PROCESO DE LABORATORIO IN VITRO PARA EL DIAGNOSTICO DEL VIRUS DE LA NECROSIS PANCREATICA INFECCIOSA (IPNV) Becario: Arturo Morales López, Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas de la Universidad Autónoma de Guerrero, becario del programa AMC [email protected], Área II. Asesor-Investigador: Dr. César Ortega Santana, Responsable del área de Sanidad Acuícola en el Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal (CIESA) de la Universidad Autónoma del Estado de México, [email protected]. RESUMEN El virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) es el agente etiológico de una enfermedad sistemática aguda, altamente contagiosa, usualmente letal para peces salmónidos jóvenes. El virus tiene distribución mundial y provoca severas pérdidas; una forma de control y prevención es realizar su diagnóstico oportuno en granjas donde llevan a cabo cultivos de trucha arcoíris. En este trabajo se usaron “muestras ciegas” para el diagnóstico de IPNV utilizando células de cultivo de la línea RTG-2 (Rainbow trout gonad) y CHSE-214 (Chinook salmon embryo). El proceso inició con la toma y obtención de órganos para el diagnóstico viral (hígado, riñón y bazo), seguido de la preparación de placas de células para inoculación de las muestras biológicas, luego de la inoculación las muestras que presentaron efecto citopático (CEP)
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Diagnostico de IPNV Por Inmunofluorescencia Indirecta
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PROCESO DE LABORATORIO IN VITRO PARA EL DIAGNOSTICO DEL VIRUS DE LA NECROSIS PANCREATICA INFECCIOSA (IPNV)
Becario: Arturo Morales López, Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas de la Universidad Autónoma de Guerrero, becario del programa AMC [email protected], Área II.
Asesor-Investigador: Dr. César Ortega Santana, Responsable del área de Sanidad Acuícola en el Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal (CIESA) de la Universidad Autónoma del Estado de México, [email protected].
RESUMEN
El virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) es el agente etiológico de una
enfermedad sistemática aguda, altamente contagiosa, usualmente letal para peces salmónidos
jóvenes. El virus tiene distribución mundial y provoca severas pérdidas; una forma de control y
prevención es realizar su diagnóstico oportuno en granjas donde llevan a cabo cultivos de trucha
arcoíris. En este trabajo se usaron “muestras ciegas” para el diagnóstico de IPNV utilizando
células de cultivo de la línea RTG-2 (Rainbow trout gonad) y CHSE-214 (Chinook salmon
embryo). El proceso inició con la toma y obtención de órganos para el diagnóstico viral (hígado,
riñón y bazo), seguido de la preparación de placas de células para inoculación de las muestras
biológicas, luego de la inoculación las muestras que presentaron efecto citopático (CEP)
sugestivo de la presencia de IPNV fueron sometidas a la prueba de inmunofluorescencia indirecta
(IFAT). En la prueba de inmunofluorescencia indirecta, la muestra positiva debe presentar una
fluorescencia específica de color verde únicamente en el citoplasma de las células infectadas. El
proceso realizado en este estudio está basado en la recomendación de la Organización
Internacional de Salud Animal (OIE, 2006), considerada la “prueba de oro” para el diagnóstico
de IPNV y otros virus de peces, específicamente salmónidos, el cual es un proceso único en el
país e inclusive en Latinoamérica. En este trabajo, las líneas celulares (RTG-2 y CHSE-214)
anales y 19 radios caudales. Presenta una aleta adiposa, usualmente con borde negro. Tiene una
coloración azul a verde oliva sobre una banda rosada a lo largo de la línea lateral y plateada por
debajo de ella. El lomo, los costados, la cabeza y aletas están cubiertas con pequeños puntos
negros. La coloración varía con el hábitat, tamaño y condición sexual. Existe una tendencia de los
desovantes en corrientes a ser más oscuros con color más intenso, mientras que los desovantes de
lagos son más brillantes y más plateados. La ausencia de dientes hioideos es la característica que
más fácilmente permite distinguirla de Oncorhynchus clarki (FAO, 2006).
La trucha arco iris es nativa de las cuencas que drenan al Pacífico en Norte América. Las
pesquerías de trucha son mantenidas, o su cultivo es practicado, en las cuencas altiplánicas de
muchos países tropicales y sub-tropicales de Asia, este de África y Sudamérica. Como resultado,
se han desarrollado varios linajes o cepas locales domesticadas, mientras que otras han surgido a
través de selección masiva y entrecruzamiento para mejorar la calidad de los peces para cultivo.
Muchos países están reportando producción de trucha arco iris cultivada, de los cuales, algunos
tienen producción relativamente insignificante en comparación con la producción de los sistemas
más grandes que se localizan en los principales países productores en Europa, Norte América,
Chile, Japón y Australia (FAO, 2006).
La trucha arco iris es un pez resistente y fácil de desovar, de crecimiento rápido (3 a 4
años de vida), tolerante a una amplia gama de ambientes y manipulaciones. Es capaz de ocupar
muchos hábitats diferentes, que abarcan desde un ciclo de vida anádromo (que vive en el océano
pero desova en ríos y corrientes con fondos de grava, flujos rápidos y bien oxigenados) hasta
habitar de manera permanente en lagos. La especie puede soportar amplias gamas de variación de
temperatura (0-27 °C), pero el desove y crecimiento ocurren en una gama más estrecha (9-14 °C).
La selección de características superiores también se logra por entrecruzamiento, aumentando las
tasas de crecimiento, resistencia a las enfermedades, fecundidad y mejorando la calidad y sabor
de la carne. Las hembras no desovarán naturalmente en sistemas de cultivo; de modo que los
juveniles deben ser obtenidos ya sea por desove artificial en un partidero o por recolección de
huevos de poblaciones silvestres. Las larvas están bien desarrolladas al momento de la eclosión.
En la naturaleza, las truchas adultas se alimentan de insectos acuáticos y terrestres, moluscos,
crustáceos, huevos de peces y otros peces pequeños, pero el alimento más importante son los
camarones de agua dulce, que contienen los pigmentos carotenoides responsables del color
rosado-naranja en la carne. En acuicultura, la inclusión en los alimentos de los pigmentos
sintéticos astaxantina y cantaxantina causa que se produzca esta coloración rosada (FAO, 2006).
En base a lo previamente establecido, es importante diagnosticar el virus de la necrosis
pancreática (IPNV) en las granjas donde llevan a cabo los cultivos de trucha arcoíris como una
forma de control y prevención.
MATERIAL Y MÉTODO
El procedimiento de diagnóstico de la necrosis pancreática infecciosa (IPN) consiste en
pruebas de aislamiento del virus en cultivos celulares, seguido de la identificación inmunológica
(OIE, 2006).
Peces: Las muestras utilizadas fueron “muestras ciegas” previamente obtenidas con fines
académicos para el diagnóstico de IPNV; cabe mencionar que en el CIESA se reciben muestras
provenientes de distintos comités establecidos en el país (Querétaro, Michoacán, Guerrero,
Morelos, Hidalgo, Tlaxcala, Veracruz y del Estado de México) y público en general (Sinaloa,
Tabasco, Oaxaca, etc.). Los peces pertenecen a la especie Oncorhynchus mykiss (trucha arcoíris)
y los órganos que se utilizan para este diagnóstico es el hígado, riñón y bazo.
Control positivo: Cepa Mexicana de IPNV (VR-299) previamente obtenida (Ortega et al., 2002).
Línea celular: RTG-2 (Rainbow Trout Gonad), y CHSE-214 (Chinook Salmon Embryo) de la
especie Oncorhynchus tshawytscha.
Toma y obtención de órganos para diagnostico viral (OIE, 2006)
Sacrificar a los peces por un método humanitario dependiendo de su tamaño. Colocar los peces muertos o insensibilizados sobre una charola o sobre una toalla de papel.
Rociarlos con alcohol al 70%. Realizar grupos de 5 peces. Diseccionar a los peces y extraer asépticamente trozos de riñon, hígado y bazo en proporción 3:1:1 respectivamente hasta completar 1 g aproximadamente. Colocar los órganos en el tubo de plástico que contiene 9
ml de MEM (Medio Mínimo Esencial) al 2% de suero fetal bovino, quedando una disolución 1:10.
El contenido del tubo (el cual debe estar en un recipiente frio) se deposita en un mortero esteril y frio; después se regresa parte del medio al tubo.
En el mortero que contiene los órganos y parte del medio se adiciona arena de rio esteril, para macerar los órganos. La mezcla resultante se vacia nuevamente en el tubo de origen.
Se centrifugan los tubos de 3500 rpm durante 15 minutos a una temperatura de 4 °C. El sobrenadante obtenido se extrae con una jeringa y se hace pasar a través de un filtro esteril
con una membrana de 0.2 μm de diámetro. La mezcla filtrada se coloca en otro tubo estéril identificado y se coloca en refrigeración a 4 ± 3 °C, estando lista para ser inoculado.
Preparación de placas de células para inoculación viral (OIE, 2006)
Calcular el número de pozos que se requieren preparar y la cantidad necesaria de medio MEM 10% para las placas y la botella de cultivo celular.
Retira el MEM contenido en el frasco o botella con monocapa celular. Lavar las células adicionando a la botella 0.5 ml de tripsina, procurar que la solución recorra toda la superficie de la monocapa e inmediatamente retirarla. Repetir este procedimiento una vez más.
Adicionar 1 ml de tripsina a la botella con células, dejándola actuar durante 5 a 10 min, observando al microscopio cada minuto. Cuando las células se observan redondas, se golpea suavemente con la mano en un extremo de la botella para desprender las células. Una vez que las células se han despegado se adiciona 1.5 ml de MEM 10% para bloquear la actividad de la tripsina sobre las células, y se realiza un pipeteo suave sobre la pared de la botella para homogenizar el contenido de la botella. Acto seguido se adiciona la cantidad necesaria de medio MEM al 10% para completar el total de cultivo que se desea preparar.
Separar 20 ml de la suspensión de células para la botella de cultivo celular; el resto del medio se adiciona, según corresponda. En la placa de 24 pozos, colocar 1 ml ± 100 μl, sellar e identificar cada botella a una temperatura de 20 °C.
Inoculación de muestras biológicas (OIE, 2006)
En un tubo de plástico estéril se depositan 900 μl de MEM con 2% de suero fetal bovino y posteriormente se le adicionan 100 μl de muestra, quedando a una dilución 1:100. Agitar en vortex e identificar con el número de la muestra original.
INOCULACIÓN: Inicialmente, a cada pozo de la placa de cultivo se le retiran 900 μl del medio MEM, sin tocar el fondo para no dañar la monocapa de células. Acto seguido, se inoculan con 100 μl de cada muestra debidamente identificada en diluciones 1:10 y 1:100 por duplicado, sin tocar la monocapa celular. En la misma placa se dejan dos pozos sin inocular para usarse como control negativo y como control positivo también se inoculan dos pozos con 100 μl del virus de referencia.
La placa se sella con cinta aislante blanca para permitir la adsorción, se incuba durante 1 hora a 15 °C. Después de este tiempo, a cada pozo de la placa se adiciona 1 ml ± 100 μl de
MEM al 2% de suero fetal bovino. Las placas inoculadas son selladas con cinta aislante y se colocan en incubación para permitir la replicación viral a una temperatura de 15 °C por 7 dias; en este tiempo es necesario checar las placas cada 24 horas, buscando el efecto citopatico (ECP) causado por el virus citopatogénico a las células.
Inmunofluorescencia indirecta (IFAT; OIE, 2006).
Se debe preparar una placa de 6 pozos con anterioridad para esta prueba, en la cual se colocan en cada poco un cubreobjetos cubreobjetos (esto dependerá del número de muestras que hayan mostrado ECP) y se repite el procedimiento de inoculación.
Se espera a que se observe ECP en más del 50% de los pozos inoculados con las “muestras ciegas” y se procede a realizar la tinción.
TINCIÓN: Se deben extraer los cubreobjetos de los pozos de la placa de 6 pozos y dejarlos secar a temperatura ambiente con ayuda de la campana de flujo laminar.
Agregar acetona fría (-20 °C) hasta tapar el cubreobjetos y dejar secar (entre 15 a 30 min). Lavar los portaobjetos en un recipiente y agregar abundante solución de lavado previamente
diluida (1:25) y dejarlos reposar por 3 a 5 min. Repita este procedimiento 2 veces más. Remover los portaobjetos del recipiente y eliminar el exceso de solución evitando que el tejido se seque.
Agregar sobre cada portaobjetos 100 μl del reactivo oligoclonal, previamente diluido 1:100 con la solución de dilución e incubar los portaobjetos a temperatura ambiente por 30 min en una cámara humeda cerrada. Evitar que se seque la solución del anticuerpo.
Repetir el lavado con la solución de lavado. Agregar sobre cada portaobjetos 100 μl del conjugado-FITC, previamente diluido 1:100 con
la solución de dilución. Incube los portaobjetos a temperatura ambiente por 30 min en una cámara húmeda cerrada y en oscuridad.
Repetir el lavado con la solución de lavado y dejar secar en la oscuridad a temperatura ambiente.
Colocar una gota de resina para la fijación sobre el cubreobjetos evitando la formación de burbujas. Las muestras se deben de examinar en un microscopio de fluorescencia con un aumento de 1000x para realizar el diagnóstico.
RESULTADOS
Una muestra positiva en las placas debe presentar el efecto citopático (ECP) ocasionado
por IPNV. La presencia de IPNV ocasionara una desnaturalización en la monocapa formada por
las células, provocando que se redondeen y se desprendan de la pared de la placa (figura 1). Se
diagnostica una muestra negativa cuando las células, después de 7 días no muestran ECP y se
observa la monocapa sin ningún daño.
Figura 1: Células CHSE-214 mostrando ECP después de 4 días de haber sido inoculadas con las muestras ciegas.
En la prueba de inmunofluorescencia indirecta, una muestra positiva debe presentar una
fluorescencia específica de color verde del tejido. La presencia de IPNV aparece como una
fluorescencia verde difusa en el citoplasma de las células infectadas (figura 2). Se diagnostica una
muestra negativa por la ausencia de fluorescencia en las células o tejido.
Figura 2: Prueba de inmunofluorescencia indirecta en células RTG-2, mostrando la presencia de IPNV en el citoplasma.
DISCUSIÓN
Para el diagnóstico de IPNV, se llevó a cabo en base al protocolo recomendado por la OIE
(2006), en el cual se sigue un proceso ciertamente complicado y tardado debido a los multiples
pasos que se deben realizar con suma cautela y el tiempo que tardan las células en crecer y
mostrar el Efecto citopático (ECP), sin embargo, es considerado como la prueba irrefutable para
el diagnóstico del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) en peces, específicamente
salmónidos, y otras enfermedades virales con características particularmente parecidas. Cabe
mencionar que el trabajar con cultivo de células requieren de condiciones de laboratorio
especificas al igual que de equipo apto (esterilización y calibración). De igual manera, ambas
líneas celulares (RTG-2 y CHSE-214) mostraron ser aptas para la detección de IPNV.
Se usó el virus de referencia utilizado por el laboratorio, y de igual manera, se analizaron
“muestras ciegas” en las cuales se obtuvieron resultados positivos que contrastan lo observado en
el control positivo por lo cual indica que se está llevando un desequilibrio en las células ya que
IPNV induce muerte celular por represión del gen del factor de sobrevivencia Mcl-1 (moléculas
pro y antiapoptosis). Se sugiere que las proteínas virales podrían estar relacionadas de forma
directa o indirecta en este proceso; sin embargo, el mecanismo responsable aún no es claro. Al
parecer en la batalla virus-hospedero, la célula en un intento por contrarrestar al virus responde
induciendo apoptosis. En contraste, el virus trata de producir la mayor progenie posible
liberándola de la célula infectada a través de la lisis celular. Por tanto, el resultado de la infección
podría depender de la habilidad del hospedero para montar una respuesta apoptótica (Ortega y
Enríquez, 2007).
IPNV-Fluoro Test es un ensayo de inmunofluorescencia indirecta para la detección del
virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) en muestras de tejidos de peces así como en
líneas celulares infectadas con el patógeno. IPNV-Fluoro Test indirecto utiliza una mezcla de
anticuerpos monoclonales que son específicos para el virus IPN del serotipo Sp como VR-299.
Al agregar este reactivo a preparaciones de tejidos que contienen el patógeno, los anticuerpos
reaccionan con las proteínas VP2 y VP3 del IPNV. Después de una etapa de lavado para remover
el anticuerpo libre, la presencia del virus se detecta con un anticuerpo anti-IgG de ratón
conjugado con FITC y posterior observación en un microscopio de fluorescencia. La presencia de
virus se visualiza como una intensa fluorescencia verde en el citoplasma de las células infectadas
(OIE, 2006). En cuanto al desarrollo del protocolo para la detección de IPNV en México, este
proceso es único en el país e inclusive en Latinoamérica, ya que laboratorios similares solo
existen en Chile.
CONCLUSION
Durante la realización de este trabajo, se recalca que el proceso de laboratorio para el
diagnóstico de IPNV de acuerdo al protocolo recomendado por la OIE (2006) es bastante
complicado y tardado, pero sus resultados para la detección de enfermedades emergentes en
peces causadas por virus son inequívocos, por lo cual es de suma importancia realizar este tipo de
procedimientos para lograr llevar un sistema de control y prevención entre las granjas de trucha
arcoíris que existen en México. Su diagnóstico ayuda en el mejoramiento de los sistemas de
inocuidad dentro de las mismas granjas para exportar y vender productos de calidad. De igual
manera, sería deseable trabajar con muestras de animales sospechosos o en muestras de animales
supuestamente libres del virus como medida de confirmación.
Es importante señalar que no cualquier laboratorio está calificado para llevar a cabo este
tipo de diagnóstico, ya que se requieren de condiciones de laboratorio y conocimientos o
habilidades técnicas que mejoren la calidad del servicio brindado a la sociedad.
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