165 1.1 CULTURILE IN VITRO: DEFINIŢIE, CARACTERIZARE ŞI APLICABILITATE 1.1.1 Definiţie În sens general, prin cultura in vitro se înţelege creşterea pe medii artificiale, în condiţii de asepsie deplină şi de factori ambientali bine controlaţi, a unor organe, părţi de organe, ţesuturi sau celule vegetale. Reuşita culturii depinde de o multitudine de factori şi este vizibilă în momentul în care explantul creşte. Explantul, numit şi inocul, este porţiunea de plantă (organ, ţesut, celulă) care se desprinde de pe planta donor (planta mamă), şi se inoculează în condiţii sterile pe un mediu artificial de cultură. Evoluţia explantului este dirijată de operator în funcţie de scopul urmărit. Acesta poate evolua formând o nouă plantă (sau mai multe plante - neoplantule), prin stimularea dezvoltării organelor aeriene (tulpina şi frunzele) şi a rădăcinii, sau poate forma calus, prin stimularea înmulţirii nediferenţiate a celulelor. Explantul constituie unitatea vie ce conţine în celule întreaga informaţie genetică a plantei mamă şi pe baza totipotenţei este capabil de a regenera una sau mai multe plante identice cu planta donor. Totipotenţa, este însuşirea celulelor vegetale de a se divide, de a se reproduce şi de a forma o plantă identică cu planta mamă. Teoretic fiecare celulă vie este totipotentă, însă în practică s-a observat că nu toate celulele au capacitatea de a-şi exprima acest caracter, datorită pe de o parte diferenţierii celulare şi îmbătrânirii, iar pe de altă parte gradului mare de specializare al acelor celule. Astfel, s-a demonstrat practic că, într-o plantă matură, celulele specializate care constituie ţesuturile, de exemplu: traheidele, fibrele libero-lemnoase, sclereidele, etc, la care lipseşte citoplasma şi nucleul, nu sunt totipotente. Acest aspect este explicat chiar prin faptul că întreaga informaţie genetică a celulei totipotente se află în cromozomii din nucleu. La plantele cormofite, odată cu înaintarea în vârstă, o parte din celule îşi pierd capacitatea de totipotenţă sau aceasta se reduce foarte mult. Rămân, însă, anumite zone în care activitatea celulelor este intensă, având loc diviziunea şi formarea aproape continuă de noi celule. Aceste celule sunt mici în dimensiuni, poligonale, bogate în citoplasmă, au vacuolă mică şi nucleu mare dispus central şi prezintă o membrană celulozică, formând ţesutul cu denumirea de meristem. Meristemele sunt zonele generatoare de celule necesare creşterii în lungime şi grosime a plantelor, fiind dispuse terminal atât în tulpină cât şi în rădăcini. 1.1.2 Caracteristicile culturilor in vitro Spre deosebire de multiplicarea tradiţională, unde se operează cu seminţe sau porţiuni mari de plantă (marcote, butaşi, altoi), la multiplicarea in vitro se folosesc explante mici, de ordinul milimetrilor sau chiar microscopice (celule, protoplaşti), explante care în condiţii normale de cultură nu ar reuşi să crească opunând rezistenţă agenţilor patogeni şi sintetizându-şi singure substanţele nutritive necesare. Din acest motiv, pentru reuşita culturii de celule şi ţesuturi se cer respectate următoarele condiţii: -prepararea unui mediu de creştere care să asigure o bună nutriţie heterotrofă a explantului, prin asigurarea sursei de carbon organic uşor accesibil explantelor; -asigurarea şi controlarea factorilor de mediu (temperatură, lumină, umiditate) în limitele optime pentru fiecare specie, soi şi fază de creştere, în funcţie de cerinţele acestora şi scopul urmărit; -stimularea creşterii şi diferenţierii sau dediferenţierii organelor prin utilizarea corespunzătoare a substanţelor stimulatoare de creştere; -asigurarea unei asepsii depline pe tot fluxul de producere a plantelor in vitro, prin dezinfecţia materialului vegetal, sterilizarea mediului şi a vaselor de cultură, precum şi efectuarea tuturor operaţiilor în hota cu flux de aer laminar steril, folosind instrumentar sterilizat prin flambare.
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
165
1.1 CULTURILE IN VITRO: DEFINIŢIE, CARACTERIZARE ŞI
APLICABILITATE
1.1.1 Definiţie
În sens general, prin cultura in vitro se înţelege creşterea pe medii artificiale, în condiţii de
asepsie deplină şi de factori ambientali bine controlaţi, a unor organe, părţi de organe, ţesuturi sau
celule vegetale. Reuşita culturii depinde de o multitudine de factori şi este vizibilă în momentul în
care explantul creşte.
Explantul, numit şi inocul, este porţiunea de plantă (organ, ţesut, celulă) care se desprinde de
pe planta donor (planta mamă), şi se inoculează în condiţii sterile pe un mediu artificial de cultură.
Evoluţia explantului este dirijată de operator în funcţie de scopul urmărit. Acesta poate evolua
formând o nouă plantă (sau mai multe plante - neoplantule), prin stimularea dezvoltării organelor
aeriene (tulpina şi frunzele) şi a rădăcinii, sau poate forma calus, prin stimularea înmulţirii
nediferenţiate a celulelor.
Explantul constituie unitatea vie ce conţine în celule întreaga informaţie genetică a plantei
mamă şi pe baza totipotenţei este capabil de a regenera una sau mai multe plante identice cu planta
donor.
Totipotenţa, este însuşirea celulelor vegetale de a se divide, de a se reproduce şi de a forma o
plantă identică cu planta mamă. Teoretic fiecare celulă vie este totipotentă, însă în practică s-a
observat că nu toate celulele au capacitatea de a-şi exprima acest caracter, datorită pe de o parte
diferenţierii celulare şi îmbătrânirii, iar pe de altă parte gradului mare de specializare al acelor celule.
Astfel, s-a demonstrat practic că, într-o plantă matură, celulele specializate care constituie
ţesuturile, de exemplu: traheidele, fibrele libero-lemnoase, sclereidele, etc, la care lipseşte citoplasma
şi nucleul, nu sunt totipotente. Acest aspect este explicat chiar prin faptul că întreaga informaţie
genetică a celulei totipotente se află în cromozomii din nucleu.
La plantele cormofite, odată cu înaintarea în vârstă, o parte din celule îşi pierd capacitatea de
totipotenţă sau aceasta se reduce foarte mult. Rămân, însă, anumite zone în care activitatea celulelor
este intensă, având loc diviziunea şi formarea aproape continuă de noi celule. Aceste celule sunt mici
în dimensiuni, poligonale, bogate în citoplasmă, au vacuolă mică şi nucleu mare dispus central şi
prezintă o membrană celulozică, formând ţesutul cu denumirea de meristem.
Meristemele sunt zonele generatoare de celule necesare creşterii în lungime şi grosime a
plantelor, fiind dispuse terminal atât în tulpină cât şi în rădăcini.
1.1.2 Caracteristicile culturilor in vitro
Spre deosebire de multiplicarea tradiţională, unde se operează cu seminţe sau porţiuni mari de
plantă (marcote, butaşi, altoi), la multiplicarea in vitro se folosesc explante mici, de ordinul
milimetrilor sau chiar microscopice (celule, protoplaşti), explante care în condiţii normale de cultură
nu ar reuşi să crească opunând rezistenţă agenţilor patogeni şi sintetizându-şi singure substanţele
nutritive necesare.
Din acest motiv, pentru reuşita culturii de celule şi ţesuturi se cer respectate următoarele
condiţii:
-prepararea unui mediu de creştere care să asigure o bună nutriţie heterotrofă a explantului, prin
asigurarea sursei de carbon organic uşor accesibil explantelor;
-asigurarea şi controlarea factorilor de mediu (temperatură, lumină, umiditate) în limitele optime
pentru fiecare specie, soi şi fază de creştere, în funcţie de cerinţele acestora şi scopul urmărit;
-stimularea creşterii şi diferenţierii sau dediferenţierii organelor prin utilizarea corespunzătoare a
substanţelor stimulatoare de creştere;
-asigurarea unei asepsii depline pe tot fluxul de producere a plantelor in vitro, prin dezinfecţia
materialului vegetal, sterilizarea mediului şi a vaselor de cultură, precum şi efectuarea tuturor
operaţiilor în hota cu flux de aer laminar steril, folosind instrumentar sterilizat prin flambare.
166
1.1.3 Domenii de aplicare a culturilor in vitro
Datorită spectrului larg de probleme la care culturile in vitro au răspuns afirmativ, sunt
utilizate în prezent în agricultură, silvicultură, farmacie, industria alimentară, industria uşoară, etc. În
agricultură, în general şi în horticultură în special, culturile de ţesuturi şi celule sunt folosite pentru
multiplicarea unor specii, soiuri sau clone valoroase, pentru ameliorarea speciilor cultivate, pentru
conservarea germoplasmei horticole, pentru obţinerea de metaboliţi secundari.
Avantajele culturii in vitro sunt multiple, dintre care amintim:
-asigură multiplicarea clonală rapidă a unor soiuri, hibrizi sau clone valoroase pornind de la
cantităţi mici de material vegetal. Teoretic, se asigură o multiplicare exponenţială, prin care în circa 6
luni se pot obţine 1 milion de plante;
-se poate produce material săditor liber de viroze şi micoplasme, material mai viguros, precoce
şi productiv;
-necesită spaţii mici de cultură şi se valorifică bine spaţiul din laborator prin cultura pe
verticală pe 3-5 nivele suprapuse;
-obţinerea de plante haploide, prin cultura de polen, antere sau alte explante de ţesuturi
generative (cu n cromozomi);
-dă posibilitatea obţinerii hibrizilor interspecifici prin fecundarea in vitro, hibrizi care în
condiţii normale sunt imposibil de obţinut;
-selecţia de plante rezistente la stres, boli şi dăunători;
-se evită efectul sezonier de pepinieră;
-se pot obţine seminţe artificiale;
-se pot obţine plante pe rădăcini proprii evitând astfel cheltuielile de altoire;
-asigură multiplicarea clonală a portaltoilor care nu înrădăcinează în condiţii normale de
cultură;
-asigură păstrarea materialului în faza de plantulă până la primirea unor comenzi ferme de
multiplicare.
Cu toate aceste avantaje, există specii care nu răspund bine la cultura in vitro şi care,
deocamdată rămân să fie înmulţite tradiţional.
Există însă şi câteva impedimente în utilizarea acestei metode pentru înmulţirea în masă a
plantelor, cum ar fi:
-necesitatea unui laborator cu dotările minime: instalaţii şi aparate indispensabile activităţilor
de micropropagare, care sunt costisitoare;
-necesitatea unui personal specializat în multiplicarea clonală şi manipularea in vitro;
-utilizarea fitohormonilor, care sunt scumpi şi puţin accesibili tuturor unităţilor de producţie;
-nu se poate controla caracterul recalcitrant al unor specii sau soiuri, care nu răspund la
metodele cunoscute de multiplicare;
-există riscul apariţiei şi multiplicării mutaţiilor recesive, cu afectarea autenticităţii soiurilor;
-riscul apariţiei germenilor genetici prin multiplicarea solitară numai a unor tipuri care se
comportă bine la acest tip de cultură, cu riscul sărăcirii bazei de germoplasmă pentru unele specii.
1.2 PROCESE MORFOFIZIOLOGICE LA NIVELUL EXPLANTELOR
CULTIVATE IN VITRO
Explantele inoculate pe medii aseptice îşi vor relua activitatea metabolică, se vor integra noilor
condiţii de viaţă, îşi vor reamorsa procesele fiziologice vitale şi vor începe un nou ciclu de viaţă. În
dependenţă de mediul de cultură, de natura inoculilor, de seria de operaţiuni prin care au trecut
prealabil ultimei inoculări, de condiţiile de cultură şi de scopul urmărit, după dediferenţierea celulelor
şi regenerarea de noi celule, evoluţia acestora poate fi dirijată. Inoculii pot fi menţinuţi într-o stare
primară de organizare cum ar fi: culturi de celule în suspensie (fără a intervenii formarea de agregate
celulare) sau de calus, ori pot fi induse procese de citodiferenţiere, de morfogeneză sau organogeneză.
167
1.2.1 Diferenţierea
Celulele meristematice, divizându-se continuu, dau naştere la noi şi noi celule care, treptat,
cresc şi suferă o specializare morfofiziologică ce poartă numele de diferenţiere.
În procesul de diferenţiere se pierd caracterele citologice şi fiziologice de tip embrionar
specifice celulelor meristematice, evoluându-se spre calităţi proprii specializării funcţionale a
diferitelor tipuri de ţesuturi sau organe în alcătuirea cărora celulele mature vor intra. În primele faze
de diferenţiere se remarcă o modificare ultrastructurală şi funcţională a celulelor, fenomen denumit
citodiferenţiere.
Pe măsura diferenţierii, volumul celulei creşte, scade raportul nucleoplasmatic, citoplasma
devine peliculară şi parietală, se extinde vacuomul care împinge citoplasma şi nucleul la periferia
celulei.
Plastidomul este constituit din cloroplaste, cromoplaste sau amiloplaste, în funcţie de rolul
îndeplinit de celule.
Odată cu avansarea proceselor de diferenţiere peretele celular poate suferi modificări
secundare de genul depunerilor de celuloză, lignină, mineralizare, gelificare sau chiar lichefiere, care
conduc treptat la o îngreunare a comunicării intercelulare, intervenind cu timpul un declin fiziologic
sau chiar moartea celulelor (de exemplu la sclerenchim).
Celulele odată diferenţiate nu se mai divid. Celulele care compun un ţesut sau organ nu posedă
acelaşi ritm de creştere şi se află sub un permanent endocontrol fitohormonal.
Substanţele elaborate de celule pot difuza înspre celulele învecinate exercitând un anumit rol
în dezvoltarea acestora fenomen denumit inducţie, şi care stă la baza interrelaţiilor dintre ţesuturi, ce
servesc la organizarea acestora în formaţiuni funcţionale, respectiv la organogeneză.
După diferenţiere şi generarea de noi celule se ajunge la situaţia în care celulele neoformate
tind să se reorganizeze structural şi funcţional suferind o citodifereţiere, histodiferenţiere, cu
organizarea de ţesuturi (histogeneză), de organe (organogeneză) şi în final regenerarea unei noi plante.
Diferenţierea celulară in vitro nu este foarte variată, unele funcţii sunt reduse sau simplificate în timp
ce altele sunt amplificate.
1.2.2 Dediferenţierea celulară
Dediferenţierea constă în transformarea progresivă a celulelor din starea de celulă specializată
în celulă meristematică, recâştigând aptitudinea de a se divide.
Dediferenţierea naturală a celulelor poate fi observată în organele care se ramifică sau în cazul
traumatizării organelor şi al generării, la locul rănirii, de calus. Procesul de dediferenţiere este
complex şi se instalează în momentul în care celulele primesc un impuls inductiv, de obicei
fitohormonal, impuls ce declanşează transformări la nivel molecular.
În cadrul unui ţesut nu toate celulele dediferenţiază, puţine celule devin centrii generatori de
noi şi noi celule suficiente pentru a asigura îndeplinirea fenomenelor de restituţie. În caz de
traumatism organele din ţesuturile lezate beneficiază de acumularea unor substanţe cu rol esenţial în
inducerea şi stimularea proceselor de dediferenţiere.
Deci, fitohormonii, condiţiile de cultură, natura ţesuturilor implicate, starea lor fiziologică şi
vârsta plantelor donatoare constituie factori ce intervin în procesele de regenerare.
Aptitudinea celulelor de a se dediferenţia este foarte inegal răspândită în corpul plantelor şi
chiar şi în cadrul subunităţilor structurale, morfofuncţionale, care alcătuiesc un organism, existând
diferenţe mari în ceea ce priveşte capacitatea de a se dediferenţia, la celule aparţinând aceluiaşi organ
sau chiar ţesut.
Celulele explantelor inoculate pe medii aseptice, pentru a putea să-şi reorganizeze un mod de
viaţă, trebuie sa sufere un proces de conversie din celule definitivate structural şi funcţional în celule
meristematice, apte de multiplicare.
Aptitudinea celulelor explantelor inoculate in vitro de a se dediferenţia este foarte inegal
răspândită la specii, organe şi ţesuturi variate.
168
Fazele de dediferenţiere celulară pot fi caracterizate astfel:
1.prima faza de dediferenţiere:
-amorsarea proceselor de dediferenţiere;
-producerea dediferenţierii celulelor până la dobândirea caracteristicilor citologice specifice
unui ţesut meristematic de tip secundar, cu celule aplatizate asemănătoare ca aspect şi structură cu
cambiul.
2.a doua fază de dediferenţiere:
- dediferenţierea în continuare a celulelor până la stadiul de celule cu caracter de meristem
primar;
-generarea, din meristemele neoformate, de promeristeme sau meristemoizi (centre
organogene), ori de embrioni somatici, iar din acestea regenerarea de plante;
-generarea, prin proliferarea celulelor dediferenţiate, a unui calus neorganizat, structurat
omogen. La nivelul acestui ţesut calusal se pot apoi forma meristemoizi sau centri embriogeni.
1.2.3 Regenerarea
Regenerarea este capacitatea organismelor vii de a-şi reface oricare parte le-a fost distrusă.
Prin intermediul tehnicilor de cultivare in vitro a organelor, ţesuturilor sau celulelor vegetale se
exploatează la maxim capacitatea regenerativă a celulelor explantelor, respectiv se pune în valoare
manifestarea integrală a totipotenţialităţii celulare. Teoretic, toate celulele vii ale plantelor sunt
totipotente. Din celule somatice sau obţinut plante diploide, iar din celule generative, prin
androgeneză şi ginogeneză, sau regenerat plante haploide.
Ca şi în cazul dediferenţierii celulare, se poate spune că şi în regenerare există o mare
variabilitate în ceea ce priveşte reactivitatea celulară, capacitatea regenerativă este manifestată sau nu
de către o celulă vegetală sau de un grup de celule în funcţie de numeroşi factori endogeni şi exogeni.
Factorii endogeni ce joacă un rol esenţial în regenerare sunt: vârsta celulelor, gradul de diferenţiere,
capacitatea de a se dediferenţia, conţinutul în hormoni, natura balanţei hormonale şi echipamentul
enzimatic. Factorii exogeni implicaţi în regenerare sunt:traumele şi natura acestora (stresul datorat
introducerii unui explant în cultura in vitro), precum şi condiţiile de mediu.
Totipotenţa este deţinută de către fiecare celulă a plantelor dar exprimarea sa aparţine numai
anumitor tipuri de celule numite meristemoizi. Acestea sunt celule competente morfogenetic în a
răspunde la variaţi stimuli şi care, în condiţii specifice, pot da naştere la tulpini, rădăcini sau embrioni.
Numărul celulelor dintr-o populaţie cultivată in vitro care-şi exprimă potenţialul organogen
sau embriogen se află sub controlul mai multor factori.
Specia. Există specii la care regenerarea are loc în special prin organogeneză şi specii care
regenerează prin embriogeneză, dar şi specii care pot regenera atât lăstari cât şi embrioni in vitro.
Genotipul. S-a constatat că nu toate soiurile aparţinând unei specii cultivate au potenţial
regenerativ. Astfel, s-au evidenţiat genotipuri „culturabile”, ce au permis o regenerare uşoară din orice
tip de ţesut, dar şi genotipuri recalcitrante, la care stabilirea unui protocol de regenerare s-a făcut cu
mare dificultate şi cu rezultate slabe.
Natura explantului. La unele specii (lucerna) toate tipurile de explante generează calus
regenerativ. La altele însă obţinerea plantelor in vitro este condiţionată de utilizarea anumitor
explante, de exemplu la graminee numai embrionii imaturi, inflorescenţele foarte tinere şi microsporii
generează calusuri regenerative.
Vârsta explantelor. Calusurile iniţiate din ţesuturi tinere regenerează mult mai bine decât cele
provenite din explante mature. În embriogeneza somatică directă, exprimarea totipotenţei depinde de
stadiul de dezvoltare al explantelor. Sunt capabile sa parcurgă embriogeneza directă celulele
embrionare, celulele epidermei hipocotilului, celulele nucelei şi sinergidele.
Alţi factori care influenţează regenerarea sunt: starea fiziologică a plantei donor, compoziţia
mediului de cultură, vârsta culturii, temperatura, fotoperioada, intensitatea şi calitatea luminii, stresul
(biotic sau abiotic).
169
1.2.4 Morfogeneza in vitro
Întrucât la culturile in vitro morfogeneza prezintă aspecte particulare, specifice acestui tip de
cultură, vom adopta termenul de morfogeneză în sens larg iar în acest context, vom descrie procesele
de morfogeneză sesizabile la nivelul explantelor cultivate in vitro, respectiv organogeneza şi
embriogeneza.
Bibliografia existentă până în prezent subliniază dependenţa capacităţii morfogenetice de
natura explantelor; pe de altă parte sunt numeroase referiri bibliografice care evidenţiază relaţia care
există între genotip şi competenţa morfogenetică a explantelor cultivate in vitro. Vasil (1984) a
considerat ca factor decisiv în menţinerea capacităţii morfogenetice, starea fiziologică şi de dezvoltare
a explantului. Deci, adeseori, stadiul de dezvoltare al plantei donatoare condiţionează regenerarea şi
reacţia explantului , altfel spus un răspuns morfogenetic corespunzător a fost obţinut numai atunci
când explantul a prezentat un anumit stadiu de dezvoltare. Folosirea unor explante mai tinere sau mai
avansate în dezvoltare, faţă de cel optim, adeseori s-a soldat cu formarea unui calus nemorfogen.
Morfogeneza la culturile in vitro este influenţată, în mare măsură de anumiţi factori:
-conţinutul endogen în fitohormoni şi aportul exogen de regulatori de creştere;
-sărurile minerale prezente în mediul de cultură (mai ales natura sursei de azot);
-natura şi concentraţia glucidului din mediul de cultură;
-prezenţa în substrat a unor compuşi organici, în special al unor aminoacizi;
-prezenţa, natura şi concentraţia gazelor (O2, CO2, C2H4) dizolvate în mediu sau existente în
atmosfera din recipientele de cultură;
-prezenţa în substrat a unor extracte complexe, de origine biologică, sau a cărbunelui activ;
-factorii fizici (lumina, temperatura).
Deci lumina, temperatura, potenţialul osmotic al mediului, starea fizică a acestuia, tipul vaselor
de cultură sunt factori care pot influenţa în sens negativ morfogeneza.
Nu se cunoaşte încă dacă morfogeneza este influenţată şi în ce măsură, de substanţele
introduse iniţial în mediul de cultură sau de către complexul ionic, format în substrat, ca o consecinţă
a autoclavării, sau în ce măsură schimbările intervenite în compoziţia mediului, sub acţiunea
inoculilor, afectează morfogeneza.
1.2.4.1 Organogeneza in vitro
Organogeneza in vitro este un proces foarte complex care depinde care depinde de o serie
întreagă de fenomene biologice, aflate în antecedenţa momentului explantării ţesuturilor. Până în
momentul explantării ţesuturilor, celulele viitorului explant au parcurs, împreună cu sistemul cărora le
aparţineau, anumite trepte ale ciclului vital, trepte în care diferitele cerinţe fiziologice au fost
satisfăcute, mai mult sau mai puţin. Dintre aceste cerinţe amintim raportul endogen în fitohormoni şi
conţinutul endocelular în nutrienţi, ambele fiind dependente de iluminarea plantelor, de temperatura
mediului ambiant, de aprovizionarea cu săruri minerale. De modul în care au fost asigurate aceste
cerinţe, prealabile explantării, vor depinde, în mare măsură, reacţia explantelor, capacitatea
regenerativă şi mai ales organogeneza la nivelul inoculilor, derivaţi din acestea. Aspectele menţionate
au fost foarte clar relevate, mai ales în cazul studiilor de embriogeneză somatică şi de înrădăcinare a
tulpinilor recalcitrante în a genera rădăcini adventive. De exemplu, pentru inducerea înrădăcinării
tulpinilor de Sequoia sempervirens sau a altor plante lemnoase, se impune un pretratament, de scurtă
durată, a lor cu soluţie nutritivă, conţinând 100 mg/l AIB. Cu toate acestea, nici o tulpină nu a
înrădăcinat dacă tulpinile au fost păstrate, pe o durată lungă de timp, în acest mediu; rădăciniţe s-au
diferenţiat şi au crescut numai după ce explantele caulinare au fost scoase şi reinoculate pe un alt
mediu, lipsit de auxină (Teixeira, 1981).
Din cele prezentate, s-a putut reţine faptul că factorul endogen este dominant în obţinerea unei
anumite reacţii şi că pe lângă operarea unei modificări în condiţiile de incubare ale inoculilor, alegerea
explantului constituie factorul determinant în evoluţia acestora in vitro, în procesele de morfogeneză.
170
A.Rizogeneza in vitro
Un anumit fragment explantat se comportă, în linii mari, ca un minibutaş. El diferă de un butaş
normal, întrucât cel clasic deţine bogate rezerve endogene, are muguri şi eventual frunze. Mugurii şi
frunzele pot şi după desprinderea fragmentului de planta mamă să sintetizeze anumiţi compuşi
hormonali.
Explantul însă, din cauza dimensiunilor sale reduse şi a detaşării sale, nu mai beneficiază de
susţineri pe care să le primească de la muguri sau de la frunze şi rămâne în totalitate dependent de
mediul de cultură. În acest caz factorul genetic, mărimea explantului vârsta plantei mamă, starea
fiziologică a celulelor pe care le deţine, sunt tot atâţia factori care concură la evoluţia ulterioară a
inoculului.
Uneori, însă, in vitro, se produce o pierdere a capacităţii rizogene, mai ales ca urmare a
practicării unor repicări (subculturi) succesive. Se pune problema păstrării sau a redobândirii
capacităţii rizogene. Factorii care condiţionează menţinerea acesteia şi mai ales, cei care cauzează
pierderea aptitudinii rizogene sunt în mică măsură cunoscuţi.
Lumina poate exercita un efect pozitiv asupra rizogenezei dar numai la o intensitate slabă sau
în urma unei perioade scurte de acţiune (600 lucşi mai puţin de o oră/zi). Temperatura optimă pentru
rizogeneză este aceea de 26 oC. Uneori, însă, se recomandă practicarea unei alternanţe între o
temperatură scăzută (5-15 oC) şi ridicată, în prezenţa luminii, a auxinei şi a unui mediu bogat în
glucide.
În cele mai multe cazuri, formarea rădăcinilor este localizată polar. Rădăcinile se formează la
polul radicular al explantului, în timp ce generarea mugurilor este localizată la polul foliar. Aportul de
auxină, în concentraţie ridicată, poate perturba polaritatea. În concentraţii optime auxina stimulează
rizogeneza.
B.Caulogeneza in vitro
Formarea de muguraşi in vitro, denumită şi caulogeneză, respectiv formarea de centri
vegetativi, este esenţială atunci când se urmăreşte, de exemplu, multiplicarea sau „reconstituirea” unei
noi plante ori a unui genotip, generat prin hibridare somatică. Inducerea caulogenezei, a formării de
muguraşi şi tulpiniţe, la nivelul inoculilor cultivaţi in vitro, este stimulată de prezenţa în mediul de
cultură a citochininelor, adeseori, în condiţiile asocierii acestora cu auxinele. De asemenea trebuie
menţionat şi faptul ca formarea de muguraşi la nivelul calusului se află sub controlul interacţiunii
celor două categorii de fitohormoni. Reuşita formării muguraşilor presupune nu doar prezenţa celor
două tipuri de fitohormoni, ci şi a realizării unui anumit raport al cărui eficienţă este variabilă în
funcţie de specie, de provenienţa şi natura inoculului. Se poate spune deci, că nu este important doar
raportul fitohormonal, ci şi natura şi concentraţia compuşilor utilizaţi ca regulatori de creştere. Uneori,
se poate declanşa caulogeneza reducând concentraţia de auxină. Alteori, cel mai mare număr de
muguraşi este atins atunci când se folosesc concentraţii relativ ridicate de citochinină. Dar nu există
reguli general valabile. Adeseori fiecare experienţă reprezintă un caz aparte, iar reacţia explantelor, la
balanţa hormonală din substrat, variază mult, în dependenţă de tipul materialului vegetal.
La calus, în inducerea caulogenezei, se obţin, uneori, rezultate pozitive prin cultivarea
succesivă a acestuia, într-o primă etapă, pe un mediu fie cu o concentraţie foarte ridicată de 2,4D, fie
în prezenţa unei auxine mai slabe ca eficienţă, dar administrată în concentraţie mare, asociată eventual
cu o citochinină, în concentraţie moderată. Acest calus subcultivat pe un mediu cu aport scăzut în
auxină şi cu un conţinut ridicat în citochinină, ar putea conduce cu succes la declanşarea procesului de
înmugurire.
Factorii externi (lumina, temperatura, calităţile fizice ale mediului) sunt controversaţi în ceea
ce priveşte efectele lor asupra caulogenezei. Acţiunea acestora depinde foarte mult de tipul inoculilor
şi de etapele parcurse anterior.
Cu toate că numeroase specii necesită o anumită fotoperioadă pentru inducţie florală, în
general se apreciază că formarea de muguraşi este independentă de fotoperioadă.
171
Temperatura recomandabilă pentru desfăşurarea optimă a proceselor de caulogeneză este aceea
de 25 oC.
Folosirea alternativă a mediilor lichide şi a celor solide poate exercita un efect benefic asupra
producerii proceselor de morfogeneză. Astfel, la orhidee, se cunoaşte că menţinerea protocormilor în
stare submersă favorizează multiplicarea acestora, dar este inhibată organogeneza. Trecerea
protocormilor din mediu lichid pe mediu agarizat declanşează organogeneza. Dacă după o perioadă de
menţinere a protocormilor pe mediu agarizat (câteva săptămâni) se submersează protocormii, prin
acoperirea lor cu soluţie nutritivă diluată, sau cu apă distilată sterilă, se reuşeşte o stimulare a
proceselor de organogeneză (Cachiţă, 1983).
La monocotiledonate capacitatea caulogenă este mai moderată. Aptitudinea cerealelor de a
forma muguri in vitro este foarte variabilă. Adeseori această capacitate, la nivelul calusului, se pierde
în timp, pe măsura practicării unor subcultivări succesive (mai ales la grâu).
1.2.4.2 Embriogeneza somatică
Procesul de formare a embrionului, respectiv succesiunea fazelor de multiplicare celulară şi de
histogeneză finalizate cu formarea unui embrion se numeşte embriogeneză. Indiferent de tipul
embriogenezei, punctul de plecare în formarea viitoarei plante este o unică celulă.
Embriogeneza somatică este fenomenul prin care din celule somatice iau naştere embrioni.
Aşadar dintr-o celulă a sporofitului, pe cale sexuată se pot genera embrioni care se aseamănă foarte
mult cu embrionii zigotici. Embrionii somatici sunt, deci, un rezultat al multiplicării repetate a unei
celule somatice şi nu a unei celule a gametofitului sau a celulelor generative.
Embriogeneza somatică in vitro a fost semnalată la morcov de către Steward şi colab. (1958) şi
de către Reinert (1958, 1959). În inducerea embriogenezei somatice un rol important l-a avut
adăugarea în mediul de cultură a laptelui din nucă de cocos datorită citochininelor naturale, aflate din
abundenţă în acest produs natural.
Prin dezvoltarea tehnicilor de embriogeneză somatică s-a reuşit o cotitură în cercetările de
embriologie experimentală. Astfel, s-a putut stabili:
-capacitatea embriogenă este conţinută în fiecare celulă, aparent banală şi că această aptitudine
nu este numai un apanaj al zigotului rezultat din fecundare;
-embrionul în formare are un anumit grad de autonomie şi nu este strict dependent de prezenţa
unui anumit mediu constituit din albumen, aşa cum este cazul la embrionul zigotic;
-atât embrionul zigotic, cât şi cel somatic trec prin faze morfologice identice, tipice cunoscute
în embriogeneza clasică şi anume: celula generatoare dă naştere la un masiv celular care, treptat suferă
o succesiune de transformări denumite arbitrar stadiul globular, stadiul cordiform, stadiul de torpilă
sau torpedo.
În embriogeneza somatică prin izolarea şi detaşarea explantelor se realizează eliberarea
celulelor din intercorelaţiile fiziologice în care se aflau integrate, prealabil desprinderii lor din corpul
plantei, moment în care se rup nu numai legăturile trofice şi fitohormonale avute, ci se sistează şi
eventuala prezenţă a factorilor inhibitori endogeni care prin represie biochimică controlau şi blocau
dezvoltarea haotică a celulelor unui organism.
1.2.5 Habituaţia sau anergismul
Habituaţia sau anergismul este un fenomen fiziologic care se referă la totalitatea schimbărilor
ereditare survenite spontan, la un moment dat, în raport cu cerinţele de aprovizionare a celulelor
cultivate pe medii aseptice; acestea privesc lipsa de reacţie, de răspuns, a materialului biologic, la
anumiţi fitoefectori, regulatori de creştere sau vitamine, prezenţi în mediul de cultură.
Habituaţia nu se referă numai la reacţia inoculilor în raport cu fitohormonii exogeni, ci priveşte
o gamă mai largă de probleme, unele dintre ele neîncadrate încă în această categorie de manifestări
fiziologice. Astfel, explantul detaşat, lipsit de punctul vegetativ (dominanţa apicală), trece prin
transformări particulare, specifice noii stări fiziologice. Celulele sale, devenind autonome, pot
prezenta un comportament deosebit (Gautheret, 1980).
172
Mecanismul habituaţiei este încă necunoscut. Se ştie doar că, există anumiţi factori de mediu
care favorizează instalarea acestor fenomene. Dintre ei amintim: auxinele (mai ales 2,4D) şi
temperaturile ridicate.
1.2.6 Vitrificarea sau sticlozitatea
Fenomenul de vitrificare sau sticlozitate este un proces de transparentizare a frunzelor şi
tulpinilor şi a fost semnalat la culturile de salată în seră (Gautheret, 1980). Se apreciază că, în cazul
acestui fenomen, în anumite condiţii (cum ar fi exces de umiditate), organele aeriene ale plantelor
devin translucide ca o consecinţă a infiltrării apei în spaţiile intercelulare, înlocuindu-se aerul din ele.
În condiţii aseptice, plante vitroase pot să apară brusc. Ele suferă transformări
morfofiziologice, frunzele lor recurbându-se, devenind translucide, sticloase, rugoase, uneori ondulate
şi casante, prezentând o creştere malformată, hipertrofiată. Aspectul general este degenerat.
Studiile amănunţite asupra structurii frunzei au arătat că frunza nu are celulele diferenţiate în
cele două ţesuturi, palisadic şi lacunar. Meristemele lăstarilor vitrificaţi sunt mai mici decât la cei
normali. Celulele sunt mult hidratate şi conţin clorofilă mai puţină.
S-a constatat că prin adăugarea cărbunelui vegetal în mediul de cultură se elimină sau se reduce foarte
mult procesul de vitrificare. De asemenea ridicarea concentraţiei de agar la 1-1,1% reduce vitrificarea
(Orlikowska, 1985). Concentraţii mai mari de 0,8% de agar duc însă la scăderea ratei de multiplicare
şi de aceea este foarte dificil de îmbinat cele două aspecte.
CAPITOLUL II
2.1 FENOMENE FIZIOLOGICE CORELATE CU REALIZAREA UNEI
CULTURI IN VITRO
Tehnicile de cultură in vitro folosite în cercetare sau pentru producerea de plante, pornesc de la
aceeaşi premiză: posibilitatea de a controla într-un mod optim factorii de mediu (temperatură, lumină,
compoziţia mediului de cultură, pH, umiditate) necesari fragmentului de plantă inoculat în condiţii
artificiale de mediu, în încercarea de a analiza funcţiile sale fiziologice sau de a-l conduce într-o
anumită direcţie, cum ar fi formarea de noi lăstari (micropropagarea).
Tehnicile de cultură in vitro, pe lângă aspectul tehnologic, ne permit rezolvarea unui număr de
probleme:
-menţinerea unui explant viabil şi activ din punct de vedere vegetativ;
-permiterea creşterii normale a unui explant reprezentat de o structură organizată (meristem,
vârf de creştere sau mugure);
-inducerea proceselor de diferenţiere în cazul unor fragmente de calus pentru formarea de
organe sau embrioni somatici;
-inducerea proceselor de dediferenţiere, în cazul unor explante formate din celule diferenţiate
(fragmente de tulpină, frunză, peţiol, rădăcină, etc.) rezultând o nouă organizare tisulară;
-inducerea proceselor de diviziune celulară, valabilă tuturor cazurilor amintite mai sus.
Aceste probleme au fost parţial rezolvate odată cu identificarea regulatorilor de creştere
endogeni de tipul auxinelor (primul grup de fitohormoni recunoscut), giberelinelor, citochininelor,
pentru a numi doar cele trei clase principale de regulatori de creştere. Aceste substanţe par a determina
orientarea dezvoltării celulelor în cultura artificială, fapt pentru care li se acordă prima atenţie atunci
când se încearcă explicarea unor fenomene fiziologice.
2.1.1 Regulatorii de creştere
Existenţa hormonilor vegetali a fost bănuită încă de la începutul secolului trecut. Numeroase
lucrări ştiinţifice privitoare la aceste subiect au evidenţiat prezenţa lor, dar nu le-au putut identifica
173
decât mult mai târziu. Primii fitohormoni descoperiţi au făcut parte din clasa auxinelor, în jurul anului
1934, giberelinele şi citochininele fiind descoperite mai târziu, în anii ’50. Aceste trei tipuri de
regulatori de creştere exercită o acţiune stimulativă asupra metabolismului celular. Există şi substanţe
cu efecte inhibitoare asupra creşterii şi dezvoltării celulelor vegetale cum ar fi acidul abscisic,
identificat în anul 1965 şi substanţele fenolice identificate câţiva ani mai târziu. De asemenea, etilena,
un compus gazos, a fost recunoscută ca regulator de creştere atunci când metodele de măsurare a
acesteia au permis detectarea sa în organele plantelor. Etilena poate avea fie efect stimulator, fie efect
inhibitor asupra plantelor.
Aceste substanţe sunt endogene, ceea ce înseamnă că sunt sintetizate de plante. Există şi
fitoregulatori de creştere artificiali cu formule chimice asemănătoare celor naturali, prezentând o
acţiune fiziologică similară. Toate aceste substanţe, sintetice sau naturale, sunt numite regulatori de
creştere şi au anumite caracteristice comune:
-acţionează într-o concentraţie foarte mică, în concentraţie mare sunt toxice, de aceea unele
dintre ele sunt folosite ca erbicide;
-acţionează numai în interacţiune cu alţi fitoregulatori, funcţia lor fiind determinată de balanţa
hormonală stabilită între ei;
-intervin într-un număr de fenomene fiziologice ce implică mai multe moduri de acţiune astfel
încât noţiunea de hormon (cu un efect rizogenic sau caulogenic specific) a fost abandonată.
O diferenţă substanţială între fitoregulatorii de creştere artificiali şi cei naturali constă în
faptul că cei endogeni pot fi controlaţi de mecanismele metabolice ale celulelor fiind eliminaţi
suficient de repede, pe când cei artificiali persistă mult mai mult fiind deseori preferaţi aplicaţiilor
practice.
2.1.1.1 Auxinele
Auxinele au fost descoperite în urma unor experimente asupra coleoptilului la Gramineae.
Numele de auxine provine din grecescul auxein – a creşte, determinând elongarea celulelor (auxesis –
creştere ce se referă în special la mărimea celulei decât la numărul de celule).
Este un compus ce are la bază nucleul indolic cu formula de bază C10H9O2N cunoscut sub
numele de acid β- indolil acetic (Fig.1).
Fig.1 Acidul β- indolil acetic
A. Proprietăţile fiziologice ale auxinelor
Auxinele intervin în multe fenomene fiziologice, iar acţiunile lor depind de concentraţiilor şi de
interacţiunile cu alţi regulatori de creştere. Studiind câteva din efectele lor s-a putut concluziona că:
-exercită o acţiune clară asupra elongării celulare, aceste efect urmează creşterii plasticităţii
peretelui celular şi penetrării apei în celulă. Apoi rezistenţa peretelui scade şi celula creşte în lungime;
-modifică permeabilitatea membranei plasmatice, ceea ce duce la o descărcare de ioni de H+,
determinând o creştere a acidităţii responsabilă de diminuarea rezistenţei peretelui celular şi o
absorbţie de ioni de K+;
-influenţează în general metabolismul celular şi în particular sinteza ARN-ului ribozomal
(ribozomii participă la sinteza proteinelor);
174
-stimulează diviziunea celulelor cu origine cambială (acest tip de acţiune a determinat insuccesele
din primele încercări de iniţierea a culturilor in vitro); Acest efect este descris ca histogenic deoarece
conduce la formarea unui număr de celule asemănătoare, numite calus;
-acţionează asupra sintezei etilenei într-o anumită concentraţie, etilena intervine în schimb în
reglarea nivelului de auxină cel puţin la nivelul vaselor conducătoare;
-acţionează asupra tropismului plantelor şi asupra corelaţiei dintre organe, în particular asupra
fenomenelor de dominanţă apicală;
-determină întârzierea căderii frunzelor şi a fructelor;
-au acţiune rizogenică fiind folosite în special în micropropagarea speciilor ornamentale destinate
comerţului de flori tăiate;
Aceste efecte numeroase nu pot rezulta doar din acţiunea singulară a auxinei deoarece
concentraţia optimă este diferită pentru fiecare tip de acţiune în parte şi se schimbă în funcţie de
concentraţia celorlalţi fitoregulatori.
Modul de acţiune al auxinelor. Nu se poate da un răspuns precis, dar cercetările în domeniu au
evidenţiat existenţa unor receptori fie membranari, fie citoplasmatici specifici auxinei. Pe baza acestei
ipoteze au rezultat următoarele concluzii:
-în funcţie de prezenţa sau absenţa unuia sau a celuilalt receptor apar diferenţe de reacţie în
concordanţă cu originea celulei ce reacţionează la acest fitohormon;
-în funcţie de afinitatea receptorului pentru auxină unii sunt angrenaţi mai repede decât alţii.
Au fost descoperiţi receptori şi pentru alte tipuri de fitoregulatori de creştere, de aici se poate
extinde ideea existenţei de receptori pentru toate tipurile de regulatori endogeni.
B. Auxinele în plante
Toate plantele sintetizează auxine, sinteză modulată de stadiul de dezvoltare ale acestora. Sinteza
auxinelor are loc la nivelul frunzelor tinere, a mugurilor şi în florile şi fructele tinere.
Auxinele circulă de la vârful spre baza organelor cu o polaritate puternic pronunţată în organele
tinere, dar în cursul transportului lor sunt descompuse de auxin-oxidaze, ceea ce înseamnă că auxinele
sunt în concentraţie mai mare în apropierea situsurilor de sinteză. Astfel, auxinele sunt prezente într-o
concentraţie suficientă în vârful plantelor în creştere, în mugurii florali sau foliari, pentru a asigura
multiplicarea şi elongarea celulelor.
C. Auxinele sintetice
De când au fost identificate auxinele, s-au sintetizat compuşi chimici similari acestora, care au
generat în celulele vegetale efecte similare auxinelor endogene, ceea ce confirmă existenţa
receptorilor pentru auxine. Mai mult, fiind influenţaţi mai puţin de activitatea auxin-enzimelor , vor
putea avea un efect prelungit în plante.
Printre numeroasele substanţe folosite, cele mai importante sunt:
-acidul.indolil butiric (AIB);
-acidul naftalen acetic (ANA – Fig.2) şi derivaţii săi: acidul naftooxiacetic (ANOA) şi
naftilacetilamida (NAD);
-acidul 2,4 diclorfenoxiacetic (2,4 D).
175
Fig.2 Acidul naftalen α-acetic
În practică, auxinele endogene pot fi folosite, fiind mai puţin toxice dar şi mai puţin eficiente
deoarece activitatea acestora este rapid inhibată de acţiunea auxin-oxidazelor. De aceea produsele
sintetice le-au luat locul chiar dacă implică un risc mai mare de toxicitate.
În aplicaţiile agricole, compuşii auxinici sunt folosiţi pentru cicatrizarea rănilor rezultate în
urma tăierilor anuale din pomicultură, în evidenţierea fructelor partenocarpice sau pentru întârzierea
căderii frunzelor sau a fructelor până la recoltare, ca urmare a efectului invers exercitat de acidul
abscisic.
Şi în domeniul culturilor in vitro se folosesc aceleaşi substanţe urmărindu-se în principal
efectele rizogenice şi de multiplicare a celulelor pe care acestea le generează.
2.1.1.2 Giberelinele
Asemeni auxinelor, efectul giberelinelor a fost evidenţiat înainte ca acestea să fie identificate.
Primele observaţii (1926) au fost făcute pe plante de orez atacate de o ciupercă (Giberella fujikuroi)
care prezentau internoduri mult elongate şi frunze clorotice. Extractul apos din ciupercă a provocat
simptome similare la plantele testate, ceea ce a condus la ideea existenţei unei substanţe responsabile
de aceste efecte.
Prima giberelină identificată a fost acidul giberelic sau GA3 (un complex izolat în 1939 şi
numit „giberelina A”). Această primă descoperire a fost urmată de descoperirea altor gibereline până
când în plante şi în ciuperci au fost identificate în total aproximativ cincizeci de gibereline. Aceştia
sunt toţi compuşi endogeni. În practică, giberelinele folosite sunt extracte purificate.
Cea mai folosită giberelină este GA3 (Fig.3) şi mai puţin folosite sunt amestecul GA4+GA7 sau
GA7. Este posibil ca în următorii ani să fie folosite gibereline sintetice, având în vedere că primele
gibereline sintetice au fost obţinute prin anii ’80.
Fig.3 Acidul giberelic
Toţi aceşti compuşi au un nucleu similar (nucleul giberelic) diferind doar prin calitate şi
poziţia substituenţilor în nucleu.
176
A. Proprietăţile fiziologice ale giberelinelor
Proprietăţile fiziologice ce urmează a fi descrise corespund acidului giberelic (GA3). Nu toate
giberelinele au activitate similară, unele sunt inactive sau doar forme intermediare, ceea ce le face
dificil de studiat, iar mai mult, nu toate plantele posedă aceleaşi gibereline.
Principalele proprietăţi ale acidului giberelic sunt:
-acţionează asupra elongării internodurilor, uneori determinând rezultate spectaculoase (ex: s-
au obţinut plante de varză cu tulpina de 3 m), dar nu asupra tuturor speciilor. Doar unele dintre
varietăţile pitice ale unor specii pot atinge talii normale în urma aplicării de GA3, în general varietăţile
pitice nu reacţionează la efectul de elongare al acidului giberelic. Acidul giberelic acţionează şi asupra
pedunculilor florali, împiedică maturizarea timpurie (cu 15 până la 20 de zile la Cyclamen) sau
alungirea inflorescenţelor prea dezvoltate (ex: la viţele de vie cu ciorchini denşi, acidul giberelic a
inhibat dezvoltarea racemelor laxe);
-în cultura in vitro giberelinele acţionează şi la nivelul meristemelor, care, în absenţa acestora,
prezintă un aspect globular;
-stimulează metabolismul celular deoarece favorizează sinteza enzimelor hidrolitice. S-a
dovedit că la seminţele de orz, acumularea α-amilazei, o enzimă cu rol în transformarea amidonului în
zaharuri solubile, este datorată acidului giberelic, care acţionează direct sau după asocierea cu un
receptor. Giberelinele acţionează, de asemenea, în prezenţa auxinelor, şi sunt deseori stimulate de
sinteza sau inhibarea sintezei auxin-oxidazelor;
-acţionează asupra înfloririi, având ca efect fie inhibarea inducerii florale, cum ar fi cazul
pomilor fructiferi, sau stimulează înflorirea speciilor ce necesită temperaturi scăzute pentru a înflori,
astfel încât în prezenţa giberelinelor aceste specii înfloresc şi fără temperaturi scăzute (morcov). La
alte specii, ce necesită de asemenea temperaturi scăzute pentru înflorire, prezenţa giberelinelor induce
doar alungirea tulpinii fără formarea florilor (sfeclă). Aceste contradicţii în aparenţă au o explicaţie
simplă: în plantele prezentate mai sus frigul acţionează doar asupra creşterii tulpinii, pe când în
celălalt caz asupra procesului de înflorire. Astfel, giberelinele, îşi exercită doar rolul de stimulatori ai
elongaţiei neinfluenţând, în acest caz, procesele fiziologice normale;
-acţionează asupra formării fructelor partenocarpice la păr, mandarin, prun;
-exercită o acţiune complexă asupra germinării seminţelor sau pornirii în vegetaţie a mugurilor
dorminzi, atunci când condiţiile climaterice (temperaturi scăzute) nu permit acest lucru, inducând şi
ramificarea sau creşterea ramurilor la Hydrangea;
-în organogeneză, acţiunea giberelinelor poate fi antagonică. Par a se opune fenomenului de
dediferenţiere, neputând fi folosite in vitro în acest scop, acţionând însă asupra meristemelor apicale
sau axilare şi asupra butonilor florali, prin stimularea creşterii şi dezvoltării acestora.
B. Giberelinele în plante
Giberelinele au fost descoperite atât în plante cât şi în ciuperci cu o distribuţie inegală. Unele
gibereline se pot întâlni doar în plante, altele doar în ciuperci şi unele în ambele grupe (acizii
giberelici 1,3,4,7,9). Unele plante posedă doar un fel de gibereline, în alte specii se află şi acţionează
mai multe tipuri de gibereline.
Locurile de sinteză a giberelinelor se află la nivelul frunzelor foarte tinere, în mugurii foliari şi
florali, în lăstarii activi, în vârful rădăcinilor şi în embrioni.
Giberelinele circulă liber prin plantă fără existenţa unei polarităţi fiind asociate deseori
zaharurilor, eliberându-se în situsurile ţintă.
2.1.1.3 Citochininele
Citochininele au fost descoperite în timpul studiilor efectuate asupra ţesuturilor vegetale
cultivate in vitro. S-a descoperit şi acum este bine cunoscut faptul că adiţia de lapte de nucă de cocos
în mediile artificiale de cultură are un efect favorabil asupra multiplicării celulare şi în lăstărire.
Cercetările ce au încercat să descopere factorul responsabil de aceste efecte au dus la izolarea unui
177
complex chimic activ de natură purinică, care nu a putut fi iniţial identificat. Aceste rezultate au dat
posibilitatea continuării cercetărilor asupra purinelor şi în 1956, Skoog a izolat, din ARN denaturat, o
substanţă activă numită „chinetina”.
Citochininele sunt înlocuitori ai adeninelor la care sunt cunoscuţi doi compuşi endogeni:
-zeatina (Fig.4)
-izopenteniladenina, a cărei compuşi sintetici sunt: chinetina (Kin –Fig.4) (6-
furfurilaminopurina) şi benziladenina (BAP) (6-benzilaminopurina).
a) b)
Fig.4 Citochinine: a) zeatina, b) kinetina
Se mai folosesc şi alţi înlocuitori ai adeninelor, sintetici, liberi sau în asociere cu zaharuri.
A. Proprietăţile fiziologice ale citochininelor
Citochininele sunt foarte active în plante şi asemeni celorlalte două clase de fitohormoni
prezentate anterior au o serie de proprietăţi dintre care:
-au un efect foarte clar asupra diviziunii celulare. În acest proces citochininele sunt
indispensabile, dar ineficiente fără acţiunea auxinelor, cele două complementându-se reciproc.
Auxinele favorizează duplicarea ADN, iar citochininele permit separarea cromozomilor;
-au un rol la fel de important în organogeneză stimulând formarea lăstarilor, fiind însă
antagonice rizogenezei;
-exercită un efect de stimulare a metabolismului celular, favorizând sinteza proteinelor, prin
rolul ce-l joacă în compoziţia ARN-ului de transfer şi protejând metaboliţii de acţiunea enzimelor
hidrolitice. Acest efect determină întârzierea senescenţei până la punctul în care frunzele mature
tratate cu citochinine se comportă asemănător celor tinere din punct de vedere metabolic;
-exercită un efect antagonic asupra dominanţei apicale stimulând lăstărirea axilară;
Citochininele prezintă o importanţă deosebită în domeniul culturii in vitro deoarece au permis
obţinerea unor progrese importante în micropropagarea plantelor. Proprietăţile citochininelor permit
rezolvarea dificultăţilor enumerate mai sus, cum ar fi menţinerea viabilităţii celulelor vegetale,
stimularea diviziunii celulare, orientarea celulelor spre dediferenţiere.
B. Citochininele în plante
Prima citochinină endogenă a fost identificată în 1963 în embrioni imaturi de porumb, de unde
şi numele de zeatină, urmată de izopentenil adenina (IPA), descoperită puţin mai târziu în plante
atacate de bacteria Corynebacterium fasciens. Toate plantele conţin citochinine sintetizate în special
în rădăcini şi în embrioni. Aplicarea citochininelor pe frunze determină atragerea substanţelor
nutritive spre aceste zone datorită efectului de stimulare a metabolismului exercitat de citochinine la
acest nivel. Creşterea în dimensiuni a tuberculilor şi fructelor se datorează prezenţei citochininelor
endogene localizate în aceste organe.
Citochininele se pot asocia cu zaharurile şi circula prin plante fără polaritate. Se presupune ca
ele circulă într-o formă inactivă şi că rămân localizate la anumite nivele unde vor fi activate ulterior,
ca în cazul aplicaţiilor pe frunze.
178
2.1.1.4 Etilena
Etilena (fig.5) este un compus gazos identificat cu mult timp în urmă în încăperile de
depozitare a fructelor sau plantelor, dar funcţia sa de regulator de creştere nu a fost evidenţiată până în
momentul dezvoltării tehnicilor de analiză în plante. Etilena se află în plante în cantităţi infime şi
poate fi produsă de toate părţile acesteia.
Fig.5 Etilena
Principalele proprietăţi ale acestui regulator de creştere sunt:
-determină iniţierea procesului de maturare a fructelor, etilena fiind folosită la început pentru
coacerea fructelor la lămâi, iar acum pentru determinarea coacerii simultane a fructelor la măr şi cireş;
-accelerează procesele de cădere a frunzelor şi fructelor, fiind folosită atunci când se urmăreşte
recoltarea mecanizată a fructelor la cireşi şi măslini;
-induce formarea florilor la speciile familiei Bromeliaceae (ananas), o proprietate folosită în
horticultură;
-modifică ritmul de creştere prin acţiunea pe care o exercită asupra polarităţii transportului
auxinelor;
-are acţiune favorabilă asupra tuberizării.
Aceste proprietăţi au unele puncte comune cu auxinele (înflorirea Bromeliaceaelor, corelaţii
de creştere) iar unele antagonice (căderea frunzelor şi fructelor, tuberizarea). Acţiunea antagonică a
etilenei pare a depinde de interacţiunea dintre cele două substanţe ce pot controla sinteza, concentraţia
şi circulaţia lor.
Aplicaţiile practice ale etilenei, dificil de utilizat în starea sa gazoasă, au făcut progrese doar
după descoperirea acidului 2-cloro-etan fosforic. Acest produs, aplicat prin pulverizare penetrează
ţesuturile, unde se eliberează etilena.
Toate părţile plantelor sunt capabile să sintetizeze etilena, însă cantitatea cea mai mare se
sintetizează în fructe, apoi într-o concentraţie mai mică în flori şi organe rănite.
2.1.1.5 Inhibitori ai creşterii
Multe substanţe au efecte inhibitoare asupra creşterii plantelor, printre substanţele endogene
enumerându-se compuşii fenolici şi acidul abscisic.
A. Inhibitorii fenolici
Inhibitorii fenolici, într-un număr mare în plante, inhibă metabolismul şi intervine în multe
procese fie ca antagonici ai regulatorilor de creştere, fie ca inhibitori ai reacţiilor metabolice. Ei
intervin în inducerea stării de latenţă a mugurilor şi seminţelor, la început prin încetinirea creşterii
acestora urmată de stoparea totală a acesteia. Nu se ştie exact rolul şi mecanismul lor în inducerea
stării de latenţă.
În culturile in vitro aceşti compuşi sunt deseori sintetizaţi şi eliberaţi în mediul de cultură, unde
se oxidează cauzând brunificarea mediului ceea ce duce deseori la moartea explantelor, de aceea în
unele medii de cultură se utilizează substanţe anti-oxidante sau adsorbanţi pentru a detoxifia mediul.
Există câteva exemple referitoare la folosirea substanţelor fenolice în cultura in vitro, cum ar fi
utilizarea florizinei pentru inducerea înrădăcinării la altoii de măr.
B. Acidul abscisic
179
Acidul abscisic (fig.6) a fost identificat în 1965 şi de atunci a fost descoperit în toate plantele.
Acest inhibitor pare să fie sintetizat de fiecare dată când o plantă este supusă unor condiţii stresante
(lipsa apei, rănire, căldură excesivă). Existenţa acidului abscisic în celule este una din cauzele cărora
plantele supuse unor factori stresanţi îşi încetinesc activitatea metabolică. Încetinirea activităţii
plantelor este reversibilă atunci când condiţiile de stres sunt trecătoare şi poate induce starea de latenţă
sau chiar decesul plantei atunci când condiţiile nefavorabile sunt prelungite.
Fig.6 Acidul abscisic
Proprietăţile acidului abscisic sunt similare celor ale compuşilor fenolici.
Astfel, cele mai importante proprietăţi ale acidului abscisic sunt:
-acţiune favorabilă asupra căderii frunzelor şi fructelor;
-determină creşterea permeabilităţii celulelor faţă de ionii de potasiu, ceea ce poate influenţa
închiderea stomatelor;
-acţionează asupra înfloririi. Aplicarea acidului abscisic la plantele de zi scurtă cultivate în
condiţii perfecte de periodism, poate inhiba complet înflorirea acestora (Volubilis) sau inhiba parţial
(Chenopodium rubrum), sau chiar stimula înflorirea (Plumbago). În cazul în care plantele de zi scurtă
sunt supuse unor condiţii de zi lungă poate induce înflorirea unora dintre specii şi inhibarea altora.
Aplicat asupra plantelor de zi lungă, acidul abscisic poate inhiba înflorirea atunci când plantele sunt
supuse unor condiţii normale de fotoperiodism (spanac, Lolium temulentum). Aceste observaţii pot
conduce la supoziţia că nopţile lungi favorizează sinteza acidului abscisic, dar această supoziţie este
prea simplă pentru explicarea modului diferit de acţiune a acidului abscisic.
Acidul abscisic este foarte puţin folosit în culturile in vitro, şi în funcţie de speciile folosite şi
de condiţiile de cultură utilizate poate induce reacţii foarte diferite şi greu de interpretat.
Concluzii
Regulatorii de creştere endogeni sunt prezenţi în plante pe tot parcursul vieţii acestora, dar
prezenţa acestora nu este constantă. Concentraţiile lor se schimbă în cursul diferitelor stagii
fiziologice şi sunt diferite pentru fiecare parte a plantei, pentru aceeaşi etapă fiziologică. Variaţia
continuă în plante a conţinutului în regulatori de creştere determină problemele legate de alegerea
momentului de recoltare a explantului.
Tehnicile de cultură in vitro pot fi controlate de echilibrul fitohormonal, dintre care cele mai
importante sunt auxinele şi citochininele.
Raportul citochinină–auxină influenţează procesele fiziologice din explante, determinând
evoluţia acestora în diferite sensuri în funcţie de concentraţia celor doi fitohormoni. Astfel, după
Skoog, comportamentul fiziologic al explantelor va fi:
-dacă raportul auxine – citochinine este mare, se induce rizogeneza;
-dacă raportul este subunitar se induce lăstărirea, explantele tind spre o funcţionare
caulogenică;
-dacă raportul este apropiat de unitate, explantele au tendinţa să genereze formaţiuni calusare.
Această schemă generală este întotdeauna valabilă, chiar dacă există variaţii în funcţie de tipul
de explant şi mai ales în funcţie de specia luată în cultură. Pe lângă aceşti fitoregulatori principali
există şi alţi regulatori de creştere ce s-ar putea dovedi indispensabili, dar în cele mai multe cazuri
aceştia au doar rol stimulator sau favorizant şi rareori esenţial.
180
2.2 ALEGEREA EXPLANTULUI
Celulele vegetale vii au capacitatea potenţială de a intra în diviziune şi de a reproduce un
individ întreg similar plantei donor. Această capacitate denumită „totipotenţa celulară”, indică faptul
că fiecare celulă deţine toate informaţiile necesare regenerării unei plante întregi, proprietate ce este
tot mai mult exploatată în culturile in vitro.
Chiar dacă toate celulele au totipotenţă nu este uşor, cel puţin pentru moment, să se folosească
în practică această calitate, însă cu cât cercetările avansează, cu atât numărul acestora va creşte.
Este mai uşor de ales un grup de celule, de exemplu un explant, capabil să reacţioneze în
condiţii artificiale de cultură unde să evolueze spre multiplicare clonală mai mult sau mai puţin
semnificativ în funcţie de răspunsul obţinut. Micropropagarea face posibilă obţinerea de plante
identice din punct de vedere genetic cu planta mamă, însă uneori este şi sursă de variabilitate genetică
atunci când explantul este supus anumitor condiţii.
Înainte de a decide criteriile de selecţie ale unui explant este necesară cunoaşterea evoluţiei
fiziologice ce va ajuta la înţelegerea diferenţelor dintre comportamentul celulelor unui segment de
plantă atunci când este detaşat de planta mamă.
2.2.1 Etapele fiziologice ale unei plante
În contextul reproducerii sexuate se poate preciza, într-o manieră simplistă, că ciclul de viaţă al
unei plante se împarte în patru stadii principale.
A. Embriogeneza
Embriogeneza începe cu fecundarea unei oosfere de către un anterozoid. Oul astfel format este
protejat de ovul unde începe să se dividă. Celulele se organizează la început într-o masă sferică (faza
globulară a embrionului), apoi se dezvoltă forme simetrice reprezentând cotiledoanele rudimentare
(faza cordiformă a embrionului dicotiledonat) după care se dezvoltă structurile cotiledonare,
hipocotilul, gemula şi radicula (stadiul de torpedou al embrionului). De la acest stadiu începe
diferenţierea celulară. Specializarea celulelor este încă foarte puţin datorată unei funcţionări
programate şi mai mult datorită unui program genetic ce se va păstra şi în celulele mature ce în
anumite condiţii se vor comporta similar unor celule gametice, dând naştere unor organe sau embrioni,
de această dată somatici.
În momentul de faţă, nu se cunoaşte pe deplin mecanismul diferenţierii celulare. Se presupune
că poziţionarea celulelor în relaţie cu celelalte celule, dar şi cu mediul de cultură, determină un schimb
de semnale biochimice, ce modulează funcţionarea fiecărei celule.
În contextul ipotezei mai sus menţionate, diferenţierea celulară intervine ca urmare a două
cauze: pe de o parte, datorită eredităţii genetice a celulei (fiecare celulă are acelaşi echipament
informaţional genetic), în care acţionează programul embriogenic, iar pe de altă parte, datorită
poziţionării specifice a celulei care va fi recunoscută de structurile membranare. Aceste structuri
filtrează informaţiile şi permit sau împiedică circulaţia unuia sau altui semnal capabil să modifice
programul informaţional spre un anumit tip de celulă.
Sfârşitul acestei prime etape este marcat, în general, după ce substanţele sunt depozitate în
albumen sau cotiledoane, de deshidratarea seminţei, ce induce intrarea embrionului în starea de
latenţă. Seminţele pot fi apoi diseminate, putându-se păstra şi rezista condiţiilor nefavorabile din
mediul înconjurător.
181
B. Stadiul vegetativ
Când condiţiile externe sunt favorabile şi starea de latenţă este întreruptă seminţele germinează
şi din embrion ia naştere o nouă plantă. De creşterea plantelor sunt responsabile două tipuri de
meristeme: meristemul caulinar ce determină creşterea părţii aeriene a plantei şi meristemul radicular,
ce determină creşterea părţii subterane a plantei.
Meristemul caulinar are o structură bine definită, fiind alcătuit dintr-o parte externă, epiderma
de două sau trei straturi numită tunica, şi o parte internă sau corpus. Într-o secţiune transversală se
poate observa o parte apicală unde celulele au o activitate mitotică redusă, înconjurată de un inel de
celule aflate în diviziune activă, celule responsabile de creşterea tulpinii. Diviziunea începe de la
inelul iniţial: zona epidermală diferenţiază în frunze rudimentare spre exterior, iar spre interior în
parenchim cortical şi vase conducătoare. Centrul este umplut de meristemul medular. Meristemul
caulinar are o funcţionare ritmică programată genetic cu o precizie aflată, în primul rând, în
aranjamentul filotaxic al frunzelor (distribuţie corespunzătoare unei simetrii particulare fiecărei specii)
şi, în al doilea rând, în forma frunzelor. Se remarcă aici că florile ce permit identificarea şi
clasificarea plantelor se bazează aproape exclusiv pe caracterele morfologice. Ipoteza prezentată mai
sus privitoare la diferenţierea celulelor în interiorul embrionului poate fi luată în considerare similar
celei privitoare la meristeme.
La început, plantula este hrănită din rezervele nutritive aflate în endospermul seminţei, primele
frunzuliţe, deseori conturate în interiorul embrionului, sunt diferite de frunzele adulte, fiind cunoscute
sub denumirea de frunze juvenile. Planta creşte şi devine capabilă să se hrănească singură, rădăcinile
transportă spre frunze sărurile minerale şi compuşii organici odată cu regulatorii de creştere. În
schimb, rădăcinile primesc de la frunze substanţe nutritive bogate în glucozide, vitamine şi de
asemenea în regulatori de creştere. Aceste schimburi stau la baza construirii scheletului unei plante,
stabilind corelaţii de creştere între sistemul aerian şi cel subteran al plantei.
Fig.7 Meristem apical
Corelaţiile, specie specifice, vor favoriza dezvoltarea unuia sau a altui mugure caulinar, ceea
ce va conduce la dezvoltarea formei specifice fiecărei plante (arbore, tufiş, tulpini întortochiate sau
împrăştiate, etc). Această arhitectură poate fi modificată prin curăţarea de uscături sau ramuri
nefolositoare, prin conducerea ramurilor sau prin aplicarea regulatorilor de creştere. În contrast
frunzele îşi menţin forma.
182
Fig.8 Meristem radicular
Această diferenţă indică faptul că principalele corelaţii implică, în general, informaţii despre
întâietatea mugurilor, care e controlată mai degrabă de fenomene de creştere relative decât de
moştenirea genetică.
Stadiul vegetativ durează, în funcţie de specie, de la câteva săptămâni la câteva luni pe an, un
an pentru plantele bienale sau mai mulţi ani pentru cele perene. În ultimul caz, sistemul vegetativ va fi
construit pe parcursul mai multor sezoane, perioadele de creştere alternând cu cele de repaus. Această
succesiune, care reflectă adaptarea plantei la climatul mediului înconjurător, este determinată de
stimulările sau inhibările reliefate ca răspuns la variaţiile condiţiilor de mediu (temperatură, lumină,
secetă, umiditate, etc). Plantele ce intră în perioada de latenţă îşi sistează creşterea, substanţele
glucizidice nefolosite sunt păstrate în rezerve, iar frunzele speciilor lemnoase cad, sau părţile aeriene
ale plantelor ierboase se usucă. Atunci când revin condiţiile favorabile (latenţa mugurilor este indusă
de obicei de temperaturile scăzute) reîncep creşterile, formarea frunzelor şi a părţilor aeriene.
C. Stadiul reproductiv
Stadiul reproductiv este marcat de modificările de ritm în funcţionarea meristemului caulinar.
Inelul iniţial încetează progresiv să mai funcţioneze şi se observă că celulele centrului latent intră în
diviziune activă iniţiind formarea florii sau a inflorescenţei. Diferenţierile încep la margini unde se
formează staminele şi părţile fertile ale plantei: staminele şi pistilul. Florile angiospermelor sunt
considerate lăstari modificaţi constituite dintr-un ax central şi anexele sale sterile (periantul) sau fertile
(staminele şi pistilul).
Aceste nou program este la fel de precis ca şi precedentul şi se presupune că mecanismele de
diferenţiere sunt similare. Instalarea stării generative este progresivă şi la început poate fi reversibilă,
în unele condiţii este posibil să se revină la starea vegetativă.
Modificările modului de acţiune pot fi controlate fie de plantă şi în aceste condiţii variaţiile
climatice nu au nici un efect, fie de variaţiile climatice (temperatură, lumină, umiditate), caz în care
planta percepe aceste variaţii şi drept răspuns emite stimuli ce vor direcţiona meristemul spre stadiul
reproductiv. La unele specii, existenţa un timp îndelungat a condiţiilor nefavorabile de mediu poate
duce la împiedicarea înfloririi. Floarea constituie ultimul stadiu în viaţa unui meristem, asigurând prin
fertilizare, continuitatea speciei. La unele specii perene ierboase unele meristeme terminale nu pot
induce formarea florilor. Această caracteristică permite plantei să supravieţuiască mai mulţi ani
(Saintpaulia, cerenţel-Geum urbanum, căpşun, etc). Dacă aceste meristeme sunt induse artificial să
înflorească, plantele înfloresc şi mor comportându-se asemeni unei plante anuale.
Cercetările asupra naturii stimulilor ce acţionează asupra meristemelor florale nu sunt
concludente, ştiindu-se doar că intervin unii fitohormoni dar şi alte substanţe. Se pot cita câteva
modele de culturi in vitro, în care, variind componentele mediului de cultură şi proporţia
fitoregulatorilor de creştere s-au putut obţine meristeme caulinare, radiculare sau chiar reproductive.
183
D. Stadiul de senescenţă
Stadiul de senescenţă urmează stadiului reproductiv la plantele anuale deoarece meristemele
sunt la sfârşitul vieţii lor, fructificarea epuizând rezervele, rădăcinile nu mai hrănesc planta în mod
normal, schimburile de substanţe nutritive se reduce şi plantele se pregătesc de iernare. La speciile
perene, această etapă începe prin încetinirea funcţiilor rădăcinilor odată cu debilitarea întregii plante,
ce devine mult mai sensibilă la toate tipurile de atac. Nu este imposibil ca regulatorii cu rol inhibitor
să intervină cel puţin la începutul acestui stagiu fiziologic (acidul abscisic şi etilena, alături de alţii).
Această scurtă prezentare a proceselor fiziologice ce au loc de-a lungul vieţii unei plante ne
permite înţelegerea importanţei interacţiunilor ce reglează morfogeneza plantelor. Astfel,
interacţiunile pe distanţă scurtă, predominant genetice, au loc la nivelul embrionilor şi al meristemelor
vegetative şi regenerative. Alt tip de interacţiuni sunt interacţiunile dintre organe ce permit plantelor
să recunoască mediul înconjurător şi variaţiile ce intervin la nivelul acestuia. Planta va putea să se
adapteze noilor condiţii datorită schimbului de semnale sub forma fitohormonilor sintetizaţi în
anumite locusuri, circulând în direcţia unui punct ţintă ce răspunde la acel stimul. În cursul deplasării
lor fitohormonii sunt controlaţi de sistemele enzimatice existente în plante. Aceste interacţiuni sunt de
aşa natură încât de-a lungul unui ciclu de viaţă al unei plante, echilibrul endogen dintre regulatorii de
creştere evoluează continuu şi reflectă la un moment dat, nu doar starea prezentă a mediului
înconjurător al celulei, ci şi ultimele evenimente petrecute cu acea celulă. Datorită acestui fapt, la
recoltarea unui explant trebuie să se ţină seama de valoarea acestui echilibru, ce depinde de stadiul
fiziologic şi de vârsta plantei donor, dar şi de organul de pe care se prelevă, precum şi de mărimea şi
natura fragmentului excizat.
2.2.2 Selecţia explantelor în funcţie de stadiul fiziologic şi vârsta plantei mamă
În funcţie de stadiul fiziologic şi vârsta plantei donor explantele pot reacţiona diferit la
condiţiile culturii in vitro. În general, plantele tinere sunt sursa cea mai potrivită de explante,
potenţialul de adaptabilitate al explantelor la condiţiile artificiale de viaţă diminuându-se cu vârsta
plantei mamă.
În cursul embriogenezei, embrionii pot fi excizaţi din ovul şi inoculaţi pe mediul de cultură
dacă se află în stadiul globular, putând reproduce un individ normal şi complet. Această tehnică
prezintă un interes scăzut atunci când se are în vedere micropropagarea (potenţialul genetic al
embrionilor este rareori cunoscut cu excepţia cazului strict de autogamie). Pe de altă parte, această
tehnică permite studierea cerinţelor speciale necesare unui embrion izolat. În unele cazuri, de
încrucişare interspecifică sau intergenerică, când embrionii pot fi avortaţi sau mor imediat în ovul,
această tehnică permite creşterea şi dezvoltarea normală a acestor embrioni.
Ţesuturile embrionare sunt uşor regenerative, dar la unele specii doar din cotiledoane s-au
obţinut rezultate notabile, ceea ce a permis specificarea cerinţelor nutritive pentru cultura ţesuturilor
speciilor studiate. Acesta poate fi primul mod de abordare a culturilor in vitro iniţiate din explante
bătrâne. În unele cazuri aceasta este singura cale cunoscută.
După germinarea în stadiul juvenil, ţesutul prelevat prezintă un răspuns favorabil in vitro şi
este sursa multor succese în domeniu. Odată cu înaintarea în vârstă a plantei donor, potenţialul de
cultură in vitro a explantelor prelevate de la acesta se diminuează. Acest fenomen este specific mai
ales plantelor perene, şi în mod deosebit la arbori. La aceste specii, calitatea tehnică a lemnului nu este
măsurabilă, cu excepţia arborilor adulţi. În acest stadiu, totuşi, pentru multe specii, iniţierea culturii
doar din butaşi nu mai este posibilă, deoarece în stadiul tânăr aceştia au o capacitate rizogenică
ridicată.
Există două tehnici ce permit obţinerea de puieţi la speciile pomicole şi arboricole:
-una ar fi utilizarea lăstarilor tineri de la baza speciilor pomicole şi arboricole. În acest caz
lăstarii par a avea caracteristici juvenile şi înrădăcinează mai repede (de exemplu la nuc şi eucalipt).
La aceste specii ţesuturile de origine ale noilor lăstari sunt genetic apropiate de stadiul juvenil,
probabil datorită faptului că se află în apropierea rădăcinilor;
184
-a doua tehnică este aplicată pentru multiplicarea speciilor pomicole şi arboricole tropicale şi a
coniferelor. Această tehnică permite rejuvenilizarea şi obţinerea de altoi. Un altoi prelevat dintr-un
arbore sau pom este altoit pe un portaltoi crescut din sămânţă. Altoiul creşte şi este apoi înlăturat fiind
ulterior altoit pe alt portaltoi. După mai multe altoiri altoiul începe să prezinte caracterele juvenile,
ceea ce-l face apoi apt pentru propagare prin butăşire.
La culturile in vitro, s-au observat fenomene similare la meristeme. Prima frunzuliţă ce se
formează are caractere juvenile (prima frunzuliţă a meristemului la viţă de vie are caracteristici
similare celei dezvoltate din sămânţă, de asemenea, şi la orhidee meristemele dezvoltă, în cultura in
vitro, protocorm identic cu cel obţinut din sămânţă). Rejuvenilizarea observată este deseori obţinută
din prima subcultură, însă uneori sunt necesare mai multe subculturi pentru a obţine aceste efect, în
funcţie de specie.
Întoarcerea la stadiul juvenil poate fi datorată supresiei de informaţii citoplasmatice sau
datorită diminuării considerabile a acestora determinând astfel posibilitatea regenerării de noi celule.
Mecanismele exacte ce determină aceste fenomen nu sunt încă pe deplin cunoscute. Se pare că
citochininele sunt implicate, cel puţin parţial, în acest proces, dar ele nu acţionează singure.
Cultivarea organelor reproductive in vitro, se poate realiza cu succes atunci când plantele
donor sunt în stadiul reproductiv. Se pare că schimbările ce apar în ritmul de funcţionare al
meristemelor este favorabil şi determină în ţesuturi un echilibru optim culturii in vitro.
Se pot obţine culturi din ţesuturi prelevate de la plante aflate în stadiul de senescenţă, dar
rezultatele sunt în general slabe sau incomplete.
2.2.3 Selecţia explantelor în funcţie de vârsta explantului
Problemele legate de vârsta explantului apar la speciile perene în care se poate distinge un
stadiu activ şi unul lent, latent, între care reacţiile fiziologice sunt diferite. Astfel, primele
experimente, ce vizau cultivarea de meristeme la plantele lemnoase, au eşuat atunci când s-a încercat
iniţierea unei culturi de ţesuturi din meristeme prelevate de pe ramuri în vegetaţie, dar au avut succes
atunci când s-a pornit de la meristeme prelevate din muguri dorminzi.
De-a lungul unui ciclu anual, echilibrul intern al plantelor se schimbă. Primăvara organele
cresc şi analizele relevă prezenţa regulatorilor de creştere de tipul auxinelor, giberelinelor şi
citochininelor. Vara transportul fitohormonilor prin vasele conducătoare se diminuează, iar toamna se
sintetizează inhibitorii creşterii. De aceea, nu e surprinzător faptul că explantele, prelevate de la
aceeaşi plantă în perioade variate ale vegetaţiei, vor da răspunsuri diferite chiar dacă vor fi plasate pe
acelaşi tip de mediu.
De aceste considerente trebuie să se ţină seama atunci când se are în vedere micropropagarea
speciilor lemnoase. Unele explante au tendinţa de a înrădăcina uşor atunci când sunt prelevate în
anumite faze de vegetaţie, în special dacă sunt excizate în perioada de vegetaţie, când concentraţia de
auxină este maximă.
La speciile cunoscute deja ca „recalcitrante” la cultura in vitro, pentru realizarea rejuvenilizării
se poate supune planta mamă, pentru o perioadă scurtă, unui tratament cu temperaturi scăzute, unui
regim de lumină particular sau unui tratament cu fitohormoni pentru modificarea echilibrului lor
intern în vederea stimulării rizogenezei.
2.2.4 Selecţia explantelor în funcţie de amplasarea plantei donor
După determinarea stadiului şi perioadei optime explantele pot fi prelevate. După tipul de
organizare a fragmentului ce urmează a fi cultivat in vitro se pot lua în considerare două cazuri:
1.Explantele ce au o structură rudimentară sau organizată, cum e cazul mugurilor, apexurilor
caulinare, meristemelor şi apexurilor florale, sunt cele mai utilizate pentru iniţierea unei culturi de
ţesuturi, deoarece acestea sunt receptive şi ridică cele mai puţine probleme, generând cu uşurinţă, în
185
condiţiile unui mediu de cultură adecvat, structuri organizate (de exemplu, organe). Dacă mediul de
cultură nu este potrivit poate tulbura funcţiile explantului şi conduce la dediferenţierea celulelor,
generând calus.
Utilizarea acestui tip de explante este similară unei microbutăşiri şi este tehnica cel mai des
folosită atunci când se urmăreşte micropropagarea pe scară largă a unei specii.
Interesant de amintit este faptul că explantele posedă un fel de memorie a tipului de creştere ce
l-au prezentat in vivo, acest fenomen fiind în special întâlnit la speciile lemnoase. La mai multe plante
la care corelaţiile de creştere sunt puternice, explantele provenite din ramuri laterale au generat plante
cu rădăcini, dar de tipul lianelor, sub forma unor plante culcate la pământ şi nu erecte. Unele cercetări
au evidenţiat faptul că această „memorie” aparţine celui mai apropiat internod de lângă meristem.
2.Explantele constituite din diferite tipuri de ţesuturi, cum ar fi fragmente de tulpină, frunze,
flori şi fructe, cărora, inoculate pe mediu de cultură, li se induce o reversie completă cu scopul de a
restaura capacitatea celulelor de a se divide şi de a-şi câştiga din nou capacitatea organogenică.
Pentru aceste explante, în funcţie de specie, s-a dovedit că toate părţile plantei sunt capabile să
urmeze procesul dediferenţierii conducând spre o nouă organizare structurală. Dar, în acest caz,
diferenţele între specii sunt uriaşe. Unele specii, cum ar fi violetele de Parma, sunt capabile să
regenereze din toate părţile plantei (peţiol, limb, rădăcini, petale, stamine, polen, ovule), alte specii
sunt mai recalcitrante, cum ar fi Actinidia sinensis, la care rezultate notabile au fost obţinute doar din
fragmente de tulpină. Unele specii sunt total recalcitrante, nereuşindu-se iniţierea culturii de ţesuturi
din explantele amintite, iar la unele conifere s-a reuşit obţinerea de propaguli doar din cotiledoane.
În general, cele mai bune rezultate au fost obţinute, la cele mai multe specii, din fragmente de
limb foliar şi tulpini tinere.
2.2.5 Selecţia explantelor în funcţie de mărimea şi natura acestora
Mărimea explantului ce urmează a fi cultivat prezintă cea mai mare importanţă. Cu cât
explantul este mai mare cu atât echilibrul endogenic al acestuia este mai determinant şi mediul de
cultură va avea o influenţă limitată. În cazul explantelor de dimensiuni mici direcţionarea acestuia în
sensul dorit se face mai uşor, deoarece explantul este receptiv la substanţele din mediul de cultură, şi
anume la regulatorii de creştere existenţi.
Explantele organizate cuprind în general un nod, un apex sau un mugure (solzii protectori sunt
înlăturaţi), fiind o unitate suficient de completă pentru care mediul va favoriza creşterea, sau în cazul
diferenţierii axilare, va bloca creşterea apicală. Pentru meristemele ce trebuie să aibă dimensiuni
foarte mici, există o mărime minimă ce conţine domul meristematic cu două primordii foliare. Sub
această mărime supravieţuirea explantului este foarte dificilă şi pierderile sunt mari, peste această
dimensiune, răspunsul la cultura in vitro este mult mai bun , însă în detrimentul eliminării virusurilor.
Dimensiunile explantelor variază între 5 şi 10 mm, ceea ce corespunde unei manipulări uşoare
a materialului vegetal, sub aspectul excizării sau prelevării, fasonării şi inoculării acestora. De
exemplu, prin cultivarea pe acelaşi mediu de cultură, a mai multe fragmente de peţiol de Saintpaulia,
de 1,5; 3; 5 şi 7 mm, s-a observat că doar fragmentele de peste 3 mm au generat plantule normale.
Fragmentele de 1,5 mm au generat două tipuri de rezultate: unele explante s-au veştejit, iar altele au
format doar rădăcini. Fără îndoială, în ultimul caz, auxinele prezente în mediu au jucat cel mai
important rol, pe când în cazul fragmentelor de dimensiuni mai mari au intrat în joc şi fitohormonii
endogeni.
Se pot fasona explante din diferite tipuri de ţesuturi: epidermal, cortical, parenchim medular,
dar şi răspunsurile vor varia. Cel mai regenerativ tip de ţesut este cel epidermal. Ţesuturile corticale şi
cambiale prezintă de asemenea rezultate bune, dar rămân deseori în stadiul de calus. Parenchimul
medular este ţesutul cel mai puţin regenerant, aceste ţesuturi cer o armonizare perfectă între regulatorii
de creştere, un exemplu fiind dat de Skoog, care a folosit măduvă de tutun pentru a determina rolul
echilibrului dintre auxine şi citochinine.
Din ţesuturi epidermale de câteva straturi grosime a fost posibilă orientarea regenerării spre
stadiul caulogenic (lăstari), rizogenic (rădăcini), calusogenic sau reproductiv. Acest experiment
confirmă ipoteza unei activităţi crescute a fitohormonilor asupra explantelor de dimensiuni reduse.
186
Cel mai mic explant este constituit dintr-o singură celulă, cum e cazul protoplaştilor izolaţi
mecanic sau enzimatic. Protoplaştii sunt capabili de a se divide şi a reproduce plante, dar nun sunt
capabili de inducerea meristemelor florale.
2.3 RĂSPUNSUL EXPLANTELOR ÎN CULTURĂ
Prima problemă ce trebuie rezolvată, atunci când se iniţiază o cultură in vitro este menţinerea
viabilităţii (pe lângă problema asepsiei) explantului. Deseori se poate observa, după fasonarea
explantului, o brunificare a celulelor,mai ales a celor ce vin în contact direct cu mediul de cultură,
fenomen datorat oxidării substanţelor fenolice sintetizate în mediu, oxidare ce are efect toxic asupra
celulelor vegetale. Mai mult, celulele moarte pot diminua sau anula schimburile dintre explant şi
mediul de cultură. Nu toate speciile prezintă fenomenul de brunificare a explantelor, deoarece la
aceste specii problema este parţial rezolvată prin imersia explantelor într-o soluţie antioxidantă
(soluţie de acid ascorbic cu acid citric în proporţie de 0,5 % respectiv 0,05%), imediat după fasonarea
acestuia sau prin adiţia în mediul de cultură a unor substanţe adsorbante sau detoxificante, cum ar fi
cărbunele activ (1 până la 4 g/l) sau polivinilpirolidonă (5 până la 10g/l).
Odată rezolvată această problemă este necesară orientarea explantului, în funcţie de natura sa,
în direcţia dorită de operator.
2.3.1 Explante cu structură rudimentară
Explantele din această categorie pot fi cultivate prin două metode.
Prima metodă constă în inducerea creşterii apicale prin adiţia în mediul de cultură a
fitohormonilor din clasa auxinelor şi/sau a giberelinelor, foarte rar se pot adăuga şi citochinine,
întotdeauna într-o doză foarte mică.
După iniţierea pe acest tip de mediu se observă apariţia unor formaţiuni calusare la baza
explantelor. Este de dorit ca aceste explante să rămână de dimensiuni mici, deoarece dacă acest calus
creşte în dimensiune, ceea ce deseori se întâmplă, indică existenţa unui dezechilibru între substanţele
minerale sau fitohormonii din mediul de cultură. După formarea calusului, ce are rol protector
(asemeni calusului format la o rană) se formează prima frunzuliţă, apoi prima rozetă de frunze şi mai
târziu are loc elongarea tulpinii (axului principal). Aceste etape morfogenice pot avea loc pe acelaşi
tip de mediu la unele specii ornamentale (crizanteme, garoafe) sau pe două medii succesive, la speciile
lemnoase. Primul mediu va iniţia creşterea, putând fi utilizat ulterior şi pentru propagarea
fragmentelor cu un nod (microbutăşire). Al doilea mediu, îmbogăţit cu auxine (cel mai frecvent,
acidul indolil acetic), serveşte ca mediu de înrădăcinare (Actinidia, măr, numeroase specii lemnoase).
A doua metodă constă în blocarea creşterii apexului caulinar favorizând regenerarea şi
dezvoltarea lăstarilor laterali (axilari), caz în care mediul de cultură este adiţionat cu citochinină (de la
1 la 10mg/l). Lăstarii regeneraţi pot fi izolaţi şi crescuţi pe mediu pentru creştere, fără hormoni sau cu
acid giberelic în concentraţie mică. În unele cazuri este nevoie de al treilea mediu de cultură pentru
înrădăcinarea lăstarilor, mediu adiţionat în general cu auxine.
Utilizarea acestui tip de explante este importantă deoarece asigură posibilitatea efectuării unui
număr foarte mare de subculturi şi, din punct de vedere genetic, un minim de variabilitate.
2.3.2 Explante constituite din diferite tipuri de ţesut
Aceste explante sunt compuse din diferite celule asociate în ţesuturi fără o organizare
structurală, putând proveni din orice parte a sistemului vegetativ (tulpină, frunze, rădăcini) sau