Crohn

La régulation positive de T-bet et la stimulation par l’interleukine 12 est essentiel pour l’induction d’une

immunopathologie médiée par Th1 dans la maladie de Crohn

Draoui Jihéne Saidi Nasreddine

T-bet upregulation and subsequent interleukin 12 stimulation are essential for induction of Th1 mediated immunopathology in Crohn’s disease

Plan

Introduction

Discussion

Résultats

Matériels et méthodes

La maladie de Crohn (MC) est une maladie inflammatoire chronique qui touche le tractus gastro-intestinal.

De nombreux éléments de preuve suggèrent qu’il y a une réponse immunitaire prédominante des lymphocytes T helper 1 (Th1) dans la maladie de Crohn (MC).

Une nouvelle facteur de transcription T-box a était découverte exprimé dans les cellules T (T-bet) qui posséde un rôle principle dans la régulation du développement de Th1.

Introduction

Objectif

Déterminer le rôle de T-bet et des

cytokines pro-inflammatoires dans

l'induction de réponses Th1 en MC

humaine et les différences dans les

réponses immunitaires entre MC et la

colite ulcéreuse (CU).

Matériel et méthodes

Patients et échantillons

Les 20 patients ont été tous soumis à des diagnostiques: Cliniques Radiographiques Endoscopiques Histologiques

Extraction d’ARN et PCR quantitative en temps réel

Extraction d’ARN total par le Kit RNeasy mini, c’est une Procédure rapide délivrant une ARN total de haute qualité en quelques minutes.

Le kit RNeasy Mini fournit une purification rapide de l'ARN de haute qualité à partir de cellules et de différents tissus vivants

• L'ADN complémentaire (ADNc) a été synthétisé en utilisant le premier système de synthèse de brin Super script pour la transcription inverse-PCR

• les bandes non spécifiques n'ont pas été détectés par analyse de courbe de fusion pour chaque jeu d'amorces

les ARNm transcrits de T-bet ont été normalisées avec les ARNm transcrits de β-actine et exprimés en unités arbitraires (UA)

Préparation: cellules mononucléées de la lamina propria (LPMCs) et cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC)

1. LPMCs ont été isolées à partir d'échantillons intestinaux

2. La muqueuse disséqué a été incubé dans une solution de calcium et de magnésium

3. La muqueuse a été ensuite mis en incubation ans un milieu contenant d'EDTA

4. Les lymphocytes intra-épithéliaux et les cellules épithéliales ont été retirés du tissu

5. les tissus contenant LPMCs ont été recueillies et incubées dans un milieu contenant de collagénase

6. La fraction a été sédimenté et les cellules centrifugé

7. Les PBMC ont été isolés par centrifugation à gradient de densité à partir d'échantillons de sang périphérique hépariné

8. LPMCs ou PBMC ont ensuite été séparées en cellules CD4 positives en utilisant MACS

La culture cellulaire

Permettent la différenciation des CD4 en

TH1

Milieu complet nécessaire a la division

cellulaire

Les AC permettent de différencié les CD4 des

autre cellules

Dosage immunoenzymatique (ELISA)

Les concentrations d'IFN-γ et l'IL-12 dans les surnageants de culture de LPMCs et PBMC (les cellules mononucléaires du sang périphérique) ont été mesurés par ELISA spécifique

les concentrations minimales: IL-12 et 7,8 pg / ml IFN-γ 25,6 pg / ml

Cytométrie en flux

• La cytométrie en flux est une technique de triage de particules en suspension dans un liquide selon plusieurs paramètres et à très grande vitesse.

• Elle consiste à analyser la fluorescence émises par chaque particule et trier les cellules

Utilisant des Ac anti IL-12Rb2 , l’intensité de fluorescence est analysé par FACScan sur les surfaces des cellules

Filtres optiques

extraction des protéines et western blot

Extraction de protéine totale

Les protéines totales ont été séparé sur un gel NuPAGE

Transférée par électrophorèse sur membrane

La membrane a été incubée avec antisérum de lapin anti-T-bet détecter la protéine T-bet

La membrane est ensuite éliminer par western blot de restauration avec un tampon d'extraction

Incubées avec des anticorps de souris anti-β-actine Ab

L'analyse densitométrique a été réalisée et l'expression T-bet a été ajusté à β-actine expression.

L'analyse statistique

Les différences statistiques ont été analysées en utilisant le test de Mann-Whitney.

Une valeur de p <0,05 était considérée comme significative.

Résultat

T-bet a été régulée positivement dans CD4 + des LPMCs Chez MC

Afin de clarifier la participation de T-bet en immunopathologie médié par Th1 dans la maladie de Crohn

Evaluation de l'expression de T-bet grâce à des ARNm obtenu à partir des CD4 + LPMCs des patients:

• 5 témoins normaux (NL)

• 10 patients atteints de la maladie de Crohn (MC)

• 10 patients atteints de la colite ulcéreuse (CU)

utilisant la PCR quantitative en temps réel

ARNm de T-bet obtenus à partir des

cellules CD4 + des LPMCs des

patients atteints de MC est élevé par

rapport à celui obtenu à partir de

patients atteints de CU et NL

1,59

0,41 0,48

Les niveaux des ARNm transcrits de T-bet ont été mesurées par RFLP et ajustés pour les ARNm transcrits de β-actine.

Protéine T-bet est également significative dans CD4 + des LPMCs des patients MC par rapport à ceux de patients atteints de CU et NL.

l’expression de T-bet n'était pas significativement différente entre les CU et NL à la fois au niveau de ARNm et de protéines.

88,5 12.7 4.1

L’expression de la protéine T-bet a été évaluée par western blot des patients MC ,CU et NL.

La production d'IFN-γ par LPMCs (cellules mononucléaires lamina propria) de patients atteints de MC est plus élevé que celle à partir de patients atteints de CU ou à partir de NL.

Cette production accrue d'IFN-γ et

correspond à l'augmentation de l'expression de

T-bet par LPMCs de patients atteints de MC.

Ces résultats indiquent que T-bet peut contribuer essentiellement à des réponses immunitaires de type Th1 en MC.

T-bet n'a pas contribué à une augmentation synergique de la production d'IFN-γ par la stimulation de l'IL-12 et IL-18

Pour déterminer quelles stimuli induisent T-bet en MC

Etudier les cytokines induisant Th1 telles que l'IL-12, qui est sécrétée par les macrophages activés et les cellules dendritiques via l'activation de la réponse immunitaire innée.

Mesurer la production d'IL-12 par LPMCs.

Bien que l'IL-12 ou d'IL-18 par eux-mêmes ont augmenté la production d'IFN-γ par LPMCs à partir de patients atteints de MC.

En combinaison un effet dramatique sur la production d'IFN-γ par les cellules

Examiner si l'IL-12 et / ou l'IL-18 pourrait réguler l'expression T-bet dans LPMCs de patients atteints de MC.

Une addition unique ou combinée de IL-12/IL-18 régule positivement et d’une manière significative l'expression T-bet.

L’expression de la proteine T-bet

Ces résultats montrent que l'augmentation synergique de la production d'IFN-γ par l'IL-12 et IL-18 chez des patients atteints MC n'a pas besoin de plus d’une activation de T-bet

Ce qui suggère une voie indépendante de T-bet.

L'induction de T-bet via la voie de signalisation médié par les récepteurs des lymphocytes T (TCR) est nécessaire pour la production d'IFN-γ avant

la stimulation D’IL12

Hypothèse

La stimulation de TCR est importante pour l’induction de T-bet dans l’immunopathologie médiée par Th1 en maladie de crohn .

Utilisation des CD4 + des PBMC dans les expériences suivantes

CD4+ des

PBMC

Stimulation de

• anti-CD3

• CD28

avec la plaque d'IL-12

en présence ou en absence

La product

ion d'IFN-γ

L’expression de T-bet

Ont été analysés

après l’activation In

Vitro

• En présence d'IL-12 et sans stimulation du plaque anti-CD3

CD4 + des PBMC de patients qui portent la maladie de crohn produit peu IFN-γ

Sous les mêmes conditions Il y a pas augmentation de niveau d’ARNm ou de la protéine de T-bet chez les CU ou MC

Une stimulation d’anti-CD3 en absence d'IL-12 induit une grande quantité d'IFN-γ ainsi qu’une expression marqué de T-bet

68,5 ng / ml

Le niveau d’ induction de T-bet par stimulation d’anti-CD3 n'était pas significativement différente entre les CD4 + des PBMC des patients atteints de

⁻ MC⁻ CU⁻ NL

• En accord avec l'expression de l'ARNm, la protéine T-bet a été augmentée par la stimulation d’anti-CD3 sur CD4 + des PBMC des patients atteints de MC.

Augmentation de l’expression

• en parallèle avec l’ induction de T-bet par une stimulation anti-CD3

L'expression de surface de IL-12Rβ2 a été analysée par FACS.

IL-12Rβ2 a également été induite chez les CD4 + des PBMC et une stimulation supplémentaire par l'IL-12 a induit une plus grande quantité d'IFN-γ (62,2 ng /ml)

La costimulation de l'IL-12 n'a pas induit une régulation positive de T-bet, qui est en accord avec les données concernant LPMCs

Ces résultats indiquent que T-bet est induite à travers la stimulation du TCR avant la signalisation d'IL-12 pour une production améliorée d‘IFN-γ

T-bet peut non seulement lancer la production d'IFN-γ, mais aussi de contrôler la réactivité à l'IL-12 par la régulation positive de l'IL-12Rβ2

Discussion

T-bet a été proposé d'être le régulateur principal du développement de Th1 en fonction de son induction de l'IFN-γ et de la répression des cytokines de Th2.

T-bet a été fortement exprimé dans CD4 + des patients LPMCs MC par rapport à ceux de patients atteints de CU et NL. 

Une régulation positive de T-bet en CD4 + des LPMCs à partir du MC.

L'expression accrue de T-bet dans les MC était compatible avec une production accrue d'IFN-γ à partir de LPMCs MC.

T-bet jouer un rôle essentiel dans l'induction de réponses immunitaires de type Th1 en MC .

Qui régule l’augmentation de T-bet en MC?

L'induction de T-bet dans les cellules CD4 + des PBMC humaines a été médiée

par les anti-CD3, mais pas d'IL-12.

la stimulation antigénique était essentiel pour l'induction de T-bet.

L'induction de T-bet par anti-CD3 sur les CD4 + des PBMC n'était pas différente entre MC et la CU.

La stimulations antigéniques répétées étaient essentielles pour maintenir une forte expression T-bet. 

l’ augmentation de l'expression de T-bet n'a été observée que dans CD4 + des LPMCs de patients atteints de MC. 

Quel est alors le rôle de T-bet dans l'induction de l'immunopathologie médiée par Th1 en MC ?

IL-12 ne pouvait pas induire la production d'IFN-γ de CD4 + des

PBMC qui n'ont pas exprimé T-bet.

T-bet est nécessaire pour initier la production d'IFN-γ

CD4 + des PBMC activés ont également augmentés l'IL-12Rβ2 et ils ont répondu à l'IL-12 pour

une production supplémentaire de l'IFN-γ. 

T-bet est nécessaire pour pour réguler la réactivité de l'IL-12 par

une régulation positive d’IL-12Rβ2 dans MC