Dampak Suplementasi Probiotik -Bacillus Sp.- Selama Perkembangan Larva Gilthead Sea Bream -Sparus Aurata, L.

Dampak Suplementasi Probiotik (Bacillus sp.) Selama Perkembangan Larva Gilthead Sea Bream (Sparus aurata, L.)

T E R J E M A H A N

Disadur dari makalah :

Effects of Probiotic (Bacillus sp.) Supplementation during Larval Development of Gilthead Sea Bream (Sparus aurata, L.)

Oleh:

Nihan Arığ1, Cüneyt Suzer1,*, Alize Gökvardar1, Fatih Başaran2, Deniz Çoban3, Şükrü Yıldırım1, H. Okan Kamacı1, Kürşat Fırat1, Şahin Saka1

Diterjemahkan Oleh :

ROMI NOVRIADI, S.Pd,kim., M.Sc

KEMENTERIAN KELAUTAN DAN PERIKANAN DIREKTORAT JENDERAL PERIKANAN BUDIDAYA

BALAI BUDIDAYA LAUT BATAM 2014

ABSTRAK Pada kajian ini, efek pemberian probiotik komersil, Bacillus sp., dianalisa pada parameter pertumbuhan dan aktivitas pencernaan protease (alkalin dan asam protease) di ikan gilthead sea bream, selama fase perkembangan larva sampai pada hari ke-40. Probiotik disuplementasi dengan tiga kali pengulangan mulai dari hari ke 3 bersamaan dengan mulainya pemberian pakan secara eksogen. Pada kelompok uji coba, probiotik dimasukkan ke dalam kultur rotifer dan air bak sampai 20 hari setelah menetas. Juga, pada kelompok control yang tidak menerima probiotik. Pada kelompok yang diberi perlakuan, aktifitas spesifik dari protease alkalin secara nyata lebih tinggi (P<0.05) pada larva dibandingkan dengan kelompok kontrol. Aktifitas asam protease tidak terpengaruh oleh suplementasi probiotik. Namun, aktivitas asam protease relative lebih tinggi pada kelompok yang diberi perlakuan dibandingkan kelompok kontrol (P<0.05). Disamping itu, tidak ada perbedaan nyata yang ditemukan pada tingkat kelulushidupan pada kedua kelompok (8,5% lebih tinggi) dan tingkat pertumbuhan spesifik (0,7% lebih tinggi) pada larva S. aurata yang menerima suplementasi probiotik melalui rotifer dengan air jika dibandingkan dengan kelompok control (P>0.05). Sebagai akibatnya, aktivitas spesifik alkalin dan asam protease dapat secara nyata meningkat dengan pemberian Bacillus sp. Pada pakan hidup dengan air dan oleh karena itu; metoda ini akan lebih efektif untuk memperoleh parameter pertumbuhan dan kondisi nutrisi pada larva S. aurata yang relatif lebih baik. Kata kunci: Bacillus, probiotik, aktivitas enzim pencernaan, pertumbuhan, kelulushidupan, Sparus aurata

Pendahuluan Selama satu dekade terakhir, penggunaan obat-obatan kimia, khususnya antibiotika, telah dibatasi karena adanya perkembangan resistensi pada beberapa patogen. Oleh karena itu, dalam upaya untuk mengendalikan dan/atau menghilangkan penggunaan antibiotika dalam sistem akuakultur, upaya lebih jauh telah dilakukan untuk memperoleh prinsip probiotik. Situasi ini mempercepat penggunaan metoda alternatif sebagai jalan keluar untuk permasalahan ini. Sudah merupakan hal yang umum dilaporkan bahwa dalam rangka mengoptimalkan lingkungan akuatik, mencegah penyakit ikan dan meningkatkan pengendalian patogen pada sistem kultur, suplementasi probiotik merupakan metoda yang umum. Probiotik telah diidentifikasi sebagai mikroorganisme hidup yang berkoloni dalam saluran pencernaan dan/atau suplemen mikrobial yang berasal dari hewan yang berdampak pada kesehatan ikan dengan meningkatkan keseimbangan mikroba di saluran pencernaan (Gatesoupe, 1999, 2007; Verschuere dkk., 2000; Balcázar dkk., 2006; Wang dkk., 2008; Dimitroglou dkk., 2011). Saat ini, probiotik dalam akuakultur telah secara umum diberikan sebagai suplemen untuk mengendalikan penyakit dan juga meningkatkan parameter pemberian pakan dan pemeliharaan. Seperti yang telah banyak disebutkan oleh beberapa penulis, bakteri jenis Bacillus secara luas digunakan sebagai bakteri probiotik pada nutrisi hewan akuatik, seperti: Bacillus cereus, B. toyoi, B. licheniformis and B. subtilis (Balcázar dkk., 2006; Ziaei-Nejad dkk., 2006; Wen-Ying dkk., 2010; Avella dkk., 2010; Jafaryan dkk., 2011; Wu dkk., 2012; Mohapatra dkk., 2012). Efek yang berguna dari probiotik ini sebagai tambahan suplementasi nutrisi termasuk tingkat pertumbuhan yang relatif lebih tinggi, efisiensi pakan, dan juga pencegahan kerusakan saluran pencernaan dan pencernaan awal dari faktor anti-nutrisi yang terdapat dalam bahan penyusun. Juga, kajian terkini yang fokus pada probiotik utamanya berkaitan dengan resistensi pada beberapa patogen akuatik seperti Vibrio sp (Villamil dkk., 2003; Planas dkk., 2006), Amyloodinium ocellatum (Li dkk., 2005), Carnobacterium sp. (Robertson dkk., 2000), dan monitoring microbial, tetapi beberapa kajian khususnya bertujuan untuk mengamati performa pertumbuhan, parameter pemberian pakan, dan juga meningkatkan efisiensi pakan dengan aktivitas enzim dalam ikan. Meningkatkan upaya dan ketertarikan tentang kemungkinan deskripsi dari probiotik baik di jenis ikan laut seperti: summer flounder, Paralichthys dentatus, (Eddy dan Jones, 2002) common dentex, Dentex dentex, (Hidalgo dkk., 2006) dan Japanese flounder, Paralichthys olivaceus, (Taoka dkk., 2006) Serta ikan air tawar seperti: rohu, Labeo rohita (Ghosh dkk., 2003), Ikan mas cina, Hypophthalmichthys molitrix dan Ctenopharyngodon idella, ikan mas, Cyprinus carpio, ikan nila, Oreochromis mossambica, ikan lele, Clarias batrachus, the murrel, Channa punctatus, (Bairagi dkk., 2002), rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Panigrahi dkk., 2005), dan ikan nila Oreochromis niloticus (El-Haroun dkk., 2006). Banyak kajian telah difokuskan pada probiotik yang secara luas digunakan untuk peningkatan baik terhadap rasio perbandingan pakan dan efisiensi dan juga aktivitas enzim pencernaan. Namun, hanya sedikit kajian telah dilakukan berdasarkan kepada performa pertumbuhan dan aktivitas enzim pencernaan untuk menyertai manfaat probiotik pada jenis ikan laut S. aurata (Salinas dkk., 2005, 2006; Díaz–Rosales dkk., 2006; Suzer dkk., 2008; Avella

dkk., 2010) jenis ikan mas air tawar, Cyprinus carpio (Wang dan Xu, 2006) dan Ctenopharyngodon idella, (Wu dkk., 2012) dan juga pada udang Penaeus vannamei, (Wang, 2007; Zhou dkk., 2009). Juga, meskipun efek menguntungkan dari probiotik dikenal baik di akuakultur, hanya ada sedikit informasi tentang pengaruh probiotik Bacillus sp. Pada aktivitas enzim pencernaan di ikan gilthead sea bream (S. aurata), yang merupakan salah satu jenis ikan yang memiliki nilai ekonomis tinggi dan dibudidayakan di industri akuakultur mediterania. Tujuan dari kajian ini adalah untuk mengamati penggunaan Bacillus sp. dan campurannya, sebagai suplemen probiotik melalui pakan hidup untuk ikan gilthead sea bream (S. aurata), hingga hari ke 40 setelah menetas selama fase perkembangan larva. Materi dan Metoda Pemeliharaan larva dilakukan dalam sistem resirkulasi air hijau dengan tiga kali pengulangan dan larva memiliki padat tebar 80 individu/liter pada bak silinder 10 m3 dan juga parameter pemeliharaan larva dan protokol dilakukan menurut Suzer dkk. (2008). Parameter kimia fisik dari air laut seperti suhu, oksigen terlarut, kadar garam, pH, ammonia, dan konsentrasi nitrit dicatat setiap hari. Selama pemeliharaan larva, suhu air secara bertahap ditingkatkan antara 17 dan 220 C. Disamping itu, kejenuhan oksigen (>85%), kadar garam (38,0 ‰) dan pH (7,7) tetap dijaga, secara berurutan. Ammonia dan nitrit diukur dan selalu menunjukkan angka yang stabil dibawah 0,01 mg/l. Tidak ada pergantian air dilakukan di bak pada periode 2 hari pertama kultur. Dari hari ke 3 hingga 12, air bak secara sebahagian diganti (5-7% setiap hari) dengan melewati penyaring (200 µm). Tingkat laju air ditingkatkan secara perlahan dari 2 hingga 20% tergantung umur larva. Periode pencahayaan diatur dengan siklus pencahayaan 24 jam setiap hari hingga akhir penambahan alga untuk teknik air hijau (20 DAH) dan kemudian 16 jam pencahayaan dan 8 jam tanpa cahaya hingga akhir masa percobaan (40 DAH). Berbarengan dengan bukaan mulut dari hari ke-3 hingga hari ke-20 setelah menetas, larva yang baru menetas diberi pakan dengan dua strain rotifer (Brachionus plicatilis namun utamanya dengan Brachionus rotundiformis pada kepadatan 10-15 individu/ml untuk pemberian pakan yang cukup bagi seluruh larva dan juga mereka diperkaya dengan alga dan bahan pengkaya (S.presso, Sistem Artemia SA, Gent, Belgia) plus air hijau yang terdiri atas Nannochloropsis sp., Chlorella sp., Tetraselmis sp. and Isochrysis sp. Pada kepadatan 1.5–2 x 105 sel/ml. Antara 10-30 hari setelah menetas, grade naupli Artemia (AF 480 INVE Aquaculture, Gent, Belgia) diberikan dengan kepadatan 4-7 individu/ml dan kemudian metanaupli Artemia disuplementasi dari 25 hari setelah menetas hingga hari ke 40 dengan kepadatan 2-4 individu/ml (EG, Sistem Artemia SA, Gent, Belgia), dan keduanya diperkaya dengan menggunakan protein Selco (EG, Sistem Artemia SA, Gent, Belgia). Pemberian pakan pada larva disimpulkan pada gambar 1.

Desain Percobaan Probiotik komersial yang digunakan pada percobaan ini adalah Bactosafe (dalam bentuk padat) BernAqua NV, Olen, Belgia) yang memiliki spora dari 3 jenis Bacillus (contoh: Bacillus subtilis, B. licheniformis dan B. cereus) dan bakteri lain Pediococcus acidilactici. Sebelum pemberian probiotik, spora di rehidrasi menjadi bakteri vegetatif menurut instruksi pabrik (10 ppm per m3). Pada percobaan 1, probiotik ditambahkan ke kedua pakan hidup (rotifer) dan langsung ke bak pemeliharaan larva sampai hari ke 20 setelah menetas. Percobaan kedua dianggap sebagai kelompok kontrol yang tidak menerima probiotik baik melalui pakan hidup atau pada air bak pemeliharaan

Gambar 1. Pertumbuhan berat larva S. aurata hingga hari ke-40. Setiap rata-rata±penyimpangan baku merupakan representasi dari 30 larva (n=3). Pengambilan sampel Dalam rangka mengukur pertumbuhan, larva diambil dari tiap kelompok dan tiap bak dengan interval 7 hari sampai hari ke 35 setelah penetasan dan pada akhir percobaan (30 larva/kelompok). Tingkat pertumbuhan spesifik dikalkulasi dengan menggunakan rumus SGR (specific growth rate) = 100 (Ln FBW-Ln IBW)/Δt, dengan IBW, FBW merupakan awal, akhir berat badan ikan (mg), Δt = interval waktu (hari). Pada akhir percobaan, kelulushidupan larva ditentukan dengan menghitung larva yang masih hidup didalam bak.

Pembedahan saluran pencernaan Dalam rangka melakukan analisa pencernaan, kelompok larva dengan tiga kali pengulangan diambil dari setiap bak dengan interval 7 hari dengan metoda pengambilan sampel yang sama seperti diatas. Untuk setiap waktu pengambilan sampel, total 100 larva sampai 10 hari setelah menetas, 75 larva sampai 20 hari setelah menetas dan 50 larva diambil sampelnya sampai 40 hari setelah menetas. Sampel biasanya diambil pada jam (08:00) dan kedalaman (30-50 cm) yang sama, sebelum pemberian pakan. Saluran pencernaan digunakan untuk analisa enzim pada larva dan oleh karena itu, larva dibelah diatas gelas dan dipertahankan pada suhu 0 0C untuk isolasi saluran pencernaan. Analisa Enzim Sampel saluran pencernaan diambil dan dihomogenisasi dalam 5 volum v/w air destilasi yang di-es-kan (pH 7.0). Ekstrak yang digunakan untuk analisa enzim diperoleh setelah homogenisasi larva (35 mg/ml) dalam larutan penyangga dingin 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 diikuti dengan sentrifugasi (13.500 x g; 30 menit pada suhu 40 C). Aktivitas protease alkalin diukur dengan menggunakan metoda Walter (1984) menggunakan casein sebagai substrat (pH 9.0). Aktivitas protease asam ditentukan dengan menggunakan hemoglobin sebagai substrat dalam (pH 2.0) (Anson, 1938). Absorbansi supernatant dideteksi pada 280 nm. Aktivitas enzim dinyatakan sebagai aktivitas spesifik (mU/mg protein). Protein ditentukan dengan menggunakan metoda Bradford (Bradford, 1976). Seluruh analisa enzim diukur secara mingguan pada interval 35 hari setelah menetas dan pada akhir percobaan dan juga dianalisa dengan menggunakan Jenway 6300 Spektrofotometer UV-Visible. Analisa statistik Seluruh perlakuan dilakukan dengan tiga kali pengulangan. Hasil disajikan sebagai nilai rata-rata±simpangan baku (n=30 untuk pertumbuhan larva; n=3 untuk analisa enzim). Uji Levene digunakan untuk menentukan variasi homogenitas. Perbedaan nyata pada data kelulushidupan dan juga data pertumbuhan larva dan aktivitas enzim diantara kelompok perlakuan dibandingkan dengan uji Fisher’s Chi-square dan dengan one way-ANOVA, diikuti dengan uji Newman-Keuls multiple range, secara berurutan pada level signifikan 5%. Hasil Pertumbuhan larva dan kelulushidupan Pertumbuhan larva S. aurata ditentukan dalam kelompok uji coba sampai 40 hari setelah menetas disajikan dalam Gambar 1. Pada kelompok uji coba, larva menunjukkan berat mereka dengan sebuah faktor lebih dari kelipatan 20 kali dari 7 hari setelah 40 hari setelah menetas. Pada akhir masa percobaan, hasil terbaik pada pertumbuhan panjang total dan berat ditunjukkan pada Exp.1 kelompok yang diberikan probiotik, dengan panjang 21.17±1.8 mm dan 28.12±4.2 mg. Disamping hal tersebut, nilai tersebut diperkirakan pada 17.03±1.2 mm dan

24.28±3.1 mg untuk kelompok kontrol (Gambar 1). Tidak ada perbedaan yang nyata pada berat dan perkembangan panjang total pada kelompok kontrol dan kelompok yang mendapatkan perlakuan (P>0.05). Lebih jauh, tingkat kelulushidupan akhir adalah 16,7% dan 8,2 % dan juga tingkat pertumbuhan spesifik sebesar 7,8% per hari dan 7,1% per hari untuk kelompok perlakuan dan kelompok kontrol, secara berurutan. Performa pertumbuhan dan parameter pemeliharaan pada kelompok perlakuan tidak secara nyata lebih tinggi dibandingkan kelompok kontrol (P>0.05)

Gambar 2. Aktivitas spesifik protease alkalin selama fase perkembangan larva S. aurata hingga hari ke 40. Hasil disajikan sebagai nilai rata-rata±simpangan baku (n=3).

Gambar 3. Akivitas spesifik asam protease selama perkembangan larva S. aurata hingga hari ke 40. Hasil disajikan sebagai nilai rata-rata dan simpangan baku (n=3).

Aktivitas enzim Aktivitas spesifik enzim protease alkalin menunjukkan peningkatan secara eksponen lebih dari kelipatan 14 pada kelompok yang diberi perlakuan hingga hari ke 28 setelah menetas. Setelah hari ini, aktivitas ini sedikit menurun sampai akhir percobaan. Puncak dari aktivitas spesifik enzim protease alkalin diukur pada hari ke 28 dalam kelompok yang diberi perlakuan 162.3±18.3 mU/mg protein (Gambar 2). Terdapat perbedaan yang nyata antara kelompok perlakuan dan kontrol untuk aktivitas enzim protease alkalin (P<0.05). Berbeda dengan hasil aktivitas protease alkalin, tidak ada aktivitas spesifik dari asam protease yang terukur hingga hari ke-28 setelah menetas, tetapi setelah hari ini aktivitas asam protease secara perlahan meningkat secara bertahap di seluruh kelompok. Khususnya, peningkatan tiba-tiba yang diamati setelah hari ke-35 yang terjadi secara bersamaan dengan penurunan aktivitas protease alkalin dan juga pengenalan dengan pakan mikro. Pada akhir percobaan, tidak ada perbedaan yang nyata ditemukan diantara kelompok (P>0.05). Aktivitas asam protease yang paling tinggi ditemukan pada hari ke 40 di kelompok yang diberi perlakuan sebesar 11.6±2.1 U/mg protein (Gambar 3). Diskusi Pertumbuhan pada seluruh kelompok yang diberi perlakuan sangat memuaskan tetapi suplementasi probiotik menyajikan peningkatan kecil pada performa pertumbuhan larva jika dibandingkan dengan kontrol. Selain itu, profil lebih tinggi yang sama untuk SGR dan tingkat kelulushidupan juga dicatat untuk kelompok yang diberi perlakuan. Namun, sangatlah jelas ditemukan bahwa pemberian probiotik melalui rotifer mendukung pertumbuhan larva. Juga, diperoleh hasil dari kelompok yang diberi perlakuan dimana probiotik yang disuplementasi melalui rotifer dan air menunjukkan pertumbuhan yang relatif lebih tinggi jka dibandingkan dengan kontrol berdasarkan fakta bahwa pemberian probiotik secara nyata merubah jumlah bakteri Bacillus dalam saluran pencernaan (Salinas dkk., 2005; Avella dkk., 2010). Hasil yang sama juga diperoleh pada udang putih India, Fenneropenaeus indicus (Ziaei-Nejad dkk., 2006) dan udang Penaeus vannamei (Wang, 2007). Pada kajian ini, telah dilaporkan bahwa suplementasi probiotik melalui pakan hidup dan/atau pakan pellet yang diolah menyebabkan peningkatan yang nyata baik terhadap performa dan parameter pertumbuhan jika dibandingkan dengan pakan dasar dan/atau tanpa pemberian probiotik. Hasil ini selaras dengan jenis ikan air tawar, seperti: ikan nila Oreochromis niloticus and ikan mas, Cyprinus carpio, (Wang and Xu, 2006) dan jenis ikan laut, seperti: red drum, Sciaenops ocellatus, (Li dkk., 2005) dan Japanese flounder, Paralichthys olivaceus,benih (Taoka dkk., 2006). Pada jenis ikan yang dibudidayakan, telah diketahui dengan baik bahwa efek manfaat utama dari probiotik adalah penguatan kondisi nutrisi inang yang dipercepat oleh produksi enzim pencernaan tambahan, pencegahan adanya hambatan di saluran pencernaan dan faktor anti nutrisi yang tersedia di dalam bahan penyusun (Gatesoupe, 1999, 2007; Thompson dkk., 1999; Balcázar dkk., 2006). Secara berurutan, setelah transisi melalui lambung, dalam upaya untuk menjaga pertumbuhan dan meningkatkan enzim pencernaan (amylase, protease dan

lipase) probiotik berkembang di dalam saluran pencernaan dan memanfaatkan sejumlah besar karbohidrat (Gatesoupe, 1999; El-Haroun dkk., 2006). Namun, di dalam akuakultur, probiotik dapat disuplementasi baik sebagai suplemen pakan dan sebagai bahan tambahan pada lingkungan budidaya (Ziaei-Nejad dkk., 2006; Suzer dkk., 2008; Avella dkk., 2010). Pada kajian ini, probiotik Bacillus sp. Diberikan melalui pakan hidup (rotifer) dan air bak, oleh karena itu, sangatlah jelas dinyatakan bahwa probiotik berkembang dan bekerja secara efektif disepanjang saluran pencernaan dan juga mempercepat pertumbuhan larva, kelulushidupan dan khususnya aktivitas enzim pencernaan. Di samping hal tersebut, berdasarkan pada hasil, ditegaskan bahwa hasil yang relatif lebih baik untuk performa pertumbuhan dan aktivitas enzim diperoleh melalui suplementasi rotifer dikarenakan kolonisasi di saluran pencernaan pakan hidup dan transisi ke saluran pencernaan larva ikan melalui proses pencernaan. Telah diketahui dengan baik bahwa seluruh pakan yang disuplementasi probiotik dan/atau penambahan probiotik ke pakan menyebabkan pertumbuhan yang lebih baik, SGR, dan parameter kelulushidupan oleh disain percobaan yang sama di beberapa organisme ikan laut seperti: udang Penaeus vannamei dan Fenneropenaeus indicus (Ziaei-Nejad dkk., 2006; Wang, 2007). Juga, hasil yang sama dilaporkan oleh Ghosh dkk. (2003) untuk ikan mas India Labeo rohita, red drum, Sciaenops ocellatus, (Li dkk., 2005) dan ikan Japanese flounder, Paralichthys olivaceus, benih (Taoka dkk., 2006) ikan mas C. carpio (Wang and Xu, 2006). Sebagai tambahan untuk manfaat yang menguntungkan tersebut, sangatlah jelas diketahui bahwa suplementasi probiotik melalui pakan hidup dan/atau air kultur menyajikan respon imun yang lebih baik dan untuk penurunan aktivitas bakteri di beberapa ikan telestoi seperti: S. aurata (Salinas dkk., 2005; 2006; Díaz–Rosales dkk., 2006), Paralichthys dentatus (Eddy and Jones, 2002), Scophthalmus maximus (Planas dkk., 2006), dan ikan Salmo salar (Robertson dkk., 2000) dan juga penambahan bakteri pada organisme akuatik dan lingkungan (Gatesoupe, 1999, 2007; Balcázar dkk., 2006; Wang dkk., 2008). Seperti yang telah digambarkan oleh banyak penulis, bakteri Bacillus telah secara luas digunakan sebagai probiotik dan juga utamanya B. subtilis, sebuah bakteri non-patogen gram positif, bakteri yang membentuk spora, telah digunakan secara luas untuk terapi bakteri secara oral, pencegahan kerusakan saluran pencernaan, meningkatkan kualitas lingkungan kultur dan meningkatkan kelulushidupan organisme yang dibudidayakan (Irene dkk., 2005; Wang, 2007; Avella dkk., 2010; Wen-Ying dkk., 2010; Mohapatra dkk., 2012). Sebagai tambahan dari beberapa keuntungan ini, utamanya, B. subtilis, diketahui dapat memproduksi enzim pencernaan protease dan enzim lainnya yang mampu berkontribusi kepada aktivitas pencernaan alamiah dari jenis ikan yang dibudidayakan dan juga dapat berperan sebagai sumber elemn mikro dan makro jika deberikan sebagai pakan (Verschuere dkk. 2000; Ziaei-Nejad dkk., 2006; Jafaryan dkk., 2011). Telah diketahui secara umum bahwa pengetahuan pada level aktivitas enzim pencernaan dapat digunakan sebagai sebuah alat untuk memperhitungkan pertumbuhan larva ikan, kapasitas pencernaan dan jenis pakan yang disukai, serta tingkat kelulushidupan selanjutnya pada jenis ikan yang dibudidayakan. Juga, penentuan aktivitas enzim pencernaan dapat lebih baik dalam mengidentifikasi kemampuan nutrisi dari organism ini selama masa awal pertumbuhan dalam kondisi pemeliharaan (Ueberschaer, 1993; Kolkovski, 2001; Zambonino Infante and Cahu, 2001; Suzer dkk., 2008).

Pada kajian ini, pemberian Bacillus sebagai probiotik menyebabkan peningkatan yang nyata dalam aktivitas spesifik protease alkalin yang dapat bekerja secara efektif dalam jangkauan pH alkalin dalam saluran pencernaan larva. Fenomena ini dapat dikaitkan dengan kolonisasi usus oleh Bacillus sp, yang dapat menyebabkan penguatan pencernaan dan penyerapan makanan, yang pada akhirnya akan berkontribusi terhadap peningkatan kelulushidupan dan pertumbuhan larva S. aurata. Peningkatan performa pertumbuhan larva dapat berasal dari peningkatan aktivitas enzim pencernaan yang dirangsang oleh probiotik disepanjang saluran pencernaan. Selama fase awal Sparids, sistem pencernaan dimana probiotik dapat bekerja secara efektif dan dikarenakan bakteri gram positif khususnya anggota dari genus Bacillus dapat mengeluarkan jangkauan luas eksoenzim (Ziaei-Nejad dkk., 2006; Avella dkk., 2010; Wu dkk., 2012; Mohapatra dkk., 2012). Lebih jauh, sangatlah jelas diketahui bahwa metoda pemberian berpengaruh kuat terhadap keberhasilan kolonisasi usus oleh probiotik. Pada kajian ini, pemberian probiotik Bacillus sp ke larva S. aurata memberikan peningkatan yang relatif lebih baik terhadap aktivitas spesifik dari enzim protease alkalin di dalam saluran pencernaan larva. Oleh karena itu, meskipun suplementasi Bacillus sp secara nyata berdampak pada aktivitas enzim protease alkalin disepanjang saluran pencernaan, tidak ada perbedaan nyata ditemukan untuk aktivitas asam protease. Untuk alasan ini, aktivitas spesifik dari protease alkalin pada kelompok yang diberi perlakuan diperkuat oleh suplementasi probiotik. Hasil yang sama diperoleh dari Avella dkk. (2010) dimana pemberian campuran, terdiri atas empat strain B. subtilis, B. strains, B. licheniformis, dan B. pumilus disediakan melalui rotifer dan naupli Artemia dan ditambahkan ke dalam air yang dipasok secara eksklusif melalui pakan hidup pada pemeliharaan larva ikan sea bream. Mereka mencatat bahwa campuran Bacillus sp. secara nyata meningkatkan pertumbuhan, efisiensi pemberian pakan, dan metabolisme pada tahapan larva dan benih S. aurata (Avella dkk. 2010). Pada kajian kami sebelumnya, kami memberikan suplementasi probiotik Lactobacillus spp. dengan kondisi percobaan yang sama pada larva S. aurata hingga hari ke 35 setelah menetas, peningkatan yang nyata kami temukan baik pada performa pertumbuhan dan aktivitas enzim pencernaan pada larva dimana probiotik telah disuplementasikan oleh pakan hidup (rotifer dan Artemia) dan pakan hidup dengan air (Suzer dkk. 2008). Pada sisi sebaliknya, dalam upaya untuk membuat kolonisasi usus dengan sukses, pH di saluran pencernaan dapat dipertahankan di kisaran alkalin antara 8.0 dan 10.0. Fenomena ini dibuktikan pada kajian ini dimana suplementasi probiotik tidak berdampak kepada aktivitas protease asamdikarenakan kisaran pH asam (1,5-2.0) setelah pembentukan fungsi lambung pada hari ke 38 pada larva sea bream (Suzer dkk., 2007). Sebagai tambahan, campuran, yang terdiri atas tiga bakteri probiotik Bacillus sp., Lactobacillus sp. dan Saccharomyces cerevisiae disediakan oleh pakan denagn komposisi nitrogen dan kalori yang sama pada benih ikan rohu (Labeo rohita). Telah dilaporkan bahwa kombinasi pakan ikan dengan tiga probiotik pada jumlah yang sama memberikan pertumbuhan, rasio efisiensi protein, asupan nutrisi dan aktivitas enzim pencernaan yang secara nyata lebih baik dibandingkan kelompok perlakuan yang lainnya (Mohapatra dkk., 2012). Hasil ini selaras dengan kajian ini. Lebih jauh, hasil yang sama juga diperoleh pada benih ikan mas, Ctenopharyngodon idella dan probiotik B. subtilis disediakan sebagai probiotik dengan konsentrasi yang berbeda. Meskipun tidak ada perbedaan yang nyata baik dalam pertumbuhan dan rasio konversi pakan sebagaimana yang ditunjukkan dalam kajian ini, sangatlh menarik mencatat aktivitas enzim pencernaan tidak meningkat setelah pemberian jangka panjang

dengan B. subtilis (56 hari), tetapi tetap lebih tinggi dibandingkan ikan kontrol. (Wu dkk., 2012). Hal ini mungkin dapat dikaitkan dengan kolonisasi yang tidak efisien dari B. subtilis dalam usus ikan selama masa percobaan. Juga, alasan lain yang mungkin dapat dijadikan evaluasi bahwa akan lebih baik untuk memberikan suplemen tidak hanya satu probiont tetapi juga campuran spora Bacillus (lebih dari 3 jenis) melalui pakan. Telah sangat jelas bahwa suplementasi probiotik secara efektif meningkatkan proses pencernaan pada larva S. aurata dengan secara relatif meningkatkan mikroorganisme yang menguntungkan dan aktivitas enzim mikobial mereka, penyusunan kesetimbangan microbial dan memperkuat pencernaan dan penyerapan pakan dan pemanfaatan pakan disepanjang saluran pencernaan. Sebagai kesimpulan, ini merupakan kajian pertama tentang suplementasi pobiotik Bacillus sp. dan juga dampaknya pada parameter pemeliharaan dan aktivitas enzim pencernaan larva S. aurata. Sangatlah jelas ditentukan bahwa pemberian probiotik melalui pakan hidup (rotifer), dapat menghasilkan parameter pertumbuhan, efisiensi pakan yang relatif lebih tinggi dan juga peningkatan yang secara nyata di dalam aktivitas protease alkalin di saluran pencernaan. Kajian lebih lanjut sebaiknya dilakukan pada efek Bacillus sp. sebagai suplementasi probiotik baik oleh pakan hidup dan/atau di dalam air pada respon imun spesifik, kekebalan penyakit dan parameter biokimia lainnya pada jenis ikan yang dibudidayakan. Ucapan terima kasih Kajian ini didanai oleh Universitas Ege, Proyek Penelitian Ilmiah, 11-SUF-014. Penulis juga memberikan penghargaan kepada staf dari Kılıç Sea Products Inc., Ören hatchery, Milas, MUĞLA, TURKI, dimana percobaan dilakukan untuk bantuan teknis yang sangat berharga selama masa percobaan. Juga, penulis mengucapkan terima kasih kepada Nektra Yem Corp, untuk pasokan probiotik. REFERENSI Anson, M.L. 1938. The estimation of pepsin, trypsin, papain and cathepsin with hemoglobin.

Journal of General Physiology, 22: 79–89. Avella, M.A., Gioacchini, G., Decamp, O., Makridis, P., Bracciatelli, C. and Carnevali, O. 2010.

Application of multi–species of Bacillus in sea bream larviculture. Aquaculture, 305: 12–19. doi: 10.1016/j.aquaculture.2010.03.029,

Bairagi, A., Ghosh, K.S., Sen, S.K., Ray, A.K. 2002. Enzyme producing bacterial flora isolated from fish digestive tracts. Aquaculture International, 10: 109–121. doi: 10.1023/A:1021355406412

Balcázar, J.L., Blas, I., Ruiz-Zarzuela, I., Cunningham, D., Vendrell, D., Múzquiz, J.L. 2006. The role of probiotics in aquaculture. Veterinary Microbiology, 114: 173–186. doi: 10.1016/j.vetmic.2006.01.009

Bradford M.M. 1976. A rapid sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein–dye binding. Anal.Biochem., 72: 248–254.

Díaz–Rosales, P., Salinas, I., Rodríguez, A., Cuesta, A., Chabrillón, M., Balebona, M.C., Morinigo, M.Á., Esteban, M.Á. and Meseguer, J. 2006. Gilthead seabream (Sparus aurata, L.) innate

immune response after dietary administration of heat–inactivated potential probiotics. Fish and Shellfish Immunology, 20: 482–492. doi: 10.1016/j.fsi.2005.06.007

Dimitroglou, A., Merrifield, D.L., Carnevali, O., Picchietti, S., Avella, M., Daniels, C., Guroy, D., Davies, S.J., 2011. Microbial manipulations to improve fish health and production–A Mediterranean perspective. Fish and Shellfish Immunology, 30: 1–16. doi: 10.1016/j.fsi.2010.08.009

Eddy, S.D. and Jones, S.H. 2002. Microbiology of summer flounder Paralichthys dentatus fingerling production at a marine fish hatchery. Aquaculture, 211: 9–28. doi: 10.1016/S0044-8486(01)00882-1

El–Haroun, E.R., Goda, A–S, A.M., Chowdury, M.A.K. 2006. Effect of dietary probiotic Biogen® supplementation as a growth promoter on growth performance and feed utilization of Nile tilapia Oreochromis niloticus (L.). Aquaculture Research, 37: 1473–1480. doi: 10.1111/j.1365-2109.2006.01584.x

Gatesoupe, F.J. 1999. The use of probiotics in aquaculture. Aquaculture, 180: 147–165. doi: 10.1016/S0044-8486(99)00187-8

Gatesoupe, F.J. 2007. Live yeasts in the gut: Natural occurrence, dietary introduction, and their effects on fish health and development. Aquaculture, 267: 20–30. doi: 10.1016/j.aquaculture.2007.01.005

Ghosh, K., Sen, S.K., Ray, A.K. 2003. Supplementation of an isolated fish gut bacterium, Bacillus circulans, in formulated diets for rohu, Labeo rohita, fingerlings. Israeli J. Aquacult.–Bamidgeh, 55: 13–21.

Hidalgo, M.C., Skalli, A., Abellán, E., Arizcun, M. and Cardenete, G. 2006. Dietary intake of probiotics and maslinic acid in juvenile dentex (Dentex dentex L.): effects on growth performance, survival and liver proteolytic activities. Aquaculture Nutrition, 12: 256–266. doi: 10.1111/j.1365-2095.2006.00408.x

Irene, S., Alberto, C., Ángeles, M.E. and José, M. 2005. Dietary administration of Lactobacillus delbrüeckii and Bacillus subtilis, used alone or combined, on cellular innate immune responses. Fish and Shellfish Immunology, 19: 67–77. doi: 10.1016/j.fsi.2004.11.007

Jafaryan, H., Taati, M.M., Jafarzadeh, M., 2011. The enhancement of growth parameters in common carp (Cyprinus carpio) larvae using probiotic in rearing tanks and feeding by various Artemia nauplii. AACL Bioflux, 4: 511–518.

Kolkovski S. 2001. Digestive enzymes in fish larvae and juveniles–implications and application to formulated diets. Aquaculture, 200: 181–201. doi: 10.1016/S0044-8486(01)00700-1

Li, P., Burr, G.S., Goff, J., Whiteman, K.W., Davis, K.B., Vega, R.R., Neill, W.H. and Gatlin III, D.M. 2005. A preliminary study on the effects of dietary supplementation of brewers yeast and nucleotides, singularly or in combination, on juvenile red drum (Sciaenops ocellatus). Aquaculture Research, 36: 1120–1127. doi: 10.1111/j.1365-2109.2005.01333.x

Mohapatra, S., Chakraborty, T., Prusty, A.K., Das, P., Paniprasad, K. and Mohanta, K.N. 2012. Use of different microbial probiotics in the diet of rohu,Labeo rohita fingerlings: effects on growth, nutrient digestibility and retention, digestive enzyme activities and intestinal microflora. Aquaculture Nutrition, 18: 1–11. doi: 10.1111/j.1365-2095.2011.00866.x

Panigrahi, A., Kiron, V., Puangkaew, J., Kobayashi, T., Satoh, S. and Sugita, H. 2005. The viability of probiotic bacteria as a factor influencing the immune response in rainbow trout

Onchorhynchus mykiss. Aquaculture, 243: 241–254. doi: 10.1016/j.aquaculture.2004.09.032

Planas, M., Pérez-Lorenzo, M., Hjelm, M., Gram, L., Fiksdal, I.,U., Bergh, Ø. and Pintado, J. 2006. Probiotic effect in vivo of Rosebacter strain 27-4 against Vibrio (Listonella) anguillarum infections in turbot (Scophthalmus maximus L.) larvae. Aquaculture, 255: 323–333. doi: 10.1016/j.aquaculture.2005.11.039

Robertson, P.A.W., O’Dowd, C., Burrels, C., Williams, P. and Austin, B. 2000. Use of Carnobacterium sp. as a probiotic for Atlantic salmon (Salmo salar L.) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum). Aquaculture, 185 : 235–243. doi: 10.1016/S0044-8486(99)00349-X

Salinas, I., Cuesta, A., Ángeles Esteban, M., Meseguer, J. 2005. Dietary administration of Lactobacillus delbrüeckii and Bacillus subtilis, single or combined, on gilthead seabream cellular innate immune responses. Fish and Shellfish Immunology, 19: 67–77. doi: 10.1016/j.fsi.2004.11.007

Salinas, I., Díaz-Rosales, P., Cuesta, A., Meseguer, J., Chabrillón, M., Morinigo, M. Á. and Ángeles Esteban, M., 2006. Effect of heat-inactivated fish and non-fish derived probiotics on the innate immune parameters of a teleost fish (Sparus aurata L.). Veterinary Immunology and Immunopathology 111, 279–286. doi: 10.1016/j.vetimm.2006.01.020

Suzer, C., Çoban D., Kamacı, H.O., Aytepe, B., Saka, Ş., Fırat, K., 2007. Variations of digestive enzyme activities in gilthead Sea bream larvae (Sparus aurata L., 1758) during the weaning stage. E.U. Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 24: 253–259.

Suzer, C., Çoban, D., Kamacı, H.O., Saka, S., Fırat, K., Otgucuoğlu, Ö. and Küçüksarı, H., 2008. Lactobacillus spp. bacteria as probiotics in gilthead sea bream (Sparus aurata, L.) larvae: effects on growth performance and digestive enzyme activities. Aquaculture, 280: 140–145. doi: 10.1016/j.aquaculture.2008.04.020

Taoka, Y., Maeda, H., Jo, J.Y., Jeon, M.J., Bai, S.C., Lee, W.J., Yuge, K. and Koshio, S. 2006. Growth, stress tolerance and non-specific immune response of Japanese flounder Paralichthys olivaceus to probiotics in a closed recirculating system. Fisheries Science, 72: 310–321. doi: 10.1111/j.1444-2906.2006.01152.x

Thompson, F.L., Abreu, P.C., Cavalli, R. 1999. The use of microorganisms as food source for Penaeus paulensis larvae. Aquaculture, 174: 139–153. doi: 10.1016/S0044-8486(98)00511-0

Ueberschär, B., 1993. Measurement of proteolytic enzyme activity: significance and application in larval fish research. In: B.T. Walther, H.J. Fhyn (Eds.), Physiological and biochemical aspects of fish development. University of Bergen, Norway.

Verschuere, L., Rombaut, G., Sorgeloos, P. and Verstraete, W. 2000. Probiotics bacteria as biological control agents in aquaculture. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64: 655–671.

Villamil, L., Figueras, A., Planas, M. and Novoa, B. 2003. Control of Vibrio alginolyticus in Artemia cultura by treatment with bacterial probiotics. Aquaculture, 219: 43–56. doi: 10.1016/S0044-8486(02)00515-X

Walter, H. E. 1984. Proteinases: methods with hemoglobin, casein and azocoll as substrates. In: H. J. Bergmeyer (Ed.), Methods of Enzymatic Analysis. Vol. V,. Verlag Chemie, Weinham: 270–277

Wang, Y.B., Xu, Z.R. 2006. Effect of probiotics for common carp (Cyprinus carpio) based on growth performance and digestive enzyme activities. Anim. Feed Sci. Technol., 127: 283–292. doi: 10.1016/j.anifeedsci.2005.09.003

Wang, Y.B. 2007. Effect of probiotics on growth performance and digestive enzyme activity of the shrimp Penaeus vannamei. Aquaculture, 269: 259–264.

doi: 10.1016/j.aquaculture.2007.05.035 Wang, Y.B, Li, J.R. and Lin, J. 2008. Probiotics in aquaculture: Challenges and outlook.

Aquaculture, 281: 1–4. doi: 10.1016/j.aquaculture.2008.06.002 Wen-Ying, S., Ling-Lin, F., Wei-Fen, l., Yao-Rong, Z., 2010. Effect of dietary supplementation with

Bacillus subtilis on growth, performance, immune response and antioxidant activities of the shrimp (Litopenaeus vannamei). Aquaculture Research, 41: 1691-1698. doi: 10.1111/j.1365-2109.2010.02554.x

Wu, Z.X., Feng, X., Xie, L.L., Peng, X.Y., Yuan, J. and Chen, X.X., 2012. Effect of Bacillus subtilis Ch9 for grass carp, Ctenopharyngodon idella (Valenciennes, 1844), on growth performance, digestive enzyme activities and intestinal microflora. J. Appl. Ichthyol. 28: 721–727. doi: 10.1111/j.1439-0426.2012.01968.x

Zambonino Infante, J.L. and Cahu, C.L., 2001. Ontogeny of the gastrointestinal tract of marine fish larvae. Comp. Biochem. Physiol. 130C: 477-487. doi: 10.1016/S1532-0456(01)00274-5

Ziaei-Nejad, S., Rezaei, M.H., Takami, G.A., Lovett, D.L., Mirvaghefi, A.R. and Shakouri, M. 2006. The effect of Bacillus spp. bacteria used as probiotics on digestive enzyme activity, survival and growth in the Indian white shrimp Fenneropenaeus indicus. Aquaculture, 252: 516–524. doi: 10.1016/j.aquaculture.2005.07.021

Zhou, X., Wang, Y., Li, W. 2009. Effect of probiotic on larvae shrimp (Penaeus vannamei) based on water quality, survival rate and digestive enzyme activities. Aquaculture, 287: 349–353. doi: 10.1016/j.aquaculture.2008.10.046