DIAGNOSI NELLE MALATTIE INFETTIVE
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DIAGNOSI NELLE MALATTIE INFETTIVE
DIAGNOSI EZIOLOGICA
• Suggerire un trattamento terapeutico appropriato
• Valutare l’efficacia di una terapia
• Valutare la presenza di portatori sani (potenziale fonte di contagio per la comunità)
Identificazione dell’agente patogeno responsabile di una malattia
Diagnosi di laboratorio
Esigenza di utilizzare metodologie scientificamente valide ed eseguibili in tempi accettabili
Necessità di acquisire in tempi rapidi informazioni utili alla diagnosi ed alla terapia
Fase pre-analitica
1. Richiesta del Clinico (scelta degli esami)
2. Informazione e Preparazione del Paziente
3. Raccolta del campione
4. Identificazione del campione
5. Trasporto del campione
FASE ANALITICA
•Fondamentale momento di interfaccia tra il
laboratorio e le altre parti coinvolte nel processo• momento cruciale nel
quale si compiono il 46% degli errori!
• L’appropriatezza di tutta la fase pre-analitica si traduce in maggiorequalità del servizio diagnostico e maggiore sicurezza dell’operatore
• Solo la stretta collaborazione tra tutte le figure coinvolte a diversotitolo nell’indagine microbiologica (che ha inizio al letto del malato conla decisione di richiedere le indagini fino al momento dell’utilizzo deireferti) ed il rispetto in tutte le fasi delle corrette procedure puòassicurare la piena valorizzazione dell’indagine microbiologica.
Fasa pre-analitica1. richiesta degli esami di laboratorio
• nella patologia infettiva ad eziologia definita, per diagnosi diforme clinicamente atipiche o iniziali, per la determinazione dellasensibilità ai farmaci.
• nelle sindromi polieziologiche, per indicazioni terapeutiche(sempre, se in assenza di specifiche informazioniepidemiologiche).
• nella patologia infettiva del paziente immunocompromesso, perindicazioni terapeutiche (quasi sempre necessarie).
• in ogni caso, per valutazioni epidemiologiche indispensabili per lostudio della circolazione dei microrganismi e la identificazione deifattori di rischio, l’adozione di idonee misure preventive, ladefinizione di un corretto approccio diagnostico e terapeutico.
La richiesta di accertamenti microbiologici è giustificata:
FASE PRE-ANALITICA2. Informazione e preparazione del Paziente
Il Paziente deve essere adeguatamente istruito sulle corrette modalità di prelievo, conservazione e trasporto del campione biologico
Esempio:
• Prelievo urine (tecnica del “mitto intermedio”)
• Prelievo dell’espettorato
FASE PRE-ANALITICA3. Raccolta del campione clinico
• Può essere prelevato da:
• siti sterili (sangue, midollo, liquido cefalo-rachidiano (liquor), liquido pleurico/pericardico/peritoneale/articolare, vie respiratorie inferiori, urine, tessuti profondi)
• ogni isolamento ha significato eziologico
• siti “contaminati” da flora autoctona (bocca, naso, vie respiratorie superiori, feci, espettorato, tratto gastro-intestinale, tratto genitale femminile, terzo distale dell’uretra, cute)
• i risultati vanno interpretati a seconda del caso
• necessaria una richiesta “mirata” del clinico, volta alla ricerca di uno o più specifici patogeni nel contesto dell’abbondante flora contaminante
• Ad ogni campione è associato un potenziale rischio biologico per la salute degli operatori sanitari
Campione clinico: materiale biologico da esaminare per verificare la
presenza o assenza di specifici microrganismi patogeni
Flora microbica “residente”
• Svantaggi
• Può contaminare i campioni
• Può causare malattia
• Vantaggi
• è in grado di proteggere dalle infezioni prevenendo la colonizzazione delle superfici epiteliali da parte dei patogeni (resistenza alla colonizzazione)
• la riduzione (o rimozione) della flora “normale” mediante impiego di antibiotici può causare superinfezioni, generalmente sostenute da microrganismi resistenti
Tutte le superfici corporee “esposte” (a contatto con l’ambiente circostante,
i.e. bocca, naso, intestino, cute, vie genitali femminili, uretra) sono
colonizzate da una flora “autoctona”
Tipologie di campioni biologici
• Campione prelevato da una zona in cui
coesistono patogeni e flora residente
(tampone)
• Campione INDIRETTO: prelevato previo
passaggio in una zona con flora residente
(lavaggio bronco-alveolare)
• Campione DIRETTO: il patogeno è localizzato in
un sito normalmente sterile ed una barriera (la
cute, generalmente) deve essere superata per
la sua raccolta (liquor, ago-aspirato)
• Campioni INUTILI ai fini diagnostici: non vanno
prelevati in quanto non forniscono alcuna
indicazione (vomito, aspirato gastrico,
contenuto intestinale, etc.)
APPROPRIATEZZA DEL CAMPIONE
Molto importante è l’adeguata raccolta (appropriatezza) del campione.
In particolare, il campione dovrebbe essere:
A. raccolto nel momento giusto;
B. prelevato da un distretto corporeo rappresentativo della patologia
infettiva;
C. prelevato in quantità sufficiente da poter effettuare i test diagnostici
necessari;
D. raccolto in maniera da evitare contaminazioni.
Appropriatezza del campione
A. QUANDO: nel momento giusto• Nella fase acuta della malattia (carica microbica maggiore)
• Prima dell’inizio di una terapia antimicrobica, quando possibile, o a distanza di almeno 48h dalla sua sospensione (se ciò non è possibile segnalarlo al laboratorio)
B. DOVE: dal distretto corporeo rappresentativo dell’area infetta
• Esempio:Il sospetto clinico di febbre tifoide, unito alla conoscenza della storia naturale di questa malattia infettiva, suggerisce la ricerca di Salmonella typhi nel sangue durante la 1°e 2°settimana e nelle feci nella 3°e 4°settimana.
Appropriatezza del campione
C. QUANTO: in quantità sufficiente• Esempio: quantità di sangue sufficiente per rilevare batteriemie
(spesso la carica batterica ematica è molto bassa)
D. COME: in maniera da evitare contaminazioni• Se il prelievo non viene eseguito con modalità rigorosamente
asettiche, altri microorganismi (flora “autoctona”), non responsabili della patologia, potrebbero contaminare i campioni e “falsare” così il risultato delle indagini microbiologiche.
• Esempio: ricerca di Streptococcus pyogenes va effettuata a mezzo di un tampone nelle fosse peritonsillari, evitando il contatto con l’orofaringe
FASE PRE-ANALITICA4. Identificazione del campione
I contenitori inviati in laboratorio debbono essere identificati con l'etichetta
riportante il relativo codice a barre ed accompagnati da un foglio di richiesta
indicante:
• Identificativo del paziente (nome, cognome, età, sesso)
• Provenienza anatomica del campione
• Nominativo del prelevatore
• Data e ora di campionamento(informazione critica!)
• Diagnosi clinica presuntiva
• (eventuale) Schema del trattamento antibiotico in corso
FASE PRE-ANALITICA5. Trasporto del campione
• Al fine di ottenere la massima recovery dei microrganismi, il campione deve essere trasportato:
• in adeguati contenitori sterili, per assicurare la corretta esecuzione delle indagini microbiologiche e consentire il corretto trasporto e manipolazione dal campione;
• rapidamente: il trasporto del campione frequentemente causa una riduzione della vitalità dei microrganismi in esso presenti;
• in adeguati terreni di trasporto, se necessario(es. tamponi), al fine di mantenere inalterata la “facies” microbica del campione, conservandone le caratteristiche possedute al momento del prelievo;
• Terreni liquidi o semisolidi (agarizzati)
• a temperatura “controllata”: generalmente a +4C, occasionalmente a temperatura ambiente
• Trasporto in sistemi “dedicati”, come nel caso della ricerca di germi anaerobi
Riflessioni … sulla fase pre-analitica
• Il contributo di chi richiede e preleva i campioni alla qualità degli esami di
laboratorio dipende sia dalla consapevolezza del fenomeno che nella capacità di
attenersi a quella serie di norme che permettono di ridurre al minimo i fattori che
possono modificare il risultato finale delle analisi.
• Un campione non idoneo può infatti causare il mancato isolamento del
microorganismo responsabile dell’infezione.
• Inoltre, si evitano in tal modo "dispersioni" di germi patogeni, specie quelli
resistenti (MRSA, Pseudomonas spp), che vanno indirettamente ad incrementare
l'incidenza delle infezioni nosocomiali.
• Il risultato dell'esame batteriologico sarà qualitativamente valido e più rapido.
In ultima analisi, gli operatori coinvolti nella fase pre-analitica sono
responsabili della qualità del percorso diagnostico del paziente…almeno
fino all’arrivo del campione in Laboratorio!
Diagnosi di laboratorio delle malattie infettive
A) DIAGNOSI DIRETTA
Ricerca dell'agente eziologico (intero o di una suacomponente) e sua identificazione:
Esame batteriologico/micologico/parassitologico/virologico
B) DIAGNOSI INDIRETTA
Ricerca di anticorpi specifici (test sierologici):sviluppo di una risposta anticorpale specifica
Diagnosi diretta
A. Esame microscopico
B. Esame colturale (isolamento)
C. Ricerca di antigeni
D. Ricerca di sequenze geniche
a. Esame microscopico
Scopo: accertare la presenza, nel materiale patologico adatto, del microrganismo patogeno sospettato e identificarlo.
Preparati fissati e colorati
Preparati “a fresco”
BatteriParassitiFunghi
BatteriParassitiFunghiVirus
a. Esame microscopico• Campioni “a fresco” oppure fissati (al calore o chimicamente)
• La scelta del tipo di microscopia dipende dal patogeno presente:
• microscopia in campo oscuro: il condensatore illumina obliquamentel’oggetto in modo che le strutture cellulari riflettano la luce verso l’occhiodell’operatore, a differenza dell’ambiente circostante. Ricerca di spirochete(T. pallidum) nelle lesioni cutanee associate alla sifilide.
• microscopia in contrasto di fase: le differenze nell’indice di rifrazione neicampioni sono convertite in differenze nella intensità della lucenell’immagine. Consente la visualizzazione di strutture in campioni noncolorati (funghi e parassiti, ma anche batteri).
• microscopia in fluorescenza: le molecole fluorescenti assorbono luce ad unae la ri-emettono ad una più lunga. Tale differenza viene rilevata dall’impiegodi filtri. Utile per l’identificazione di batteri e funghi.
• Spesso si utilizzano colorazioni “dedicate” i.e. Gram, alcool-acido resistenza(ZiehlNielsen)
Esame microscopico (“a fresco”)
Si esegue soprattutto per la ricerca di microrganismi difficilmente colorabilicon le tecniche disponibili, evidenziabili invece in campo oscuro:–ricerca di Spirochete(Treponema, Borrelia)–ricerca di Leptospire
Osservazione in campo oscuro: Treponema pallidum
Esame microscopico (previa colorazione)
• Campioni fissati (al calore o chimicamente)• Fornisce indicazioni riguardo:
•Idoneità del campione (espettorato: neutrofili / cellule squamose)•Numero e percentuale di polimorfonucleati neutrofili•Presenza/assenza di microrganismi (batteri, funghi, parassiti)
• Colorazione del campione con tecnica di Gram:• morfologia (cocchi, bastoncelli,cocco-bacilli, lanceolata)• disposizione (catenelle, clusters, diplococchi)• quantità assoluta di batteri presenti• percentuale relativa di Gram+ e Gram-• localizzazione in sede intra-od extra-cellulare
• Specifiche colorazioni:• colorazione di Ziehl Nielsen (bacilli alcool-acido resistenti)• verde malachite (endospore batteriche)• colorazione di Albert (granuli metacromatici o volutina)• colorazione di Leifson (flagelli)
Colorazioni SEMPLICI, che prevedono l’impiego di un solo
colorante:
–cristalvioletto
–fucsina basica
–blu di metilene
Colorazioni DIFFERENZIALI, che prevedono l’impiego di più di un
colorante:
–Colorazione di Gram
–Colorazione di Ziehl-Neelsen
Esame microscopico (previa colorazione)
Colorazione di gram: regressiva e differenziale
Tecnica1.Fissare gli strisci al calore2.Coprire con cristalvioletto per 1-2 min3.Lavare con acqua. Non asciugare4.Coprire con la soluzione iodio-iodurata di Lugol per 1-2 min5.Lavare con acqua. Non asciugare6.Decolorare per 10 sec con alcool-acetone7.Lavare con acqua. Non asciugare8.Coprire con safranina (2.5% in alcool 95%) per 1-2 min9.Lavare con acqua e lasciare asciugare
PrincipioNei batteri Gram+ il cristalvioletto e lo iodio sicombinano a formare un complesso (CV-I) di grossedimensioni che precipita all’interno della cellula. Ildecolorante condensa, per disidratazione, la strutturapeptidoglicanica. In questo modo, il complesso CV-Iviene “catturato” dalla parete cellulare.Nei batteri Gram- il decolorante agisce come solventelipidico, dissolvendo la membrana esterna della paretecellulare, permettendo così il rilascio del complessoCV-I e, quindi, la decolorazione della cellula batterica.
Colorazione gram: utilità clinica
• Idoneità del campione da sottoporre a coltura• Diagnosi eziologica presuntiva (suggestiva)
• meningiti e polmoniti batteriche, batteriuria, gonorrea ed infezioni piogene
• Suggerire la necessità di attuare tecniche di coltivazione “non routinarie”• anaerobi, funghi
• Ausilio nella interpretazione dell’esame colturale• angina di Vincent (spirochete, fusobatteri)• paziente antibiotizzato
• Informazioni sulla natura dell’infezione•infezioni poli/mono-microbiche
Tuttavia:• La colorazione di Gram non deve essere effettuata su campioni clinici (feci,escreato) in cui la flora patogena non può essere differenziata da quellacommensale• La colorazione di Gram non è utile per la rilevazione di:
•Legionella spp.(immunofluorescenza)•bacilli acido-resistenti (micobatteri, Nocardia spp.) (Ziehl-Neelsen)
Esame microscopico in micologia
Preparati “a fresco” o fissati e colorati
Cryptococcus: lievitiCandida: lieviti
Candida: ife in striscio vaginale
Microsporum: conidi
Aspergillus: testa conidiale
Esame microscopico in parassitologia
È di alto valore diagnostico
Preparati “a fresco” (utile per parassiti mobili) o fissati e colorati
Giardia intestinalis
Leishmania: promastigoti e amastigoti
Sarcoptes scabiei
Plasmodium: trofozoiti
Entamoeba Taenia: proglottide matura
Diagnosi diretta
A. Esame microscopico
B. Esame colturale (isolamento)
C. Ricerca di antigeni
D. Ricerca di sequenze geniche
B. Esame colturale (isolamento)
BATTERI
quasi tutti →terreni “artificiali”
M. leprae, T. pallidum→non coltivabili
chlamydie rickettsie →colture cellulari
VIRUS
Uova embrionate
colture cellulari (primarie/continue)
molti virus non coltivabili o coltivabili con difficoltà
B. Esame colturale (BATTERI)
Quasi tutti i batteri di interesse medico possono essere coltivati in sistemi artificiali (in vitro) denominati terreni di coltura.
I terreni di coltura si distinguono in base allo stato fisico:
• LIQUIDI(brodo).Composizione del brodo“normale”:
• peptone (digestione parziale di proteine animali) 0,5%
• estratto di carne 0,3%
• NaCl (per rendere isotonico il terreno)
• tampone fosfato (PBS; pH 7,0)
• H2O
• SOLIDI (brodo normale solidificato con agar). L’agar:
• Polisaccaride acido (70% agarosio,30% agaropectina) estratto da alghe rosse del genere Gelidium
• Addizionato al brodo in quantitàpari a1,5-2%
• liquido a temperature 80C, gelifica a 42-47C
• Non viene metabolizzato dalla maggior parte dei batteri
• Permettono l’isolamento di specie microbiche (colonie)
Terreni di coltura
Terreni arricchitimicrorganismi con particolari
richieste metaboliche
Terreni selettivicrescita di alcuni, inibizione della
crescita di altri
Terreni differenziali identificazione in base alle caratteristiche
differenti di crescita
Terreni minimicrescita della maggior parte dei
batteri
Agar sale-mannite Agar sangue
Streptococchi:α emoliticiβ emoliticiγ emolitici
•Carbonio•Azoto•Zolfo•Fosforo•Sotto forma di Sali inorganici, aggiunti in concentrazione nota
•sangue•siero•estratto di lievito•infusi di cuore e cervello•carboidrati•amminoacidi
ISOLAMENTO COLTURALE MEDIANTE TECNICA DELLA DISSEMINAZIONE IN SUPERFICIE
Diagnosi diretta
A. Esame microscopico
B. Esame colturale (isolamento)
C. Ricerca di antigeni
D. Ricerca di sequenze geniche
identificazione
Una volta che dal campione biologico si sia verificata, su terreni solidi opportuni, la crescita di colonie batteriche isolate si procede alla identificazione:
IDENTIFICAZIONE PRESUNTIVA caratteri microscopici (colorazioni,forma,organizzazione) caratteri macroscopici (aspetto coloniale)
IDENTIFICAZIONE FINALE (DEFINITIVA)
A. biochimicaB. immunologica (sierologica)C. molecolare
IDENTIFICAZIONE
A. IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA
La determinazione di “specie” si basa sulla capacità del microrganismo inesame di:
• metabolizzare zuccheri per via ossidativa (via aerobica) o per viafermentativa (via anaerobica)• produrre specifici enzimi• produrre specifici prodotti metabolici
Utilizzo di metodi “manuali” od “automatizzati”.Identificazione possibile in tempi rapidi (4-6h).
La fermentazione degli zuccheri e l’utilizzazionedi altri substrati (ureasi, indolo, gelatina, etc.)viene evidenziata da un indicatore di pHresponsabile della reazione colorimetrica
B. Identificazione sierologica
Ha come obiettivo finale quello di ricercare ANTIGENI direttamente nel
campione biologico esaminato.
Le tecniche di identificazione sierologica comprendono:
• agglutinazione: quando l’antigene è corpuscolato (globuli rossi, batteri)• precipitazione: quando l’antigene è solubile• fissazione del complemento: quando l’antigene è corpuscolato (lisi) • neutralizzazione: quando l’antigene, per azione del corrispondente anticorpo, perde la sua attività
• IF immunofluorescenza • RIA radioimmunoassy• test immunoenzimatici ELISA, immunoblot
Alla base di ogni reazione sierologica c’è la formazione dell’ immunocomplesso (antigene+anticorpo)
C. Identificazione molecolare
SONDE MOLECOLARI
• Sonde specifiche a DNA per geni che identificano uno specifico patogeno.
• Le sonde legano il DNA complementare presente nel campione(ibridazione), indicando la presenza del patogeno
• Permettono di individuare anche esigue quantità di acidi nucleici (elevatasensibilità)
• La reazione di ibridazione può essere condotta su diverse tipologie dicampioni:
• colonie batteriche
• preparazioni di DNA purificato
• campioni clinici
La digestione del DNA per mezzo dienzimi di restrizione, seguita daibridazione con differenti sonde genichegenera patterns specie-specifici (ossiacaratteristici di una specie microbica).
PRINCIPALI TECNICHE DI IBRIDAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI
Il DNA target denaturato (singolo filamento) viene direttamenteimmobilizzato su un supporto solido (p. es., membrana di nitrocellulosa)ed ibridato con una specifica sonda a DNA a singolo filamento marcata,per facilitarne la successiva rivelazione (dot blot). In alternativa,differenti frammenti di DNA con diverso peso possono essere separatiattraverso elettroforesi su gel di agarosio, denaturati e poi trasferiti sumembrane per l’ibridazione con sonda e rilevazione (Southern blot). Sesi utilizzano molecole di RNA separate con elettroforesi si parla diNorthern blot.
Diagnosi diretta
A. Esame microscopico
B. Esame colturale (isolamento)
C. Ricerca di antigeni
D. Ricerca di sequenze geniche
identificazione
antibiogramma
ANTIBIOGRAMMA: TEST DI ANTIBIOTICO-SENSIBILITà
Una volta eseguita l’identificazione del microrganismo in esame, si procedealla determinazione della sensibilità/resistenza dell’isolato agli antibiotici(antibiogramma).
• Obiettivo dei test per la determinazione della antibiotico-S è di predire ilsuccesso od il fallimento in vivo della terapia antibiotica.• I test vengono effettuati in vitro, e misurano la risposta (crescita) di unmicrorganismo isolato verso un particolare antibiotico/antibiotici.• I test sono eseguiti in condizioni standardizzate per garantire lariproducibilità dei risultati.• I risultati di questi test debbono essere usati per guidare la sceltadell’antibiotico da adottare, alla quale contribuiscono anche le informazionicliniche e l’esperienza professionale.
Dopo aver seminato su terreno solido ilgerme in esame si appoggiano sullasuperficie dei dischetti imbevuti degliantibiotici-test. Incubazione; Il mancatosviluppo del germe (alone di inibizione)significa sensibilità a quell’antibiotico.
Determinazione della MIC (CONCENTRAZIONE MINIMA INIBENTE):
Misura quantitativa dell’attività di un antibiotico verso un determinato batterio. Definita come la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica visibile.
Diagnosi diretta
A. Esame microscopico
B. Esame colturale (isolamento)
C. Ricerca di antigeni:
A. Test di agglutinazione
B. Test di precipitazione
C. Fissazione del complemento
D. Immunofluorescenza, ELISA, RIA, Wester blot
D. Ricerca di sequenze geniche (PCR)
Diagnosi indiretta
Volta a rilevare una RISPOSTA IMMUNE UMORALE SPECIFICA dell’ospiteall’agente infettivo
La diagnosi INDIRETTA è, ovviamente, più tardiva di quella DIRETTAin quanto si può ricorrere ad essa soltanto quando si sia sviluppata già lareattività immunitaria dell’ospite. Ciò non è sempre possibile, come nelcaso di pazienti anergici.
Le indagini sierologiche diventano di ausilio diagnostico, pertanto,soltanto quando l’isolamento del microrganismo sia difficoltoso, fallito,o non possibile.
L’accertamento indiretto non comportando l’isolamento del germe,preclude la possibilità di saggiare la sensibilità dell’agente etiologicoverso i farmaci antimicrobici.
Tecniche per la diagnosi indiretta
A. Reazione di fissazione del Complemento
B. Reazione di agglutinazione
C. Test immunoenzimatico (ELISA)
D. Saggio inimmunofluorescenza
E. Saggio radioimmunologico
Praticamente le stesse viste per la ricerca diretta dell’antigene nel campione,solo che qui cerchiamo l’anticorpo diretto contro l’antigene!
Agglutinazione diretta
antigeni corpuscolati vengono posti a contatto con siero contenente anticorpi specifici
antigeni presenti sulla superficie delle cellule batteriche
Agglutinazione indiretta
Antigeni solubili o Anticorpi vengono fatti aderire artificialmente allasuperficie di particelle corpuscolate come il lattice di polistirolo.
La reazione di agglutinazione è molto sensibile anche a piccole quantità dianticorpi ed è molto usata per esempio per la TIPIZZAZIONE SIEROLOGICA(tecnica di identificazione che fa uso di antisieri che reagiscono con i vari antigenibatterici permettendone il riconoscimento).
Ricorda!
Precipitazione
antigene solubile (macromolecole o tossine) viene messo a contatto con un siero contenente anticorpi specifici.La formazione degli immunocomplessi si può osservare con un precipitato.
Quando la concentrazione degli antigeni e degli anticorpi è ottimale si creano dei “ponti” tra un immunocomplesso e l’altro. Questa fase corrisponde al punto di equivalenza dove è massima la quantità di precipitato.
Esempi di reazione di precipitazione
Immunodiffusione
Immunoelettroforesi
Si esegue prima una elettroforesi delleproteine del siero su gel di agar stratificato sulastra di vetro. Ai lati, su dei solchi vieneintrodotto l’antisiero che contiene anticorpicontro le proteine del siero. All’unione traproteine del siero separate e i rispettivianticorpi, si formano degli archi caratteristici.
Si tratta di pozzetti scavati nell’agar.Quando si introducono antigene oanticorpo, essi diffondono e danno originead una banda di precipitazione nel puntod’incontro.
FISSAZIONE DEL COMPLEMENTOE’ una tecnica utilizzata per la diagnosi di sifilide (reazione di Wassermann)
Siero in esame con anticorpi + antigene immunocomplesso
COMPLEMENTO di cavia
SISTEMA RIVELATORE formato da: Emolisine + Emazie
Se il complemento è stato utilizzato dal 1^ immunocomplesso, non ci può essere emolisi, la reazione è positiva (presenza di anticorpi).
Se invece si verifica emolisi, significa che il complemento si è reso disponibile per il sistema rivelatore, la reazione è negativa.
+
Immunocomplesso
+
REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO
Gli Ab sono coniugati con molecole fluorescenti (fluorescina), sono molecole in grado di assorbire la luce ultravioletta emettendo poi radiazioni nel campo del visibile.Per poter osservare la reazione si utilizza un microscopio a fluorescenza.
IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTASi utilizza un anticorpo coniugato confluoresceina isotiocianato, che siaspecifico per l’antigene in esame.
IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTASi utilizza un anticorpo specifico perl’antigene in esame ma nonconiugato, che viene riconosciuto daun secondo anticorpo coniugato ediretto contro regioni costanti delleimmunoglobuline della specie in cui èstato prodotto il primo anticorpo.
immunofluorescenza
ImmunoenzimaticaE.L.I.S.A. Enzyme Linked Immunosorbent Assay
• Si ricopre la superficie plastica di un pozzetto (micropiastra) con anticorpi specifici contro l’antigene.• Si aggiunge l’antigene che viene poi evidenziato da anticorpi, anch’essi contro l’antigene ricercato, legati covalentemente ad un enzima (perossidasi, fosfatasi alcalina, β-galattosidasi) (sandwichELISA)• La quantificazione avviene con tecniche spettrofotometriche, attraverso la valutazione dell’intensità del colore prodotto in risposta alla conversione enzimatica del relativo substrato cromogeno.• La reale concentrazione dell’antigene viene determinata per confronto con diluizioni standard dell’antigene stesso.
RadioimmunologiaR.I.A. Radio Immuno Assay
Sono tecniche in cui la reazione antigene anticorpo è evidenziata da un isotoporadioattivo. La radioattività prodotta viene misurata con appositi strumenti. Questatecnica si utilizza nella determinazione della concentrazione degli ormoni.
L' isotopo è ciascuno degli atomi di unostesso elemento, con lo stesso numeroatomico ma con differente numero dimassa. Possiedono lo stesso numero diprotoni ed elettroni (quindi proprietàchimiche uguali) ma un diverso numero dineutroni (quindi proprietà fisiche diverse).
Western blot
• Separazione degli antigeni su gel dipoliacrilammide in base al pesomolecolare (elettroforesi)
• Trasferimento degli antigeni (bandeelettroforetiche) su membrana dinitrocellulosa
• Incubazione degli antigeni conl’anticorpo specifico
• Esposizione ad un anticorposecondario (anti-anticorpo primario)marcato con un enzima (perossidasi)
•La formazione di immunocomplessi (equindi la presenza dell’antigenericercato) viene evidenziatadall’aggiunta di un substrato sul qualeagisce l’enzima, che provoca laprecipitazione di colorante.
Isolamento, identificazione e tipizzazione dei
virus
Coltivazione dei virus animali
Essendo PARASSITI ENDOCELLULARI OBBLIGATI i virus devono:
• entrare in contatto (aderire)
• penetrare in una cellula ospite dentro la quale si possa svolgere il loro ciclo replicativo
Cellula sensibile e permissiva
cellule sensibili (suscettibili)possono essere infettate da undeterminato virus; sono provvistedi idonei recettori
cellule permissiveconsentono un ciclo di replicazionevirale completo (infezioneproduttiva)
Coltivazione dei virus animali
• Nell’animale (conigli, topi furetti, piccoli roditori)
• Nelle uova embrionate di pollo
• Nelle colture cellulari
coltivazione dei virus in colture cellulari
allestimento delle colture in vitro
inoculazione del campione
incubazione
Valutazione della crescita del virusnelle colture
identificazionetitolazione
Valutazione della crescita del virusnelle colture cellulari
Effetti dello sviluppo del virus• ECP (+/- specifico)
• Emoadsorbimento
• Emoagglutinazione
• ………………………………
Necessità di test di identificazione del virus:• inibizione dell’emoagglutinazione, neutralizzazione, IEA,
IF, metodi molecolari
Valutazione della moltiplicazione viralein colture in vitro
esame microscopico diretto (microscopio ottico)
effetto citopatico (CPE)
• degenerazione cellulare• formazione di cellule multinucleate o sincizi• formazione di inclusioni
• il tipo di CPE• il tempo della comparsa• la velocità di progressione
dipendono dal tipo di celluleinfettante e dal tipo di virusinfettante
Cpe (effetto citopatico)
Degenerazione cellulare (lisi delle cellule)
Cellule VERO infettate con poliovirus
Fusione delle membrane delle cellule adiacenti formazione di cellule multinucleate o sincizi
HSVLinee cellulari: HEK, HEP-2, KB, NCIH292,VeroTempo di comparsa: HSV 1: 1-2 giorniHSV 2: più lentoTipo di CPE: cellule giganti, multinucleate
Cpe (effetto citopatico)
Inclusioni cellulari
Colorazione, osservazione microscopica
• Localizzazione
• nucleo (adenovirus, herpesvirus)
• citoplasma (virus della rabbia, poxvirus, reovirus)
• entrambi (CMV, paramyxovirus)
• Tipo
• ammassi di virioni (papovavirus)
• viroplasma (poxvirus)
• materiale cellulare alterato (adenovirus)
dimostrazione della moltiplicazionevirale in colture in vitro
emoagglutinazione
Sospensione di globuli rossi
Sospensione di globuli rossi + surnatante colturale
emoadsorbimento
Cellule infettate +
sospensione di globuli rossi
Identificazione e tipizzazione dei virus
effetto citopatico (CPE) +/-
caratteristiche antigeniche
• fissazione del complemento• neutralizzazione• inibizione dell’emoagglutinazione• immunofluorescenza (IFA)• test immunoenzimatici (EIA)
sequenza genomica• ibridazione con sonde molecolari• reazioni di amplificazione
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