DETEKSI Helicobacter pylori PADA CAIRAN DAN BIOPSI …

DETEKSI Helicobacter pylori PADA CAIRAN DAN BIOPSI LAMBUNG

PASIEN ENDOSKOPI DENGAN MENGGUNAKAN METODE

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

SANATANG

P1506215002

PASCASARJANA UNIVERSITAS HASANUDDIN

PROGRAM STUDI BIOMEDIK KONSETRASI MIKROBIOLOGI

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2017

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah swt yang telah memberikan

segenap kekuatan, kesehatan, dan keteguhan serta semua nikmat tak hingga, sehingga

penulisan laporan hasil penelitian yang berjudul Deteksi Helicobacter pylori Pada

Cairan dan Biopsi Lambung Pasien Endoskopi Dengan Menggunakan Metode

Kultur dan Polymerase Chain Reaction dapat terselesaikan sebagaimana mestinya.

dalam penyusunan tesis ini penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan,

olehnya itu penulis mengharapkan koreksi dan kritikan membangun dari semua pihak

demi kesempurnaannya.

Ucapan tulus dan rasa terimakasih yang begitu besar penulis persembahkan

kepada kedua orang tua penulis tercinta Ayahanda H. Abbas dan Ibunda Hj.

Najemung atas segala kasih sayang, restu, dukungan, arahan dan segenap doa yang

dipanjatkan dalam mendidik dan membesarkan penulis.

Terimakasih dan penghargaan yang sebesar-besarnya kepada Ibu

dr.Rizalinda Sjahril, M.Sc, Ph.D dan Bapak Prof. Ahyar Ahmad, Ph. D selaku

pembimbing pertama dan pembimbing kedua yang telah banyak mengasuh,

meluangkan waktu, tenaga dan pikiran dalam mengarahkan dan membimbing penulis

selama mengikuti perkuliahan maupun dalam proses penyelesaian tugas akhir.

Pada kesempatan ini pula tidak lupa penulis menyampaikan terima kasih yang

tulus kepada :

1. Ibu Prof. Dr.Dwia Aries Tina Pulubuhu, M.A. selaku Rektor Universitas

Hasanuddin Makassar.

2. Bapak Prof. Dr. Muhammad Ali, S.E, M.S selaku Direktur Sekolah Pascasarjana

Universitas Hasanuddin..

3. Ibu Dr. dr. Andi Mardiah Tahir, M.Si, Sp.OG, selaku Ketua Jurusan Biomedik

yang telah memberikan banyak bantuan administratif.

4. Ibu dr. Rizalinda Sjahril, M.Sc, Ph.D selaku ketua konsentrasi mikrobiologi yang

selalu memberikan pengarahan dan bimbingan.

5. Bapak Dr. dr. Burhanuddin Bahar, M,Sc., Ibu DR. Rosana Agus, M.Si serta

Bapak dr. Firdaus Hamid, M,Sc, Ph.D selaku dosen penguji yang telah

memberikan kritikan dan arahan yang membangun kepada penulis selama proses

penyelesaian tugas akhir.

6. Semua dosen-dosen konsentrasi Mikrobiologi Jurusan Biomedik atas bimbingan,

ilmu dan bantuannya yang telah diberikan kepada penulis.

7. Kepada seluruh staff Mikrobiologi dan Fakultas Kedokteran untuk semua

pelayanan dan fasilitas yang telah diberikan selama penulis menuntut ilmu.

8. Kepada para tenaga medis dan para medis di Rumah Sakit Wahidin Sudirohusodo

dan Rumah Sakit Grestelina yang telah membantu dalam pengumpulan sampel.

9. Buat adik-adikku tersayang, Norma dan Adnan yang menjadi inspirasi dan selalu

memberi warna di setiap hari-hariku terimakasih untuk segalanya.

10. Special untuk “someone’ terimakasih atas motivasi, kesabaran, kasih sayang dan

pengertiannya.

11. Kepada seluruh staff di Laboratorium Mikrobiologi RS. Universitas Hasanuddin

untuk semua pelayanan dan fasilitas yang telah diberikan selama penulis

melakukan penelitian.

12. Rekan-rekan sepenelitian di Laboratorium; Kak nisma dan Elha terimakasih buat

semangat, pengertian dan kerjasamanya.

13. Kak Nawir, kak Asbar dan Galih terimakasih atas kebersamaan selama kurang

lebih 2 tahun.

14. Sahabatku tersayang, Active site the gank : Fitry_pite, Deiz_ninank, Rahma

Rusdin, Nia Idris dan Eka Sulisyawati yang telah memberi semangat.

Makassar, Mei 2017

penulis

ABSTRAK

SANATANG. Deteksi Helicobacter pylori Pada Cairan dan Biopsi Lambung

Pasien Endoskopi Dengan Menggunakan Metode Kultur dan Polymerase Chain

Reaction (PCR) (Dibimbing oleh Rizalinda Sjahril dan Ahyar Ahmad).

Helicobacter pylori adalah bakteri gram negatif yang berbentuk S atau koma

serta memiliki sifat oksidase, urease dan katalase positif sebagai penyebab gangguan

pada lambung. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui prevalensi Helicobacter

pylori dan virulensinya sebagai penyebab gangguan lambung pada pasien endoskopi.

Pemeriksaan dilaksanakan sebagai berikut: isolasi H. pylori pada cairan

lambung dengan metode kultur, uji biokimia dan pewarnaan gram, ekstraksi asam

deoksiribo nukleat (ADN) pada cairan dan biopsi lambung, amplifikasi ADN serta

elektroforesis.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ada pertumbuhan H.pylori kultur

pada medium columbia blood agar dari total 30 sampel cairan lambung. Metode PCR

untuk mendeteksi gen glmM diperoleh 2 (6,67 %) sampel positif H.pylori pada cairan

lambung dan 4 (13,3 %) sampel positif H.pylori pada biopsi lambung dengan ukuran

pita DNA sebesar 294 bp. Amplifikasi gen Cag A dan Vac A pada 6 sampel yang

positif H.pylori menunjukkan 5 (83,3 %) sampel positif Cag A dengan target band

sebesar 349 bp dan 2 (33,3 %) sampel positif Vac A dengan target band sebesar 290

bp. Uji statistik dengan Fisher menunjukkan tidak ada perbedaan yang signifikan

antara hasil yang diperoleh pada cairan maupun biopsi lambung (P=0,335).

Kata kunci : Helicobacter pylori, Pasien Endoskopi, glmM, Cag A, Vac A

ABSTRACT

SANATANG. The detection of Helicobacter pylori in Stomatch Fluid and

Endoscopic Biopsy of the Patient Using Culture Method and Polymerase Chain

Reaction (supervised by Rizalinda Sjahril and Ahyar Ahmad)

Helicobacter pylori is a gram negative bacteria in the form of S or coma and

has properties of oxidase, urease and catalase positive causes infection in gaster. This

study aimed to determine the prevalence of Helicobacter pylori and its virulence as

the cause of gastric disorder in endoscopic patients.

A series of examinations were carried out as follows: the isolation of H.pylori

in gastric juice was carried out using the culture method, the biochemical and the

gram color test, the extraction of deoksiribo nucleate acid (DNA) in the fluid and the

stomatch biopsy, the ADN amplification, and the electrophoresis.

The research result indicated that there was no growth of H.pylori culture at

the columbia medium of blood agar of the total of samples of stomach fluid. The

PCR method used the glmM gene revealed 2 (6,67 %) samples had positive H.pylori

in stomach fluid and 4 (13,3 %) samples had positive H.pylori in stomach biopsy with

the size of DNA band of 294 bp. The amplification of Cag A and Vac A gene in 6

samples with positive H. pylori showed 5 (83,3 %) samples of Cag A with target

band og 349 bp and 2 (33,3 %) positive samples of Vac A with the target of 290 bp.

The statistical test using chi square showed insignificant difference between the result

obtained from the liquid and the gastric biopsy (p=0.335).

Keyword : Helicobacter pylori, endoscopic patient, glmM, Cag A, Vac A

DAFTAR ISI

Halaman sampul i

Halaman Pengesahan ii Kata Pengantar iii

Abstrak vi

Abstract vii

Daftar Isi viii

Daftar Tabel ix

Daftar Gambar x

Daftar Lampiran xi

Daftar Arti Lambang dan Singkatan xii

BAB I. Pendahuluan 1

A. Latar Belakang 1

B. Rumusan Masalah 4

C. Tujuan 5

D. Manfaat 5

BAB II. Tinjauan Pustaka

A. Lambung 6

1. Anatomi Lambung 6

2. Kerusakan pada Lambung 7

a. Gastritis Akut 7

b. Gastritis Kronis 8

c. Ulkus gaster 8

B. Bakteri Helicobacter pylori 9

1. Taksonomi H.pylori 9

2. Sifat Fenotipe dan Genotipe H.pylori 10

3. Transmisi H.pylori 13

4. Patogenesis H.pylori 14

D. Cytotoxin Assosiated Gene A (Cag A) dan Vacuolating cytotoxin A

(Vac) 17

E. Tes Laboratorium 19

F. Polymerase Chain Reaction (PCR) 20

G. Kerangka Teori 25

H. Kerangka Pikir 26

I. Hipotesis 27

BAB III. Metodologi Penelitian

A. Jenis Penelitian 28

B. Waktu dan Lokasi Penelitian 28

C. Definisi Operational 28

D. Populasi dan Sampel 29

E. Kriteria Inklusi dan Ekslusi 29

F. Izin Penelitian 30

G. Alur Penelitian 30

1. Metode Kultur 30

2. Metode PCR 30

H. Alat dan Bahan 31

I. Metode Penelitian 32

J. Metode Analisis 37

BAB IV. Hasil Dan Pembahasan 38

BAB V. Kesimpulan dan Saran 55

Daftar Pustaka 57

Lampiran 61

DAFTAR TABEL

Nomor Teks Halaman

1. Faktor virulensi Helicobacter pylori 12

2. Pemeriksaan untuk membantu diagnosis infeksi H.pylori 20

3. Data kadar keasaman pada cairan lambung pasien endoskopi 38

4. Data demografi berdasarkan umur 39

5. Perbandingan hasil deteksi H. pylori pada cairan dan biopsi 42

lambung

DAFTAR GAMBAR

Nomor Teks Halaman

1. Pembagian Daerah Anatomi Gaster 6

2. Morfologi H.pylori 9

3. Patogenesis H.pylori 17

4. Struktur dari Cag A dan Vac A 19

5. Tahapan Reaksi dalam PCR 23

6. Ilustrasi elekroforesis 24

7. Bentuk koloni bakteri pada Colombia blood agar 40

8. Hasil visualisasi gen glmM Pada Gel agarosa 2 % 41

9. Hasil visualisasi gen Cag A dan Vac A pada Gel Agarosa 2 % 43

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Teks Halaman

1. Diagram Alir Prosedur Penelitian 61

2. Data Hasil Kultur Cairan lambung dan Tes Biokimia 66

3. Data Kadar Asam Pasien Endoskopi 67

4. Posisi Penempelan Gen glmM, Cag A dan Vac A 68

5. Dokumentasi Penelitian 69

DAFTAR ARTI LAMBANG DAN SINGKATAN

Lambang/ Singkatan Arti dan Keterangan

oC Derajat Celcius

g Gram

µg/mL Mikrogram per mililiter

pH Negatif Logaritma dari Konsentrasi ion H+

rpm Rotasi per menit

% Persen

TBE Tris Borat EDTA

ATGC Adenin, Guanin, Timin, Sitosin

DNA deoksiribo nucleat acid

ADN Asam deoksiribo nukleat

UV Ultra violet

bp base pair

dNTP deoksi nukoletida trifosfat

PCR Polymerase Chain Reaction

EB elution buffer

GSB Gel Solution Buffer

GST Gel Solution Tris Cl

Cag A Cytotoxin Assosiated gene A

Vac A Vacuolating cytotoxin

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Penyakit infeksi dapat disebabkan oleh mikoorganisme baik dari golongan

bakteri, virus maupun parasit. Tubuh manusia menyediakan lingkungan yang sesuai

untuk pertumbuhan beberapa mikrorganisme. Hal ini karena tubuh manusia kaya

akan nutrisi organik dan faktor pertumbuhan yang dibutuhkan oleh mikroorganisme.

Salah satu penyakit yang dapat disebabkan oleh mikrorganisme berupa gangguan

pada lambung (gaster).

Salah satu penyebab infeksi pada lambung adalah adanya bakteri Helicobacter

pylori (H. pylori). Infeksi H. pylori merupakan infeksi yang umum terjadi di seluruh

dunia (Ruese et al, 1997). Infeksi H. pylori masih merupakan masalah besar di

Indonesia dengan prevalensi sebesar 15 % namun sampai saat ini belum diketahui

dengan jelas cara penularan dan patofisiologisnya pada saluran pencernaan (Goto

et al, 2016).

Infeksi pada lambung yang disebabkan oleh bakteri Helicobacter pylori

(H.pylori) dapat menimbulkan penyakit berupa dyspepsia, gastritis, ulkus peptikum,

dan karsinoma lambung. Bakteri ini berkolonisasi di dalam lambung manusia dan

menyebabkan inflamasi mukosa yang berat, serta respons imun lokal maupun

sistemik (Hegar, 2000).

Helicobacter pylori terdiri dari berbagai galur (strain) yang mempunyai sifat

dan gejala klinis berbeda. Urease dan flagel terdapat pada semua strain dan

diperlukan dalam proses patogenesis dan kolonisasi. Flagel dengan sifat motilitasnya

diperlukan untuk kolonisasi, sedangkan urease yang merupakan enzim sitoplasmik

berperan menghidrolisis urea menjadi bikarbonat dan amonia. Amonia yang

terbentuk merupakan nutrisi bagi bakteri dan menyebabkan lesi pada epitel lambung.

Di samping itu, urease juga berfungsi melindungi H.pylori dari paparan asam (Blaser.

1992).

Strain H. pylori memiliki faktor virulensi yang dapat menimbulkan

peningkatan inflamasi pada gaster yaitu Cag A dan Vac A. Inflamasi yang berat ini

dapat mengakibatkan atrofi pada gaster serta meningkatkan respon imun dengan

memproduksi antibodi. Strain yang lebih virulen ini mampu meningkatkan

patogenisitasnya dengan cara mengubah morfologi, merangsang vakuolisasi dan

degenerasi pada kultur sel in vitro. Aktivitas ini berhubungan dengan adanya protein

dengan berat molekul 120 kilodalton ( kDa) yang diberi nama Cag A (cytotoxin-

associated gene A). Gen ini terdapat pada 50% -70% strain H. pylori. Pasien yang

terinfeksi oleh strain Cag A menunjukkan respon inflamasi yang lebih hebat dan lebih

berisiko untuk berkembang menjadi ulkus peptikum atau karsinoma lambung. Strain

lain dari H. pylori adalah Vac A (vacuolating cytotoxin). Kurang lebih 50% dari

seluruh strain H. Pylori mengeluarkan Vac A, suatu protein 95 kDa dengan tingkat

imunitas yang tinggi dan dapat menginduksi vakuolisasi pada sel epitel secara in

vitro (Kuster et al,2006).

Sebagaimana penyakit infeksi bakteri pada umumnya, diagnosis keberadaan

kuman H. pylori penting untuk pengobatan. Beberapa jenis pemeriksaan telah

dikembangkan untuk maksud tersebut, antara lain kultur biopsi lambung, rapid urease

test, tes immunoserologi (deteksi antibodi dan antigen) (Lage et al,1995). Akhir-akhir

ini sejalan dengan perkembangan biologi molekuler, terdapat pemeriksaan PCR

(Polymerase Chain Reaction) yang bisa dilakukan baik pada spesimen biopsi

lambung, cairan lambung, saliva, dental plaque, maupun feses (Kabir, 2001).

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Muaddeb et al (2016) diperoleh

bahwa dengan menggunakan metode PCR, diagnosis adanya H.pylori pada hasil

biopsi lambung dapat dideteksi lebih cepat dan akurat. Dari 161 sampel biopsi

lambung diperoleh 61 sampel (37,9 %) positif dengan metode kultur sedangkan

dengan metode PCR-RFLP sebesar 100 sampel (62,1 %) yang ditemukan positif

H.pylori.

Dengan menggunakan metode yang sama, Kuo et al (2016) mendeteksi

adanya H.pylori pada 114 sampel cairan lambung dengan metode kultur dan PCR.

Hasil yang diperoleh adalah 105 sampel (92,1%) ditemukan positif dengan

menggunakan PCR, dan 84 sampel (73,7%) ditemukan positif dengan metode kultur.

Sejalan dengan penelitian di atas, Syaifuddin (2014) menemukan bahwa

Berdasarkan uji MIU ternyata 7 dari 50 sampel yang diuji menunjukkan positif

mengandung H. pylori. Dari ke tujuh sampel positif tersebut, 4 diantaranya

menunjukkan positif terinfeksi bakteri berdasarkan analisis PCR untuk peta

fragmen DNA yang berhubungan dengan infeksi H. Pylori seperti gen antigen

species-specific dan cagA.

Data prevalensi H. pylori pada pasien endoskopi di Kota Makassar sampai

saat ini belum dilaporkan. Identifikasi H. pylori secara konvensional dam modern

dengan menggunakan tekhnik PCR sangat membantu dalam mendiagnosis penyebab

terjadinya gangguan pada sistem percernaan. Di samping itu, tekhnik molekuler

bersifat relatif lebih cepat, efisien dan akurat dibandingkan dengan metode

konvensional/kultur. Oleh karena itu, penelitian ini akan dilakukan deteksi H. pylori

pada cairan dan biopsi lambung pasien endoskopi dengan metode kultur dan

polymerase chain reaction (PCR).

B. Rumusan Masalah

Berdasarkan fakta tidak adanya data prevalensi H. pylori sebagai penyebab

gangguan sistem percernaan di Kota Makassar, maka rumusan masalah pada

penelitian ini adalah:

1. Bagaimana perbedaan hasil deteksi H. pylori yang terdapat pada cairan dan

biopsi lambung pasien endoskopi dengan menggunakan metode kultur dan PCR?

2. Bagaimana faktor virulensi dari H. pylori yang terdapat pada cairan dan biopsi

lambung pasien endoskopi?

3. Bagaimana efektivitas jenis sampel untuk mendeteksi H.pylori ?

C. Tujuan

Tujuan pada penelitian ini adalah:

1. Tujuan Umum

Mengetahui adanya H. pylori sebagai etiologi gangguan lambung berupa

dyspepsia, gastritis, ulkus peptrikum, dan karsinoma lambung orang dewasa

di kota Makassar dengan metode kultur dan PCR.

2. Tujuan Khusus

1. Mengetahui perbedaan hasil deteksi H. pylori yang terdapat pada cairan

dan biopsi lambung pasien endoskopi dengan menggunakan metode PCR.

2. Mengetahui faktor virulensi dari H. pylori yang terdapat pada cairan dan

biopsi lambung pasien endoskopi.

3. Mengetahui jenis sampel yang efektif untuk mendeteksi H. pylori.

D. Manfaat Penelitian

Manfaat pada penelitian ini adalah:

1. Memberikan data prevalensi bakteri H. pylori di Kota Makassar.

2. Menambah wawasan keilmuan mahasiswa dan penulis dalam deteksi

bakteri dengan menggunakan metode molekuler.