen in den
sympathischen Ganglien der Wildtyp-Tiere konnte in den Ganglien der doppelt-defizienten
Mäuse nahezu keine proliferierende Zelle nachgewiesen werden (Abb. 28G, H und Abb. 29A).
Verglichen mit den Werten der Wildtyp-Ganglien waren zu diesem Zeitpunkt sowohl die
absoluten Zahlen BrdU-positiver Zellen als auch die relativen Proliferationsraten in den
Ganglien doppelt-defizienter Tiere stark reduziert (Abb. 29A und B). Erst am Entwicklungs-
stadium 12,5 dpc konnten die ersten proliferierenden Zellen in den sympathischen Ganglien
der Sox4∆/∆, Sox11lacZ/lacZ-defizienten Tiere beobachtet werden (Abb. 28I und J). Dagegen
näherten sich am Entwicklungsstadium 14,5 dpc die absoluten Zahlen BrdU-positiver Zellen
in den sympathischen Ganglien der doppelt-defizienten Tiere den Werten in den Wildtyp-
Tieren an (Abb. 28K, L zu E, F und Abb. 29A). Im Vergleich zu den Wildtyp-Ganglien wurde
daher an 14,5 dpc in den kleinen Ganglien der Sox4∆/∆, Sox11lacZ/lacZ-defizienten Tiere eine
erhöhte Proliferationsrate bestimmt (Abb. 29B). Auch am Embryonaltag 16,5 konnten mehr
proliferierende Zellen in den Ganglien doppelt-defizienter Tiere nachgewiesen werden als in
den Wildtyp-Tieren entsprechenden Alters (Abb. 29A und B).
Abb. 29: Bestimmung der Proliferation in den sympathischen Ganglien SoxC-defizienter Tiere. Darstellung der absoluten Zahlen BrdU-positiver Zellen (A) sowie Bestimmung der relativen prozentualen Proliferationsrate (B) bezogen auf die Gesamtzellzahl in den sympathischen Ganglien von Wildtyp (wt)-, Sox4∆/∆-, Sox11lacZ/lacZ- bzw. (Sox11-/-) und Sox4∆/∆, Sox11lacZ/lacZ (dko)-Embryonen an den Entwicklungsstadien 11,5 dpc (weiße Balken), 14,5 dpc (graue Balken) sowie 16,5 dpc (schwarze Balken). Für jeden Genotyp und für jedes Alter wurden mindestens 12 Schnitte ausgezählt.
Ergebnisse
59
Wie bereits für die sympathischen Wildtyp-Ganglien gezeigt werden konnte (Abb. 28B, D und
F), sind auch die proliferierenden Zellen in den Ganglien der Sox4∆/∆, Sox11lacZ/lacZ-
Neben den sympathischen Ganglien der SoxC doppelt-defizienten Tiere wurden auch
Proliferations-Analysen für Sox4 bzw. Sox11 einfach-defiziente Mäuse miteinbezogen. Dabei
waren in den sympathischen Ganglien der Sox4∆/∆-Tiere die Anzahl der BrdU-positiven
Zellen sowie die Bestimmungen ihrer relativen Proliferationsrate mit den Werten in den
Wildtyp-Ganglien vergleichbar (Abb. 29A und B). Demgegenüber wurde in den sym-
pathischen Ganglien der Sox11lacZ/lacZ-defizienten Embryonen, ähnlich wie in den SoxC-
doppelt-defizienten Tieren am Embryonaltag 11,5 nahezu keine BrdU-positive Zelle
detektiert (Abb. 29A). Entsprechend den Ergebnissen in den sympathischen Ganglien der
Sox4∆/∆, Sox11lacZ/lacZ-Tiere wurden auch in den Sox11-defizienten Ganglien verglichen mit
den Wildtyp-Ganglien an den beiden Stadien 14,5 dpc sowie 16,5 dpc hohe Proliferations-
raten nachgewiesen (Abb. 29B).
Die Daten aus den Proliferationsstudien zeigten, dass das Fehlen des Transkriptionsfaktors
Sox11 an den früh-embryonalen Stadien negativ auf die Proliferationsfähigkeit sympatho-
adrenaler Zellen wirkt. Dadurch könnte die in der Entwicklung auftretende reduzierte
Gangliengröße der Sox11lacZ/lacZ- sowie der Sox4∆/∆, Sox11lacZ/lacZ-Tiere zu diesen frühen
Zeitpunkten erklärt werden. An den spät-embryonalen Stadien nahm dagegen die Pro-
liferation in den sympathischen Ganglien SoxC-defizienter Mäuse wieder zu.
3.2.4.4 Untersuchung der Apoptose im sympathischen Nervensystem SoxC-
defizienter Tiere
Trotz der zunehmenden Zahl an BrdU-positiven Zellen in den sympathischen Ganglien der
doppelt-defizienten Tiere an den spät-embryonalen Stadien (Abb. 29) blieben die Ganglien zu
diesen Entwicklungszeitpunkten auffallend klein (Abb. 24L und nicht gezeigte Daten). Um
eine Erklärung für diese Beobachtung zu finden, sollte im Folgenden nun die Zahl der
apoptotischen Zellen in diesem Gewebe genauer analysiert werden. In apoptotischen Zellen
spalten Endonukleasen die DNA in spezifische Fragmente, die mittels enzymatischer End-
markierung durch die terminale Desoxynucleotidyltransferase detektiert werden können.
Ergebnisse
60
Die dabei verwendeten Nukleotide waren DIG markiert und konnten mit Hilfe eines anti-
DIG-Antikörpers nachgewiesen werden. Dieser sogenannte TUNEL-Assay wurde an den
Embryonaltagen 12,5, 14,5 und 16,5 auf transversalen Gefrierschnitten aus dem Herzbereich
SoxC-defizienter Tiere durchgeführt (Abb. 30 und nicht gezeigte Daten). An dem frühen
Embryonalstadium 12,5 dpc konnten sowohl in den Wildtyp-Ganglien als auch in den
Ganglien der doppelt-defizienten Tiere nur vereinzelte apoptotische Zellen detektiert werden
(nicht gezeigte Daten). Dagegen wurde vom Stadium 14,5 dpc an reproduzierbar eine
zunehmende Anzahl TUNEL-positiver Zellen in den SoxC-defizienten Ganglien detektiert
(Abb. 30). Die Quantifizierung apoptotischer Zellen in den sympathischen Ganglien
verschiedener Genotypen an den Entwicklungsstadien 14,5 dpc sowie 16,5 dpc zeigte eine
zwei bis vierfache Zunahme der Apoptoserate in den Sox4∆/∆- und den Sox4∆/∆, Sox11lacZ/lacZ-
Embryonen (Abb. 30). Demgegenüber war die Anzahl der TUNEL-positiven Zellen in den
Ganglien der Sox11lacZ/lacZ-Tiere mit derjenigen in den Wildtyp-Mäusen vergleichbar. Die
Apoptosestudien wiesen darauf hin, dass die Sox-Proteine der Gruppe C vom Entwicklungs-
zeitpunkt 14,5 dpc an auf die Überlebensrate sympathischer Neurone Einfluss nehmen
könnten. Ferner schien dieser Effekt hauptsächlich eine Funktion des Transkriptionsfaktors
Sox4 zu sein, der während der Entwicklung des sympathischen Nervensystems vorwiegend an
den spät-embryonalen Stadien in den Ganglien exprimiert wird (siehe Abb. 21).
Abb. 30: Bestimmung der Apoptose in sympathischen Ganglien SoxC-defizienter Tiere. Durch Quantifizierungen TUNEL-positiver Zellen wurde die relative prozentuale Apoptoserate, bezogen auf die Gesamtzellzahl in den sympathischen Ganglien von Wildtyp (wt)-, Sox4∆/∆-, Sox11lacZ/lacZ- bzw. (Sox11-/-) und Sox4∆/∆, Sox11lacZ/lacZ (dko)-Embryonen an den Entwicklungsstadien 14,5 dpc (graue Balken) und 16,5 dpc (schwarze Balken) bestimmt. Für jeden Genotyp sowie für jedes Alter wurden mindestens 12 Schnitte ausgezählt.
Ergebnisse
61
3.2.5 Auswirkung der SoxC-Protein-Defizienz im sympathischen
Nervensystem adulter Tiere
Im Vergleich zu den Wildtyp-Tieren ist die Größe der sympathischen Ganglien in Sox4∆/∆,
Sox11lacZ/lacZ-Embryonen zu den unterschiedlichen Entwicklungszeitpunkten stark reduziert.
Die Gründe hierfür sind zum einen das verlangsamte Wachstum der Ganglien während der
frühen Entwicklungsphase und zum anderen die erhöhte Apoptose an den spät-embryonalen
Stadien (siehe Abb. 28-30). Dennoch waren selbst zum Zeitpunkt der Geburt in den doppelt-
defizienten Mäusen die sympathischen Ganglien noch vorhanden (nicht gezeigte Daten).
Diese Tiere sind jedoch perinatal letal und sterben an schwerwiegenden Herzdefekten, die
durch die homozygote Deletion des Sox11-Gens entstehen (Sock et al., 2004). Daher konnte
in den Sox4∆/∆, Sox11lacZ/lacZ-Mäusen nicht gezeigt werden, ob die auftretenden embryonalen
Defekte des sympathischen Nervensystems vorübergehend oder persistierend sind und somit
zu möglichen funktionellen Auswirkungen in adulten Tieren führen könnten.
Zur Klärung dieser Frage wurden Sox11loxP/loxP-Mäuse mit Sox4loxP/loxP, DBH::Cre-Mäusen
gekreuzt, um Sox4∆/∆, Sox11∆/∆-Tiere zu generieren. In diesen Tieren sind beide SoxC-Gene
spezifisch nur in den sympathoadrenalen Zellen deletiert (auch als cdko bezeichnet). Die
Sox4∆/∆, Sox11∆/∆-Tiere waren lebensfähig und zeigten bereits ab der dritten postnatalen
Woche offensichtliche phänotypische Auffälligkeiten, die darin bestanden, dass die mutanten
Mäuse ihre Augen nicht vollständig öffnen konnten (Blepharoptosis) (Abb. 31A und B).
Dieser beim Menschen als Ptosis bezeichnete Phänotyp wird durch die fehlende Innervierung
des Musculus tarsalis, der im oberen Augenlid sitzt, hervorgerufen. Weitere Defekte des
sympathischen Nervensystems, die das Auge betreffen, werden in der Humanmedizin unter
dem Begriff Horner-Syndrom zusammengefasst. Durch immunhistochemische Färbungen mit
Antikörpern gegen den noradrenergen Marker TH konnte auf sagittalen Augenschnitten der
drei Monate alten Sox4∆/∆, Sox11∆/∆-Tiere die fehlende Innervierung des Musculus tarsalis
nachgewiesen werden (Abb. 31E zu H). Im Gegensatz zu den Wildtyp-Mäusen wurden im
Augenlid der mutanten Tiere weder die Tarsal-Drüsen (Meibom-Drüsen) (Abb. 31F zu I)
noch die kleinen Blutgefäße (Arteriolen) innerviert (Abb. 31G zu J). Das vollständige Fehlen
TH-positiver Zellen spricht für den Verlust der sympathischen Innervierung dieser
Zielgewebe. Übereinstimmend mit den Resultaten der TH-Immunhistochemie auf sagittalen
Augenschnitten von Sox4∆/∆, Sox11∆/∆-Mäusen wurden in diesen Tieren lediglich verküm-
merte Rudimente der oberen Hals- und Brustbein-Ganglien aufgefunden (Abb. 31C zu D).
Ergebnisse
62
Die Ergebnisse des Phänotyps adulter Mäuse mit spezifischen Deletionen der beiden SoxC-
Transkriptionsfaktoren in den sympathoadrenalen Zellen konnten zeigen, dass Sox4 und
Sox11 maßgeblich für die Entwicklung eines funktionellen sympathischen Nervensystems
benötigt werden.
Abb. 31: Phänotyp adulter Mäuse mit spezifischen Sox4- und Sox11-Deletionen im sympa-thischen Nervensystem. (A, B) Im adulten Stadium (hier drei Monate) zeigten die Sox4∆/∆, Sox11∆/∆(cdko)-Mäuse (B), eine Blepharoptosis, die bei Wildtyp (wt)-Geschwistertieren (A) nicht auftrat. (C, D) Im Vergleich zu den Wildtyp (wt)-Tieren war die Größe der oberen zervikalen Ganglien (C) sowie der Brustbeinganglien (D) in den Sox4∆/∆, Sox11∆/∆ (cdko)-Tieren stark reduziert. (E-J) Die sympathische Innervierung des Musculus tarsalis (E und H), der Meibom-Drüsen (F und I) und der Arteriolen (G und J) konnte mittels immunhistochemischer Färbungen mit Antikörpern gegen den noradrenergen Marker TH auf sagittalen Augenschnitten der Wildtyp (wt)-Mäuse (E, F und G) gezeigt werden. Dagegen wurden in den Sox4∆/∆, Sox11∆/∆ (cdko)-Tieren keine TH-positiven Signale beobachtet (H, I und J).
Diskussion
63
4 Diskussion
Die Entwicklung komplexer Organismen mit spezialisierten Organsystemen erfordert eine
kontrollierte sowie koordinierte Genexpression, um Genom-kodierte Informationen sowohl
zeitlich als auch räumlich genau geregelt abzurufen. An der Aktivierung bzw. Inaktivierung
ganzer Genombereiche sind sequenzspezifische Transkriptionsfaktoren beteiligt, die eine
wichtige Rolle bei der Spezifizierung und Differenzierung verschiedener Zelltypen über-
nehmen. Dazu gehört auch die Klasse der Sox-Proteine, von denen während der Embryonal-
entwicklung in nahezu jedem Gewebe mindestens ein Vertreter exprimiert wird (Wegner,
1999; Bowles et al., 2000; Lefebvre et al., 2007).
Die Sox-Proteine der Gruppe C, Sox4, Sox11 und Sox12, werden u.a. gemeinsam in verschie-
denen Zelltypen und Regionen des Säuger-Nervensystems exprimiert (Hoser et al., 2008).
Überexpressionsstudien deuten zudem darauf hin, dass sie wichtige transkriptionelle Regula-
toren neuronaler sowie glialer Entwicklungsprozesse sind (Bergsland et al., 2006; Hoser et al.,
2007). Dennoch konnten weder in Sox4- noch in Sox11-defizienten Mäusen Defekte im sich
entwickelnden Nervensystem nachgewiesen werden (Cheung et al., 2000; Sock et al., 2004).
Dies könnte für eine funktionelle Redundanz beider SoxC-Proteine sprechen. Daher wurde im
Rahmen dieser Arbeit die Bedeutung von Sox4 und Sox11 im sich entwickelnden Säuger-
Nervensystem mittels Überexpression und spezifischer Gendeletion analysiert.
4.1 Das MBP-Sox4-transgene Mausmodell
Im Hinblick auf die frühe Letalität der konstitutiven Sox4- bzw. Sox11-Einzelmutanten
(Schilham et al., 1996; Sock et al., 2004) kann die Funktion der SoxC-Proteine in neuralen
Geweben nur durch einen zeitgleichen sowie zelltyp- und gewebsspezifischen Verlust von
Sox4 und Sox11 aufgeklärt werden. Zu Beginn der Doktorarbeit standen jedoch konditionale
SoxC-Mausmutanten nicht zur Verfügung, die durch Expression der Cre-Rekombinase unter
spezifischen Promotoren die Deletion der SoxC-Gene im entstehenden Nervensystem
ermöglichen. Daher wurde zunächst der experimentelle Ansatz der Überexpression gewählt,
um die Bedeutung von Sox4 im zentralen Nervensystem zu untersuchen.
Diskussion
64
Normalerweise wird der Transkriptionsfaktor Sox4 in spezifizierten unreifen glialen Vor-
läuferzellen exprimiert und während der Differenzierung zu reifen Gliazellen in den post-
mitotischen glialen Zellen herunterreguliert (Kuhlbrodt et al., 1998a). Um die Funktion von
Sox4 für die Differenzierung der Oligodendrozyten aufzuklären, wurde in dieser Arbeit die
Expression von Sox4 durch das MBP-Promotor-Fragment in den ausreifenden myelinisie-
renden Oligodendrozyten im transgenen Mausmodell verlängert.
4.1.1 Expression des Sox4-Transgens in terminal differenzieren-
den Oligodendrozyten
Die Expression des Sox4-Transgens wird durch das MBP-Promotor-Fragment selektiv in den
differenzierenden oligodendroglialen Zellen angeschaltet. Frühere Studien konnten zeigen,
dass die Expression des MBP-Gens in den Oligodendrozyten bzw. den Schwannzellen über
verschiedene regulatorische Elemente des MBP-Promotors, abhängig vom Gewebe und
Entwicklungszeitpunkt, kontrolliert wird (Farhadi et al., 2003). Um die Expression des Sox4-
Transgens ausschließlich in den terminal differenzierenden Oligodendrozyten zu gewähr-
leisten, wurde ein 3,1 kb langes Fragment des MBP-Promotors verwendet, das keine
regulatorischen Elemente für die Expression des Sox4-Transgens in den Schwannzellen des
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