Aus der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie der Ruhr-Universität Bochum Leiter: Prof. Dr. med. S. G. Gatermann Der Zusammenhang zwischen der Dominanz bestimmter MRSA-Klone und der Variabilität des agr-Genlocus Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Sven Hengesbach aus Meschede 2006
117
Embed
Der Zusammenhang zwischen der Dominanz bestimmter MRSA ... · Das Enzym Koagulase wird nur von Staphylococcus aureus gebildet und ist somit ein wesentliches diagnostisches Kriterium
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Aus der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie
der Ruhr-Universität Bochum
Leiter: Prof. Dr. med. S. G. Gatermann
Der Zusammenhang zwischen der Dominanz bestimmter MRSA-Klone
und der Variabilität des agr-Genlocus
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Sven Hengesbach
aus Meschede
2006
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent: Prof. Dr. med. S. G. Gatermann
Koreferent: Prof. Dr. rer. nat. Manfred Köller
Tag der mündlichen Prüfung: 30.11.2006
Abstract
Hengesbach
Sven
Der Zusammenhang zwischen der Dominanz bestimmter MRSA-Klone und der
Variabilität des agr-Genlocus
Problem: Weltweit wird das Phänomen beobachtet, dass Epidemien mit Methicillin-
resistenten Staphylococcus aureus von nur wenigen Stämmen dieser Spezies verursacht
werden. Die Entdeckung der agrBDC-Interferenzgruppen gab Anlass zu der These, dass
ein bestimmter agr-Interferenztyp mit der Ausbreitungsfähigkeit von MRSA-
Epidemiestämmen in Verbindung gebracht werden könnte. Dies sollte in der
vorliegenden Arbeit genauer untersucht werden.
Methoden: Anhand der Pulsfeldgelelektrophorese-Muster wurden die Isolate der
MRSA-Stammsammlung des Instituts für Medizinische Mikrobiologie der Stadt
Bochum nach epidemiologischen Kriterien klassifiziert und mit anerkannten nationalen
und internationalen Epidemiestämmen verglichen. Zur Analyse der
Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen erfolgte zunächst die DNA-Präparation.
Anschließend wurde eine PCR durchgeführt mit nachfolgender Aufreinigung der PCR-
Produkte. Zur Restriktionsanalyse wurde das Enzym DraI verwendet.
Ergebnisse: Es wurden vier epidemische MRSA-Stämme in Bochum identifiziert, die
51,2% aller Infektionen verursachten. Das PFGE-Muster von zwei Isolaten aus Bochum
war identisch mit anerkannten Epidemiestämmen aus Kanada, den USA und
Großbritannien. Auch der Hannoversche-, Süddeutsche- und Berliner Epidemiestamm
waren in der Stammsammlung enthalten. Im ersten Beobachtungszeitraum (13.02.1998-
31.12.2000) wiesen 70,9% der epidemischen MRSA-Stämme das agr-Interferenzmuster
II auf. Bei Betrachtung des gesamten Untersuchungszeitraumes (13.02.1998-
12.01.2004) nahm sein Anteil auf 53,3% ab, während die Interferenzgruppen I und Ia
wesentlich häufiger unter den epidemischen Stämmen zu finden waren.
Diskussion: Da bei den MRSA-Epidemiestämmen mit den meisten Isolaten drei agr-
Interferenzmuster, I, Ia und II, zu finden waren, scheint es keine Präferenz der
epidemischen MRSA für ein bestimmtes Interferenzmuster zu geben. Dies gilt auch für
die Restriktionsmuster der anerkannten deutschen Epidemiestämme.
Für meine Eltern
Inhalt und Verzeichnisse
Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1 1.1 Staphylococcus aureus 1 1.1.1 Kolonisation und Infektion 1 1.1.2 Nosokomiale und ambulante Infektionen mit Staphylococcus aureus 2 1.2 Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) 3 1.2.1 MRSA im ambulanten Bereich, Alten- und Pflegeheimen 5 1.2.2 Resistenzentwicklung 6 1.2.3 Vancomycin-intermediäre Staphylococcus aureus (VISA) und die Entwicklung neuer Antibiotika 8 1.2.4 Epidemiologie von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) 10 1.2.5 Methoden zur Differenzierung von MRSA-Stämmen 13 1.3 Die Virulenzfaktoren von Staphylococcus aureus und ihre stadienbezogene Expression 14 1.4 Der agr-Genlocus 17 1.4.1 Globale Regulatorsysteme virulenzassoziierter Gene 17 1.4.2 Die Koordination bakterieller Genexpression durch Quorum-sensing-Systeme 19 1.4.3 Aufbau und Funktion des agr-Genlocus 22 1.4.4 Interferenz von S.-aureus-Stämmen durch die hypervariable Region des agr-Genlocus 26 1.4.5 Nachweise von agr in anderen Staphylokokken-Spezies 28 1.5 Komplexe Interaktionen der beiden globalen Regulatoren agr und sar 29 1.6 Fragestellung 30 2 Material und Methoden 32 2.1 Material 32 2.1.1 Chemikalien 32 2.1.2 Stämme 32 2.1.3 Kulturmedien und Puffer 36 2.1.4 Enzyme 36 2.1.5 Oligonukleotide 36 2.2 Methoden 37 2.2.1 Einteilung der MRSA-Stämme nach epidemiologischen Kriterien anhand der Pulsfeldgelelektrophorese- (PFGE-) Muster 37 2.2.2 Operationalisierung und Zuordnung der epidemiologischen Eigenschaften
3 Ergebnisse 43 3.1 Epidemiologie von MRSA-Stämmen in Nordrhein-Westfalen mit Konzentration auf Bochum und Städte der näheren Umgebung 44 3.1.1 Klassifizierung der MRSA-Stämme der Sammlung des Instituts für Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum nach der Häufigkeit ihres klinischen Auftretens 44 3.1.2 Aktualisierung der Daten bis Januar 2004 47 3.2 PFGE-Muster-Vergleich der Bochumer MRSA-Sammlung mit anerkannten nationalen und internationalen Epidemiestämmen 51 3.3 Krankenhaus-Assoziation der MRSA-Stämme 54 3.4 Zusammenhang zwischen den agr-Interferenzgruppen und der epidemiologischen Zuordnung der MRSA-Stämme 63 3.4.1 Bestimmung der agr- Interferenzgruppen von Bochumer MRSA 64 3.4.2 Die agrBDC-Interferenzgruppen und ihr möglicher Einfluss auf die epidemiologischen Eigenschaften von MRSA-Stämmen 68 4 Diskussion 76 4.1 Epidemiologische Besonderheiten bei MRSA-Infektionen 76 4.1.1 Klassifizierung von MRSA-Stämmen nach epidemiologischen Kriterien 78 4.1.2 Anerkannte Epidemiestämme in Bochum 79 4.1.3 Grenzfälle bei der epidemiologischen Klassifikation 80 4.2 Die bakterielle Kommunikation und der agr-Genlocus 82 4.2.1 Die Bedeutung des agr-Genlocus für die Ausbreitungsfähigkeit von MRSA-Stämmen 83 4.2.2 Die Assoziation bestimmter S.-aureus-Phänotypen mit einem agr-Interferenzmuster 86 4.2.3 Koordination der Virulenzfaktoren in vivo 87 5 Zusammenfassung 90 6 Literaturverzeichnis 93 7 Danksagung 107 8 Lebenslauf 108
II
Inhalt und Verzeichnisse
Verzeichnis der Tabellen Tabelle 1 Die 20 Kliniken, aus denen die MRSA-Isolate (Gesamtzahl: 1161) zugesandt wurden 33 Tabelle 2 mecA-Primer zum Nachweis des mecA-Gens 34 Tabelle 3 In dieser Arbeit verwendete epidemische MRSA aus Mitteleuropa 35 Tabelle 4 Primer zur Amplifikation der hypervariablen Region des agr-Gens 36 Tabelle 5 Kriterien zur epidemiologischen Klassifikation der MRSA-Isolate (Stand: 31.12.2000) 47 Tabelle 6 Aktualisierung der Tabelle 5 auf den Stand Januar 2004 49 Tabelle 7 Die Kliniken der 1161 MRSA-Isolate mit Farbkodierung (Legende zu Abbildung 13) 57 Tabelle 8 Verteilung der 393 Isolate auf die vier Interferenzgruppen 71 Tabelle 9 Dominanz des Interferenztyps II bei den epidemischen Stämmen 72 Tabelle 10 Aktualisierung der Daten bis auf den Stand Januar 2004 74 Verzeichnis der Abbildungen Abbildung 1 Zwei-Komponenten-Systeme globaler Regulatoren 18 Abbildung 2 Schema der molekularen Vorgänge eines Quorum-sensing-Modells 21 Abbildung 3 Transkription des polycistronischen agr-Locus 23 Abbildung 4 Modell des agr-Systems von S. aureus 25 Abbildung 5 Hypervariable Region des agr-Genlocus 27 Abbildung 6 Screenshot, Molecular Analyst Fingerprinting Software 38 Abbildung 7 Optimization 38 Abbildung 8 Identifikation der vier Interferenzgruppen des agr-Genlocus 42 Abbildung 9 Einteilung der Bochumer MRSA-Isolate in Gruppen anhand ihrer PFGE-Muster (Stand der Sammlung: 31.12.2000) 46 Abbildung 10 Aktualisierung der PFGE-Gruppen-Einteilung der Bochumer MRSA-Stammsammlung 48 Abbildung 11 Screenshot, Molecular Analyst Fingerprinting Software,
Übereinstimmung mit PFGE-Bandenmustern deutscher Epidemiestämme 52
Abbildung 12 Übereinstimmende PFGE-Bandenmuster von MRSA-Isolaten aus Deutschland, Kanada, den USA und Großbritannien 54 Abbildung 13 Verteilung der Isolate aus den 20 Kliniken auf die PFGE-Gruppen 56 Abbildung 14 Verteilung der 360 Isolate der Klinik A auf die PFGE-Gruppen 60 Abbildung 15 Verteilung der 294 Isolate der Klinik B auf die PFGE-Gruppen 60 Abbildung 16 Verteilung der 110 Isolate der Klinik C auf die PFGE-Gruppen 61 Abbildung 17 Verteilung der 81 Isolate der Klinik D auf die PFGE-Gruppen 61 Abbildung 18 Foto eines Kontroll-Gels nach der PCR 65 Abbildung 19 Bestimmung der Restriktionsfragmente nach Verdau durch DraI 67 Abbildung 20 Die agr-Interferenzmuster der PFGE-Gruppen und der sporadischen Stämme 69 Abbildung 21 Aktualisierung der agr-Interferenzmuster-Verteilung 73
III
Inhalt und Verzeichnisse
Verzeichnis der Abkürzungen
ABC ATP binding cassette ADP Adenosindiphosphat agr accessory gene regulator AIP autoinducing peptide ATP Adenosintriphosphat bidest. Bidestilliert bp Basenpaare °C Grad Celsius CDC Centers for Disease Control and Prevention CF Clumping factor cm Zentimeter cMRSA community acquired MRSA CMRSA Canadian methicillin-resistant Staphylococcus aureus cna collagen adhesion gen CNISP Canadian Nosocomial Infection Surveillance Program DNA Desoxyribonukleinsäure ds doppelsträngig EDTA Ethylendiaminotetraessigsäure EMRSA epidemic methicillin-resistant Staphylococcus aureus EPIC European Prevalence of Infection in Intensive Care et al. et alii FDA Food and Drug Administration FnBPA Fibronektin-Bindeprotein A FnBPB Fibronektin-Bindeprotein B IgG Immunglobulin G g Gramm x g Gravitationskonstante der Erde GISA Glykopeptid-intermediäre Staphylococcus aureus GPI-Karte gram-positiv identification card h Stunde HCl Salzsäure hla Alphatoxin-Gen HIV human immunodeficiency virus H2O Wasser H2O2 Wasserstoffperoxid HPK Histidin-Proteinkinase IL-2 Interleukin-2 kb Kilobasen kD Kilodalton (Einheit für das Molekulargewicht) KNS Koagulase-negative Staphylokokken l Liter M Molar mecA Penicillin-Resistenzgen mg Milligramm min Minute ml Milliliter MLEE Multilocus Enzyme Electrophoresis MLST Multilocus Sequence Typing
IV
Inhalt und Verzeichnisse
mM Millimolar mRNA messenger-Ribonukleinsäure MRSA Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus MSCRAMM microbial-surface components recognizing adhesive matrix molecules MSSA Methicillin-sensibler Staphylococcus aureus NaCl Natriumchlorid NaOH Natronlauge NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards ng Nanogramm nm Nanometer NNIS National Nosocomial Infections Surveillance NRW Nordrhein-Westfalen ORF open reading frame PBP Penicillin-Bindeprotein PBP2a Penicillin-Bindeprotein 2a PCR Polymerase-Kettenreaktion pmol Pikomol RAP RNA III activating protein RIP RNA III inhibiting peptide RNA Ribonukleinsäure rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute) RR response regulator sar staphylococcal accessory regulator spa Gen für Protein A TAE-Puffer Tris-Acetat-EDTA-Puffer Taq Thermophilus aquaticus TBE-Puffer Tris-Borat-EDTA-Puffer TBS Tris-gepufferte Kochsalzlösung TE Tris-EDTA TNF-α Tumornekrosefaktor-alpha Tris Tris(hydroxymethylaminomethan) U Unit µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer UV Ultraviolett V Volumen VISA Vancomycin-intermediäre Staphylococcus aureus VRSA Vancomycin-resistente Staphylococcus aureus V/cm Volt/Zentimeter (v/v) Volumen/Volumen VRE Vancomycin-resistente Enterokokken WHO Weltgesundheitsorganisation (w/v) Gewicht/Volumen
V
Einleitung
1 Einleitung
1.1 Staphylococcus aureus
Die Gattung Staphylococcus enthält über 30 Spezies und Subspezies und ist den
grampositiven Kokken zuzuordnen. Staphylokokken bilden keine Sporen, haben eine
kugelige bis ovale Zellform und einen Durchmesser von etwa 1 µm. Sie vermehren sich
sowohl aerob als auch anaerob und ordnen sich in Haufen oder Trauben an (griechisch
staphyle, die Traube). Das Enzym Koagulase wird nur von Staphylococcus aureus
gebildet und ist somit ein wesentliches diagnostisches Kriterium der klinisch
wichtigsten, fakultativ bis obligat pathogenen Spezies. Die oft goldgelben
Pigmentierungen der Kolonien führten zu der Bezeichnung „aureus“ (lateinisch aureus,
golden).
Koagulasenegative Staphylokokken sind klassische fakultativ pathogene Opportunisten.
Die beiden Hauptvertreter dieser Gruppe sind Staphylococcus epidermidis und
Staphylococcus saprophyticus (Kloos und Schleifer, 1986).
1.1.1 Kolonisation und Infektion
Ungefähr 30-50% der gesunden Individuen sind Träger von Staphylococcus aureus, von
denen 10-20% dauerhaft kolonisiert sind. Sowohl Methicillin- (Oxacillin-) sensible
(MSSA) als auch Methicillin- (Oxacillin-) resistente Isolate (MRSA) können einen Wirt
dauerhaft kolonisieren. Die bevorzugten Körperregionen einer asymptomatischen
Kolonisierung sind Nasenvorhöfe und Rachen. Außerdem werden häufig Vagina und
Perineum befallen. Die nasale Kolonisierung hat sich als einer der größten
Risikofaktoren für die Entwicklung nosokomialer und auch ambulant erworbener
Infektionen erwiesen (von Eiff et al., 2001). Etwa 20% der Bevölkerung sind ständig
und circa 60% intermittierend im Bereich der vorderen Nasenhöhle mit S. aureus
kolonisiert. Ausgehend von der Nase kann sich der Erreger auf weitere Bereiche der
Haut- und Schleimhäute ausbreiten.
1
Einleitung
Die Bakterien können als transiente Flora für Wochen oder Monate asymptomatisch
intakte Mukosa kolonisieren. Sobald es jedoch zu einem Gewebedefekt kommt, wird
der Erreger inokuliert und kann Krankheitsbilder auf drei verschiedene Arten
verursachen:
1. Die Bakterien befinden sich am Infektionsort, beziehungsweise breiten sich
lokal begrenzt aus, und führen zu Abszessen, Karbunkeln, Zellulitis, Impetigo
bullosa und Wundinfektionen.
2. Eine Invasion der Blutbahn mit hämatogener Streuung kann der Grund sein für
Krankheitsbilder wie eine Endokarditis, Osteomyelitis, epidurale Abszesse bis
hin zum septischen Schock.
3. Staphylococcus aureus sezerniert Toxine und verursacht auf diesem Wege das
Toxic-Schock-Syndrom und das „staphylococcal-scalded-skin-syndrome“
(Dermatitis exfoliativa neonatorum Ritter von Rittershain) (Archer, 1998).
Nach von Eiff et al. (2001) haben Personen, die mit S.-aureus-Stämmen kolonisiert
sind, ein erhöhtes Risiko, sich mit diesen zu infizieren. Die meisten Fälle nosokomialer
Infektionen entstehen durch den Kontakt mit staphylokokkenbesiedelten Händen des
Krankenhauspersonals, entweder von ihrem eigenen Reservoir oder durch den Kontakt
mit einem infizierten Patienten. Die wichtigste prophylaktische Maßnahme ist deshalb
die regelmäßige Händedesinfektion. Dies scheint zunächst einfach zu realisieren, doch
Studien zeigen, dass es den Ärzten hierbei deutlich an Compliance mangelt (Archer,
1998; Kipp et al., 2004; Lowy, 1998; Pittet et al., 2004; Vandenbergh et al., 1999).
1.1.2 Nosokomiale und ambulante Infektionen mit Staphylococcus aureus
Als nosokomial werden im Krankenhaus erworbene Infektionen bezeichnet, die im
Durchschnitt bei ungefähr 4,8% aller hospitalisierten Patienten gefunden werden. Sie
entstehen häufiger in Schwerpunktkrankenhäusern als in kleineren Institutionen,
innerhalb eines Krankenhauses häufiger bei Patienten der Intensivstationen als bei
denen der Normalabteilungen (Schentag et al., 1998). S. aureus ist einer der häufigsten
Gründe für endemische und epidemische nosokomiale Infektionen. Er ist der häufigste
Erreger nosokomialer Wundinfektionen und Pneumonien sowie die zweithäufigste
Ursache einer Sepsis.
2
Einleitung
Weitere Beispiele nosokomialer S.-aureus-Infektionen sind Omphalitiden, Impetigo,
infizierte Dekubital-Ulzerationen, Brandwunden und Weichteilabszesse (Boyce, 1997).
Schon 1880 und 1882 beschrieb Sir Alexander Ogston in einer Reihe klinischer
Beobachtungen und Laborstudien die bedeutende Rolle von Staphylococcus aureus in
der Entstehung von Wundinfektionen, Abszessen und einer Sepsis (Ogston, 1882).
S. aureus ist ebenfalls schon lange als ein Erreger ambulanter Infektionen bekannt.
Bereits in den 1950er Jahren beschrieben Nahmias und Eikhoff (1961) das Auftreten
der epidemischen S.-aureus-Stämme des Phagentyps 80/81 außerhalb von
Krankenhäusern. Ein besonders hohes Risiko, an einer ambulant erworbenen S.-aureus-
Infektion zu erkranken, haben Patienten mit Diabetes mellitus, chronischen
Hauterkrankungen, Dialyse-Patienten, Abhängige von intravenös applizierten Drogen
und HIV-Infizierte (Kauffman und Bradley, 1997). Häufige Manifestationen sind
umschriebene Abszesse, die auch in Form von Furunkeln oder Karbunkeln in
Erscheinung treten sowie Pneumonien und Tonsillarabszesse (Archer, 1998).
Bakterien befinden sich in einem kontinuierlichen Prozess der Anpassung an sich
verändernde Umweltbedingungen. Signale vom Zytoplasma und aus der Umgebung
beeinflussen die zellulären Aktivitäten und vermitteln eine entsprechende Antwort
(Stock et al., 1989). Vermehren sich Bakterien exponentiell, ist ihr Metabolismus
schnell und effizient. In diesem Stadium werden bestimmte Regulatorsysteme so
koordiniert, dass eine konstante Wachstumsrate gewährleistet ist. Wird eine Kultur älter
und wächst langsamer oder stoppt ihr Wachstum auf Grund verschlechterter
Umweltbedingungen, werden andere als die vorherigen Regulatorsysteme aktiviert, um
dem zellulären Metabolismus ein Überleben auf lange Zeit zu sichern. Diese
Umstellung wird in der sogenannten postexponentiellen Phase eingeleitet. Ein
besonderes Merkmal dieser Phase ist die schnelle Synthese von nicht-essentiellen
Proteinen, von denen die meisten sezerniert werden. Bei grampositiven Bakterien, und
somit auch bei Staphylococcus aureus, handelt es sich vor allem um Enzyme, die
Biopolymere abbauen und so das Überleben, die Vermehrung und Ausbreitung im
infizierten Gewebe erleichtern (Balaban und Novick, 1995). Diese Exoproteine
erschließen für den bakteriellen Metabolismus neue Nahrungsquellen und würden
während der exponentiellen Wachstumsphase keinen Vorteil bringen, da ein
hinreichendes Nahrungsangebot besteht (Kornblum et al., 1991). Unter den optimalen
Wachstumsbedingungen der exponentiellen Phase werden vornehmlich
Oberflächenproteine, zum Beispiel Protein A, Koagulase und das Fibrinogen-
Bindeprotein synthetisiert, die eher für die Adhäsion eine wichtige Rolle spielen
(Arvidson, 1983). Das einzelne Bakterium muss somit den Zustand seiner Umwelt
wahrnehmen können und auf Änderungen der Umgebungsvariablen reagieren können,
um sein Überleben und das der eigenen Population zu sichern.
17
Einleitung
Abbildung 1: Zwei-Komponenten-Systeme globaler Regulatoren Die zwei Komponenten dieses Systems sind das Protein mit der sensorischen Funktion, typischerweise in
der zytoplasmatischen Membran lokalisiert, und das Regulatorprotein. Das Sensor-Protein enthält eine
extrazelluläre Domäne für die Erfassung des Signals und eine intrazelluläre mit einer Histidin-Kinase.
Auf einen Stimulus hin, den die sensorische Komponente erfasst, wird die Histidin-Kinase direkt aktiviert
und es erfolgt eine Autophosphorylierung. Der Phosphatrest wird auf ein Regulatorprotein übertragen,
woraufhin es für die weitere Signalweiterleitung aktiviert wird und zur Transkription von Zielgenen führt.
Die Erkennung von Umweltsignalen und deren Übertragung in die Zelle erfolgt häufig
über sogenannte Zwei-Komponenten-Systeme von globalen Regulatoren, die den
wichtigsten Weg bakterieller Kommunikation untereinander und mit der Außenwelt
darstellen (siehe Abbildung 1). Ein Sensorprotein empfängt Signale aus der Umwelt.
Durch Phosphorylierung wird bei Erfassung des spezifischen Signals ein
Regulatorprotein aktiviert, woraufhin weitere Reaktionen in der Zelle ausgelöst werden
über welche die Transkription von Zielgenen gesteuert wird (Lyon et al., 2000, 2002;
Morschhäuser, 2000). Die Expression der meisten Virulenzfaktoren wird von
wenigstens einem gut charakterisierten globalen Regulator gesteuert (Ji et al., 1995).
18
Einleitung
Das agr-System ist solch ein Regulator von Staphylococcus aureus, bei dem das
spezifische Umweltsignal, was letztendlich die Expression der Zielgene veranlasst, die
Bakteriendichte ist. Hierbei sezernieren die Bakterien ein Peptid, das die interbakterielle
Kommunikation ermöglicht (Balaban et al., 2000).
1.4.2 Die Koordination bakterieller Genexpression durch Quorum-sensing-Systeme
Die Expression bestimmter bakterieller Eigenschaften ist nur dann sinnvoll, wenn eine
hohe Zelldichte vorhanden ist. Erreicht das spezifische Signal, in diesem Fall die
Bakteriendichte, einen Schwellenwert, dann werden -charakteristisch für ein globales
Regulatorsystem- eine Reihe unverbundener Gene aktiviert. Damit jedes einzelne
Bakterium die Dichte der Bakterienpopulation für eine koordinierte Genexpression
wahrnehmen kann, müssen die Bakterienzellen miteinander kommunizieren.
Quorum-sensing-Systeme vermitteln diese Kommunikation zwischen Bakterien durch
Signalmoleküle, sogenannte Pheromone oder Autoinducer mit einem geringen
Molekulargewicht, die in die Umgebung abgegeben werden. Durch Erfassung dieser
Signalmoleküle können die Bakterien die Zelldichte ihrer Population wahrnehmen und
die Expression von Virulenzgenen koordinieren (Morschhäuser, 2000; Winzer und
Williams, 2001). Der aus dem römischen Recht stammende Begriff „Quorum“
bezeichnet jene Teilnehmerzahl einer Versammlung, die mindestens erreicht sein muss,
um einen Beschluss zu fassen. Auf Bakterien übertragen meint Quorum die Anzahl der
Signalmoleküle, die zur Aktivierung der Genexpression von den Bakterien sezerniert
werden muss.
Diese Strategie setzt voraus, dass jede einzelne Bakterienzelle in der Lage ist, andere
Zellen der gleichen Spezies zu erkennen, deren Anzahl zu bestimmen und im Einklang
mit diesen bestimmte Genen zu exprimieren. Auf diesem Weg können die Bakterien ihr
Verhalten so aufeinander abstimmen, dass dem Wirt die Zeit fehlt, eine effektive
Verteidigung aufzubauen (Winzer und Williams, 2001). Sind die Exoproteine vieler
Bakterien zur gleichen Zeit an einem Fokus lokalisiert, haben sie einen viel größeren
Effekt, als wenn sie von nur wenigen Individuen zu verschiedenen Zeitpunkten
produziert werden.
19
Einleitung
Wundinfektionen durch Staphylococcus aureus sind oft durch große, mit Pus gefüllte
Läsionen gekennzeichnet, die Ausdruck eines konzertierten Zusammenwirkens vieler
Bakterien sind (Salyers und Whitt, 2002).
Für die koordinierte Genexpression verschiedener Bakterienzellen bedarf es eines
effektiven Signalmechanismus in Form des schon erwähnten Zwei-Komponenten-
Systems. Die Signaltransduktion beruht hierbei auf einem Phosphotransfer, somit ist das
entscheidende Mittel zur Informationsübertragung die Phosphorylierung. Die erste
Komponente, das Sensorprotein, ist eine Histidin-Proteinkinase (HPK), die bei vielen
dieser Systeme in der Zytoplasmamembran lokalisiert ist. Ihre N-terminale
Bindungsdomäne empfängt das Signal und überträgt es auf den C-Terminus (siehe
Abbildung 2). Es wird eine Phosphokinase aktiviert, die das Sensorprotein an einem
Histidin-Rest unter Verbauch von ATP (Adenosintriphosphat) phosphoryliert. ATP
wird zu ADP und stellt somit den Phosphatrest zur Verfügung, durch den die
Signalkaskade ermöglicht wird. Nach dieser Autophosphorylierung wird die
Phosphatgruppe vom Histidin des transmembranen Sensorproteins auf die Carboxyl-
Seitenkette eines Aspartat-Restes am N-Terminus der zweiten Komponente, dem
Regulatorprotein (response regulator), übertragen. Der C-Terminus des Sensorproteins
und der N-Terminus des Regulators, zwischen denen es zur Übertragung des
Phosphatrestes kommt, sind hoch konserviert. Durch Phosphorylierung des
Regulatorproteins wird seine C-terminale Domäne zu einem Aktivator, bindet in der
regulatorischen Region von Zielgenen und aktiviert oder reprimiert deren Transkription
(Kleerebezem et al., 1997; Novick et al., 1995; Stock et al., 1989).
Im Fall des agr-Systems senden Bakterienzellen bestimmte Pheromone aus, die es
ihnen indirekt ermöglichen, die Zelldichte zu ermitteln. Bei Erreichen einer
Schwellenkonzentration von Pheromonen, die das entsprechende Signal für den Sensor
sind, kommt es zur Aktivierung der Signalkaskade, die, wie oben beschrieben, mittels
eines Phosphotransfers abläuft (Koenig et al., 2004; Qiu et al., 2005). Das Signal führt
beim agr-System einerseits dazu, dass bevorzugt Strukturgene für sezernierte
Virulenzfaktoren transkribiert werden, wie Hämolysine und Toxine, wohingegen
diejenigen für Oberflächenproteine nur noch abgeschwächt transkribiert werden;
andererseits werden über eine Feed-forward-Stimulierung die Proteine des
Signaltransduktionsweges selbst, einschließlich des Pheromons, vermehrt transkribiert.
20
Einleitung
Dies geschieht über einen anderen Promotor als die Transkription der Zielgene (siehe
Abbildung 2).
Abbildung 2: Schema der molekularen Vorgänge eines Quorum-sensing-Modells Das Sensorprotein (sensor) empfängt das spezifische Signal und wird daraufhin an seinem Histidin-Rest
unter Verbrauch von ATP phosphoryliert. Das Phosphatmolekül wird auf das Regulatorprotein (response
regulator) übertragen. Nachfolgend aktiviert oder reprimiert der Regulator die Transkription von
Zielgenen. Zusätzlich werden die Proteine der Signaltransduktion über einen zweiten Promotor vermehrt
transkribiert. Hierzu gehört auch das Pheromon, beziehungsweise der Autoinducer, ein posttranslational
modifiziertes Protein, das aus einem größeren Peptid gebildet und über einen ABC- (ATP-binding
cassette-) Transporter sezerniert wird. Das Pheromon ist das Signal für das Sensorprotein und aktiviert
bei Bindung an diesen Sensor die Signalkaskade, sodass sich dieses System selbst verstärkt (aus
Kleerebezem et al., 1997).
Das Zwei-Komponenten-System hat als Signalweg in vielen Bakterien eine große
Bedeutung. Es steuert je nach Bakterium Vorgänge wie Chemotaxis, Osmoregulation,
Sporulation, Symbiosen und vieles mehr. Das agr-System von Staphylococcus aureus
kontrolliert die Expression von Virulenzfaktoren.
21
Einleitung
1.4.3. Aufbau und Funktion des agr-Genlocus
Die Expression des globalen Regulatorsystems agr von Staphylococcus aureus weist
eine starke Abhängigkeit vom Eintritt der Bakterien in die post-exponentielle
Wachstumsphase und der Aktivierung des Quorum-sensing-Systems über einen Zwei-
Komponenten-Signaltransduktionsweg auf (Novick et al., 1995; Stock et al., 1989).
Sobald die Zellen das Ende der exponentiellen Wachstumsphase erreicht haben, wird
die Anzahl der Oberflächenproteine reduziert. Stattdessen werden gewebezerstörende
Proteine und Toxine vermehrt synthetisiert (Novick et al., 1995). Eine Zunahme der
Bakteriendichte führt demnach ab einem bestimmten Schwellenwert zur Up-Regulation
von sezernierten Virulenzfaktoren und der reziproken Down-Regulation von
Oberflächenproteinen. Startet man einen neuen Wachstumszyklus, indem man eine
Dilution der Bakterien mit einem neuen Medium durchführt, schalten die Bakterien
wieder um auf die vermehrte Synthese der Oberflächenproteine der exponentiellen
Phase (Peng et al., 1988).
Entdeckt wurde agr von Recsei et al. (1986) bei der Herstellung einer Mutante. Die
Insertion des Transposons Tn551 für die Erythromycin-Resistenz in das
Staphylococcus-aureus-Genom hatte einen weitreichenden Effekt auf die Expression
(Toxic-Schock-Syndrom-Toxin-1) und die Staphylokinase wurden ungefähr um das
50fache reduziert, während Protein A um das circa 20fache anstieg. Das Transposon
musste somit ein Kontrollelement inaktiviert haben, das die Expression dieser Gene
steuert. Es wurde als agr (accessory gene regulator) bezeichnet (Recsei et al., 1986).
Der agr-Locus ist polycistronisch. Die transkribierte mRNA kodiert also für mehr als
ein Protein, wobei für jedes Protein ein eigenes Start- und Stoppsignal auf der mRNA
existiert (Stryer, 1988).
Der Genlocus agr besteht aus zwei divergierenden Operons, die von benachbarten,
jedoch nicht überschneidenden Promotoren, P2 und P3, transkribiert werden. Die
Sequenz des P2-Operons besteht aus vier offenen Leserahmen (ORFs, open reading
frames), agrA, -B, -C und -D (siehe Abbildung 3). Man geht davon aus, dass zwei
davon, agrA und agrC, die Proteine eines klassischen Zwei-Komponenten-
Signaltransduktionsweges kodieren.
22
Einleitung
Das Sensorprotein, die Histidin-spezifische Proteinkinase (HPK), wird vermutlich durch
den AgrC–Teil repräsentiert; agrA kodiert ein Protein, das dem Regulator (RR, response
regulator) und somit auch Aktivator der Zielgen-Transkription entsprechen könnte
(siehe Abbildung 4). Diese Annahme ist sehr verbreitet, allerdings bis zum jetzigen
Zeitpunkt noch nicht bewiesen.
Die Transkription von P2 beginnt an der Position 1750 der Nukleotidsequenz des agr-
Genlocus und es entsteht ein 3,5 kb (Kilobasen) langes Transkript, die RNA II (siehe
Abbildung 3). Die Transkription von P2 ist nur mit den Produkten des P2-Operons
möglich, sodass es sich hier um einen autokatalytischen Prozess handelt, der geeignet
ist, eine schnelle Produktion von Exoproteinen bei Stagnation des Bakterienwachstums
zu induzieren (Kornblum et al., 1991; Novick et al., 1993, 1995; Stock et al., 1989).
Abbildung 3: Transkription des polycistronischen agr-Locus Die Darstellung zeigt die Orte der drei Promotoren P1, P2, P3 und das ungefähre Ausmaß ihrer
Transkripte. Die RNA III, das Transkript des P3-Operons, wird in die gegensätzliche Richtung zu P1 und
P2 abgelesen. Außer der RNA III wird durch die ersten 160 Nukleotide des P3-Operons ein Toxin, das δ-
Hämolysin, kodiert. Entdeckt wurde agr bei der Herstellung einer Mutante durch Insertion des
Transposons Tn551 in agrA (aus Kornblum et al., 1991).
Das aus 0,5 kb bestehende Transkript des P3-Operons, die RNA III, beginnt an der
Position 1566 und wird in entgegengesetzter Richtung zum P2-Operon abgelesen. Die
ersten 160 Nukleotide enthalten oft die Sequenz für ein agr-reguliertes Protein, das δ-
Hämolysin (siehe Abbildung 3). Die RNA III ist aber das wesentliche Transkript, da sie
eine regulatorische RNA und daher selbst der eigentliche Effektor der agr-Antwort ist.
Sie kontrolliert in der postexponentiellen Wachstumsphase die Expression von
23
Einleitung
wenigstens 15 nicht miteinander verbundenen Exoprotein-Genen. Novick et al. (1993)
zeigten mit einem Klonierungsexperiment, dass allein die RNA III die gesamte
regulatorische Funktion des agr-Locus ersetzen kann und damit der agr-spezifische
Effektor für die Genregulation der Exoproteine in Staphylococcus aureus ist. Primär
beeinflusst die RNA III die Ebene der Zielgen-Transkription, jedoch hat sie in einigen
Fällen auch Einfluss auf die Translation. Auf welche Weise die RNA III die Zielgen-
Expression kontrolliert, ist bisher nicht bekannt (Kornblum et al., 1991; Novick et al.,
1993, 1995). Ein dritter Promotor, P1, befindet sich nahe des 5’-Endes von agrA und
zeigt nur wenig Aktivität. Er hat in etwa die gleiche Aktivität in agr+-Stämmen wie in
agr-defekten Stämmen. Zudem lässt sich kein Aktivitätsunterschied zwischen der
exponentiellen und postexponentiellen Wachstumsphase beobachten, sodass er von der
agr-Funktion unabhängig zu sein scheint. Seine Bedeutung innerhalb des agr-Systems
ist noch unbekannt. Er scheint -neben dem wesentlich stärkeren Promotor P2- die
Transkription des agrA-Gens zu regeln (Peng et al., 1988).
AgrA scheint die Rolle des Regulators und AgrC die des Sensorproteins in diesem
Zwei-Komponenten-System zu übernehmen (siehe Abbildung 4). Ji et al. (1995, 1997)
entschlüsselten die Funktion der Proteine AgrB und AgrD. Sie isolierten ein Oktapeptid
mit der Funktion des Quorum-sensing-Signalmoleküls, das sowohl die Transkription an
dem Promotor P2, als auch die am divergierenden Promotor P3 aktiviert. In der
postexponentiellen Wachstumsphase von Staphylococcus aureus akkumuliert es in der
Umgebung. Man geht davon aus, dass dieses Peptid (AIP, autoinducing peptide) aus
einem Fragment des agrD-Genproduktes gebildet wird, das von AgrB aus dem agrD-
Propeptid prozessiert und anschließend sezerniert wird. Das integrale Membranprotein
AgrB übernimmt demnach die Aufgabe eines modifizierenden Enzyms (Ji et al., 1995,
1997; van Leeuwen et al., 2000). Der genaue Mechanismus vom Vorläufer-Protein zum
funktionsfähigen Pheromon sowie die Interaktion von AgrB mit AgrD, ist bislang
unbekannt. Zhang et al. (2004) fanden heraus, dass das Propeptid AgrD für das agr-
Quorum-sensing-Signal (AIP) von S. aureus ein Membranprotein ist, dessen N-
terminale Region in die zytoplasmatische Membran integriert ist. Diese
Membranintegration ist notwendig, damit ein reifes AIP entstehen kann. Es wird
postuliert, dass dieses so entstandene Signalpeptid mit dem Transmembranrezeptor-
Protein eines klassischen Zwei-Komponenten-Regulatorsystems, AgrC, interagiert,
durch die Übertragung einer Phosphatgruppe den Regulator AgrA aktiviert und in
24
Einleitung
Verbindung mit einem zweiten Transkriptionsfaktor, SarA, die Transkription des P2-
und P3-Promotors triggert (Ji et al., 1995). Das AIP wird kontinuierlich sezerniert, zur
RNA III-Aktivierung kommt es -im Sinne des Quorum-sensing-Systems- jedoch erst,
wenn eine bestimmte Schwellendosis des AIP erreicht ist (Balaban und Novick, 1995).
Das Akronym AIP für „autoinducing peptide“ bezieht sich auf die funktionsfähigen
AgrD-Peptide, die schon von AgrB modifiziert wurden (Lyon et al., 2000).
Abbildung 4: Modell des agr-Systems von S. aureus Das P2-Operon kodiert neben AgrD, dem Vorläufer-Protein des autoinduzierenden Peptides (AIP), noch
drei weitere Proteine, nämlich AgrA, AgrB und AgrC. AgrB ist ein notwendiges Protein für die
Prozessierung von AgrD zum funktionsfähigen AIP. Dieses bindet dann an die extrazelluläre Domäne der
AgrC-Histidin-Proteinkinase, die daraufhin in der zytoplasmatischen Domäne eine Autophosphorylierung
erfährt. Der Phosphatrest wird vermutlich auf AgrA übertragen, das in seiner phosphorylierten Form
zusammen mit dem Protein SarA des globalen Regulators sar, die Promotoren P2 und P3 aktiviert. So
entsteht ein autoinduzierender Kreislauf, der über eine erhöhte RNA III-Transkription die Expression von
Oberflächenproteinen vermindert und die Anzahl der sezernierten Proteine erhöht (modifiziert nach
Novick, 1999).
Zusammenfassend gelten folgende Prinzipien für den Aufbau und die Funktion des agr-
Locus: Das P2-Operon kodiert in Form eines Oktapeptids seinen eigenen Aktivator
(AIP), der als Ligand an den Signalrezeptor bindet, welcher ebenfalls durch dasselbe
Operon kodiert wird. Die Hauptfunktion des Signal-Transduktionspfades ist die
Aktivierung seines eigenen Promotors P2 und die des divergierenden P3-Promotors.
25
Einleitung
Der Netto-Effekt dieser dualen Aktivierung ist eine schnelle RNA III-Expression auf
einem sehr hohen Level. Vermutlich ist die RNA III nicht besonders aktiv, sodass eine
hohe Konzentration benötigt wird. Das dichte-sensitive Merkmal dieses Systems
offenbart sich in der graduellen Akkumulation des Aktivators während der
Wachstumsphase und der plötzlichen Aktivierung bei Erreichen der Schwellendosis (Ji
et al., 1995).
1.4.4 Interferenz von S.-aureus-Stämmen durch die hypervariable Region des agr-Genlocus
Das AgrD-Peptid eines S.-aureus-Stammes aktiviert seinen eigenen agr-Locus und
inhibiert die agr-Expression anderer Stämme. Man nimmt an, dass dieser inhibitorische
Effekt auf andere Stämme vorteilhaft für die eigene Population und das Bakterium
selbst bezüglich Kolonisierungs- oder Infektionsort ist. Mayville et al. (1999) zeigten,
dass es diese Sequenzvariationen für agr tatsächlich gibt und zwar nicht nur für den
Autoinducer (AgrD), sondern auch für sein modifizierendes Protein (AgrB) und den
Rezeptor (AgrC). Dass diese drei Gene, agrD, agrB und agrC, von der
Sequenzvariation betroffen sind, stützt die Vorstellung, dass sie im Sinne eines Zwei-
Komponenten-Signaltransduktionsmechanismus zusammenwirken. Diese hypervariable
Region, agrBDC, besteht nicht aus den vollständigen drei Genen, sondern aus den C-
terminalen zwei Dritteln von agrB, dem kompletten agrD-Gen und der N-terminalen
Hälfte von agrC (siehe Abbildung 5) (Jarraud et al., 2000).
26
Einleitung
Abbildung 5: Hypervariable Region des agr-Genlocus Im oberen Teil des Schemas ist ein Shuttle-Vektor zu sehen, pRN7062, der zwei Segmente des agr-Locus
enthält, agrA und agrC sowie die P2- und P3-Region. Die C-terminalen zwei Drittel von agrB, das agrD-
Gen und die N-terminale Hälfte von agrC bilden die hypervariable Region des agr-Locus, welche die
Spezifität des Autoinducers und Rezeptors dieses Zwei-Komponenten-Systems ausmacht. Diese Gene für
das dichte-sensitive und sich selbst verstärkende Zwei-Komponenten-System liegen auf dem P2-Operon.
Der Effektor der Zielgen-Transkription, die RNA III, ist auf dem P3-Operon lokalisiert. Bei Bindung des
Autoinducers an den Rezeptor werden P2 und P3 aktiviert (aus Jarraud et al., 2000).
Auf der Basis dieser Autoinducer-Rezeptor-Spezifität, nämlich der
Aminosäurensequenz des AIP und des korrespondierenden Rezeptors, kann S. aureus in
vier verschiedene agr-Interferenzgruppen (I-IV) eingeteilt werden (siehe Material und
Methoden, Abbildung 8). Es gibt eine Besonderheit der Interferenzgruppe I des agr-
Genlocus, denn sie besitzt noch eine Subgruppe, Ia. Dies ist eine Variante, die sich von
I nur darin unterscheidet, dass ein Fragment aus 174 Basenpaaren fehlt und durch ein
anderes aus 270 bp ersetzt wurde (Papakyriacou et al., 2000). Innerhalb einer Gruppe
findet eine Kreuzaktivierung der agr-Antwort durch das autoinduzierende Peptid statt,
wohingegen die agr-Expression von anderen agr-Interferenzgruppen unterdrückt wird.
Dies bestätigte ein Vergleich der agrBDC-Sequenzen von S.-aureus-Stämmen, denn sie
waren innerhalb einer Gruppe identisch, verglichen mit den agrBDC-Sequenzen anderer
Gruppen wiesen sie aber deutliche Unterschiede auf (Ji et al., 1997). Lyon et al. (2000)
entdeckten, dass sowohl die Aktivierung innerhalb einer Gruppe als auch die
Inhibierung zwischen den Gruppen über den gruppenspezifischen AgrC-Rezeptor
vermittelt werden.
27
Einleitung
Jarraud et al. (2002) fanden die agr-Interferenzgruppe III gehäuft bei menstruellen
TSST- (Toxic-Schock-Syndrom-Toxin-) Stämmen, wohingegen die Gruppen I und II
nicht bei bestimmten klinischen Symptomen gehäuft auftraten.
Sie entdeckten außerdem die vierte der bisher bekannten Interferenzgruppen, bei der das
AIP (autoinducing peptide) erwartungsgemäß deutliche Veränderungen zu dem der
Gruppen II und III aufwies. Verglichen mit dem Autoinducer der Interferenzgruppe I
zeigte sich jedoch bis auf den Austausch einer Aminosäure, Aspartat gegen Tyrosin,
kein Unterschied. Der agr-Locus der Gruppe IV ist demnach nahe verwandt mit dem
der Gruppe I. Diese Annahme stimmt mit der Beobachtung überein, dass die RNA III-
Synthese in Stämmen der agr-Gruppe I durch die Zugabe des Überstandes von S.
aureus der agr-Interferenzgruppe IV nicht gehemmt sondern stimuliert wird. Diese
Aktivierung erreichte ungefähr 30% der agr-Aktivierung, die bei Zusatz des
Überstandes der gleichen Interferenzgruppe (I) aufgetreten ist. Eine weitere
Besonderheit der agr-Interferenzgruppe IV ist ihre Korrelation zu S.-aureus-Stämmen,
die ein exfoliatives Toxin produzieren. Diese Korrelation ist aber nicht besonders eng,
da auch Stämme der Gruppen I und II exfoliative Toxine produzieren (Jarraud et al.,
2000).
1.4.5 Nachweise von agr in anderen Staphylokokken-Spezies
Bei Staphylococcus epidermidis, der klinisch wichtigsten Koagulase-negativen Spezies,
konnte ebenfalls ein agr-System identifiziert werden, das bei der Wachstumsphasen-
abhängigen Regulation der Virulenzfaktoren eine zentrale Rolle spielt. Die Homologie
zwischen dem agr-Locus von S. aureus und S. epidermidis beträgt 68% (Kies et al.,
2003; Otto et al., 1998; van Wamel et al., 1995). Unter Staphylokokken wurde agr stark
konserviert. Studien der AIPs von Staphylococcus epidermidis haben im Allgemeinen
das bestätigt, was von ihnen bereits bei S. aureus bekannt ist (Kornblum et al., 1991;
Lyon et al., 2000; Otto, 2001; Otto et al., 1998, 1999). Dufour et al. (2002) fanden
durch Hybridisierung in mindestens 14 anderen Staphylokokken-Spezies oder
Subspezies Sequenzen, die mit dem agr-Regulon verwandt sind. Dieser
Regulationsmechanismus scheint somit unter Staphylokokken weit verbreitet zu sein.
28
Einleitung
1.5 Komplexe Interaktionen der beiden globalen Regulatoren agr und sar
Neben agr beeinflussen noch andere Regulatorsysteme die RNA III-Transkription. Der
sar- (staphylococcal accessory regulator-) Locus ist zum Beispiel ein weiterer
entscheidender Regulator. Er besteht aus drei überlappenden Transkripten, sarA, sarB
und sarC, die einer vom Wachstumszyklus abhängigen Regulation unterliegen, wobei
sarA und sarB in der frühen logarithmischen Wachstumsphase und sarC in der späten
stationären Phase die höchsten Konzentrationen zeigen. Sie werden von drei getrennten
Promotoren (P1, P2, P3) transkribiert; das Terminationssignal am 3’-Ende von allen
drei Transkripten ist jedoch identisch (Bayer et al., 1996). Das sarA-Transkript ist ein
regulatorisches Molekül, das die Expression der RNA II am Promotor P2 des agr-
Operon triggert und dadurch indirekt Einfluss auf die RNA III-Produktion nimmt
(Heinrichs et al., 1996).
Es wird angenommen, dass die beiden globalen Regulatoren agr und sar auf folgende
Weise interagieren:
Im Gegensatz zu agr aktiviert der sar-Locus sowohl die Synthese extrazellulärer als
auch Zellwand-assoziierter Proteine. SarA bindet zwischen der P2- und P3-
Promotorregion, der sogenannten Interpromotorregion. Die Bindungsstelle liegt
allerdings näher an P2, was die höhere Affinität zu diesem erklärt. Außerdem wirkt sich
eine sar-Mutation mehr auf die Transkription von RNA II als von RNA III aus (Chien
und Cheung, 1998). Es spricht vieles für die Annahme, dass sar den agr-Genlocus in
der Synthese von Exoproteinen kontrolliert.
Diese vereinfachte Darstellung wird dem komplexen Geflecht von Wechselwirkungen
zwischen agr und sar nicht gerecht. An dieser Stelle würde eine profundere Betrachtung
jedoch zu weit führen, zumal agr und sar nicht die einzigen Regulatorsysteme sind, die
Einfluss auf die Virulenzfaktorproduktion nehmen. Die Regulation der Synthese von
extrazellulären und Zellwand-assoziierten Proteinen von Staphylococcus aureus ist ein
äußerst komplexer und sorgfältig koordinierter Prozess, der von vielen Faktoren
beeinflusst wird. In diesem Netz von Interaktionen sind noch viele Wege unbekannt und
die jetzt schon bestehende Komplexität macht eine überschaubare Ansicht unmöglich
(Cheung und Projan, 1994; Cheung und Ying, 1994; Gertz et al., 2000; Heinrichs et al.,
1996; Smeltzer et al., 1993).
29
Einleitung
1.6 Fragestellung
Es gibt seit langem in vielen Ländern die Beobachtung, dass sich einige MRSA-Stämme
besonders erfolgreich, zum Teil weltweit ausbreiten und zu einem enormen
epidemiologischen Problem werden. Andere Stämme hingegen treten nur sporadisch in
Erscheinung und sind von untergeordneter klinischer Relevanz. Somit entstehen
weltweit Epidemien, die von wenigen MRSA-Stämmen verursacht werden. Dieser
epidemiologische Unterschied führt zu der Frage, was den epidemischen MRSA-
beziehungsweise S.-aureus-Stämmen die enorme Fähigkeit zur Ausbreitung verleiht.
Welche Faktoren sind daran beteiligt, dass ein Stamm epidemisch wird, sich schnell
über große Entfernungen ausbreitet und zu einem erheblichen klinischen Problem wird?
Dieses Phänomen ist bisher nur wenig erforscht.
Es ist allgemein anerkannt, dass die Pathogenität eines S.-aureus-Stammes von seiner
Ausstattung mit Virulenzfaktoren abhängt. Neben der Fähigkeit zur Produktion von
Virulenzfaktoren ist auch die Regulation ihrer Expression in den verschiedenen
Infektionsstadien für die Pathogenität von entscheidender Bedeutung.
Papakyriacou et al. (2000) entdeckten zwei epidemische Stämme von S. aureus, die für
die Hälfte aller Infektionen in Kanada verantwortlich waren und einen einheitlichen
Phänotyp aufwiesen. Die Sekretion von Exoproteinen war bei ihnen begrenzt zu
Gunsten einer erhöhten Bindungsfähigkeit an Wirtszellproteine. Dieser spezielle
Phänotyp könnte der Grund sein für die starke Prävalenz dieser Stämme unter
klinischen Isolaten.
Durch seine regulatorische Funktion auf die Expression von Virulenzfaktoren und der
Variabilität seines zentralen Segmentes, agrBDC, könnte der agr-Genlocus einen
entscheidenden Einfluss auf die Epidemiologie von MRSA ausüben. Deshalb erscheint
es sinnvoll, hier nach einer Erklärung zu suchen. Die Entdeckung der agrBDC-
Interferenzgruppen gab Anlass zu der These, dass möglicherweise ein bestimmter agr-
Interferenz-Typ mit Epidemiestämmen in Verbindung gebracht werden kann. Dies
sollte in der vorliegenden Arbeit genauer betrachtet werden.
30
Einleitung
Als Erstes galt es in dieser Studie herauszufinden, ob es in den untersuchten Kliniken
epidemische MRSA-Stämme gibt. Dazu wurden die MRSA-Isolate der
Stammsammlung des Instituts für Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum nach
epidemiologischen Kriterien klassifiziert. Weiterhin sollten die in Bochum
vorherrschenden Stämme mit anerkannten nationalen und internationalen
Epidemiestämmen verglichen werden.
Nachfolgend sollte nach Auffälligkeiten in der Verteilung der MRSA-Stämme auf die
Kliniken gesucht werden, damit mögliche Zusammenhänge von MRSA-Klonen mit den
Kliniken hergestellt werden können. Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht jedoch die
Suche nach einer Korrelation zwischen den vier bekannten agrBDC-Interferenzgruppen
und den epidemiologischen Eigenschaften der MRSA-Stämme, denn der agr-Locus gilt
als eine mögliche Erklärung für das unterschiedliche epidemiologische Verhalten der
MRSA-Stämme. Die Erforschung der Regulatorsysteme und der bakteriellen
Kommunikation könnten für zukünftige therapeutische Entwicklungen von Bedeutung
sein.
31
Material und Methoden
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Chemikalien
Alle verwendeten Chemikalien waren von höchstem Reinheitsgrad und wurden, falls
nicht anders angegeben, von den Firmen Merck Eurolab (Darmstadt) und
Sigma/Aldrich (München) bezogen.
2.1.2 Stämme
Die für diese Arbeit ausgewählten MRSA- (Methicillin-resistente Staphylococcus
aureus-) Stämme waren klinische Isolate aus dem Institut für Medizinische
Mikrobiologie der Stadt Bochum, zugesandt aus einer Gemeinschaftspraxis und 19
Kliniken Nordrhein-Westfalens, insbesondere aus Bochum und Städten der näheren
Umgebung (siehe Tabelle 1). Der Einfachheit halber werden im Folgenden 20 Kliniken
als Einsender beschrieben. Aus Gründen des Datenschutzes wurden die Kliniken selbst
nicht genannt, sondern durch Buchstaben gekennzeichnet. Insgesamt wurden in der Zeit
vom 13.02.1998 bis zum 31.12.2000 417 MRSA-Stämme in die Studie aufgenommen.
Bei einer nachfolgend durchgeführten Aktualisierung der Untersuchung stieg die
Anzahl der MRSA-Stämme um 744 auf 1161. Einige MRSA der Stammsammlung
blieben dabei unberücksichtigt, da sich deren einsendende Kliniken weit außerhalb des
Einzugsbereiches dieser Studie befinden oder nicht mehr sicher identifiziert werden
konnten.
Das Institut für Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum identifizierte im
Grampräparat alle Stämme als grampositive Kokken; der Nachweis von Katalase mit
H2O2 und der des Fibrinogenrezeptors mit dem Clumping-factor-Test (CF) waren
positiv. Bei nicht eindeutig zu differenzierenden Stämmen wurde zusätzlich das
VITEK-System (bioMerieux, Nürtingen) mit der GPI-Karte (gram-positiv identification
card) Nr. V 1305 eingesetzt.
32
Material und Methoden
Die als Kontrollstämme verwendeten S. aureus ATCC 38591 (Oxacillin-resistent) und
ATCC 25923 (Oxacillin-sensibel) sind Referenzstämme der „American Type Culture
Collection“.
Tabelle 1: Die 20 Kliniken, aus denen die MRSA-Isolate (Gesamtzahl: 1161) zugesandt wurden
KLINIK ANZAHL DER ISOLATE
A 360
B 294
C 110
D 81
E 37
F 34
G 34
H 33
I 26
J 26
K 22
L 13
M 18
N 18
O 14
P 12
Q 11
R 9
S 6
T 3
33
Material und Methoden
Die Pulsfeldgelelektrophorese- (PFGE-) Muster der für diese Arbeit verwendeten
Stämme wurden mit denen folgender anerkannter epidemischer MRSA und MSSA
verglichen:
CMRSA-1A, -1B, -1D = -1E, -2A, -3A, -3B, -4 sind MRSA-Stämme des
Department of Microbiology, Sunnybrook and Women's College Health Science
Centre, Toronto, Ontario, Canada (Papakyriacou et al., 2000).
Diese MRSA wurden aus der Sammlung des Canadian Nosocomial Infection
Abbildung 10: Aktualisierung der PFGE-Gruppen-Einteilung der Bochumer
MRSA-Stammsammlung
Angelehnt an Abbildung 9 wurde in diesem Diagramm der Zeitraum der Datenerfassung bis Januar 2004
erweitert und PFGE-Muster-Übereinstimmungen einiger Gruppen mit anerkannten Epidemiestämmen
ergänzt. Durch unterschiedliche Farbkodierung der beiden Beobachtungszeiträume wird die zeitliche
Entwicklung der Gruppen veranschaulicht.
Die im zweiten Beobachtungszeitraum (01.01.2001–12.01.2004) um 744 Isolate
erweiterte MRSA-Stammsammlung enthielt 22 neue sporadische Stämme, 46
zusätzliche Isolate bei den unklaren und 676 bei den epidemischen Gruppen. Das führte
zu einem Anstieg der PFGE-Gruppen (epidemisch und unklar) von vormals 29 auf 45
und der sporadischen Stämme von 37 auf 59. Die Gruppe 34 stellt im eigentlichen Sinn
keine PFGE-Gruppe dar, sondern symbolisiert die sporadischen Stämme.
Innerhalb der einzelnen PFGE-Gruppen ließen sich mit zunehmender Gruppengröße oft
mehrere Subgruppierungen bilden, die aus Gründen der Übersichtlichkeit jedoch im
Weiteren unerwähnt bleiben. Die Gruppen 30 und 32 wurden in dieser Arbeit nicht
berücksichtigt (siehe Abbildung 10), da sich die Einsender der Isolate weit außerhalb
des Einzugsbereichs dieser Studie befinden.
Besonders ausgeprägt war beim Vergleich der beiden Beobachtungszeiträume der
Anstieg der epidemischen Stämme, deren Anteil am gesamten Spektrum von vormals
62,8% auf 80,8% angestiegen war. Der Anteil der unklaren Stämme sank von 28,3% auf
14,1% und derjenige der sporadischen Stämme fiel von 8,9% auf 5,1% (siehe Tabellen
5 und 6).
Tabelle 6: Aktualisierung der Tabelle 5 auf den Stand Januar 2004
Beim Vergleich der Ergebnisse der Tabellen 5 und 6 fällt im zeitlichen Verlauf eine prozentuale Zunahme
des epidemischen Anteils von Stämmen am Gesamtvorkommen auf, und zwar von 62,8% auf 80,8%.
Gegenläufig verhalten sich die unklaren Gruppen, deren Anzahl an Isolaten insgesamt weniger stark
anstieg. Ihr Anteil sank von 29,3% auf 14,1%. Der Anteil der sporadischen Stämme nahm ebenfalls von
8,9% auf 5,1% ab.
EPIDEMIOLOGISCHE KLASSIFIKATION DER 1161 ISOLATE
Epidemisch: N ≥ 20 Unklar: 1 < N < 20 Sporadisch: N = 1
(insgesamt: 938) (insgesamt: 164) (insgesamt: 59)
80,8 % 14,1 % 5,1 %
49
Ergebnisse
Mit 676 zusätzlichen Isolaten ist bei den epidemischen MRSA-Stämmen der größte
Anstieg zu erkennen. Die Anzahl der epidemischen PFGE-Gruppen ist von ursprünglich
7 auf 11 angestiegen und die der unklaren Gruppen von 22 auf 45.
Im Verlauf der gesamten Studie konnten bei einigen Gruppen deutliche Veränderungen
beobachtet werden. Einige von ihnen zählten im ersten etwa dreijährigen
Beobachtungszeitraum (13.02.1998–31.12.2000) zu den unklaren Gruppen und sind
durch deutlichen Anstieg von Isolaten während der folgenden dreijährigen
Datenerfassung (01.01.2001–12.01.2004) epidemisch geworden (Gruppen 2, 9 und 11).
Die Gruppe 35, mit 137 Isolaten der drittgrößte epidemische MRSA-Stamm, ist sogar
erst im zweiten Beobachtungszeitraum entstanden. Vorher gab es nur ein Isolat mit
diesem Muster, das somit zu den sporadischen zählte. Diesem einen Isolat folgten in
den anschließenden Jahren 136 Isolate. Hier ist demnach ein vormals sporadischer
Stamm im Verlauf von drei Jahren zu einem der häufigsten klinisch relevanten
Epidemiestämme geworden. Die unklaren kleinen Gruppen 19, 40 und 42 sind ebenfalls
aus ursprünglich sporadischen Stämmen entstanden.
Beim Vergleich der beiden Beobachtungszeiträume (siehe Abbildung 10) ist erkennbar,
dass die Gruppen 2, 3, 7, 9, 11, 13, 16 (Berliner Epidemiestamm) und vor allem 35
deutlich an Isolaten zugenommen haben. Für die Gruppen 7, 13, und 35 lässt sich sogar
eine Zunahme von weit mehr als 100 Isolaten verzeichnen. Gruppe 13 ist insgesamt mit
190 Isolaten die größte und hatte mit 156 Isolaten auch den erkennbarsten Anstieg. Die
Gruppe 6, die für den Zeitraum bis Ende 2000 mit 52 Isolaten die größte Gruppe war,
ist mit 9 Isolaten nur geringfügig angestiegen.
Der Anteil der vier größten Gruppen mit jeweils über 100 Isolaten an den insgesamt
1161 Isolaten beträgt 51,2%. Im Einzelnen sind das für die PFGE-Gruppe 13 16,4%, für
die Gruppe 7 13,5% sowie für die Gruppe 35 11,8% und die Gruppe 16 9,6% (siehe
Abbildung 10). Da im zweiten Beobachtungszeitraum nur vier neue epidemische PFGE-
Gruppen entstanden sind, haben sich die 676 zusätzlichen epidemischen Isolate
hauptsächlich auf die schon bestehenden epidemischen Gruppen aufgeteilt. Durch den
enormen Anstieg einiger schon bestehender epidemischer Gruppen ist der Abstand zu
den unklaren PFGE-Gruppen deutlicher geworden. Dies untermauert die Annahme, dass
es sich in diesen Fällen um epidemische Stämme handelt.
50
Ergebnisse
Die großen Epidemiegruppen 13, 7 und 16 mit mehr als 100 Isolaten weisen über beide
Beobachtungszeiträume hinweg einen relativ stabilen zeitlichen Verlauf auf.
Im Gegensatz dazu fällt auf, dass der epidemischen PFGE-Gruppe 1 innerhalb der drei
Jahre des zweiten Beobachtungszeitraums nur zwei weitere Isolate zugeordnet werden
konnten, die am 19.03.2001 und am 06.08.2003 als Dauerkulturen in die
Stammsammlung aufgenommen wurden. Auch bei PFGE-Gruppe 5 (Süddeutscher
Epidemiestamm) ist in diesem Zeitraum nur ein weiteres Isolat hinzugekommen. Das
letzte Isolat mit dem PFGE-Muster von Gruppe 5 wurde am 28.02.2001 der Sammlung
hinzugefügt. Diese beiden Gruppen scheinen somit im zeitlichen Verlauf an Bedeutung
verloren zu haben. Der Zeitraum, in dem der Begriff „epidemisch“ Gültigkeit besitzt
und auf eine PFGE-Gruppe angewendet werden darf, ist nicht definiert. Bei isolierter
Betrachtung der zurückliegenden drei Jahre müsste Gruppe 1 als unklar und Gruppe 5
als sporadisch gelten. Die PFGE-Gruppe 35, die mit 137 Isolaten den dritthäufigsten
Epidemiestamm darstellt, erlangte ihre epidemiologische Bedeutung, im Gegensatz zu
den meisten anderen Gruppen, ausschließlich im zweiten Abschnitt der Studie
(01.01.2001–12.01.2004). Vorher galt dieser Stamm sporadisch.
3.2 PFGE-Muster-Vergleich der Bochumer MRSA-Sammlung mit
anerkannten nationalen und internationalen Epidemiestämmen
Die PFGE-Bandenmuster der MRSA-Sammlung des Instituts für Medizinische
Mikrobiologie der Stadt Bochum wurden mit bekannten deutschen, amerikanischen und
kanadischen Epidemiestämmen sowie einem österreichischen und englischen
Epidemiestamm verglichen. Dabei zeigten sich in einigen Fällen große
Übereinstimmungen in der Anordnung der Muster. Ein Vergleich mit sechs anerkannten
deutschen Epidemiestämmen (Süddeutscher-, Berliner-, Barnimer-, Rhein-Hessen-,
Hannoverscher-, Norddeutscher-Epidemiestamm) führte in zwei Fällen zu
Übereinstimmungen (siehe Abbildung 11).
51
Ergebnisse
Abbildung 11: Screenshot, Molecular Analyst Fingerprinting Software, Übereinstimmung mit
PFGE-Bandenmustern deutscher Epidemiestämme
In diesem Screenshot der für den Bandenmuster-Vergleich verwendeten Software sind exemplarisch die
Übereinstimmungen von zwei PFGE-Gruppen mit anerkannten deutschen Epidemiestämmen (siehe
Material und Methoden, Tabelle 3) dargestellt. Rechts sind neben den Bandenmustern die Dauerkultur-
Nummern aufgeführt, links ist der Grad der Verwandtschaft der einzelnen Muster durch ein
Dendrogramm zu erkennen. Die beiden anerkannten deutschen Epidemiestämme sind durch rote Pfeile
gekennzeichnet. Auf dem oberen Bild ist die nahe Verwandtschaft des Süddeutschen Epidemiestammes
mit den Isolaten der Gruppe 5 zu erkennen, das untere Bild zeigt die Ähnlichkeit des Berliner
Epidemiestammes zur Gruppe 16.
52
Ergebnisse
Wie erwartet bestand bei diesem Vergleich keine Verwandtschaft der anerkannten
Epidemiestämme zu sporadischen Stämmen der Bochumer Stammsammlung. Das
PFGE-Muster der Gruppe 4, deren epidemiologische Bedeutung mit zwei Isolaten
unklar ist, weist eine große Ähnlichkeit zu dem des Hannoverschen Epidemiestammes
auf und das Muster der Gruppe 5, die mit 34 Isolaten zu den epidemischen Stämmen
zählt, entsprach dem des Süddeutschen Epidemiestammes. Weiterhin zeigten sich
übereinstimmende PFGE-Muster der Gruppe 16 -mit 111 Isolaten die viertgrößte
Gruppe- und dem Berliner Epidemiestamm (siehe Abbildung 10). Die drei größten
Epidemiegruppen (in absteigender Reihenfolge: 13, 7, 35) entsprachen jedoch keinem
der oben genannten deutschen Epidemiestämme.
Weitere PFGE-Muster-Vergleiche wurden mit kanadischen MRSA-Stämmen des
Department of Microbiology, Sunnybrook and Women’s College Health Science Center
in Toronto (Papakyriacou et al., 2000) und nordamerikanischen epidemischen MRSA-
und MSSA-Stämmen des Department of Microbiology and Immunology, University of
Oklahoma Health Sciences Center (Booth et al., 2001) durchgeführt. Zwei anerkannte
europäische Epidemiestämme, der EMRSA-16 aus Großbritannien und der Wiener–
Epidemiestamm, wurden ebenfalls hinsichtlich verwandter PFGE-Muster mit der
Bochumer Stammsammlung geprüft (siehe Material und Methoden 2.1.2).
Beim Vergleich der internationalen Stämme mit den 1161 MRSA-Stämmen aus
Nordrhein-Westfalen waren nur wenige Gemeinsamkeiten zu erkennen. Es fand sich ein
PFGE-Muster, das in mehreren Ländern und auch in der Bochumer Stammsammlung
gefunden wurde. Das Muster dieses Isolates aus Bochum mit der Dauerkultur-Nummer
429, das am 07.12.1999 in die Stammsammlung aufgenommen wurde, war im ersten
Untersuchungszeitraum bis Dezember 2000 einzigartig und somit den sporadischen
Stämmen zugeordnet. Bei der nachfolgenden Aktualisierung bis Januar 2004 hatte sich
ein weiteres Isolat mit dem gleichen Muster gefunden, sodass die Gruppe 19 mit zwei
Isolaten entstanden ist.
Obwohl diese beiden Stämme in der Region um Bochum nicht epidemisch sind,
entspricht ihr Bandenmuster dem von epidemischen Stämmen außerhalb Deutschlands.
Sie weisen einen hohen Verwandtschaftsgrad zu den PFGE-Mustern des kanadischen
Epidemiestammes CMRSA-4 (Papakyriacou et al., 2000), SA 506 aus den USA (Booth
et al., 2001) und EMRSA-16 aus Großbritannien (Cox et al., 1995) auf.
53
Ergebnisse
Demzufolge entsprechen sich die MRSA-Stämme aus den vier Ländern Deutschland,
Kanada, den USA und Großbritannien im hohen Maße (siehe Abbildung 12).
Abbildung 12: Übereinstimmende PFGE-Bandenmuster von MRSA-Isolaten aus Deutschland, Kanada, den USA und Großbritannien Der oberste Stamm, EMRSA-16, ist ein anerkannter Epidemiestamm aus Großbritannien; der zweite von
oben ist ein kanadischer, darunter der MRSA-Epidemiestamm aus den USA und ganz unten der Stamm,
der in Bochum zwei Mal innerhalb von sechs Jahren auftrat und den unklaren PFGE-Gruppen zugeordnet
wurde (PFGE-Gruppe 19). Bei Betrachtung der Bandenmuster fällt die enge Verwandtschaft der Isolate
untereinander auf. Eine Übereinstimmung von 96,2% - 100% der Bandenmuster bei Anwendung des
Algorithmus Jeffrey’s x coefficient in der rechnergestützten Clusteranalyse (siehe Material und Methoden
2.2.1) stützt die These, dass diese vier Bandenmuster einen gemeinsamen MRSA-Stamm repräsentieren.
EMRSA-16 ist bisher nicht in Deutschland beschrieben worden (siehe Material und
Methoden, Tabelle 3). Vorausgesetzt, es handelt sich bei den PFGE-Bandenmustern in
Abbildung 12 um einen gemeinsamen MRSA-Stamm, dann wurde EMRSA-16 als
PFGE-Gruppe 19 mit zwei Isolaten in Bochum nachgewiesen (siehe Abbildung 10).
3.3 Krankenhaus-Assoziation der MRSA-Stämme
Obwohl von einigen Kliniken nur sehr wenig Material zur Verfügung stand, konnte in
dieser Arbeit sichergestellt werden, dass die Isolate der epidemischen Gruppen aus
unterschiedlichen Krankenhäusern stammen. Die Isolate der PFGE-Gruppe 1, die
kleinste epidemische Gruppe, stammen aus zwei verschiedenen Krankenhäusern und
die anderen 10 epidemischen Gruppen enthalten MRSA-Isolate aus mindestens vier
verschiedenen Kliniken.
54
Ergebnisse
Um Auffälligkeiten hinsichtlich des Anteils der Kliniken an den PFGE-Gruppen
auszumachen, wurde untersucht, ob es PFGE-Gruppen gibt, deren Isolate hauptsächlich
aus einer bestimmten Klinik stammen (siehe Abbildung 13). Umgekehrt wurden für die
vier Kliniken mit über 100 eingesandten Isolaten die jeweils häufigsten MRSA-Stämme
regulators control virulence gene expression in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 3129-3134
106
7 Danksagung
Bedanken möchte ich mich bei all denen, die mich bei der Durchführung der Experimente und
bei der Anfertigung der Dissertationsschrift unterstützt haben.
Zu großem Dank verpflichtet bin ich Prof. Dr. med. S. G. Gatermann für die Überlassung des
Themas sowie die intensive, ausdauernde und freundliche Betreuung.
Mein besonderer Dank gilt allen Mitarbeitern des Instituts für Medizinische Mikrobiologie
der Ruhr-Universität Bochum, ohne deren wohlwollende und kompetente Hilfe diese Arbeit
nicht möglich gewesen wäre.
Insbesondere möchte ich mich bei Frau Susanne Friedrich und Michaela Stieglitz-Rumberg
bedanken für die kontinuierliche Unterstützung bei der Durchführung der Dissertation.
Helen Papakyriacou und Mary C. Booth danke ich für die Überlassung der epidemischen
MRSA-Stämme.
Des Weiteren möchte ich mich bei Christof Albers für die fachkundigen sprachlichen
Korrekturen und hilfreichen Anregungen bedanken. Der gesamten Familie Albers danke ich
für die moralische und kulinarische Unterstützung.
Kaschayar Saadat-Gilani und Christian Kersting möchte ich für die Ratschläge bei den
Abbildungen danken.
Nicht zuletzt bedanke ich mich bei meinen Eltern für die liebevolle Unterstützung meines
Studiums.
Vor allem gilt aber mein zutiefst empfundener Dank meiner lieben und geduldigen Freundin
Nicole.
107
Sven Hengesbach, Geiststraße 84, 48151 Münster
Curriculum Vitae
Sven Hengesbach geboren am 08.10.1975 in Meschede
Schulausbildung 1982 – 1986 Marien-Grundschule in Meschede 1986 – 1995 Gymnasium der Benediktiner in Meschede, Abschluss Abitur Zivildienst Juli 1995 – Juli 1996 Pflegehilfe im St. Walburga-Krankenhaus, Meschede Hochschulausbildung Oktober 1996 – Oktober 2002 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum August 1998 Physikum August 1999 1. Staatsexamen August 2001 2. Staatsexamen Oktober 2002 3. Staatsexamen
Famulaturen März 1999 Allgemein-Chirurgie, Kingston Hospital, London September 1999 Innere Medizin, St. Walburga-Krankenhaus, Meschede Februar 2000 Allgemeinmedizinische Praxis, Meschede März 2000 Urologische Praxis, Meschede Juli/ August 2000 Viszeral- und Thoraxchirurgie, Charité, Berlin Februar/ März 2001 Radiologie, St. Josefs-Hospital, Bochum Praktisches Jahr Oktober 2001 – Oktober 2002 St. Josefs-Hospital Bochum (Universitätsklinik) Allgemein- und Gefäßchirurgie, Innere Medizin,
Anästhesie Berufspraxis Januar 2003 – Juni 2004 Arzt im Praktikum in der Chirurgischen Klinik I, Clemenshospital Münster Juli 2004 – Dezember 2004 Aktualisierung der Daten für die Dissertation und journalistische Hospitationen beim ZDF und NDR Ab Januar 2005 Assistenzarzt in der Inneren Klinik I, Raphaelsklinik Münster