-
Procese biotehnologice propriu-zise - ETAPE1. Selecia i
ameliorarea factorului biologic: 1-substane chimice; 2-esut animal;
3-cromozom animal; 4-gen tiat dintr-un cromozom; 5-microorganism,
ca de exemplu E.coli; 6-plasmid; 7-plasmid secionat; 8-plasmid
recombinant; 9-introducere n microorganism; 10-multiplicarea
plasmidei i expresia genei; 11-diviziune celular; 12 - cultivare n
laborator (inocul); 13 - bioreactor de laborator, 14 - bioreactor
pilot; 15 - operare la scar industrial; 16 - recuperarea
produsului; 17 - condiionare i vnzare.
-
Etapele unui proces biotehnologicLaboratorPentru situaiile cnd
microorganismul nu trebuie modificat genetic, ci doar preluat din
natur, se izoleaz tulpinile de microorganisme de pe fructe,
cereale, deeuri alimentare, sol (selecie sub microscop)Selecia: se
aleg acei indivizi de microorganisme capabili s sintetizeze
compusul dorit (aici intervine competena microbiologului, rigoarea
sa, migala i experiena n alegerea cea mai bun)Se cultiv pe plci
Petri pe medii solidificate de agar-agar; aceste medii sunt foarte
prielnice nmulirii microorganismelor, avnd loc o multiplicare
eficient a unor microorganisme foarte similare ca performane cu
cele selectateSe obine SUA, adic acea colecie de microorganisme
care vor fi supuse multiplicrii la scal mai mare pentru a produce
metabolitul urmrit n bioreactor
-
Selecie i ameliorarea genetic LaboratorEtapa ine de competena
microbiologului sau a inginerului geneticianSe preleveaz o gen
dintr-un cromozom animal, din esut viu, care se implanteaz ntr-un
microorganism rezistent i cunoscut ca evoluie n procese de cretere
i diviziune celularSe confirm reuita diviziunii celulare, pe un
mediu de cultur adecvat nevoilor microorganismului purttor al genei
prelevate din esutul animalAmeliorarea genetic a suelor se face
prin tratamente mutageneMutanii sunt microorganisme care apar n
cursul ameliorrii ca rezultat al tratrii cu diferii factori fizici
sau chimici i difer de microorganismele din care provinAgeni
fizici: radiaii UV, raze X, radiaii ionizate, radiaii Ageni
chimici: alchilani, nonalchilani, baze analoge, ageni de
intercalareNumrul de cicluri de mutaie-selecie poate atinge cteva
zeci
-
Sua trebuie s fie nalt productiv:s aib o rat de cretere a
microorganismelor nalts fie rezistent la aciunea precursorilors fie
rezistent la aciunea produsului sintetizat i la enzimele de
degradares fie rezistent la factorii externi (lumin, pH, oxigen,
temperatur) n cursul pstrrii pn la evoluia n bioreactor (de la
cteva ore la cteva sptmni)
-
Etapele unui proces biotehnologicLaborator
-
Etapa de laboratorCultura de inocul (etapa 12 de pe schema
general)Inoculul reprezint materialul de nsmnare propriu-zis al
mediului de biosintezEste o cultur microbian n curs de multiplicare
pe un substrat nutritiv corespunztor, n condiii specifice de
dezvoltare (pH, temperatur, agitare, aerare). Transvazarea culturii
de inocul se realizeaz n condiii aseptice (sub flacr), dup o
perioad de dezvoltare bine stabilit de microbiolog (vrst,
cantitate, aspect microscopic)
-
Operarea n staia-pilotEste o etap intermediar ntre faza de
laborator i aplicarea la scal industrialEste necesar pentru a
confirma rezultatele obinute la nivel de laborator i optimiza
biotehnologia Inoculul se transvazeaz pe un mediu de cultur
sterilizat i rcit la temperatura de cultivareDac raportul de
inoculare (cantitate de inocul/cantitate de mediu de cultur) este
mic, este necesar introducerea unei etape intermediare de
cultivare, numit cultur intermediarRaportul volumic ntre
inoculator/intermediar/regim este de 1/10/100
-
Operare la scar industrialSe aplic doar dup ce etapa de operare
n staia pilot a confirmat c microorganismul conduce ntr-adevr la
performana estimat la testele de laboratorPresupune cheltuieli mari
cu instalarea bioreactorului de mari dimensiuni i cu prepararea
mediului de cultur sterilizat i cu compoziia corectEtapa de
biosintez este urmat de procedee fizice de recuperare a produsului,
urmate de condiionare, ambalare, depozitare, vnzare
-
Cinetica proceselor de biosintezFermentaie: procesul de cretere
a microorganismelor pe medii de cultur* Creterea este rezultatul
interaciunii celulelor individuale cu mediul de cultur La bacterii,
creterea are loc prin depunerea uni- sau tridimensional de substan
nou, mrirea volumului celular, urmat de diviziunea
celularActivitatea microorganismelor este condiionat de existena
unui anumit raport ntre volumul celulei i suprafaa ei (n cursul
creterii, volumul crete mai rapid dect suprafaa) La bacterii,
viteza de multiplicare a numrului de indivizi este extrem de mare
(n 20-30 minute, populaia se dubleaz)
-
BACTERII - Curba de cretereStell: a-b inoculare; b-c cretere
logaritmic; c-d cretere ncetinit; d-e - descretereMonod: 1 cretere
staionar (lag); 2 - cretere accelerat; 3 cretere exponenial; 4
retardare; 5 faza staionar; 6 distrucie accelerat; 7 distrucie
logaritmic
-
Curba de cretereFaza de lagCuprins ntre momentul introducerii
inoculului i debutul multiplicriiEste o faz de adaptare la
condiiile de cultivareNumrul de bacterii rmne constant sau scade
uorBacteriile viabile i acumuleaz n celule metaboliii eseniali i
sistemele enzimatice necesare creteriiDurata este n general de
cteva ore; este cu att mai scurt cu ct condiiile de via (mediu
nutritiv, aeraie, pH, temperatur) sunt mai apropiate de cele
anterioare
-
Curba de cretereFaza de cretere logaritmic (multiplicare
exponenial)- ritmul de cretere se accelereaz- diviziunile celulelor
se sincronizeaz; la intervale de timp regulate, numrul de celule
viabile se dubleaz brusc- etapa dureaz 2-3 ore- celulele rezultate
au dimensiuni mai mari dect cele tipice speciei lor, nu conin
materiale de rezerv, au coninut ridicat de ARN (sunt celule
specializate pe producie, datorit modului n care au fost selectate,
modificate, crescute, multiplicate n etapele precedente)
-
Curba de cretereFaza staionar maximal- numrul de celule viabile
este maxim i rmne constant - faza dureaz de la cteva ore la cteva
zile; n aceast etap are loc biosinteza substanelor urmrite ca
produi de biosintez- are loc atunci cnd din mediu se epuizeaz
substanele nutritive sau se acumuleaz produi toxici- celulele sunt
mature i au dimensiuni normale
-
Curba de cretereFaza de declin- scderea progresiv a numrului de
celule viabile, din cauza morii acestora- celulele sunt btrne i cu
semne de involuie (sunt deformate, mai mari sau mai mici dect
normal, se coloreaz slab), la speciile sporogene apar foarte muli
spori- uneori apare fenomenul de autoliz
-
Curba de cretere la fungi n cazul acestor microorganisme se
dezvolt micelii ramificate cu lungimi de pn la 10-15 mFaza de lag:
are loc germinarea sporilor (dac se inoculeaz suspensie de spori)
sau se regenereaz hifele rupte i lezate (cnd se inoculeaz inocul
vegetativ). Faza de lag se poate prelungi mult dac s-a adugat o
cantitate prea mic de inocul. Unele bacterii au nevoie de ioni ai
metalelor grele n aceast faz (Bacillus Subtilis are nevoie de Mn
pentru iniierea dezvoltrii)Faza de cretere liniar: pe suprafaa
mediului apare o colonie circular, care crete liniar n timp, sub
forma unor reele fine de hife Faza de nvechire viteza de cretere
este ncetinit, ca urmare a efectului duntor al produilor de
metabolism.
-
Parametri care evideniaz cretereaDeterminarea masei celulare -
izolarea celulelor i cntrirea lor Determinarea numrului de
microorganisme sau a concentraiei celulare prin metode
instrumentale Metoda turbidimetric multiplicarea microorganismelor
determin tulburarea mediului de cultur direct proporional cu
populaia lor Analiza prin IR a concentraiei de CO2 care prsete
cultura Numrarea celulelor sub microscop Determinarea concentraiei
sursei de carbon din mediu
-
Efectul pH-ului asupra creterii microorganismelorn general,
exist un domeniu de pH n care viteza specific de cretere atinge
valoarea maxim (drojdii: 4-5, excepional 2-8)pH-ul influeneaz
randamentul transformrii substratului la un anumit produs; n
general, domeniul de pH n care are loc bioprocesul este foarte
ngust. n caz de schimbare n cursul reaciei biologice a pH-ului, n
mediul de cultur trebuie adugai corectori de pH (NaOH, KOH sau NH3
pentru cretere, HCl, HNO3, H2SO4 pentru scdere)
-
Efectul temperaturii asupra creterii
microorganismelorTemperatura este un factor care influeneaz
cerinele nutritive ale microoganismelor i viteza de cretere
microbianAre de asemenea influen asupra randamentului de
transformare a substratului n produsul
doritCRIOFILEMEZOFILETERMOFILE
-
Sunt incinte n care se desfoar reacii intermediate de factori
biologiciConstrucia bioreactoarelor este puternic dependent de
necesitile de detaliu ale agentului biologic, dar i de proprietile
fizice n special ale mediului de culturDintre proprietile mediului
de cultur se pot enumera: densitatea, viscozitatea, tixotropia
(creterea coeficientului viscozitii n condiii de micare intens),
tensiunea superficial, cldura specific, valoarea coeficientului de
transfer de cldur prin mecanism de convecie etc.BIOREACTOARE
-
BIOREACTOARECaracteristici ale sistemelor biochimiceDimensiunea,
morfologia i evoluia biomasei influeneaz eficiena amestecrii i
vitezele de transfer de mas i cldurDensitatea agentului biologic:
este redus n cazul imobilizrii enzimelor pe suporturi inerte sau a
folosirii asociaiilor microbieneCelulele i enzimele sunt foarte
sensibile la factorii de mediu (temperatur,
concentraie)Microorganismele sunt sensibile la forele de frecare
create prin amestecarea mecanic (se pot distruge n urma deformrilor
majore)Procesele decurg n condiii asepticeInfluena fenomenelor de
inhibiie de substrat sau de produs
-
BIOREACTOARE - ClasificareDup natura proceselor
biochimice:Biologice (fermentatoare): transformrile substraturilor
se realizeaz n prezena microorganismelor, care parcurg etapele
specifice dezvoltrii lorBiochimice: n care au loc reacii catalizate
de enzime sau celuleDup modul de curgere:Cu amestecare perfectCu
deplasare total
-
IndicatorBioreactoare discontinueBioreactoare continueCosturi
investiii reduse ridicate, datorit costurilor cu
automatizareaCosturi manoper mari, datorit numrului mare de
personal (pot fi reduse prin automatizare) reduse, ca efect al
automatizrii avansateFlexibilitate ridicat redus, datorit
domeniului restrns de variaie a parametrilorVolum bioreactor
relativ mare relativ micPericol de infectare a culturii redus,
datorit currii i sterilizrii dup fiecare arj ridicat, deoarece
bioreactoarele funcioneaz continuu mai multe luniCalitatea materiei
prime utilizate poate fi diferit de la o arj la alta trebuie s fie
aceeaiConversiasubstratului ridicat poate fi redusUzura
instrumentelor de msur i control ridicat, datorit sterilizrilor
repetate redus, sterilizarea realizndu-se doar la pornireApariia
inhibitorilor sau a condiiilor nefavorabile de mediu relativ des,
datorit gradului redus de automatizare relativ rar, datorit
automatizrii avansate
-
Dup necesarul de oxigen:AerobeAnaerobeDup modul de
amestecareMecanic: agitatoare cu diferite configuraiiAmestecare
pneumatic - prin barbotarea unui gazAmestecare hidraulic - bazate
pe circulaia lichidului de cultur de ctre o pompAmestecare mixt
combinaii ale metodelor de mai susBIOREACTOARE
-
Bioreactoare cu agitare mecanica, b bioreactoare cu agitatoare
tip elice i difuzor; c bioreactor tronconicabc