DAFTAR PUSTAKA - eprints.undip.ac.ideprints.undip.ac.id/50721/8/LISANA_H_U_22010112130187_BAB_7.pdf · DAFTAR PUSTAKA 1. Ochiai RL, ... Sjamsuhidajat R. Buku Ajar Ilmu Bedah. 3rd

40

DAFTAR PUSTAKA

1. Ochiai RL, Acosta CJ, Danovaro-holliday MC, et al. A Study of Typhoid

Fever in Five Asian Countries: Disease Burden and Implications for

Controls. Bull World Health Organ. 2008;86:260-268.

2. Vollaard AM, Verspaget HW, Ali S, et al. Helicobacter Pylori Infection

and Typhoid Fever in Jakarta, Indonesia. Epidemiol Infect. 2006;134:163-

170.

3. Ibarra JA, Steele-mortimer O. Microreview Salmonella The Ultimate

Insider: Salmonella Virulence Factors that Modulate Intracellular Survival.

Cell Microbiol. 2009;11(11):1579-1586.

4. Mcsorley SJ, Cookson BT, Jenkins MK. Characterization of CD4 + T Cell

Responses During Natural Infection with Salmonella typhimurium. J

Immunol. 2016;164:986-993.

5. Mittru H, Kaufmann SHE. Immune Response to Infection with Salmonella

typhimurium in Mice. J Leukoc Biol. 2000;67:457-463.

6. Munasir Z. Respons Imun Terhadap Infeksi Bakteri. Sari Pediatr.

2001;2(4):193-197.

7. Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Cellular and Molecular Immunology.

7th ed. Philadelphia: Elsevier Saunders. 2012.

8. Hatta M. Enteric Fever in Endemic Areas of Indonesia: An Increasing

Problem of Resistance. J Infect Dev Ctry. 2008;2(4):279-282.

9. Astuti IP, Munawaroh E. Karakteristik Morfologi Daun Sirih Merah: Piper

crocatum Riutz & Pav dan Piper porphyrophyllum N.E.Br. Koleksi Kebun

Raya Bogor. Berk Penel Hayati Ed Khusus. 2011;7A:83-85.

10. Agromedia R. Buku Pintar Tanaman Obat: 431 Jenis Tanaman

Penggempur Penyakit. Jakarta: PT Agromedia Pusstaka; 2008.

11. Lister INE, Viany RD, Nasution AN, Zein R. Antimicrobial Activities of

Methanol Extract of Sirih Merah (Piper crocatum L.) lleaf. 2014;6(12):650-

654.

41

12. Hartini YS, Wahyuono S, Widyarini S. Uji Aktivitas Fagositosis Makrofag

Fraksi-fraksi dari Ekstrak Metanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz

& Pav.) Secara In Vitro. 2013;11(2):108-115.

13. Hartini YS, Wahyuono S, Widyarini S. In vivo Immunomodulatory Effect

and Histopathological Features of Mouse Liver and Kidney Treated with

Neolignans Isolated from Red Betel (Piper crocatum Ruiz & Pav) Leaf.

2014;13(10):1609-1614.

14. Hermiati, Rusli, Manalu NY, Sinaga MS. Ekstrak Daun Sirih Hijau dan

Merah sebagai Antioksidan pada Minyak Kelapa. J Tek Kim USU.

2013;2(1):37-43.

15. Astuti I, Munawaroh E, Rahayu E, P A, Sumanto. Heteroblastic

Development in Six Species of Wild Piper. Ber Biol - J Ilmu-ilmu Hayati.

2011;10:621-625.

16. Suhermanto. Profil Flavonoid, Tanin dan Alkaloid dari Ekstrak Daun Sirih

Merah (Piper crocatum). Skripsi. Bogor: Institut Pertanian Bogor. 2013.

17. Alfarabi M, Bintang M, Safithri M. The Comparative Ability of

Antioxidant Activity of Piper crocatum in Inhibiting Fatty Acid Oxidation

and Free Radical Scavenging. 2010;17(4):201-204.

18. Holderness J, Jackiw L, Kimmel E, et al. Select Plant Tannins Induce IL2R

Up-Regulation and Augment Cell Division in T Cells. J Immunol.

2007;179:6468-6478.

19. Kumar S, Pandey AK. Chemistry and Biological Activities of Flavonoids:

An Overview. Sci World J. 2013;2013.

20. Rich RR. Clinical Immunology: Principle and Practice. 4th ed. China:

Elsevier Saunders; 2013.

21. Subowo. Imunobiologi. 3rd ed. Jakarta: Sagung Seto. 2014.

22. Shipkova M, Wieland E. Surface Markers of Lymphocyte Activation and

Markers of Cell Proliferation. Clin Chim Acta. 2012;413(17-18):1338-

1349.

23. Parslow TG, Stites DP, Terr AI, Imboden JB. Medical Immunology. 10th

ed. Singapore: Mc Graw Hill. 2003.

42

24. Sjamsuhidajat R. Buku Ajar Ilmu Bedah. 3rd ed. Jakarta: EGC. 2010.

25. Petroianu A. Surgical Anatomy of the Spleen. In: The Spleen. Brazil:

Bentham Science Publisher. 2011:117-113.

26. Paul WE. Fundamental Immunology. Philadelphia: Lippincott Williams &

Wilkins, A Wolter Kluwer Bussiness. 2013.

27. Gartner LP, Hiatt JL. Concise Histology. China: Elsevier Saunders. 2011.

28. Elliott T, Worthington T, Osman H, Gill M. Mikrobiologi Kedokteran &

Infeksi. 4th ed. Jakarta: EGC. 2013.

29. Santos RL, Zhang S, Tsolis RM, Kingsley RA. Animal Models of

Salmonella Infections: Enteritis Versus Typhoid Fever. Microbes Infect.

2001;3:1335-1344.

30. Brenner FW, Villar RG, Angulo FJ, Tauxe R, Swaminathan B. Salmonella

Nomenclature. J Clin Microbiol. 2000;38(7):2465-2467.

31. Kaur J, Jain SK. Role of Antigens and Virulence Factors of Salmonella

enterica serovar Typhi in Its Pathogenesis. Microbiol Res.

2012;167(4):199-210.

32. Zenewicz LA, Shen H. Innate and Adaptive Immune Responses to Listeria

monocytogenes: A Short Overview. Microbes Infect. 2008;9(10):1208-

1215.

33. Badovinac VP, Harty JT. Adaptive Immunity and Enhanced CD8 + T Cell

Response to Listeria monocytogenes in the Absence of Perforin and IFN- γ.

J Immunol. 2000;164:6444-6452.

34. Sulistini RP. Pengaruh Ekstrak Lompong Mentah ( Colocasia Esculenta L

Schoot ) Terhadap Aktivitas Fagositosis Dan Kadar NO ( Nitrit Oksida )

Mencit Balb / C Sebelum Dan Sesudah Terinfeksi Listeria Monocytogenes.

Skripsi. Semarang: Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro. 2015.

35. Jiao Y, Wen J, Yu X, Zhang D. Influence of Flavonoid of Astragalus

Membranaceus’s Stem and Leaves on The Function of Cell Mediated

Immunity in Mice. Chinese J Integr Tradit West Med. 2001;7(2):117-120.

36. Ridwan E. Etika Pemanfaatan Hewan Percobaan dalam Penelitian

Kesehatan. J Indones Med Assos. 2013;63(3):112-116.

43

37. WHO. Research Guidelines for Evaluating the Safety and Efficacy of

Herbal Medicines. Manila: WHO Regional Office for the Western Pacific.

1993.

44

LAMPIRAN 1. CARA PEMBUATAN EKSTRAK DAUN Piper crocatum

(METODE MASERASI)

A. Alat :

1. Erlen meyer 1 liter

2. Cawan porselin

3. Pipet tetes

4. Beker glass

5. Gelas ukur

6. Neraca analitik

7. Water bath

8. Corong

9. Kertas saring/kain flannel

B. Bahan :

1. Daun Piper crocatum (sirih merah)

2. Pelarut etanol 70%

3. Aquadest

C. Cara kerja :

1. Daun sirih merah dicuci bersih hingga hilang kotorannya kemudian

dirajang-rajang, lalu dikeringkan dibawah sinar matahari tetapi tidak

terkena langsung sinarnya (diatasnya ditutup kain/kertas)

Sinar langsung pada proses pengeringan akan merusak zat aktif yang

ada dalam sampel, karena pengaruh ultraviolet. Tujuan pengeringan

45

adalah untuk mengurangi/menghilangkan kandungan air yang ada

dalam sirih merah).

2. Timbang seksama sampel Daun sirih merah yang telah kering masing-

masing : sampel (I) +/- 62,25 gr, sampel (II) +/- 60,15 gr, sampel (III)

+/- 60,5 gr, sampel (IV) +/- 59,86 gr dan samper (V) +/- 50,83 gr.

3. Masukkan kelimanya dalam empat Erlenmeyer ukuran 1 liter.

4. Tambahkan kelimanya pelarut etanol 70% sampai sampel terendam

semua.

5. Tutup dan gojok rendaman, simpan ditempat gelap dan biarkan

rendaman tersebut selama 24 jam.

6. Setelah 24 jam, saring rendaman tersebut dengan kertas saring/kain

flannel dan tuangkan dalam cawan porselin.

7. Uapkan diatas water bath dengan suhu 60-70° atau diangin-anginkan

sampai air dan pelarutnya hilang dan didapat ekstraknya.

8. Sisa rendaman ditambah pelarut dengan volume yang lebih kecil dari

yang pertama dan dilakukan percobaan yang sama.

9. Proses rendaman dilakukan 3 kali atau lebih dengan penambahan

volume pelarut yang semakin kecil.

10. Timbang ekstrak yang diperoleh.

Keterangan :

Berat sampel keseluruhan : 293,6 gr

Pelarut yang dibutuhkan : 6,3 liter

Ekstrak yang diperoleh : 43,17 g

46

LAMPIRAN 2. PERHITUNGAN DOSIS EKSTRAK DAUN Piper crocatum

Dosis Piper crocatum (z) sebagai imunostimulan13

- Senyawa aktif : neolignans (crocatidin dan deacetyl crocatidin)

- Diperoleh dari fraksi ekstrak metanol (ekstraksi bertingkat)

- 8,26 kg daun basah dikeringkan menjadi 1,9 kg (23%) kemudian diekstrak

metanol mendapat 224,03g (= 11,79%). Dari 2,12g ekstrak tadi dilakukan

fraksinasi didapatkan neolignan 24mg (=1,13%)

- Telah dilakukan penelitian menggunakan neolignan dosis 2.5; 5 dan

10mg/kgBB

Pada Dosis 5mg/kgBB neolignan

= 5 / 1,13% = 442,5 mg/kgBB ekstrak metanol (= 8,85mg/mencit)

= 442,5 / 11,79% = 3753 mg/kgBB daun kering (= 75mg/mencit)

= 3753 / 23% = 16317 mg/kgBB daun basah (= 3263mg/mencit)

Dosis perlakuan:

Dosis 1 : Ekstrak etanol 10 mg/mencit (setara 3846mg/kgBB)

Dosis 2 : Ekstrak etanol 30 mg/mencit (=antilog ½ dosis 1)

Dosis 3 : Ekstrak etanol 100 mg/mencit (=antilog 1 dosis 1)

47

LAMPIRAN 3. PROSEDUR ISOLASI DAN KULTUR LIMFOSIT LIMPA

MENCIT (Mahardika, 2003)

Alat :

1. Gunting dan pinset

2. Spuit 10 mL steril dengan jarum ukuran 18 atau 20 gauge

3. Tabung sentrifus 50 mL steril

4. Cawan Petri

5. Pipet Pasteur steril

6. Tabung berlapis silicon

7. Inkubator CO2

8. Hemacytometer

9. Refrigerated centrifuge

Bahan :

1. Ether

2. Alkohol 70%

3. Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 (GIBCO)

4. Tris Buffered Ammonium Chlorid

5. Fetal Bovine Serum, FBS

Cara kerja :

1. Mencit dianesthesia dengan ether selanjutnya mencit diterminasi dengan

disklokasi cervical mencit.

2. Selubung peritoneum dibuka, kemudian limpa diangkat dan diletakkan pada

cawan petri steril diameter 50 mm yang telah diisi 5 mL medium RPMI 1640.

48

3. Medium disemprotkan ke dalam limpa untuk mendapatkan suspensi sel

tunggal. Setelah itu, dimasukkan ke dalam tabung sentrifus 10 mL untuk

disentrifus pada 1200 rpm 4°C selama 10 menit.

4. Pellet yang didapat, diresuspensikan dalam 2 mL Tris Buffered Ammonium

Chlorid untuk melisiskan eritrosit.

5. Sel dicampur menggunakan pipet dan dikocok, kemudian didiamkan pada

suhu ruangan selama 2 menit.

6. Tambahkan 1 mL Fetal Bovine Serum pada dasar tabung menggunakan pipet.

7. Suspensi tersebut disentrifus pada 1200 rpm 4°C selama 5 menit, dan

supernatannya dibuang.

8. Pellet dicuci dua kali dengan RPMI dengan cara dipipet berulang-ulang dan

disentrifus pada 1200 rpm 4°C selama 5 menit.

9. Supernatan dibuang dan pellet yang didapat diresuspensikan pada 4 mL

medium komplet.

10. Suspensi sel dikultur pada cawan petri diameter 50 mm dalam inkubator CO2

5%, 37°C selama 2 jam.

11. Supernatan yang berisi sel-sel limfosit diambil dengan menggunakan pipet

dan ditampung dalam tabung sentrifus.

12. Supernatan kemudian disentrifus pada 1200 rpm 4°C selama 5 menit.

Supernatannya dibuang dan limfosit diresuspensikan dengan 1 mL medium

komplet.

13. Hitung sel menggunakan hemositometer dan ditentukan viabilitasnya dengan

trypan blue sehingga didapat suspensi sel dengan kepadatan 106 sel/mL.

49

LAMPIRAN 4. PROSEDUR UJI PROLIFERASI LIMFOSIT LIMPA

DENGAN METODE MTT ASSAY (Chapdelaine, 2001)

Alat &Bahan :

1. Limfosit

2. Phytohaemaglutinin

3. Microplate 96 well

4. Inkubator CO2

5. MTT

6. HCl isopropanol

7. ELISA reader

Cara Kerja :

1. Limfosit dikultur pada mikroplate 96 dengan volume 100 μL/sumuran.

2. Tiap-tiap kelompok dengan replikasi tiga kali.

3. Ditambahkan phytohaemaglutinin dengan konsentrasi akhir 50 μg/mL

sebanyak 10 μL/sumuran,

4. Kemudian diinkubasi pada 37°C, CO2 5% selama 72 jam.

5. Selanjutnya ditambahkan MTT (3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazolium bromide) pada masing-masing sumuran dengan

konsentrasi 5 mg/mL sebanyak 10 μL, dan diinkubasi pada 37°C, CO2

5%, dilanjutkan selama 4 jam.

6. Reaksi dihentikan dengan menambah HCl-isopropanol 0,04 M sebanyak

100 μL/sumuran.

7. Hasilnya dibaca dengan ELISA reader.

50

LAMPIRAN 5. ETHICAL CLEARANCE

51

LAMPIRAN 6. DETERMINASI SAMPEL Piper crocatum

52

53

LAMPIRAN 7. SURAT KETERANGAN TELAH MELAKSANAKAN

PENELITIAN

5201

54

55

LAMPIRAN 8. HASIL PEMBACAAN PROLIFERASI LIMFOSIT LIMPA

METODE MTT ASSAY

56

57

LAMPIRAN 9. DATA SPSS

Tabel Uji Deskriptif

Case Summariesa

K1 K2 P1 P2 P3

Total N 5 5 5 5 5

Mean .0620 .0785 .1090 .1168 .1274

Std. Deviation .01617 .02760 .02292 .01171 .01644

Median .0600 .0765 .1020 .1165 .1274

Minimum .04 .04 .09 .11 .11

Maximum .09 .12 .15 .13 .15

Tabel Uji Normalitas

Tests of Normality

KELOMPOK

Shapiro-Wilk

PROLIFERASI

LIMFOSIT

K1 .991 5 .984

K2 .990 5 .979

P1 .880 5 .311

P2 .883 5 .324

P3 .880 5 .309

58

Tabel Uji Homogenitas

Test of Homogeneity of Variances

PROLIFERASI LIMFOSIT

Levene Statistic df1 df2 Sig.

.592 4 20 .673

Tabel Uji One Way Anova

ANOVA

PROLIFERASI LIMFOSIT

Sum of

Squares df

Mean

Square F Sig.

Between Groups .015 4 .004 9.620 .000

Within Groups .008 20 .000

Total .023 24

59

Tabel Uji Post Hoc

Multiple Comparisons

Dependent Variable: PROLIFERASI LIMFOSIT

LSD

(I)

KELOMPOK

(J)

KELOMPOK

Mean

Difference

(I-J)

Std.

Error Sig.

95% Confidence

Interval

Lower

Bound

Upper

Bound

K1 K2 -.01650 .01251 .202 -.0426 .0096

P1 -.04700* .01251 .001 -.0731 -.0209

P2 -.05480* .01251 .000 -.0809 -.0287

P3 -.06537* .01251 .000 -.0915 -.0393

K2 K1 .01650 .01251 .202 -.0096 .0426

P1 -.03050* .01251 .024 -.0566 -.0044

P2 -.03830* .01251 .006 -.0644 -.0122

P3 -.04888* .01251 .001 -.0750 -.0228

P1 K1 .04700* .01251 .001 .0209 .0731

K2 .03050* .01251 .024 .0044 .0566

P2 -.00780 .01251 .540 -.0339 .0183

P3 -.01838 .01251 .157 -.0445 .0077

P2 K1 .05480* .01251 .000 .0287 .0809

K2 .03830* .01251 .006 .0122 .0644

P1 .00780 .01251 .540 -.0183 .0339

P3 -.01058 .01251 .408 -.0367 .0155

P3 K1 .06537* .01251 .000 .0393 .0915

K2 .04888* .01251 .001 .0228 .0750

P1 .01838 .01251 .157 -.0077 .0445

P2 .01058 .01251 .408 -.0155 .0367

*. The mean difference is significant at the 0.05 level.

60

LAMPIRAN 10. DOKUMENTASI PENELITIAN

Mencit balb/c dibagi menjadi 5 kelompok Ekstrak daun sirih merah

Infeksi Salmonella typhimurium

Proliferasi limfosit limpa metode MTT Assay

Pembacaan ELISA reader

61

LAMPIRAN 11. BIODATA MAHASISWA

Identitas

Nama : Lisana Himmatul Ulya

NIM : 22010112130187

Tempat/ tanggal lahir : Kudus, 27 September 1995

Alamat : Jl. Kutilang Raya No. 64 Ungaran, Kab. Semarang

Nomor HP : 085712534500

Email : [email protected]

Riwayat Pendidikan

1. SD Negeri Ungaran 03 Lulus Tahun: 2006

2. SMP Negeri 1 Ungaran Lulus Tahun: 2009

3. SMA Negeri 3 Semarang Lulus Tahun: 2012

4. Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro Masuk Tahun: 2012

Keanggotaan Organisasi

1. Sekretaris Umum HIMA KU Tahun: 2013/2014