Cuerpo de Tesis · de salmón y la distribución de los productos exportados con un un 48% de Salmón coho congelado, 45% de trucha (91% congelado) y 7% de Salmón atlántico (96%

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1. INTRODUCCIÓN El cultivo de salmónidos se ha transformado en un símbolo de prosperidad

comercial para la economía nacional. Pese a que el salmón no es una especie natural

de las costas chilenas, las extraordinarias condiciones climáticas y ambientales de la

zona austral, han permitido una exitosa inserción de esta especie (Furci y cols., 2006).

La acuicultura fue denominada como la “revolución azul” y catalogada como la

gran solución para disminuir la presión sobre los recursos pesqueros intensamente

explotados, debido a la mayor demanda por proteínas de origen marino. Algunos

investigadores han señalado que la acuicultura no sólo puede contribuir

significativamente a las demandas de alimentación mundial, sino que puede además

ayudar directamente a la conservación de los recursos acuáticos y su diversidad

genética (Neira y Díaz, 2005).

El objetivo de la acuicultura de salmónidos en este momento se enfoca en

obtener productos de calidad a un precio competitivo, para lo cual se deben elaborar

alimentos apropiados y altamente estandarizados a partir de ingredientes estables y de

buena calidad (Ackman, 1998).

1.1. Dieta del salmón El factor de mayor impacto en la composición química del músculo de salmón

es la composición de su alimento. El acuicultor esta interesado en hacer crecer el pez

lo más rápido posible empleando la menor cantidad de alimento, dado que el alimento

constituye el mayor componente del costo en acuicultura. El potencial de crecimiento

es mayor cuando el pez es alimentado con una dieta rica en lípidos, para propósitos

energéticos, y alto contenido de proteínas con una composición balanceada de

aminoácidos (FAO, 1999).

El alimento estándar en el comienzo del cultivo de salmón en Canadá, contenía

harina de pescado secada al vapor, usualmente elaborada a partir de arenque (Lall,

1987). Hoy la alimentación del salmón en cultivo es un proceso altamente tecnificado y

científicamente elaborado, siendo los componentes más importantes de la dieta

artificial la harina y aceite de pescado (Valenzuela, 2005).

Las harinas de pescado producidas alrededor de todo el mundo contienen los

mismos tipos de lípidos, mayoritariamente poliinsaturados, si en ésta no se usa un

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antioxidante (ejemplo: etoxiquina) se oxidarán algunos de los ácidos grasos. Si la

harina de pescado es estabilizada con antioxidante hay pocos cambios posteriores en

los ácidos grasos, si no es estabilizada, entonces los ácidos grasos saturados y los

ácidos grasos monoinsaturados permanecen igual, pero generalmente hay una pérdida

considerable, a través de la oxidación, de los ácidos grasos de cadena larga altamente

insaturados omega - 3, considerados como esenciales para la nutrición de los

salmónidos (Ackman, 1998). El aceite de pescado, por su parte, además de constituir

un aporte energético importante, le permite incorporar los ácidos grasos

poliinsaturados de cadena larga omega – 3 fundamentales para su crecimiento y

desarrollo (Valenzuela, 2005). Se debe estabilizar el aceite con antioxidantes sintéticos

utilizando BHA y BHT (FAO, 1999).

Otro factor a considerar es el color rojo anaranjado intenso del salmón, el cual

se obtiene al agregar carotenoides artificiales como astaxantina y cantaxantina, los

cuales además de ser pigmentantes, que otorgan al músculo de salmón un color

rosado atractivo para el consumidor, son antioxidantes, que mejoran la calidad y

estabilidad del músculo una vez procesado (Valenzuela, 2005).

1.1.1. Antioxidantes en dieta para salmón La inclusión de antioxidantes en la dieta animal es un método efectivo para

incrementar la estabilidad oxidativa del músculo, especialmente en aquellos productos

en los que la adición del antioxidante en el producto final puede resultar dificultosa

(Carreras, 2004).

Los antioxidantes son moléculas orgánicas de origen sintético o natural,

capaces de evitar o retardar el desarrollo del deterioro oxidativo. Se les considera

aditivos alimentarios por ser aportados a los alimentos intencionalmente, sin el

propósito de cambiar su valor nutritivo, sino con la finalidad de favorecer su

conservación y mejorar su adaptación al uso al que se destinan (Fernández San Juan,

2002).

Se ha despertado un especial interés en el uso de fuentes alternativas de

compuestos naturales con propiedades antioxidantes, debido a estudios sugiriendo

efectos mutagénicos y carcinogénicos de algunos antioxidantes sintéticos, junto con el

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aumento de la preocupación de los consumidores por la seguridad alimentaria

(Carreras, 2004).

Mercados como el japonés, principal destino a nivel nacional, en los embarques

de salmón y la distribución de los productos exportados con un un 48% de Salmón

coho congelado, 45% de trucha (91% congelado) y 7% de Salmón atlántico (96%

congelado) (Revista Aqua, 2007), exige limites máximos para antioxidantes sintéticos

como el BHT (Servicio Nacional de Pesca, 2007). Esto indica la necesidad del uso de

antioxidantes naturales en el salmón.

1.1.1.1. Antioxidantes sintéticos Los antioxidantes sintéticos fueron desarrollados a partir de la necesidad de

obtener una protección más efectiva y, al mismo tiempo, más económica en relación a

los antioxidantes naturales (Vieira, 2000). En general, los antioxidantes sintéticos se

caracterizan por su elevada actividad química, alta eficacia a dosis bajas, costo

reducido y alta estabilidad (Costa - Batllori, 2003).

1.1.1.1.1. Butil hidroxitolueno (BHT) El BHT (Figura 1) tiene apariencia de un polvo blanco cristalino y posee

excelente solubilidad en varios aceites y grasas, por lo cual es utilizado en aceite de

pescado. Pero no es muy eficiente, si se compara a otros antioxidantes, para que su

efecto se refuerce, generalmente debe utilizarse en conjunto con otro antioxidante

(Vieira, 2000).

La acción antioxidante del BHT es similar a la de la vitamina E, dona

eficientemente un átomo de hidrógeno a un radical peroxi o alcohoxi, interfiriendo con

la propagación de la peroxidación lipídica (López, 1996).

1.1.1.1.2. Etoxiquina La etoxiquina es un antioxidante utilizado en la industria alimentaria, en especial

en la fabricación de harina de pescado (Castañeda y cols., 1999), estabiliza las grasas

y protege el valor nutricional del alimento, incluidas las vitaminas liposolubles A, D, E y

K (Revista Aqua, 2006).

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Figura 1: Estructura química del BHT.

Fuente: Rubber Dispersión Chemical, 1998.

1.1.1.2. Antioxidantes naturales

Los extractos naturales se han utilizado mayoritariamente con fines

terapéuticos. Estos extractos están constituidos por compuestos de diferente

naturaleza química; polifenoles, isoprenoides, compuestos tiólicos, ácido ascórbico y

polisacáridos que en conjunto contribuyen, bajo diferentes mecanismos, a ejercer la

capacidad antioxidante característica de un preparado natural. La presencia y

proporción de ellos en los preparados naturales, dependerá principalmente de la planta

utilizada como materia prima y del solvente utilizado en la extracción. Estos

compuestos, además de su rol preservante del alimento, pueden actuar como

antioxidantes biológicos en el consumidor, a través de diferentes mecanismos

(Gormaz, 2005).

1.1.1.2.1. Romero (Rosmarinus officinalis)

El extracto de romero contiene cuatro compuestos con acción antioxidante:

carnosol, rosmanol, isorosmanol y rosmaridifenol (Carreras, 2004), entre los que

destaca el carnosol, que sería responsable de la actividad antioxidante del romero en

materias grasas (Bruneton, 2001).

1.1.1.2.2. Tocoferoles

Entre los antioxidantes naturales, los más utilizados son los tocoferoles,

popularmente conocidos como vitamina E, éste término hace referencia a una familia

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de compuestos relacionados estructuralmente y que incluye todos los derivados tocol y

tocotrienol que manifiestan actividad biológica del α - tocoferol (Carreras, 2004).

Los tocoferoles generalmente se extraen del destilado del aceite de soya, un

subproducto del proceso de fabricación del aceite de soya comestible. Poseen buena

eficiencia en grasas animales y son una alternativa en países cuya legislación no

permite el uso de los antioxidantes sintéticos (Vieira, 2000).

1.2. Salmón coho o del pacífico (Oncorhynchus kisutch)

Esta especie es originaria de las costas del Océano Pacífico y fue introducida

en Chile a principios del siglo XX (Figura 2). La introducción exitosa del Salmón coho,

en el sur de Chile fue posible a partir de 1976 (Campos, 1981). La producción mundial

se ha más que duplicado entre 1986 y 1996 y Chile se encuentra entre los principales

productores de salmón en el mundo (Naylor y cols., 1998). Los principales mercados

de destino de esta especie son Japón y Estados Unidos (Salgado, 2005).

Tiene en promedio 45 centimetros de longitud, llegando en el momento de su

cosecha a un peso de 3 kilos, su color es pardo, verde o azul en el dorso, los costados

son plateados y el vientre plateado blanquecino (Salgado, 2005).

La temporada de cosecha del Salmón coho es muy corta, habitualmente va de

dos a tres meses, abarcando los meses de Noviembre y Diciembre. Esta especie se

distingue del Atlántico en que son semélparos, es decir, mueren después de

reproducirse (Salgado, 2005).

Figura 2: Salmón coho o del pacifico (Oncorhynchus kisutch)

Fuente: Cazadero Performing Arts Camps, 2007.

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El contenido de proteína del Salmón coho criado en piscina es de 21.27%, valor

muy similar al del Salmón coho que vive en un ambiente natural el cual es de 21.62 %.

Su contenido total de lípidos es de 7,67 % presentando una cantidad de ácidos grasos

poliinsaturados (PUFA) de 1,86 % y un 3,33% de ácidos grasos monoinsaturados

(MUFA) (Agricultural Research Service, 2007).

1.3. Fracción proteica del salmón

Las proteínas del músculo del pez se pueden dividir en tres grupos:

Proteínas estructurales: (miosina, actina, tropomiosina, troponina). Constituyen el 70 -

80 % del contenido total de proteínas (comparado con el 40 % en mamíferos) (FAO,

1999). Las proteínas miofibrilares son las proteínas estructurales que conforman las

miofibrillas, las que contienen la unidad estructural básica responsable de la

contracción muscular en los animales (Pearson y Young, 1989)

Proteínas sarcoplasmáticas: (mioalbúmina, globulina y enzimas metabólicas), esta

fracción constituye el 25-30 % del total de proteínas (FAO, 1999). Se encuentran cerca

de 100 diferentes proteínas sarcoplasmáticas, la mayoría enzimas involucradas en el

metabolismo. (Pearson y Young, 1989)

El grupo de proteínas sarcoplasmáticas es característico de cada especie

marina. Esta fracción de proteínas solubles en agua es la que se utiliza

mayoritariamente para la identificación de especies por métodos electroforéticos

(Rehbein, 1995).

Proteínas del tejido conectivo: (colágeno), que constituyen aproximadamente el 3 % del

total de las proteínas en teleósteos, cerca del 10 % en elasmobranquios y escaso en el

caso del salmón, comparado con el 17 % en mamíferos (FAO, 1999).

El tejido conectivo provee de fuerza y soporte para el sistema muscular. Las

propiedades de estos tejidos se deben principalmente a dos proteínas extracelulares,

colágeno y elastina (Pearson y Young, 1989).

La modificación de parte de la fracción enzimática se puede evaluar midiendo

su actividad proteolitica (AP), actividad de glutatión peroxidasa (GSH – Px) y presencia

de metaloproteinasas (MMP’s).

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1.3.1. Actividad proteolítica El músculo de pescado posee muchas y diferentes proteasas (Stoknes y

Rustad, 1995) y el efecto de la descomposición proteolítica está generalmente

relacionado con un extenso ablandamiento del tejido (FAO, 1999). Las proteasas

endógenas, las cuales tienen la capacidad de hidrolizar diferentes proteínas en el

músculo son de importancia en los procesos de deterioro (Cepeda y cols., 1990). Por

otro lado la actividad proteolítica (AP) también se ve asociada al nivel microbiológico,

sin embargo y dado que sólo un número limitado de microorganismos realmente invade

el músculo y el crecimiento microbiano se lleva a cabo principalmente en la superficie,

el deterioro es probablemente una consecuencia de la difusión de enzimas bacterianas

hacia el interior del músculo y de la difusión externa de nutrientes (FAO, 1999).

Si bien han sido aisladas varias enzimas proteolíticas en el tejido del pescado,

han sido las catepsinas las que quizás se han descrito con mayor frecuencia. Las

catepsinas son proteasas "ácidas" que usualmente se encuentran empacadas en

diminutos organelos submicroscópicos llamados lisosomas (FAO, 1999). La alta AP

ocurre en músculo y carne picada, debido a la ruptura de los lisosomas que las

contienen (Chang-Lee y cols., 1989).

En el tejido vivo, se cree que las proteasas lisosomales son responsables de la

degradación proteica en las áreas de daño. De esta forma, las catepsinas están

generalmente inactivas dentro del tejido vivo pero son liberadas dentro de los fluidos

celulares luego de abuso físico o congelación y descongelación post mortem del

músculo (FAO, 1999). Hultamnn y Rustad (2004) indican que cuando los tejidos

miofibrilares y conectivos son desnaturados, las proteínas son extremadamente

susceptibles a la acción hidrolítica de catepsina B.

Un factor postmorten que influye en la textura del pescado, importante

característica de calidad, es la razón y extensión de la proteolisis causante del quiebre

de tejido miofibrilar y conectivo (Hultmann y Rustad, 2004). Además, muchas

proteinasas del músculo participan en la degradación durante el almacenamiento y

procesamiento, y son de gran importancia en el congelamiento y preservación del

pescado (Pérez-Borla, 2002). La AP del músculo ha sido descrita como cambios en

las proteínas miofibrilares las cuales afectan la calidad del músculo de pescado

(Kinoshita y cols., 1990).

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1.3.2. Glutatión peróxidasa La glutatión peróxidasa (GSH - Px), es una enzima selenio dependiente que

cataliza la reducción del peróxido de hidrógeno (H2O2) o lipoperóxido (L-OOH),

utilizando como agente reductor el glutatión reducido (GSH) (Cisneros y cols., 1997).

Esta enzima fue reportada por primera vez por Mills y Randall (1957) en eritrocitos

bovinos y más tarde en diferentes tejidos, como pulmón de ratas (Chiu y cols., 1976) e

hígado (Little y cols., 1968).

La GSH - Px, como parte del mecanismo de defensa antioxidante, evita la

oxidación de los L-OOH, reduciéndolos en presencia de GSH. Desempeña así un

importante papel en la defensa antioxidante por su localización en todos los órganos y

tejidos, como parte del sistema antioxidante del glutatión, por lo que está involucrada

en las alteraciones funcionales del organismo que, son causa de varias enfermedades

(Cisneros y cols., 1997). Cabe considerar además, que en condiciones de

congelamiento, los productos de la oxidación de los componentes lipídicos interactúan

con las proteínas, llevando a la desnaturalización de éstas, pérdida nutricional,

modificación de perfiles de electroforesis de las proteínas, y pérdida de sistemas

endógenos de antioxidantes, como GSH - Px (Aubourg, 2004).

Se conoce que los L - OOH son tóxicos en los tejidos animales y que dan lugar

a especies reactivas al oxígeno (ROS) como los radicales peróxido (L-OO*), que son

compuestos indeseables para los organismos vivos (Cisneros y cols., 1997), por lo

tanto las células de los mamíferos elaboran mecanismos de defensa para eliminar

radicales (Figura 3).

Las etapas metabólicas clave son la catálisis de superoxido dismutasa (SOD),

de la dismutación de superóxido a peróxido de hidrógeno y oxígeno, y la conversión de

H2O2 a 2H2O por GSH – Px, o a O2 + H2O por catalasa. La reacción catalizada por

GSH – Px, es importante para la detoxificacilón de ROS, las que pueden reaccionar

con sulfhidrilo (cisteina) o aminoácidos básicos (histidina, lisina), modificando tanto la

estructura como la función de las proteínas. La oxidación de las proteínas catalizada

por metales conduce a la adición de grupos carbonilos o entrecruzamiento o

fragmentación de proteínas (San Miguel y cols., 2006).

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Figura 3: Mecanismo de defensa frente al daño por ROS.

Fuente: San Miguel y cols. 2006.

La catalasa, ha sido por largo tiempo considerada la enzima con mayor

responsabilidad para reducir peróxido de hidrógeno (Little y cols, 1970), sin embargo, y

según Cohen y Hochstein (1963) la GSH - Px protegería de mejor forma a los

eritrocitos de la oxidación a metamioglobina causada por peroxido de hidrogeno. A

partir de estos resultados, los autores antes mencionados sugirieron que la GSH - Px

puede ser la primera línea de defensa contra el daño oxidativo por peróxido de

hidrógeno o peróxido de lípidos producidos en diversas células animales.

Por otro lado, Cisneros y cols. (1997) afirman que la GSH - Px y la glutatión

reductasa (GRd) se encuentran formando parte de un sistema antioxidante (GSH – Px

/ GRd), y la catalasa de otro (SOD/CAT) y han observado que ambos sistemas no

actúan a la par; la catalasa actúa en presencia de altas concentraciones de H2O2 y la

GSH - Px lo hace a concentraciones bajas, lo que se refleja en una correlación inversa

en la actividad de ambas enzimas.

1.3.3. Metaloproteinasas

Las metaloproteinasas (MMP’s) constituyen una familia de más de 21

endopeptidasas dependientes de zinc (Alaniz y cols., 2003), que son capaces de

degradar diversos componentes de la matriz extracelular (ECM) y de la membrana

basal (Aguilar, 2004). En conjunto tienen la capacidad de degradar todos los

componentes de la pared arterial y además juegan un papel importante en los sucesos

fisiológicos y patológicos que dan lugar a la degradación de la ECM (Peña, 2001). Así,

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el papel biológico de estas enzimas hidrolíticas de proteínas es esencial dada su

capacidad de ruptura del colágeno y de otras proteínas que conforman el tejido

conectivo, que hacen posible importantes consecuencias como la remodelación

continua de órganos y tejidos (Lozano, 1999).

Las MMP’s son sintetizadas como zimógenos o pro-enzimas inactivas, se

clasifican de acuerdo a sus características funcionales y estructurales. Por su

funcionalidad y según el sustrato que son capaces de degradar pueden ser agrupadas

en: colagenasas, gelatinasas, estromelisinas o matrilisinas, como se muestra en la

Figura 4 (Alaniz y cols., 2003).

Figura 4: Estructura de las MMP’s

Fuente: Westermarck y Kähäri, 1999

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El músculo de pescado esta dividido en bloques de células musculares

separadas en miotomo, mediante tejido conectivo denominado miocomata, cada célula

muscular está rodeada por tejido conectivo que se une a la miocomata al final de la

célula mediante finas fibras de colágeno, es allí donde se observa un deterioro,

presumiblemente debido a la acción de las enzimas colagenasas autolíticas (FAO,

1999), el cual se ve reflejado en la medición instrumental de la textura del músculo de

trucha refrigerada, el cual decae a medida que se solubilizan los niveles de colágeno

(Sato y cols.,1991).

La familia de enzimas MMPs, comparten una estructura similar en sus

dominios. Todas las enzimas de esta familia poseen en común los siguientes:

Péptido señal: es la secuencia responsable de la secreción de la molécula, no está

presente en la forma inactiva de la enzima (Peña, 2001).

Dominio proteolítico o catalítico: contiene 2 iones de zinc y al menos un ion de

calcio. Uno de los iones de zinc está presente en el centro activo e implicado en el

proceso catalítico de las MMPs. El segundo ion de zinc, también denominado zinc

estructural, y el ion de calcio están presentes en el dominio catalítico. El ion de zinc

catalítico es esencial para la actividad proteolítica de las MMP’s (Peña, 2001).

Dominio propéptido: consiste en 80-90 aminoácidos que contienen un residuo de

cisteina el cual interactúa con el átomo de zinc del dominio catalítico a través de un

grupo tiol. En este dominio hay una secuencia altamente conservada. La proteólisis de

este propéptido da como resultado la activación del zimógeno. La activación puede

darse por la acción de enzimas proteolíticas, agentes mercuriales o el calor (Peña,

2001).

Dominio hemopexina/vitronectina: está altamente conservado y muestra una

secuencia similar a la proteína plasmática hemopexina. Se ha demostrado que este

dominio juega un papel funcional en la unión al sustrato y/o en las interacciones con los

inhibidores de las metaloproteinasas (Peña, 2001).

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2. HIPOTESIS Al adicionar antioxidantes naturales - extracto de romero y exceso de

tocoferoles - a la dieta de engorda de Salmón coho (Oncorhynchus kisutch) se

mantendrán los parámetros enzimáticos de actividad proteolítica (AP), actividad de

glutatión peróxidasa (GSH - Px) y presencia de metaloproteinasas (MMP’s),

comparado con la Dieta Control, durante un período de 18 meses almacenado a -18º

C, lo que finalmente influirá en la calidad final del músculo de salmón.

2.1. Objetivo general. Determinar el efecto de la adición de antioxidantes naturales a la dieta de

engorda, sobre la actividad enzimática medida en el músculo de Salmón coho

(Oncorhynchus kisutch) almacenado por 18 meses a una temperatura de - 18º C.

2.2. Objetivos específicos. En las muestras de músculo de Salmón coho, extraídos de individuos

alimentados con cada una de las tres dietas de engorda en estudio (Dieta I o Control,

Dieta II o Exceso de Tocoferoles y Dieta III o Extracto de Romero):

a) Determinar AP en músculo de Salmón coho cada tres meses de almacenamiento

congelado a -18º C y por un período de 18 meses.

b) Montar el método y determinar la actividad de la enzima GSH - Px en músculo de

Salmón coho cada tres meses de almacenamiento congelado a -18º C y por un período

de 18 meses.

c) Determinar la presencia de MMP’s en músculo de Salmón coho cada tres meses de

almacenamiento congelado a -18º C y por un período de 18 meses.

d) Correlacionar AP, GSH - Px y MMP´s con propiedades físicas y sensoriales para

músculo de Salmón coho.

d) Correlacionar GSH - Px con parámetros de oxidación lipídica para músculo de

Salmón coho.

e) Correlacionar los valores de AP, GSH - Px y MMP´s determinados para Salmón

coho con el peso de los individuos muestreados.

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3. MATERIALES Y METODOLOGÍA 3.1. Materiales

Se utilizó una serie de reactivos, equipos e insumos necesarios para realizar de

forma correcta las metodologías aplicadas. Estos son específicos para cada una de las

técnicas utilizadas para determinar: actividad proteolítica, glutatión peróxidasa y

metaloproteinasas, y se detallan en Anexo 1.

3.2. Metodología 3.2.1. Diseño experimental

El estudio se realizó en músculo de Salmón coho cultivado por Ewos Innovation

Chile, en piscicultura ubicada en Colaco, X Región de Chile, donde se dispuso de

jaulas separadas para ensayar 3 tipos de dieta: Dieta I o Control, Dieta II (Exceso de

Tocoferoles) y Dieta III (Extracto de Romero), las cuales se diferencian en el tipo de

antioxidante adicionado tanto a la harina como al aceite de pescado (Anexo 2).

En el mes de Septiembre, cuando los salmones pesaban en promedio 1.500 g,

se separaron en 3 jaulas independientes y se les alimentó con las dietas antes

mencionadas. El ensayo se prolongó hasta el período de cosecha, Diciembre, cuando

el peso promedio fue de 2.500 g por individuo.

Los salmones fueron procesados, tipo HG (sin cabeza, sin vísceras, sin

agallas), en la planta Fitz Roy de la procesadora Mainstream, también ubicada en

Colaco. Se congelaron en túneles, se glasearon, y cada individuo se envasó en bolsa

de polipropileno, luego en caja de aislapol para ser enviados a la Facultad de Ciencias

Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile.

El estudio consistió en analizar para cada dieta, 5 individuos, cada tres meses

de almacenamiento congelado a –18º C (Figura 5).

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Figura 5: Diagrama que muestra el Diseño Experimental

JAULA UNICA DE CULTIVO (Salmón coho, hasta alcanzar un promedio de 1.500 g)

JAULA 1 (1.200 individuos) JAULA 2 (500 individuos) JAULA 3(500 individuos) Dieta I o Control Dieta II (Exceso de Tocoferoles) Dieta III (Extracto de Romero) Harina de pescado Harina de pescado Harina de pescado (Etoxiquina) (Tocoferoles Libres) (Tocoferoles Libres) Aceite de pescado Aceite de pescado Aceite de pescado

(BHT) (Tocoferoles libres) (Extracto de Romero)

Cosecha - promedio de 2.700 g Cosecha - promedio de 2.434 g Cosecha - promedio de 2.648 g

30 individuos 30 individuos 30 individuos

Procesadora Mainstream Planta Fitz Roy Puerto Montt

Proceso HG

Congelado en túneles Glaseado/envoltura PP/caja PEE Envio Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas. Universidad de Chile

Almacenado a -18ºC

Análisis de muestras de músculo Análisis de muestras de músculo Análisis de muestras de músculo de 5 individuos alimentados con de 5 individuos alimentados con de 5 individuos alimentados con

Dieta I durante el almacenamiento Dieta II durante el almacenamiento Dieta III durante el almacenamiento

Mes 0 de almacenamiento a -18º C Mes 0 de almacenamiento a -18º C Mes 0 de almacenamiento a -18º C






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3.2.2. Métodos 3.2.2.1. Actividad proteolítica

La AP en músculo de salmón, fue determinada por un procedimiento de

autolisis, de acuerdo con lo expuesto por Pacheco-Aguilar y Crawford (1994), con

algunas modificaciones.

Preparación de la muestra Se separaron 4 muestras de 3 g de músculo de salmón cada una. A cada

muestra se agregó 3 ml de NaCl 0,1M frío y agitó. Luego, tres de las muestras fueron

incubadas en un baño de agua termoregulado a 60º C por 30 minutos. La muestra

restante (control) fue puesta en hielo, también por 30 minutos. Después de la

incubación, se deben adicionó 6 ml de solución de ácido tricloroacético 10% (TCA)

frío a cada uno de los tubos para terminar la reacción, inclusive a la muestra control.

Todas las muestras ya tratadas con TCA fueron mantenidas a una temperatura entre 2

– 4º C por 30 minutos. Entonces éstas fueron filtradas a través de un papel Whatman

Nº 1. El filtrado fue recibido y mantenido a temperatura de refrigeración, ya que

corresponde al extracto enzimático con el cual se continuó el análisis.

Determinación de la actividad proteolítica La actividad enzimática se determinó utilizando el método expuesto por

Bradford en 1976, modificando lo expuesto por Pacheco-Aguilar y Crawford (1994)

quienes utilizan método de Lowry (1951) (Anexo 3).

Análisis estadísticos Se realizó un tratamiento estadístico de los datos obtenidos para determinar si

existen o no diferencias significativas entre los factores involucrados en la

determinación de AP. Además se realizó una correlación de Pearson con propiedades

físicas y sensoriales del salmón. Para tal propósito se utilizó el programa

computacional Statgraphics Plus versión 4.0 (Anexo 4).

3.2.2.2.Glutatión peróxidasa. La actividad de la enzima GSH - Px en el músculo de Salmón coho, fue

determinada mediante un ensayo acoplado a glutatión reductasa, de acuerdo con lo

expuesto por Chiu y cols. en 1976.

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Preparación de la muestra Para la determinación y cuantificación de glutatión peroxidasa, se peparó un

extracto enzimático de acuerdo a Aubourg y cols. (2004), con algunas modificaciones.

La enzima fue extraída por homogeneización de la 1 g de muestra con 4 ml de solución

de NaCl 0,1M, en reemplazó de KCl. Luego se centrifugó hasta la separación del

sobrenadante de los restos de músculo. El sobrenadante obtenido fue usado para

medir la actividad enzimática de acuerdo al método de Chiu y cols. en 1976.

Determinación de glutatión peróxidasa Se realizó un ensayo acoplado a glutatión reductasa y la razón de oxidación de

NADPH fue medida espectrofotométricamente a 340 nm. La mezcla a reaccionar

consiste en 150 μL de 2,5 mM de glutatión reducido, 100 μL de peróxido de hidrogeno,

150 μL de 1,2 mM de NADPH, 0,45 unidades de glutatión reductasa (1 unidad oxida

1ųmol por minuto), 150 μL de 0,91 mM EDTA, y 150 μL de 500 mM de buffer Tris HCl

(pH 7,6).

Análisis estadísticos Se realizó un tratamiento estadístico de los datos obtenidos para determinar si

existen o no diferencias significativas entre los factores involucrados en la

determinación de GSH - Px. Además se realizó una correlación de Pearson con

propiedades del salmón e indicadores oxidación y deterioro del mismo. Para tal

propósito se utilizó el programa computacional Statgraphics Plus versión 4.0 (Anexo 5).

3.2.2.3. Metaloproteinasas.

La metodología a seguir para la determinación de la enzima se basa en lo

expuesto por Pozo (2003), con algunas modificaciones en la concentración de los

geles.

Preparación de la muestra La muestra se obtuvo mediante un corte en el músculo del Salmón coho, en el

cual se introdujo papel Whatman N°1, de 7 mm de ancho por 40 mm de largo, durante

1 hora. Luego, el papel fue retirado del músculo del salmón e introducido en 180 µL de

Tris-HCl 1M pH 6,8 y fue agitado; de esta solución se tomó 15 µL los cuales se

mezclaron con 5 µL de tampón desnaturante en condiciones no reductoras, Tris HCl

pH 6,8 y SDS, obteniéndose así la muestra tratada para ser llevada a un gel.

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Preparación de los geles

Las enzimas buscadas tienen actividad gelatinásica en presencia de un ión

metálico, lo cual se explica la presencia de gelatina, como sustrato, en el gel

separador. Los geles, se realizaron de 1mm de espesor, el gel separador se realizó al

10% de acrilamida y el concentrador al 5% de acrilamida. En cada calle del gel, se

agregó 30 µL de muestra tratada, y se aplicaron 200 volts durante un período de

tiempo de 45 minutos, en una solución de tampón de electrodos.

Determinación de la actividad enzimática Una vez realizada la electrofóresis, que produce la separación de las proteínas

por peso molecular, las enzimas se reactivaron mediante lavado en 50 ml de una

solución de tritón X-100 al 2,5 % por 30 minutos a temperatura ambiente con agitación

orbital y luego fueron incubadas por 48 horas a 37° C en una solución de CaCl2 5mM,

NaN3 0,02%, Tris-HCl 50mM pH 8. Se reveló por tinción con una solución compuesta

de 5 partes de metanol, 5 partes de agua, 2 partes de ácido acético y 0,1% de azul de

coomasie R-250, por un mínimo de 6 horas y posterior lavado con una solución

desteñidora de ácido acético al 10%. La actividad corresponde a bandas transparentes

sobre fondo azul de gelatina sin degradar.

Análisis estadísticos Se realizó un análisis computacional en el programa UN SCAN IT, el cual

determina los pixeles en las bandas que presentan actividad gelatinásica. Luego,

mediante el uso del programa computacional Statgraphics Plus versión 4.0, se realizó

un tratamiento estadístico de los datos para determinar si existen diferencias

significativas (p< 0,05) en la intensidad de las bandas para el período de

almacenamiento y cada una de las diferentes dietas de engorda. Además se realizó

una correlación de Pearson con propiedades del salmón y también se correlaciono con

los parámetros de AP, GSH – Px y peso de los individuos (Anexo 6).

18

4. RESULTADOS Y DISCUSION 4.1. Actividad proteolítica

La AP en el músculo de Salmón coho (Oncorhynchus kisutch), fue estudiada

para determinar si la variación en la dieta de engorda de los individuos, es decir, la

adición de antioxidantes naturales, ejercía efecto sobre la conservación de la estructura

de las proteínas del salmón, durante el almacenamiento a una temperatura de -18º C

por un período de 18 meses, los resultados se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1: Actividad Proteolítica para músculo de Salmón coho almacenado congelado (-18º C) por 18 meses

ACTIVIDAD PROTEOLITICA (μg de producto soluble en TCA/g de músculo/30min)

Meses Dieta I o Control

Dieta II (Exceso de Tocoferoles)

Dieta III (Extracto de Romero)

0 r 6,65 ab (7,71)

r 20,40 d

(31,05)

r 8,39 e

(11,14)

3 s 3,18 a (4.16)

s 7,21 d

(5,79)

s 8,63 e

(10,85)

6 t 22,01 bc

(8,52)

t 20,43 d

(16,00) t 12,78 e

(13,34)

9 u 14,00 bc

(1,64)

u 5,57 d

(5,29) v 341,51 f (196,30)

12 wx 5,19 ab

(5,25)

x 9,34 d

(4,67)

w 2,77 e

(4,63)

18 y 0,00 a

(0,00)

yz 13,24 d

(10,74)

z 17,77 e

(23.28)

( ) desviación estándar. a b c Indican si existen o no diferencias significativas con un 95 % de confianza entre los meses de

almacenamiento para los valores de AP de individuos alimentados con la Dieta I o Control. d Indica si existen o no diferencias significativas con un 95 % de confianza entre los meses de

almacenamiento para los valores de AP de individuos alimentados con la Dieta II (Exceso de tocoferoles) e f Indican si existen o no diferencias significativas con un 95 % de confianza entre los meses de

almacenamiento para los valores de AP de individuos alimentados con la Dieta III (Extracto de Romero) r s t u v w x y z Indican si existen o no diferencias significativas con un 95 % de confianza entre las dietas para

los valores de AP en los respectivos tiempos.

19

Los resultados anteriores fueron obtenidos a partir de muestras de 5 individuos

para cada tiempo de análisis, realizando 3 réplicas en cada uno de ellos (Anexo 7).

Para estudiar si hubo diferencias estadísticamente significativas, a éstos valores se les

realizó un análisis estadístico para determinar si el valor de AP de las réplicas para

cada individuo es o no promediable. Este expresó que no existen diferencias

estadísticamente significativas con un 95% de confianza entre las réplicas, entonces

las réplicas son promediables (Anexo 8).

Se realizó nuevamente un análisis estadístico para determinar si existían o no

diferencias significativas, con un 95% de confianza, entre los individuos considerando

esta vez el promedio de las réplicas (Anexo 9). Se obtuvo entonces un valor p > 0,05

para las muestras extraídas de individuos alimentados con las tres dietas en estudio,

Dieta I o Control, Dieta II (Exceso de Tocoferoles) y Dieta III (Extracto de Romero)

(Anexo 10). Por lo tanto, los individuos no presentaron diferencias estadísticamente

significativas, por lo cual se promediaron y los resultados se expresaron como la media

de los 5 individuos con su respectiva desviación estándar (Tabla 1).

Cabe destacar que existió una gran variabilidad en el valor de AP entregado por

los individuos, expresada en la alta desviación estándar, lo cual es consistente con los

valores expuestos por Hultmann y Rustad (2004) que reportaron desviaciones estándar

hasta 4 veces mayor que la media de las muestras analizadas en el caso de Salmón

atlántico. Esta alza pudo deberse a características propias de los individuos medidos

en ese período, ya que el músculo de pescado esta sujeto a diversas variaciones

estacionales como pH, grasa, cantidad de agua y proteína que pueden influenciar

propiedades funcionales y de procesamiento (Pérez – Borla y cols., 2002). Además un

inadecuado manejo post – captura induce la actividad de enzimas endógenas y la

autolisis del músculo (Pacheco – Aguilar y cols., 2000).

Al analizar los individuos alimentados con cada una de las dietas de forma

independiente, se realizó el análisis estadístico del comportamiento de AP en el

tiempo. Este indicó que entre los valores de AP de las muestras extraídas de

individuos alimentados con la Dieta I o Control (Anexo 11), existen diferencias

estadísticamente significativas (p ≤ 0,05) durante el tiempo de almacenamiento

congelado a – 18º C. Los resultados obtenidos por los análisis estadísticos, indicaron la

20

formación de dos grupos con una AP homogénea en el tiempo, el primero incluyendo

los meses 0, 3, 12 y 18, y el segundo los meses 6 y 9.

Los resultados anteriores fueron correlacionados con otros parámetros que

representan propiedades físicas y sensoriales del salmón (Latorre, 2007), se encontró

que la variación de AP en el tiempo, para individuos alimentados con la Dieta I o

Control, se encuentra directamente relacionada con el porcentaje de agua perdida

(Driping cocido), presentando un índice de correlación de Pearson de 0,8182 (Figura 6)

(Anexo 12), es decir, que al aumentar la AP del músculo de salmón, éste pierde una

mayor cantidad de agua al ser sometido al proceso de cocción.

Figura 6: Correlación entre Actividad Proteolítica y Porcentaje de agua

perdida (Driping cocido) en músculo de Salmón coho almacenado congelado (-18º C) por 18 meses

-5

0

5

10

15

20

25

0 2 4 6 8 10 12

Porcentaje de agua perdida (Driping cocido)

Act

ivid

ad P

rote

oliti

ca (u

g de

pro

duct

o so

lubl

e en

TC

A/g

de

mús

culo

/30

min

)

El aumento del “driping” en salmón congelado / descongelado es consistente

con la disminución de la capacidad de retención de agua debido a la desnaturalización

de las proteínas miofibrilares de las fibras musculares, daño celular, menor solubilidad

21

y agregación de las proteínas que tiene lugar durante la congelación y descongelación

(Einen y cols.,2002), lo cual es congruente con el aumento de la AP ya que las

proteínas del músculo, importante característica de calidad, tal como sus propiedades

texturales, al ser afectadas por enzimas proteolíticas son degradadas. La mayoría de

las proteínas pierde su función cuando está desnaturalizada afectando por ende su

óptimo funcionamiento y sus propiedades físico-químicas, por lo cual se observan

cambios en la textura del músculo (Hultmann y Rustad, 2004).

Se trabajó de manera similar con las muestras provenientes de individuos

alimentados con la Dieta II (Exceso de Tocoferoles). El análisis estadístico indicó que

no existen diferencias estadísticamente significativas (p > 0,05) en el comportamiento

de AP durante el tiempo de almacenamiento congelado a – 18º C (Anexo 13).

Al comparar los resultados anteriores con propiedades físicas y sensoriales del

salmón (Latorre, 2007), no se observó correlación directa o inversa entre los

parámetros analizados para los valores de AP de las muestras extraídas de individuos

alimentados con la Dieta II (Exceso de Tocoferoles) (Anexo 14).

El análisis estadístico para el comportamiento de AP de las muestras obtenidas

de individuos alimentados con la Dieta III (Extracto de Romero), presentó diferencias

estadísticamente significativas, con un 95% de confianza, en la AP durante el tiempo

de almacenamiento congelado a – 18º C (Anexo 15). Estadísticamente se observa la

formación de dos grupos entre los tiempos, donde claramente es el mes 9 el que varía

con respecto a los otros (Tabla 1). Debido a que las muestras de músculo de Salmón

coho alimentado con la Dieta III (Extracto de Romero) en el noveno mes de

almacenamiento, presentaron una AP notoriamente mayor con respecto a las otras

dietas y meses en estudio, se repitió el análisis para ese punto en específico,

obteniéndose resultados del mismo orden. La diferencia de AP en este punto puede

deberse a la alta variabilidad entre los individuos, situación comentada anteriormente y

reflejada en la alta desviación estándar que reportó Hultman y Rustad (2004) o a un

mal manejo al momento de almacenar las muestras a -18º C, entre otros factores.

Al comparar los valores de AP de las muestras obtenidas de individuos

alimentados con la Dieta III (Extracto de Romero), con propiedades físicas y

sensoriales del salmón (Latorre, 2007) (Anexo 16), se encontró una correlación directa

con el recuento de aerobios mesófilos (RAM), expresado como (ufc/g), con un índice

22

de correlación de Pearson de 0,9783 (Figura 7). Esto concuerda con estudios que

expresan que entre las posibles fuentes de AP en el músculo se encuentran las

enzimas secretadas por bacterias y parásitos que lo invaden (Pacheco-Aguilar y

Crawford, 1994).

Figura 7: Correlación entre Actividad Proteolítica y Recuento de Aerobios Mesófilos en músculo de Salmón coho almacenado

congelado (-18º C) por 18 meses

-50

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 500 1000 1500 2000 2500

RAM (ufc/g)

Act

ivid

ad P

rote

olíti

ca (u

g de

pro

duct

o so

lubl

e en

TC

A/g

de

mús

culo

/30

min

)

Varias investigaciones han reportado enzimas microbianas que se escapan a

través de la piel o superficie del filete introduciéndose en el músculo, causando

cambios en la textura del pescado y en otras propiedades (Ashie y cols., 1996).

La AP podría asociarse a Kudoa paniformis, mixosporidian que penetra el

centro de las fibras individuales del músculo y se extiende a lo largo de ellas, hasta que

esta se llena de esporas, aún no se conoce su mecanismo de acción, si el parásito

libera una proteasa o si la enzima es liberada de los lisosomas como respuesta del

sistema inmune (Chang- Lee y cols., 1989).

23

Luego se analizó el comportamiento para cada mes de almacenamiento de la

AP de las muestras extraídas de individuos alimentados con la Dieta I o Control, con la

Dieta II (Exceso de Tocoferoles) y con la Dieta III (Extracto de Romero) para todo el

período de almacenamiento a -18º C (Figura 8).

Figura 8: Comportamiento de la Actividad Proteolítica para músculo

de Salmón coho almacenado congelado (-18º C) por 18 meses

-100

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 3 6 9 12 15 18

Tiempo (meses de almacenamiento congelado a - 18º C)

Act

ivid

ad P

rote

oliti

ca (u

g de

pro

duct

o so

lubl

e en

TC

A/g

de

mús

culo

/30m

in)

Dieta I o control Dieta II (Exceso de tocoferoles) Dieta III (Extracto de romero)

Se observó que hasta el sexto mes de almacenamiento la AP no presentó

diferencias estadísticamente significativas (p > 0,05), por lo que podría asumirse que la

adición de antioxidantes naturales a la Dieta II (Exceso de Tocoferoles) y Dieta III

(Extracto de Romero) no favorece ni retarda el proceso de AP en el músculo de

salmón. Sin embargo a partir del noveno mes la situación cambia, observándose

diferencias significativas (p ≤ 0,05) en la variación de AP durante los últimos meses de

almacenamiento, dependiendo de la dieta suministrada a los salmones (Anexo 17). Al

noveno mes de almacenamiento congelado (-18º C) la AP para las muestras de

individuos alimentados con la Dieta III (Extracto de Romero) es mucho mayor que la

presentada por individuos alimentados con las otras dietas en estudio. Al doceavo mes,

24

son las muestras de individuos alimentados con la Dieta II (Exceso de Tocoferoles), las

que presentan mayor AP y finalmente en el mes 18 de almacenamiento son las

muestras de individuos alimentados con la Dieta III (Extracto de Romero) las que

presentaron mayor AP.

Al comparar los datos obtenidos para AP en el músculo de Salmón coho, con

los valores de AP reportados por Sánchez (2002), para otras especies como el

Pejegallo y Tollo, silvestres, en las mismas condiciones de almacenamiento, estos son

similares hasta el sexto mes de almacenamiento. La actividad inicial para las muestras

obtenidas de músculo de Salmón coho alimentado con las Dietas I o Control, II o

(Exceso de Tocoferoles) y III (Extracto de Romero) 6,65, 20,41 y 8,39 (μg de producto

soluble en TCA/g de músculo/30 min.), respectivamente, fue menor a la determinada

en Tollo, 48,62 (μg de producto soluble en TCA/g de músculo/30 min.), pero mayor a

la del Pejegallo, 1,14 (μg de producto soluble en TCA/g de músculo/30 min).

Valores de iniciales de AP para Salmón atlántico (Salmo salar) 0,05 y 0,08 (mg

de péptido soluble liberado TCA/gramo/hora) para pH 6 y 6,5 respectivamente,

reportados por Hultmann y Rustad (2004) son mayores que los encontrados para AP

en músculo de Salmón coho en cada una de las tres dietas analizadas, 0.0133, 0.0408,

0.0168 (mg de péptido soluble liberado TCA/g/h) para las muestras de individuos

alimentados con las Dietas I o Control, II o (Exceso de tocoferoles) y III (Extracto de

Romero) respectivamente.

4.2. Glutatión peróxidasa

La Glutatión Peróxidasa (GSH - Px) es una enzima que cataliza la reducción de

peróxido de hidrógeno (H2O2) o L - OOH, utilizando como agente reductor el GSH. Es

una enzima que desempeña un importante papel en la defensa antioxidante por su

localización en todos los órganos y tejidos, como parte del sistema antioxidante del

glutatión. Ha sido reportada en tejidos como eritrocito humano, pulmón e hígado de

rata e inclusive en músculo, piel y hepatopáncreas de los peces, por lo que aparenta

ser una enzima universal (Cisneros y cols., 1997).

El mecanismo de esta enzima (Figura 9), parte del sistema antioxidante GSH .

Px/GRd, se desarrolla a partir de la GRd, enzima dependiente del nicotinamín adenín

dinucleótido fosfato reducido (NADPH) que cataliza la reducción del glutatión oxidado

25

(GSSG) a GSH el cual será utilizado por la GSH – Px para la reducción del H2O2 y de

L-OOH, los cuales son elementos tóxicos (Cisneros, 1995)

Figura 9: Mecanismo de la enzima Glutatión Peroxidasa

Fuente: López y cols.,1997.

Mediante la realización de ensayos previos, se montó el método para la

determinación de la actividad de la enzima GSH – Px en músculo de salmón.

En primer lugar se determinó el comportamiento de la enzima frente a distintas

cantidades de H2O2 en la mezcla a reaccionar. Se mantuvo constante las cantidades

de los otros componentes en la mezcla y se modificó la cantidad de H2O2 en 100, 50 y

30 μL (Tabla 2).

El análisis estadístico indico que la cantidad de H2O2 adicionado a la reacción

tuvo una influencia estadísticamente significativa (p ≤ 0,05) sobre los valores de

absorbancia obtenidos, además hubo diferencias entre las todas las cantidades de

H2O2 utilizadas (100, 50 y 30 μL) (Anexo 18).

Con respecto al H2O2, como sustrato de ésta reacción enzimática, cabe

destacar que existen al menos 3 formas de GSH - Px selenio dependientes: una forma

intracelular o celular (GSH – Px - c), una extracelular o plasmática (GSH – Px - p) y

otra con actividad específica para los fosfolipoperóxidos (GSH – Px - PH) que por lo

general está asociada a la membrana y aunque su actividad es la misma, poseen

diferencias en estructura y afinidad. La GSH – Px - c tiene mayor afinidad por el H2O2

que por los L-OOH, en tanto la GSH – Px - p tiene una afinidad semejante para los 2

26

sustratos. La GSH – Px - c y la GSH – Px - p utilizan como sustratos los H2O2 y los

L-OOH; sin embargo, no son capaces de utilizar los fosfolipoperóxidos (PHL-OOH) que

son los sustratos principales para la GSH – Px – PH (Cisneros y cols., 1997).

Tabla 2: Comportamiento de Glutatión Peróxidasa frente a la cantidad de H2O2

Absorbancia a 340 nm para variación de H2O2

Tiempo (s) 100 μL 50 μL 30 μL 0 1,149 1,088 1,092

30 1,140 1,076 1,081 60 1,131 1,069 1,070 90 1,125 1,063 1,063

120 1,119 1,053 1,053 150 1,109 1,046 1,047 180 1,099 1,037 1,042 210 1,090 1,030 1,033 240 1,084 1,023 1,024 270 1,076 1,014 1,016 300 1,067 1,003 1,005

Variación 0,082 0,085 0,087 Glutatión Peróxidasa* 4.112,40 4.262,85 4.363,15

*Expresada como nmoles de NADPH oxidado/min/ml de glutatión reductasa/g de muestra

La presencia de diferentes formas de GSH – Px, las cuales poseen distinto

grado de afinidad por el H2O2 como sustrato, podría explicar en cierta forma la

diferencia de actividad entre los individuos.

De igual forma, se determinó cómo se comportaba la enzima utilizando distintas

cantidades de GRd, la cual permite mantener concentraciones de GSH en la célula no

sólo para ser utilizado por la GSH - Px en la eliminación del H2O2, este GSH es de

utilidad en la recuperación de las vitaminas C (ácido ascórbico) y E (alfa-tocoferol)

luego de participar en la eliminación de radicales libres generados in situ o a distancia.

El GSH interviene además en la detoxificación de compuestos xenobióticos, el

almacenamiento y transporte de cisteína, la regulación del balance redox de la célula,

el metabolismo de los leucotrienos y las prostaglandinas, la síntesis de los

27

desoxirribonucleótidos, la función inmunológica y la proliferación celular (Cisneros,

1995)

Se modificó entonces la cantidad de GRd adicionado a la mezcla, variando esta

en 2, 4, 6 y 10 μL, se mantuvo constante los otros reactivos involucrados (Tabla 3).

Tabla 3: Comportamiento de Glutatión Peróxidasa frente a la cantidad de GRd

Absorbancia a 340 nm para variación de Glutatión Reductasa

Tiempo (s) 2 μL 4 μL 6 μL 10 μL 0 0,544 0,711 0,533 0,731

30 0,538 0,705 0,522 0,722 60 0,531 0,698 0,515 0,711 90 0,527 0,693 0,505 0,700

120 0,523 0,689 0,495 0,690 150 0,518 0,681 0,486 0,680 180 0,512 0,677 0,475 0,673 210 0,506 0,671 0,465 0,663 240 0,501 0,665 0,456 0,653 270 0,495 0,660 0,446 0,644 300 0,491 0,656 0,436 0,632

Variación 0,053 0,055 0,097 0,099 Glutatión Peróxidasa* 2.660,69 2.761,10 4.869,57 4.969,98

*Expresada como nmoles de NADPH oxidado/min/ml de glutatión reductasa/g de muestra

El análisis estadístico indicó que la cantidad de GRd tuvo una influencia

estadísticamente significativa (p ≤ 0,05) sobre los valores de absorbancia obtenidos.

Sin embargo se observó la formación de un grupo homogéneo entre las absorbancias

obtenidas cuando se agregó 4 y 10 μL de GRd a la reacción (Anexo 19).

Por último se modificó la cantidad de muestra, extracto enzimático que

representa a la GSH – Px en la reacción, en 50, 100 y 150 μL dentro de la mezcla a

reaccionar (Tabla 4).

El análisis estadístico indicó que la cantidad de muestra (GSH – Px) tuvo una

influencia estadísticamente significativa (p ≤ 0,05) sobre los valores de absorbancia

obtenidos (Anexo 20).

28

Tabla 4: Comportamiento de Glutatión Peróxidasa al variar la cantidad de ésta en la mezcla reactante

Absorbancia a 340 nm para variación de cantidad de muestra

Tiempo (s) 50 μL 100 μL 150 μL 0 0,810 0,862 0,921

30 0,804 0,856 0,908 60 0,799 0,850 0,906 90 0,792 0,842 0,898

120 0,785 0,837 0,889 150 0,780 0,834 0,883 180 0,776 0,827 0,877 210 0,769 0,821 0,871 240 0,765 0,814 0,868 270 0,760 0,810 0,859 300 0,756 0,803 0,854

Variación 0,054 0,059 0,067 Glutatión Peróxidasa* 2.942,44 3.214,89 3.650,81 *Expresada como nmoles de NADPH oxidado/min/ml de glutatión reductasa/g de muestra

Cabe destacar que el aumento de la actividad no se comportó directamente

proporcional a la cantidad de muestra adicionada.

Considerando los tres ensayos anteriores, y a pesar de que los resultados no

fueron los esperados para el comportamiento de la enzima, se decidió realizar los

estudios de cuantificación de la enzima en músculo de Salmón coho con las tres dietas

en estudio.

La presencia de GSH – Px en el músculo de Salmón coho, fue estudiada para

determinar si la variación en la dieta de engorda de los individuos, es decir, la adición

de antioxidantes naturales, ejercía efecto sobre los mecanismos propios de defensa

antioxidante del salmón, durante el almacenamiento a una temperatura de -18º C por

un período de 18 meses (Tabla 5).

Se obtuvo los resultados anteriores a partir de 5 individuos para cada tiempo

(Anexo 21). Se realizó un análisis estadístico de dos vías, tiempo e individuos, el cual

expresó que no existían diferencias estadísticamente significativas, con un 95% de

confianza, para los valores de actividad de la enzima GSH – Px de individuos

29

alimentados con todas las dietas en estudio, con respecto a los individuos, lo cual

indica que para las tres dietas analizadas los individuos son promediables (Anexo 22).

Tabla 5: Actividad de Glutatión Peroxidasa para músculo de Salmón coho

almacenado congelado (-18º C) por 18 meses

Glutatión Peroxidasa (µmoles de NADPH oxidado/min/ml de glutatión reductasa/g de muestra)

Meses Dieta I o Control

Dieta II (Exceso de Tocoferoles)

Dieta III (Extracto de Romero)

0 s 8,51 a

(4,48) t 16,35 b (3,27)

st 12,97 c

(1,12)

3 u 10,56 a (1,23)

u 10,81 b

(0,17) u 8,92 c d

(4,62)

6 v 14,23 a (1,19)

v 12,65 b

(0,39) w 7,86 d

(1,45)

9 x 12,31 a (2,01)

x 13,10 b

(0,09) x 10,95 c d

(0,21)

12 y 11,51 a (0,15)

y 11,77 b

(0,67) y 14,09 c

(1,34)

18 z 11,33 a (5,68)

z 16,37 b

(4,95) z 12,63 c d

(0,73) ( ) desviación estándar. a Indican si existen o no diferencias significativas con un 95 % de confianza entre los meses de

almacenamiento para los valores de GSH - Px de individuos alimentados con la Dieta I o Control. b Indica si existen o no diferencias significativas con un 95 % de confianza entre los meses de

almacenamiento para los valores de GSH - Px de individuos alimentados con la Dieta II (Exceso de

Tocoferoles) c d Indican si existen o no diferencias significativas con un 95 % de confianza entre los meses de

almacenamiento para los valores de GSH - Px de individuos alimentados con la Dieta III (Extracto de

Romero) s t u v w x y z Indican si existen o no diferencias significativas con un 95 % de confianza entre las dietas para

los valores de GSH – Px en los respectivos tiempos.

Luego se analizó el comportamiento de la enzima GSH – Px de forma

independiente para cada una de las dietas en estudio. El análisis estadístico para la

actividad de esta enzima en muestras extraídas de individuos alimentados con la Dieta

I o Control indicó que no existían diferencias estadísticamente significativas (p > 0,05)

30

en la actividad de la GSH - Px durante el tiempo de almacenamiento congelado a – 18º

C (Anexo 23).

Además se realizó una comparación entre los valores de la actividad de la

enzima GSH – Px para muestras de individuos alimentados con la Dieta I o Control

con propiedades físicas y sensoriales del salmón (Latorre, 2007), en este no se

destaca una buena correlación con ninguno de los parámetros analizados (Anexo 24).

Luego se realizó una comparación con parámetros indicadores de oxidación lipídica y

frescura del salmón (Concha y Vivanco, 2006), encontrándose correlación directa con

el índice de peróxidos, se obtuvo un índice de Correlación de Pearson de 0,8746

(Figura 10) (Anexo 25).

Figura 10: Correlación entre Actividad de Glutatión Peróxidasa e Índice de Peróxidos en Salmón coho almacenado congelado (-18º C) por 18 meses

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 2 4 6 8 10 12Indice de Peróxidos (mEq de oxígeno/kg de aceite)

Act

ivid

ad d

e G

luta

tión

Peró

xida

sa (u

mol

es d

e N

AD

PH o

xida

do/m

in/m

l de

glut

atió

n re

duct

asa/

g de

m

uest

ra)

Los peróxidos se encuentran entre los sustratos requeridos para la reacción en

la cual participa la GSH - Px, con acción antioxidante, por lo tanto un aumento de éstos

aumentaría la actividad de la enzima, a menos que se encontraran en condiciones

31

saturantes en la reacción. Cabe destacar que a mayor cantidad de sustrato, mayor

número de centros catalíticos estarán ocupados, lo que incrementará la eficiencia de la

reacción, hasta el momento en que todos los sitios posibles estén ocupados. En ese

momento se habrá alcanzado el punto de saturación de la enzima y, aunque se añada

más sustrato, no aumentará más la eficiencia.

Por su parte el análisis estadístico, ANOVA de una vía, para la actividad de la

enzima GSH – Px para muestras de individuos alimentados con la Dieta II (Exceso de

Tocoferoles) indicó que no existen diferencias estadísticamente significativas (p > 0,05)

en la actividad de esta enzima durante el tiempo de almacenamiento congelado a – 18º

C (Anexo 26). Se comparó también la actividad de la enzima con propiedades físicas y

sensoriales (Latorre, 2007), (Anexo 27), como con parámetros de oxidación lipídica y

frescura (Concha y Vivanco, 2006) (Anexo 28), del salmón. En ambos casos no se

encontró una buena correlación tanto directa como inversa entre la actividad de la

enzima y los parámetros antes mencionados.

Finalmente el análisis estadístico, ANOVA de una vía para el comportamiento

de la enzima GSH – Px para muestras obtenidas de individuos alimentados la Dieta III

(Extracto de Romero) indica que existen diferencias estadísticamente significativas (p ≤

0,05) en la actividad de la enzima durante el tiempo de almacenamiento congelado a –

18º C (Anexo 29). Al igual que en los casos anteriores, se correlacionó la variación de

la actividad de esta enzima con propiedades físicas y sensoriales (Latorre, 2007)

(Anexo 30) e indicadores de oxidación lipídica y frescura (Concha y Vivanco, 2006)

(Anexo 31) del salmón. En este caso, no se presentó una buena correlación, ni directa

ni inversa, en ninguno de los casos anteriormente analizados.

Luego se analizó el comportamiento para las muestras extraídas de individuos

alimentados con la Dieta I o Control, con la Dieta II (Exceso de Tocoferoles) y con la

Dieta III (Extracto de Romero) en forma conjunta, para todo el período de

almacenamiento a -18º C (Figura 11).

Para esto, se realizó un análisis estadístico, ANOVA de una vía con respecto a

las dietas en estudio (Anexo 32). A tiempo inicial, mes 0, se observan diferencias entre

el comportamiento de la enzima de individuos alimentados con la Dieta I o Control y la

Dieta II (Exceso de tocoferoles). Esto puede deberse a que los tocoferoles y el selenio

actúan sinérgicamente, lo que permite al organismo disponer de su actividad

32

antioxidante aunque uno esté disminuido (Benítez, 2006). Esto es de importancia, ya

que el selenio es un cofactor para la actividad de la GSH - Px, donde sus deficiencias

pudieran inducir modificaciones del estado oxidativo celular y la aparición de

enfermedades (Céspedes y Sánchez, 2000).

Figura 11: Actividad de Glutatión Peróxidasa para músculo de Salmón coho almacenado congelado (-18º C) por 18 meses

0

5

10

15

20

25

0 3 6 9 12 15 18Tiempo (Meses de almacenamiento congelado a -18º C)

Act

ivid

ad d

e G

luta

tión

Pero

xida

sa (u

mol

es d

e N

AD

PH o

xida

do/m

in/m

l de

glut

atio

n re

duct

asa/

g de

m

úscu

lo)

Dieta I o Control Dieta II (Exceso de Tocoferoles) Dieta III (Extracto de Romero)

Al tercer mes de almacenamiento congelado, el comportamiento de esta enzima

se presentó como un grupo homogéneo si comparamos las tres dietas en forma

conjunta, para que luego al sexto mes la actividad enzimática de las muestras de

individuos alimentados con la Dieta III (Extracto de Romero) es significativamente

menor con a las otras.

A partir del noveno mes y hasta el final del período de almacenamiento

congelado a -18º C, el comportamiento de la enzima no presentó diferencias

estadísticamente significativas (p > 0,05), para los individuos alimentados con las tres

33

dietas de engorda, lo que indicaría que no existe una influencia de la adición de

antioxidantes naturales a partir de ese mes.

La variación en la actividad de esta enzima, puede tener su origen en diversos

factores como la hidrólisis de la GSH - Px por el efecto de proteasas intracelulares, la

desnaturalización de la enzima por el tiempo y condiciones de almacenamiento

(Watanabe y cols., 1996).

4.3. Metaloproteinasas Las metaloproteinasas (MMP’s) son una familia de proteinasas dependientes de

zinc, sintetizadas como zimógenos o pro-enzimas inactivas, que se clasifican de

acuerdo a sus características funcionales y estructurales (Alaniz y cols., 2003). Son

capaces de degradar componentes de la ECM tales como el colágeno (Woessner,

1991). Por otro lado, es bien conocido que la carne de pescado contiene varios tipos

de proteinasas, como serina proteinasas, MMP’s y cisteina proteinasas y la calidad de

los productos del mar, como pescado seco – curado, seco - ahumado, y productos a

base de surimi, los cuales se ven afectados por estas proteinasas (Saito y cols., 2002).

La relevancia del colágeno en el ablandamiento de la carne de pescado ha sido

indicada recientemente al observar que la solubilidad del colágeno aumenta durante el

almacenamiento en frío de la carne de pescado (Saito y cols., 2002).

La actividad de MMP’s en el músculo de Salmón coho, fue estudiada para

determinar si la variación en la dieta de engorda de los individuos, es decir, la adición

de antioxidantes naturales, tienen efecto sobre la degradación del colágeno presente el

músculo de pescado, durante un período de almacenamiento de 18 meses a

temperatura de congelación (-18º C).

Se realizó una zimografía para determinar las enzimas MMP’s se encontraban

presentes en las muestras analizadas, las cuales fueron alimentadas con 3 diferentes

dietas de engorda (Figura 12).

En la Figura 12, se observa la presencia de actividad gelatinásica en todos los

carriles, es decir, en todas las muestras analizadas. La actividad principal se observa

en dos posiciones, la primera cercana y bajo los 85 kD y la segunda sobre los 18 kD.

La presencia de esta actividad concuerda con valores reportados por Saito y cols.

(2002), quienes detectaron actividad cerca de las posiciones 85, 73, 67, 20, y 19 kDa,

34

110, 85, 73, y 67 kDa y, 85 y 67 kD, para extractos provenientes de piel, sangre y

músculo de trucha arco iris; destacaron que la sangre aparentemente contiene una

mayor cantidad de actividad gelatinásica que otros extractos de tejidos y aquellas

provenientes de extracto de músculo fueron ligeramente detectadas.

Figura 12: Zimografía que determina presencia de MMP’s en músculo de

Salmón coho alimentado con distintas dietas

Carril 1 y 2: Correspondiente a las muestras provenientes de individuos alimentados con Dieta I o Control

para mes 0 y 18 respectivamente. Carril 3 y 4: Correspondiente a las muestras provenientes de individuos alimentados con Dieta II (Exceso

de Tocoferoles) para mes 0 y 18 respectivamente. Carril 5 y 6: Correspondiente a las muestras provenientes de individuos alimentados con Dieta III (Extracto

de Romero) para mes 0 y 18 respectivamente.

Debido a la posición de las bandas, presentadas en la Figura 12, se puede

asumir que, aquella de MM que primero aparece correspondería a MMP-9 o Gelatinasa

- B, la cual se observa en un rango de 92 a 84 kD (Westermarck y Kähäri, 1999),

perteneciente al grupo de las gelatinasas tiene afinidad por la membrana basal

85 kD

130 kD

43 kD

32 kD

18 kD

1 2 3 4 5 6

Posición Banda 1

Posición Banda 2

CATODO (-)

ANODO (+)

35

(colágeno tipo IV), colágeno desnaturalizado (gelatina), elastina y fibronectina

(Bárcenas y cols., 2004). Las MMP – 9, han sido reportadas como activas en la

escisión de colágeno nativo tipo V y desnaturando proteínas desde todos los tipos de

colágeno, se cree que la degradación del colágeno tipo V es la causa de la

desintegración de las fibras musculares y de ablandamiento muscular (Woessner,

1991). Por lo tanto, estas MMP’s pueden ser los componentes activos que deben ser

reprimidos en el músculo de pescado durante el almacenamiento refrigerado (Saito y

cols., 2002), ya que el colágeno es el mayor constituyente en el tejido conectivo

intramuscular de los peces y como ha sido demostrado, ejerce un importante

significado en la textura de la carne (Hatae y cols., 1989).

La segunda banda notoria que se observa con actividad gelatinásica (Figura

12), se encuentra sobre los 18 kD. Una banda similar a esta fue reportada en piel de

trucha arco iris (Saito y cols., 2000). Se podría asumir que, debido a la posición en que

aparece esta banda se trataría de MMP – 7, la cual tiene afinidad similar a las

gelatinasas (MMP – 2 y MMP – 9), éstas separan la fibronectina, laminina, elastina y

los proteoglicanos (Bárcenas y cols., 2004). Esta enzima existe como una forma

inactiva, con una masa molecular en un rango de 28 – 30 kD la cual es activada por

escisión proteolítica a una forma activa de 19 kD (Fitzgerald Industries Intl., 2001).

Se analizó también la actividad enzimática, en las muestras de salmones

alimentados con cada una de las dietas de forma independiente. El comportamiento de

la Dieta I o Control, Dieta II (Exceso de Tocoferoles) y Dieta III (Extracto de Romero) se

observa en la Figura 13, 14 y 15 respectivamente; se observa la variación en el tiempo

de las bandas con actividad gelatinásica analizadas anteriormente, banda 1 cercana y

bajo 85 kD y banda 2 sobre los 18 kD, durante los 18 meses de almacenamiento

congelado (Anexo 33).

Se realizó un análisis estadístico de ANOVA multifactorial, para determinar si

existían o no diferencias entre la actividad gelatinásica presentada por las bandas, con

respecto al tiempo. Este determinó que no existían diferencias estadísticamente

significativas (p > 0,05) en la variación de la Banda 1, cercana a los 85 kD, entre cada

uno de los meses de almacenamiento a -18º C, se observó el mismo resultado

estadístico para la Banda 2, cercana a los 18 kD (Anexo 34).

36

Figura 13: Comportamiento de la actividad enzimática de MMP’s para individuos alimentados con la Dieta I o Control.

(A) (B)

0

20

40

60

80

100

120

140

0 3 6 9 12 15 18

Tiempo (meses de almacenamiento congelado a -18º C)

Inte

nsid

ad (P

ixel

es/A

rea)

Banda 1 Banda 2

(A) Zimografía correspondiente a individuos durante todo el periodo de almacenamiento. Carril 1: mes 0.

Carril 2: mes 3. Carril 3: mes 6. Carril 4: mes 9. Carril 5: mes 12. Carril 6: mes 18.

(B) Análisis computacional de la variación de las bandas con actividad gelatinolitica durante todo el

período de almacenamiento.

STD – MM: Estándar de Masa Molecular en kD.

Figura 14: Comportamiento de la actividad enzimática de MMP’s para individuos alimentados con la Dieta II (Exceso de Tocoferoles)

(A) (B)

-20

0

20

40

60

80

100

120

140

0 3 6 9 12 15 18


Inte

nsid

ad (P

iexe

les/

Area

)

Banda 1 Banda 2






1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6

STD MM

18

32

43

85

130

STD MM

18

32

43

85

130

37

Figura 15: Comportamiento de la actividad enzimática de MMP’s para individuos alimentados con la Dieta III (Extracto de Romero)

(A) (B)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 3 6 9 12 15 18


Inte

nsid

ad (P

ixel

es/A

rea)

Banda 1 Banda 2






Se determinó también, que no existían diferencias entre la variación de la

actividad enzimática de la Banda 1, con respecto a las dietas de engorda, a diferencia

de lo ocurrido con la Banda 2, donde la variación en la actividad enzimática presentada

por los individuos alimentados con la Dieta II (Exceso de Tocoferoles) mostró

diferencias con respecto al comportamiento de las otras dos dietas en estudio (Anexo

35). La Dieta II (Exceso de Tocoferoles), durante los primeros meses de

almacenamiento no mostró actividad en la Banda 2 (Figura 14), o por lo menos esta no

es detectada tanto al observar el gel como por el programa computacional utilizado,

esto la diferencia con las otras dos dietas en estudio que presentaron actividad durante

el periodo de tiempo mencionado.

La actividad enzimática de MMP’s provoca degradación del colágeno, el cual es

el mayor constituyente del tejido conectivo intramuscular de los peces, ejerciendo una

importante función en la textura de su carne (Sato y cols., 1986; Hatae y cols., 1986),

por lo cual es de importancia correlacionar la variación de la actividad presentada por

esta enzima, en el músculo de Salmón coho, con otras propiedades del salmón

1 2 3 4 5 6

130

STD MM

85

43

32

18

38

(Latorre, 2007). Así, mediante un análisis de correlación de Pearson, se logró

correlacionar, para los individuos alimentados con cada dieta por separado, la actividad

gelatinásica con propiedades físicas y sensoriales del salmón (Anexo 36).

Para aquellas bandas provenientes de individuos alimentados con la Dieta I o

Control, cabe destacar una correlación positiva de la banda 2 con “gaping” (Figura 16).

El “gaping” corresponde al grado de separación espontánea de los miómeros en el

filete, lo cual, dificulta su posterior procesamiento y disminuye su valor comercial

(Skjervold y cols., 2002). El colágeno es el principal constituyente de la matriz la cual

es la responsable de la integridad del miocomata, láminas de colágeno (Nurshall,

1956), y las propiedades mecánicas del músculo (Delbarre-Ladrat y cols., 2006), por lo

tanto un aumento en la degradación del colágeno presente en el músculo de Salmón

coho, facilitaría la separación de los miómeros.

Figura 16: Correlación entre Actividad Gelatinásica de Banda 2 y Gaping en músculo de Salmón coho alimentado con la Dieta I o Control y

almacenado congelado (-18º C) por 18 meses

0

20

40

60

80

100

120

140

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Gaping

Inte

nsid

ad B

anda

2 (P

ixel

es/A

rea)

39

Espe y cols. (2004) reportaron resultados similares en Salmón atlántico, donde

el colágeno insoluble estuvo relacionado con filetes que presentaron “gaping” durante

el almacenamiento en hielo. Hallet y Bremner (1985) determinaron que el gaping

causado por la degradación de las fibras de colágeno entre la fibra muscular y el

miocomata, es el responsable por el ablandamiento del músculo de “hoki” (Macruronus

novaezelandiae).

Dentro de las bandas presentadas por los individuos alimentados con la Dieta I

o Control, también se presentó una correlación inversa entre las Bandas 1 y 2 con el

porcentaje de líquido perdido o “driping crudo” (Figura 17), que corresponde al exudado

de líquidos por goteo, en pescados que se descongelan (Einen y cols., 2002). Esto

podría significar que al aumentar el exudado la pérdida de enzimas en éste aumenta,

por lo que disminuiría la cantidad de éstas en el músculo y por ende su actividad.

Figura 17: Correlación entre Actividad Gelatinásica de Banda 1 y 2 y Porcentaje de Líquido Perdido (Driping crudo) en músculo de Salmón coho alimentado con

la Dieta I o control y almacenado congelado (-18º C) por 18 meses

0

20

40

60

80

100

120

140

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Porcentaje de Liquido perdido (Driping Crudo)

Inte

nsid

ad (P

ixel

es/A

rea)

Banda 1 Banda 2 Lineal (Banda 1) Lineal (Banda 2)

40

Para aquellas bandas provenientes de individuos alimentados con la Dieta II

(Exceso de Tocoferoles) no se encontró correlación con ninguno de los parámetros

analizados anteriormente (Anexo 36).

Como se muestra en la figura 18, la Banda 1 proveniente de individuos

alimentados con la Dieta III (Extracto de Romero) correlacionaron de forma directa con

las unidades formadoras de colonias (Anexo 36), en este sentido cabe destacar que

diversos microorganismos, especialmente Clostridium, producen colagenasas. Estas

enzimas difieren de las colagenasas animales porque degradan extensamente el

colágeno (Mahecha y cols., 2007)

Figura 18: Correlación entre Actividad Gelatinásica de Banda 1 y Nivel microbiológico (ufc) en músculo de Salmón coho alimentado con la Dieta III

(Extracto de Romero) almacenado y congelado (-18º C) por 18 meses

0

20

40

60

80

100

120

140

0 10 20 30 40 50 60 70

Recuento microbiológico (ufc)

Inte

nsid

ad B

anda

1 (P

ixel

es/A

rea)

Además la Banda 2 obtuvo una buena correlación con el porcentaje de agua

perdida, driping cocido (Figura 19), como se mencionó anteriormente, cuando este

41

índice correlacionó con AP, el aumento del “driping” se encuentra directamente

relacionado con la capacidad de retención de agua (Einen y cols.,2002).

Finalmente se correlacionaron los parámetros de AP, GSH – Px, MMP’s y peso

de los individuos entre sí. El análisis estadístico determinó que no existe correlación

alguna entre los parámetros en estudio, para músculo de Salmón coho alimentado con

cada una de las dietas de engorda en estudio (Anexo 37).

Figura 19: Correlación entre Actividad Gelatinásica de Banda 2 y Porcentaje de Líquido Perdido (Driping cocido) en músculo de Salmón coho alimentado con la

Dieta III (Extracto de romero) y almacenado congelado (-18º C) por 18 meses

115

120

125

130

135

140

145

115 120 125 130 135 140 145

Porcentaje de agua perdida (Driping cocido)

Inte

nsid

ad B

anda

2 (P

ixel

es/A

rea)

42

5. CONCLUSIONES Determinación de Actividad Proteolítica

Los valores de AP presentaron una alta desviación estándar, entre individuos

alimentados con la misma dieta de engorda dentro de un mismo tiempo de

almacenamiento, lo cual indicaría que este parámetro es muy variable entre individuos.

La AP para músculo de Salmón coho alimentado con la Dieta I o Control,

presentó diferencias en su comportamiento en el tiempo, siendo el sexto y noveno mes

de almacenamiento los que presentaron mayor actividad.

Estos valores presentaron una buena correlación directa con el porcentaje de

pérdida de agua de músculo sometido a cocción (driping cocido), por lo tanto el

aumento de la AP indica mayor pérdida de propiedades físico – químicas de las

proteínas musculares, como la capacidad de retención de agua.

La AP para músculo de Salmón coho alimentado con la Dieta II (Exceso de

Tocoferoles), no presentó diferencias en su comportamiento en el tiempo.

Estos valores no presentaron una buena correlación, directa o inversa, con

propiedades físicas y sensoriales del salmón.

La AP para músculo de Salmón coho alimentado con la Dieta III (Extracto de

Romero), presentó diferencias en su comportamiento en el tiempo, el noveno mes de

almacenamiento el que presentó mayor actividad.

Estos valores presentaron una buena correlación directa con RAM, expresado

como UFC/gramo, lo que indica presencia de microorganismos que liberan enzimas

microbianas que afectan las proteínas del músculo del salmón, o la enzima es liberada

como respuesta del individuo a la presencia del microorganismo.

Durante los seis primeros meses de almacenamiento congelado a -18º C, la AP

observada para las muestras de músculo de Salmón coho provenientes de las tres

dietas en estudio, no presentaron variación estadísticamente significativa (p > 0,05), lo

que indica que la adición de antioxidantes naturales no afecta este parámetro hasta el

sexto mes de almacenamiento.

La AP inicial para las muestras de músculo de Salmón coho provenientes de las

tres dietas en estudio, es menor al compararla con especies como Tollo silvestre y

Salmón atlántico, pero mayor si la comparamos con Pejegallo silvestre.

43

Determinación de Glutatión Peroxidasa Las muestras de Salmón coho, provenientes de individuos alimentados con tres

diferentes dietas de engorda y almacenados congelados por 18 meses, presentaron

actividad de la enzima GSH – Px durante el período de almacenamiento.

La actividad de la enzima GSH – Px para músculo de Salmón coho alimentado

con la Dieta I o Control, no presentó diferencias en su comportamiento en el tiempo.

Estos valores presentaron una buena correlación con el Índice de peróxidos, el

cual es un sustrato de la reacción, lo que indica que al aumentar éste la actividad

también aumenta.


con la Dieta II (Exceso de Tocoferoles), no presentó diferencias en su comportamiento

en el tiempo. Estos valores no presentaron una buena correlación con propiedades

físicas y sensoriales ni con parámetros de oxidación y calidad del salmón.


con la Dieta III (Extracto de Romero), presentó diferencias en su comportamiento en el

tiempo. Estos valores no presentaron una buena correlación con propiedades físicas y

sensoriales ni con parámetros de oxidación y calidad del salmón.

La actividad enzimática de la GSH – Px para las muestras de músculo de

Salmón coho provenientes de las tres dietas en estudio, no presentó diferencias

estadísticamente significativas en su comportamiento, a partir del noveno mes de

almacenamiento, lo cual indicaría que a partir de este mes los antioxidantes naturales

adicionados no favorecen ni retardan la actividad de ésta enzima.

Determinación de Metaloproteinasas Las muestras de Salmón coho, provenientes de individuos alimentados con tres

diferentes dietas de engorda y almacenadas congeladas por 18 meses, presentaron

actividad gelatinásica cercanas a 85 y 18 kD. Esta actividad no presentó diferencias en

su comportamiento con respecto a los individuos analizados durante todo el período de

almacenamiento.

La actividad de enzimas MMP’s cercana a 85 kD, no presentó diferencias en su

comportamiento con respecto a las tres dietas de engorda en estudio. Por otro lado, la

actividad de enzimas MMP’s cercana a 18 kD, presentó diferencias en su

44

comportamiento con respecto a las dietas de engorda, ya que en las muestras de

individuos alimentados con la Dieta II (Exceso de Tocoferoles), no se observó actividad

gelatinásica durante los seis primeros meses de almacenamiento congelado.

La actividad de enzima MMP’s próxima a 18 kD, en muestras de individuos

alimentados con la Dieta I o Control, presentó una buena correlación con el “gaping”, lo

cual indica que al observarse aumento de actividad de esta enzima, aumenta también

el grado de separación espontánea de los miómeros en el filete.

La actividad de las enzimas MMP’s próxima a 85 kD y aquella cercana a 18 kD,

en muestras de individuos alimentados con la Dieta I o Control, presentó una buena

correlación inversa con el porcentaje de líquido perdido o “driping” crudo. Similar al

caso de la actividad de la enzima cercana a 18 kD, que correlacionó con “driping”

cocido, para las muestras de individuos alimentados con la Dieta III (Extracto de

Romero). Lo cual indicaría que al aumentar el exudado la perdida de enzimas en éste

aumenta.

La actividad de enzimas MMP’s, tanto cercana a 85 kD como a 18 kD, en

muestras de individuos alimentados con la Dieta II (Exceso de Tocoferoles) no

presentaron una buena correlación directa ni inversa con las propiedades físicas y

sensoriales del salmón.

La actividad de enzima MMP’s cercana a 85 kD, en muestras de individuos

alimentados con la Dieta III (Extracto de Romero), presentó una buena correlación con

las unidades formadoras de colonias, parámetro microbiológico, lo cual indica la

presencia de microorganismos que producen colagenasas, enzimas que degradan

extensamente el colágeno.

No se encontró correlación entre los parámetros de AP, GSH – Px, MMP’s y

peso de los individuos en estudio.

Finalmente al comparar las dietas adicionadas con antioxidantes naturales con

la Dieta I o Control, cabe destacar la existencia de diferencias entre las dietas al

determinar los parámetros de AP, GSH – Px Y MMP`s, durante el período de

almacenamiento.

- Al observar los parámetros de AP y GSH – Px, la Dieta I o Control podría ser

reemplazada por la Dieta II (Exceso de Tocoferoles) ya que los individuos alimentados

con estas dietas de engorda presentaron un comportamiento similar.

45

- Con respecto a la actividad de MMP’s, la Dieta I o Control podría ser reemplazada por

la Dieta III (Extracto de Romero) ya que los individuos alimentados con estas dietas de

engorda presentaron un comportamiento similar.

Debido a lo anterior se sugiere continuar el estudio para determinar la cantidad

de antioxidantes naturales y su concentración a adicionar en la dieta de engorda,

además de una dieta en la que se utilice tanto un exceso de Tocoferoles como extracto

de Romero para estudiar la sinergia de estos antioxidantes en los parámetros a

determinar.

46

6. BIBLIOGRAFÍA

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balanceado – Factores de calidad en harina de pescado y en los lípidos de alimento

para peces.” En: CRUZ, L.E., RICQUE, M. D., y MENDOZA, R. “Avances en Nutrición

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13 de noviembre 1996.” Universidad Autónoma de Nueva León, Monterrey, México.

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Cuerpo de Tesis · de salmón y la distribución de los productos exportados con un un 48% de Salmón coho congelado, 45% de trucha (91% congelado) y 7% de Salmón atlántico (96%

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