FACULTÉ DES SCIENCES DE MARSEILLE LABORATOIRE DE CHIMIE BACTÉRIENNE (C.N.R.S.) Contribution à l'étude du métabolisme du glucose chez THÈSE DE DOCTEUR-INGÉNIEUR (BIOCHIMIE) présentée par Maurice RAIMBAULT 1969 MEMBRES DU JURY MM. .i.-c, SENEZ. Président J. RICARD F. PICHINOTY Examinateurs Y. DOMMERGUES 1
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FACULTÉ DES SCIENCES DE MARSEILLE
LABORATOIRE DE CHIMIE BACTÉRIENNE (C.N.R.S.)
Contribution à l'étude dumétabolisme du glucose chez~ip6ntgee~ ~tackegi
THÈSE DE DOCTEUR-INGÉNIEUR (BIOCHIMIE)
présentée par
Maurice RAIMBAULT
1969
MEMBRES DU JURY
MM. .i.-c, SENEZ. Président
J. RICARD
F. PICHINOTY Examinateurs
Y. DOMMERGUES 1
UNIVERSI~ D'AIX-MARSEILLE
FACULTE DES SCIENCES DE MARSEILLE
Doyens honoraires: MM. MARCHAUD, CORROY, CHOUX.
Professeurs honoraires: MM. J. MARC IffiUD , C. PETIT, J. BOSLER, A. TIAN,L. MARGAIL"LAN, P. BENOIT, H. CABANNES, P. CHOUX,G. LIANDRAT, R. CERIGHELLI, C. CORROY, L. ROYERP. VINCENS INI •
Doyen 1 M. v. BODIOU Assesseur : M. A. GUILLEMONAT.
Secrétaire principal honoraire 1 M. H. LANFRANCHI.
Conseiller, chef des services administratifs: M. C. MOYNAULT.
Mécanique expérimentale des fluidesPhysique généraleBotaniqueChimie biologiqueBiologie généralePhysique industrielleAstronomieMécanique de l'atmosphère et météorologioChimie industrielleChimiePhysique expérimentaleBiologie végétaleP:jJ-'::':':' Cl....CMéthodes mathématiques de la physiqueChimieMathématiquesPhysiqueMathématiques appliquéesChimie des corps grasPsycho-physiologiePhysiquoPhysiqueMécanique rationnelle et appliquée
.../ ...
G. GOUVERNET Géologie appliquéeA. VISCONTI PhyGique théorique, BLANCHJ.RD Mathématiques généraleil.
Mécanique des fluidesZoologiePhysiologie animaleBiologie marinePhysiqueTechniques mathématiques de la physiqueBiologie animalePhysiquePhysiqueMathématiques appliquéesPhysique
. . ·1 · · ·
MM. Je .TRll.YNAIillF. PECAUT (Mme)J. HE:r.TNEQUINL. CAPELLAJC .M1I.IRES. GUEIr~RD (Mlle)e. FEUGE.A.SJ. CABANEG. RASIGNIS. COMBETH. GATIRON
, M. eADILHACA. PONSP. BILLARDM. BONNE1~U
H. PATINL. LAGARDE (Mlle)M. PIC RENOT (Mlle)M. SIMONM. EGOG. MAnc HIS -MOUmmF. HALBWACHSM. GILLETB. WAEGELLJP .nOGGEROJ. CIŒSPG. nAUZYL. SARDA111. BENA RROC HEH. TACHOIRETI. PE'T'ITM. HUGONe. ROMANA. GILLETG. RENUCCIE. VINCENTL. VICENTES. MARTINUZZIJ. MANUCEAUGuy R. GIHAUD
Chez !.~ le système synthétisant les acides gras est soluble et
comporte : une acétyl-transférase, une malonyl-transférase, un enzyme de conden
sation, une 8-céto-acyl-réductase, et une énoyl-hydrase. En outre, le système
comporte une protéine de transport des groupements acyles (ACP), à laquelle les
acyles intermédiaires sont attachés pendant tout le processus synth~tique. Le
point d'attache est de type thiolester et a été récemment identifié à un groupe
ment prosthétique 4'-phosphopantéthéine. Chez Clostridium kluyveri le système a
été résolu en deux composants. Par contre dans le cas de la levure il est consti
tué par une particule à fonctions mu1ti~~nzymatiques ayant un poids moléculaire
de Z 300 000.
VII - UTILISATION DU GLUCOSE RADIO-ACTIF
Les méthodes isotopiques utilisées pour estimer l'importance des diffé
rentes voies du métabolisme du glucose se répartissent en deux catégories. Les
unes sont basées sur la mesure de la radio-activité du COZ métabolique, les autres
sur l'isolement d'intermédiaires ou de produits finaux du catabolisme du glucose
(glycéro1, lactate, pyruvate ••• ) dont on détermine la radio-activité spécifique.
Les méthodes au COZ ont l'avantage d'être plus simples. La technique
la plus utilisée consiste à employer le glucose-1-C14• Dans ce cas, en effet, le
COz radioactif qui est produit provient uniquement de la voie des pentose
phosphates. Wang et coll. (37) ont montré que le pourcentage de glucose oxydé
par cette voie est donné par la formule :
14
G - G1 G 6 x 100
T
où Gl et G6 représentent respectivement les radio-activités récupérées sous forme
de cO2 à partir du glucose-l-C14 et du glucose-6-C14 ; GT
étant la radio-activité
totale du glucose consommé. Cette technique présente cependant des inconvénients.
En pratique, il faut manipuler de petites quantités de l4c02 , d'où des difficultés
dues au cO2 atmosphérique et la nécessité d'ajouter du carbonate non radio-actif
comme entraineur pour avoir des quantités de CO2 manipulables. D'autre part cette
méthode n'est ,applicable que dans certaines conditions bien précises: le glucose
ne doit pas être utilisé par des voies "non triose-phosphates", et le dégagement
de CO2 provenant du carbone 6 doit être faible, ce qui exige que le cycle de Krebs
ne fonctionne pas. Il s'agit donc d'une méthode ayant un champ d'application
limité, susceptible de fournir surtout des renseignements qualitatifs.
En ce qui concerne la seconde catégorie de méthodes, l'isolement des
composés est plus laborieux, mais elles présentent des avantages. En effet, on
effectue des mesures de radio-activités spécifiques, et par conséquent, la perte
de matériel au cours de la purification n'est pas gênante. Par ailleurs, il est
possible de soumettre les substances isolées à la dégradation et d'obtenir de
précieux renseignements supplémentaires. Le principe général de ce type de méthode
est d'isoler un intermédiaire, comme le glycérol ou le pyruvate, représentatif
des triose-phosphates, à partir de glucose spécifiquement marqué en position
l, 2, ou 6. La radio-activité spécifique de ce produit est comparée à celle du
glucose utilisé comme précurseur. Grâce à l'établissement de graphiques théoriques
préalables il est alors possible de déduire la part prise par chacune des voies
du métabolisme.
La principale difficulté rencontrée a été de trouver un procédé de
calcul théorique tenant compte du recyclage des carbones 2 et 3 du glucose dans
le cycle des pentose-phosphates. Dawes et Holms (6) ont calculé, pour des pour
centages donnés du cycle des pentose-phosphates, le pourcentage apparent de molé
cules de triose-phosphates (donc de pyruvate) portant le marquage ; ils ont ainsi
établi des graphiques théoriques à partir de ces données pour le glucose-l-C1 4,
_2_c14 et _6_c14 utilisés comme précurseurs (figure 6). Notons ici que le pour
centage de participation du cycle des pentose-phosphates est exprimé en pourcen
tage d'activité par rapport à la glycolyse, et non pas en métabolisme total; en
effet le résultat représente le nombre de molécules de glucose qui sont oxydées
15
.:
T---- --- --,1
1
l11
1l
Glucose-2-C14
Glucose _6_C14
Q,I 50k---.-------TCl
g 40E"Ë30
~ 20-6 10+'L.
&. 50t---i-......=;;:;:;t:::~-+--+---~
~ 40c>2 30>.Q. 20QI"0
U1 10QI
...J
~100r-----r----+-----+-----+---~'QI...JE90
Q,I 80"C
~ 70QIL.
~600-c 50 __l~_~ l _
;!!. 20 40 60 80 100-/0 de molécules de glucose oxydées par
le cycLe des pentose-phosphates
Figure 6 - Relation entre le pourcentage apparent de molécules de pyruvate portant
le marquage et le pourcentage de molécules de glucose oxydées par le
cycle des pentose-phosphates~Cas où l'hexose-phosphate régénéré par
le cycle est dégradé dans les mêmes proportions que l'hexose initial
par le cycle des pentose-phosphates et la glycolyse.
16
par cette voie, mais un tiers seulement fournira du pyruvate et du CO2
, le reste
étant recyclé. Cette technique n'est applicable que dans le cas où il n'y a pas
de voies "non triose-phosphates" actives. Il faut en effet supposer que tout le
glucose est métabolisé par le cycle des pentose-phosphates et la glycolyse. En
outre, chez les organismes où il y a une dilution endogène du pyruvate, il est
plus précis d'utiliser des rapports, à partir de deux sucres, qui éliminent ce
facteur.
Pour. surmonter les précédentes difficultés, Katz et Wood (17) ont pro
posé une méthode générale d'estimation des différentes voies du métabolisme du
glucose. A la différence de la technique de Dawes et Holms, les calculs sont
effectués par rapport au métabolisme total. Ils donnent donc les proportions de
glucose réellement métabolisé par chacune des voies.
Voici comment sont effectués les calculs lorsque l'on isole le pyruvate.
Soit Rl , R2 et R6 les radio-activités spécifiques molaires relatives comparées14 14 14respectivement au glucose-l-C ,-2-C ,et -6-C • Le pourcentage de glucose-6-P
total métabolisé par le cycle des pentose-phosphates est déterminé à partir du
rapport Rl /R2 grâce à une courbetthéorique calculée (figure 7). La valeur obtenue
(PC) nous permet d'apprécier l'importance du recyclage:
100Q • 100 + 2 PC
Dans une seconde étape, on détermine la fraction de triose-phosphates formés par
la glycolyse :
REM'. 1
Q x R6
et par le shunt: PC' • 1 - EM'.
Le rapport EM'/PC' est égal au rapport Etl/PC. Connaissant déjà PC, on
peut calculer EM (fraction du glucose total transformé en pyruvate par la gly
colyse). Enf in la frac tion du glucose métabo1isé par les voies "non triose
phosphates" (NTP) est obtenue par différence: NTP • 1 - (EH + PC).
Comme l'ont fait remarquer Katz et Wood U7), dans le cas où il existe
des voies "non triose-phosphates", si on utilise la méthode d'estimation de
Dawes et Holms, seule la valeur obtenue à partir du glucose-6-c14 est valable
le résultat représente alors le pourcentage d'activité du shunt par rapport à
17
0,80.60,40.2
20
~100 .----·----.-----r------ --1- -- -- --. - .o
~ 1
8°111
1
60 r-i1
1
L
Figure 7 - Rapport des radio-activités dans les dérivés des triose-phosphates en
fonction du pourcentage de glucose-6-P métabolisé par le cycle des
pentose-phosphates. Rt et R2 • radio-activités spécifiques molaires
du dérivé triose-phosphate comparées respectivement au glucose-l-c1 4
et _2-c14 utilisés comme précurseurs,
18
la glycolyse. En effet, le carbone 6 du glucose n'est pas affecté par le recyclage
Il est possible de passer des résultats de Katz et Wood exprimés en
termes de glucose réellement métabolisé, aux résultats de Dawes et Halms exprimés
en pourcentages d'activité des différentes voies. Soit PC, EM, et NTP les résul
tats exprimés comme dans le premier cas et pc, em, et ntp les résultats exprimés
comme dans le second cas.
PC • 100 nombre de molécules de glucose dégradées par le shuntx nombre de molécules de glucose dégradées par le shunt
+ nombre de molécules dégradées par les autres voies
pC/3donc : PC • pc/3 + (100 _ pc) x 100
Par un calcul algébrique simple on trouve
_
-.;;.30.;..0.;..,.,,;;P,.;;C~pc • 100 + 2 PC
D'autre part, EM/NTP • em/ntp, et em + ntp • 100 - pc.
Prenons un exemple pour illustrer la différence qui existe entre ces deux modes
d'expression. Supposons que 100 molécules de glucose entrent dans le "pool" des
hexose-phosphates. Si on raisonne en pourcentages d'activité, on dira par exem
ple, que 40 molécules passent par les voies "non triose-phosphates", 30 molécules
par la glycolyse et 30 molécules par le cycle des pentose-phosphates. Si au
contraire on considère les molécules de glucose réellement métabolisées, les
fractions seront différentes, car à partir des 30 molécules qui passent par le
cycle des pentose-phosphates, la seront transformées en triose-pho~phates et CO2,
le reste étant régénéré. Ces 20 molécules d'hexose-phosphates qui arrivent dans
le "pool" seront redistribuées de la même façon que les 100 premières : 40 %
(8 molécules) vers les voies non-triose-phosphates, 30 % (6 molécules) vers la
glycolyse, et 30 % (6 molécules) vers le cycle des pentose-phosphates. 4 molécules
seront régénérées de nouveau, ceci jusqu'à l'épuisement total des 100 molécules
initiales. On trouve alors que: 40 + 8 + •• • 50 molécules ~e glucose sont
métabol isées par les voies "non triose-phosphates" : 30 + 6 + ••• • 37,5 molécu
les par la glycolyse, et seulement la + 2 + •• , • 12,5 molécules par le cycle
des pentose-phosphates. Sur la figure 8 les deux modes d'expression des résultats
sont comparés synoptiquement.
~recycLage
cycLe despentose - phosphates
(30%)
~1pyruvate 1
125 moLécuLes
1GLUCOSE 1
glycoLyse(30%)
l1pyruvate 1
37,5 molécules
voies "non
triose - phosphates"
(40%)
~1poLysaccharides 1
50 molécules
19
~ .. ~~_~~_I
Figurl 8 ~ COmparaison des deux modes d'expression de la participation des
différentes voies au métabolisme du glucose.
20
On doit effectuer les estimations des différentes voies en termes de
métabolisme total, mais il est intéressant de pouvoir aussi les exprimer en
pourcentages d'activité. En effet, dans le premier cas les résultats traduisent.
le bilan global du métabolisme du glucose, tandis que dans le second cas ils
représentent mieux les activités enzymatiques et l'importance relative des diffé
rentes voies dans le métabolisme intermédiaire.
21
CHAPITRE II
MATERIEL ET METHODES
l - ORGANIS}ŒS ET CULTURES
Nous avons utilisé Lipomwces starkeyi C 79 (M. Dommergues, Centre de
Pédologie Biologique, C.N.R.S., Nancy) et Saccharomyces cerevisiae 59 RL
(M. Sloni~ki, Centre de Génétique }wléculaire, C.N.R.S., Gif-sur-Yvette). Ces
deux organismes sont conservés sur gélose nutritive inclinée contenant du glucose
et de l'extrait de levure.
Lors de l'étude de la croissance et de l'accumulation de produits inter
médiaires, 1. starkeyi a été cultivé en milieu l~quide ayant la composition
suivante (milieu AB) : KH2P04 : 1 g ; Na2HP04.l2 1120 : 0,3 g ; MgS04.7 H20 : 0,1 i
CaC1 2 : 0,1 g ; FeS04 : 0,01 g ; MnS04 : 0,002 g ; Molybdate de Na : 0,0001 g. LeI
cultures carencées en azote, contiennent du glucose (8 g/l) ou du mannitol
(10 g/l) mais d'aliment azoté. On ajoute, aux cultures non carencées, 10 ml d'une
solution tamponnée de phosphates mono- et diammoniques ; cette solution est pré
parée en mélangeant 7,8 g de NH4H2P04 et 1,75 g de (NH4)2HP04 pour 100 ml d'eau.
Le pH est de 5,7 dans le premier cas, et de 6 dans le second. Les fioles à toxi
nes contenant 0,5 1 de milieu sont agitées à 32°.
Dans tous les autres cas, les cultures ont été faites en milieu liquide
ayant la composition suivante (milieu C) : KH2P04 : 7 g ; Na2HP04.l2 U20 : 1,2 g
MgS040 7 H20 : 0,2 g ; NaCl : 0,1 g ; NH4Cl : 2,5 g ; eau du canal, 100 ml ; eau
distillée : 900 ml. Le pH de ce milieu est de 5,5. On ajoute en plus la source
de carbone: glucose (8 g/l) ou mannitol (10 g/l), et dans le cas de i. cerevisia.
2 g/l d'extrait de levure Difco. Les fioles à toxines contenant 0,5 1 de milieu
sont agitées à 32° ; l'incubation est arrêtée juste avant la fin de la croissance
(60 heures pour 1. starkeyi et 16 heures pour i. cerevisiae).
II - PREPARATION DES SURNAGEANTS DE CULTURES ET DES EXTRAITS
Le surnageant est séparé des cellules par centrifugation à 4 000 tours/I
22
pendant 20 minutes • les cellules sont remises en suspension dans un tampon phos
phates M/15 pH • 6, puis lavées 2 fois. Elles peuvent alors être utilisées pour
la préparation des suspensions cellulaires ou des extraits enzymatiques. Dans ce
dernier cas on fait une suspension dense. dans le tampon, que l'on traite à la2presse de French exerçant une pression de 1 200 Kg/cm. Dans ces conditions 50 %
des cellules de levure sont détruites. On centrifuge ensuite à 16 000 tours/min.
dans une machine Servall réfrigérée, pendant 20 minutes, afin d'éliminer les
débris cellulaires. le surnageant, qui constitue l'extrait brut, est utilisé
pour les mesures d'activités enzymatiquese
III - METHODES EMPLOYEES POUR DETEIDIINER LES BILANS ET LES RENDE~ŒNTS
a) Croissance des levures
Elle est mesurée par opacimétrie à 450 m~ (spectrophotomètre Jean et
Constant) dans une cuve ayant 1 cm de trajet optique, et en se référant à une
courbe d'étalonnage densité/poids sec. Les masses cellulaires seront toujours
exprimées en poids sec.
b) Dosage du glucose
Il est dosé par la technique colorimétrique de Park et Johnson (27).
c) Dosage des acides volatils
Après avoir été acidifié jusqu'à pH • 1,7 par l'acide tartrique, le
surnageant de la culture est placé dans un appareil d'entratnement à la vapeure
On mesure l'acidité du distillat recueilli (6 fois le volume de la solution) par
NaOH N/50 en présence de phénol-phtaléinee
Voici comment est effectuée l'identification des acides volatils. Le
distillat, recueilli en l'absence d'indicateur coloré, est fortement alcalinisé
puis évaporé jusqu'à un très faible volume. On effectue alors une chromatographie
de partage sur gel de silice Mallinckrote en employant comme solvant d'élution
un mélange butanol tertiaire/chloroforme (8 : 92 v/v). La colonne est préparée
selon le procédé de Bové et Raveux (3). On dose l'acidité des fractio~s recueil
lies (4 ml) avec NaOH N/20 en présence d'indicateur. On trace la courbe d'élution
23
et on la compare à celle obtenue à partir d'un mélange témoin d'acides acétique
et formique.
d) Dosage de l'acide glucuronique
Cet acide est dosé par la méthode colorimétrique au carbazole (1). On SE
sert des surnageants de cultures sur mannitol j en effet, contrairement à ce
polyol, le glucose interfère dans ce dosage. Nous avons pu cependant doser l'acidE
glucuronique dans des cultures sur glucose en fin de croissance lorsque l'aliment
carboné est épuisé. Nous avons comparé le spectre d'absorption donné par l'acide
glucuronique témoin à celui de notre échantillon, après réaction avec le carbazolE
Il faut noter que cette méthode a l'avantage de doser tout l'acide glucuronique
présent dans le milieu, qu'il soit sous forme libre ou conjuguée dans les
polysaccharides.
e) Dosage du pyruvate
Après précipitation des protéines par i'acide trichloracétique à 10 X,
l'acide pyruvique est dosé directement dans le milieu par la réaction colorée
que donne sa 2,4-dinitrophénylhydrazone en milieu alcalin (35).
IV - DOSAGE DES ENZYMES
a) ~mnnitol-déshydrogénase
Nous avons utilisé la méthode spcctrophotométrique de Edmundowicz et
Wriston (10) ; cuve de 1 cm ; composition des systèmes : tampon tris 0,05 M
pH • 8: 2,5 (ou 2,4) ml ; extrait: 0»2 ml ; NAD, NADP, NADH2 ou NADPH2 0,01 M
0,1 ml ; MgC1 2 0,1 M : 0,1 ml ; fructose 0,1 M : 0,1 ml ou mannitol 0,5 M : 0.2 ml
Température ambiante. Les activités enzymatiques ont été mesurées dans le sens de
la réduction du fructose avec le NADPH2 ou le NADH2 et dans le sens de la déshydro
génation du mannitol avec le NADP ou le NAD.
b) Mannitol-l-phosphate-déshydrogénase
Nous avons employé la technique décrite par Wolf et Kaplan (39) avec
le fructose-6-P comme substrat et le NADPH2 ou le NADH2 comme donneurs
d'électrons.
24
c) Glucose-6-phosphate- et 6-phosphogluconate-déshydrogénases
Nous avons employé la méthode de Komberg et coll. (20). Nous avons
utilisé comme substrats le glucose-6-P et le 6-P-g1uconate respectivement dans le
cas de la glucose-6-phosphate-déshydrogénase et de la 6-phosphog1uconate-déshy
drogénase. Dans les deux cas le NADP est l'accepteur d'électrons. Pour la mesure
de l'activité du premier enzyme, la vitesse de la réaction est calculée en utili
sant la variation de la densité optique pendant les 30 premières secondes, pour
éviter l'interférence du second enzyme.
d) Hexokinase, fructokinase
Hexokinase : On suit la vitesse de réduction du NADP en mesurant la
densité optique à 340 m~. On opère en présence d'un excès de glucose-6-phosphate
déshydrogénase. le glucose-6-P formé par l'hexokinase est oxydé aux dépens.;du
NADP. Dans nos conditions expérimentales, la vitesse de réaction est proportion
nelle à la concentration d'hexokinase.
Le mélange réactionnel a la composition suivante tampon tris l M
pH • 8,: 1,6 ml • 1~C12 0,1 M : 0,75 ml ; extrait: 0,1 ml glucose-6-phosphate
déshydrogénase 10 unités/ml : 0,1 ml ; NADP 0,01 M : 0,1 ml • ATP 0,3 M : 0,1 ml ;
La vitesse de la réaction est mesurée, par la méthode de De La Haba et Racker (7).
en dosant la glycéra1déhyde-3-P à mesure de sa formation. Nous avons utilisé le
ribose-5-P comme substrat et non pas le mélange de xy1ose-5-P et de ribose-5-P.
Ici le mélange de ces deux produits est obtenu grâce à l'action des deux isomé
rases des pentose-phosphates. Par cette modification nous avons la preuve de la
présence de ces deux enzymes et de la transcéto1ase dans les extraits actifs.
Nous ne pouvons pas affirmer que la transcéto1ase est le facteur limitant. Toute
fois. les isomérases sont en général beaucoup plus actives que cet enzyme. De
toute façon, l'activité obtenue est caractéristique de la partie non oxydative
du cycle des pentose-phosphates.
i) 6-phosphog1uconate-déshxdrase et 2-céto-3-désoxX-6-phosphog1uconate
a1do1ase
Nous avons dosé simultanément ces deux enzymes, de la voie d'Entner
Doudoroff par la méthode de Kovachevich et Wood (21). Le pyruvate formé à partir
du 6-phosphog1uconate est dosé par la réaction colorée que donne sa 2.4-dinitro
phény1hydrazone en milieu alcalin (35) •
.j) Expression des résultats
Toutes les activités enzymatiques sont exprimées en ~mo1es de substrat
métabo1isé par minute et par mg d'azote. La teneur en azote des extraits est
évaluée par micro-Kje1dah1.
26
v - EXPERIENCES REALISEES AVEC LE GLUCOSE RADIO-ACTIF'
Nous avons utilisé du glucose spécifiquement marqué en positions 1. 2.
et 6. En outre. le glucose uniformément marqué (U_C14) a été utilisé comme témoin
pour l'estimation de la dilution due au métabolisme endogène.
a) Méthode de comptage
Les mesures de radio-activité sont effectuées dans un compteur à scin
tillations (Nuclear Chicago). en utilisant un liquide ayant la composition sui
vante (liquide de Bray) : naphtalène : 50 g ; PPO : 4 g ; POPOP : 0.2 g ; méthanol
absolu : 100 ml ; éthylène glycol; 20 ml ; dioxane : quantité nécessaire pour
compléter le volume à 1 000 ml. Ce liquide a l'avantage de rendre possible les
mesures de radio-activité à partir d'échantillons en solution aqueuse. Suivant
son activité, on utilise de 0.05 à 0.3 ml d'échantillon. puis on complète le
volume à 14 ml avec le liquide de Bray.
En utilisant des standard de contenu radio-actif en désintégrations par
minute (d.p.m.) connu et ayant des "quenching" différents. nous avons pu établir
une courbe d'étalonnage de l'appareil. donnant le rapport c.p.m./d.p.m. en fonctioD
du rapport B/A. Lors d'une mesure effectuée sur un échantillon. l'appareil nous
donne le nombre de coups par minute (c.p.m.) et le rapport B/A • nous pouvons
donc en déduire le nombre de d.p.m. Les radio-activités spécifiques seront tou
jours exprimées en d.p.m./umole.
b) Mesure de la radio-activité spécifique du pyruvate
Extraction du pyruvate : L'acide pyruvique est extrait sous forme de
sa 2.4-dinitrophénylhydrazone suivant la technique de White et Wang (38). Le
résidu obtenu à partir de l'échantillon initial (18 ml) est dissous dans 5 ml de
NaOH 0.01 N. Pour contrôler la pureté du produit isolé. on compare son spectre
en milieu alcalin à celui de la 2.4-dinitrophénylhydrazone préparée à partir de
l'acide pyruvique pur. Ce produit sert également à établir une courbe d'étalon
nage pour le dosage colorimétrique en milieu alcalin d'une solution de 2.4-dini
trophénylhydrazone de l'acide pyruvique. Ce dosage nous permet de connattre la
concentration du dérivé du pyruvate dans nos échantillons. Grâce à la mesure de
la radio-activité de ceux-ci. on peut calculer la radio-activité spécifique de la
2.4-dinitrophénylhydrazone qui est la même que celle de l'acide pyruvique.
27
Corrections: Comme l'ont fait remarquer Dawes et Holms (6), une correc
tion est nécessaire en raison de l'échange du groupement carboxyle du pyruvate
avec le CO2 atmosphérique par le mécanisme de Wood et Werkman. En principe. dans
le cas du glucose-l-C14 et _6_C14 on ne doit pas trouver de radio-activité dans
le -COOH du pyruvate ; celle que l'on mesurera sera due à la fixation du l4C02produit métaboliquement. et l'on devra donc la soustraire. Par contre, dans le
cas du glucose-U-C14• la perte de radio-activité dans le carbone 1 du pyruvate
par rapport aux carbones 2 et 3 est due à la fixation du CO2 atmosphérique. Il
n'est pas possible d'effectuer de correction pour le pyruvate provenant du14glucose-2-C ,car le fonctionnement simultané du cycle des pentose-phosphates
14et de la glycolyse peut entraîner la formation de pyruvate-l-C ; on suppose
alors que le gain et la perte s'équilibrent.
Pour effectuer ces corrections on prélève une fraction de l'échantillon
de radio-activité connue, que l'on soumet à la décarboxylation dans des coupes
de Warburg en présence de sulfate cérique selon la technique de Meister (25). Le
CO2 provenant du -COOH du pyruvate est absorbé par NaOH 2 N. récupe~e et sa
radio-activité mesurée. On en déduit le pourcentage de radio-activité contenu
dans les carbones 2 et 3 du pyruvate. A partir de ces valeurs on calcule les
radio-activités spécifiques corrigées du pyruvate en appliquant les hypothèses
énoncées ci-dessus.
c) Radio-activités spécifiques comparées au glucose
Elles sont calculées en faisant le rapport de la radio-activité spéci
fique corrigée du pyruvate sur la radio-activité spécifique du glucose utilisé
comme précurseur. C'est ce rapport que nous avons appelé R dans le premier cha
pitre. au paragraphe 7. A partir de ces différents rapports. on calcule le pour
centage de participation des différentes voies du métabolisme total du glucose
suivant le procédé de Katz et Wood (page:'16).
Pour pouvoir utiliser la méthode d'estimation de Dawes et Holms
(page 14). il faut effectuer une correction supplémentaire due à la dilution du
pyruvate par le métabolisme endogène de la cellule. La valeur de cette dilution
est estimée grâce à l'emploi du glucose-u-c14 • En effet. s'il n'y a pas de
dilution le rapport est égal à 0.5. puisque tout le pyruvate provenant du glucose
U_c14 est marqué mais ne contient que 3 atomes de carbone par molécule au lieu
de 6. La valeur de la dilution endogène est représentée par le facteur par lequel
28
il faut multiplier la valeur observée pour obtenir 0,5. La dilution endogène
étant supposée avoir la même importance quel que soit le marquage dans le
glucose, on utilise le même facteur correctif dans le cas du glucose l, 2 et
6_C14 • En multipliant le résultat par 100 on obtient ce que Dawes et Holms ont
appelé le pourcentage de molécules de pyruvate portant le marquage, et qui nous
per~t d'estimer le pourcentage d'activité du cycle des pentose-phosphates.
29
CHAPITRE III
CROISSANCE ET RESPIRATION
1 - ETUDE CYTOLOGIQUE
Nous avons mis en évidence les lipides intracellulaires en les colorant
au noir Soudan. Cette coloration a été faite sur filtre millipore et non sur une
suspension fixée sur lame afin d'éviter l'altération des cellules. Après avoir
été traitées, les cellules retenues par le filtre sont remises en suspension dans
un peu d'eau j on ajoute ensuite quelques gouttes d'encre de Chine et l'on examine
entre lame et lamelle. L'encre de Chine fournit un fond sombre sur lequel les
levures se détachent parfaitement. On peut ainsi.observer les capsules qui
autrement seraient invisibles au microscope optique.
Nous avons examiné des cellules provenant de cultures sur milieu
liquide glucosé carencé ou non en azote. Dans le cas des cultures avec chlorure
d'ammonium, les cellules sont habituellement groupées par paires, contiennent
relativement peu d'inclusions lipidiques et possèdent une capsule très développée
(photographie nO 1). Par contre les cellules provenant de cultures carencées en
azote sont remplies de globules gras et présentent une capsule très petite
(photographie nO 2).
Les observations précédentes confirment celles de Starkey en ce qui
concerne l'influence de l'ion ammonium sur le contenu lipidique de~. starkeyi
(33).
II - TAUX DE CROISSANCE
Nous avons déterminé le taux de croissance. Pour cela nous avons effec
tué des cultures de ~. starkeyi sur un milieu minéral AB auquel nous avons ajouté,
soit du glucose, soit du mannitol pour les cultures carencées en azote, et en plus
du phosphate d'ammonium pour les cultures non carencées. Nous avons également
fait des cultures contenant en plus de l'extrait de levure. Nous avons suivi les
30
(1 )
(2)
Planche 1 - Cellules de 1. starkeyi cultivé sur milieu liquide glucosé.
Photographie nO 1 : milieu non carencé en azote t âge des cultures
60 heures.
Photographie nO 2 : milieu carencé en azote t âge des cultures
90·heures.
31
variations de la densité optique et du pH de chaque culture. Grâce à une courbe
d'étalonnage: densité/poids sec, nous avons pu suivre les variations de la masse
de levure produite.
On obtient des résultats comparables avec le glucose et le mannitol
comme source de carbone, même lorsque le milieu contient de l'extrait de levure.
Par contre, les résultats diffèrent suivant que le milieu contient ou ne contient
pas de source d'azote (figure 9). En présence d'ammonium, la phase exponentielle
dure 66 heures environ avec un milieu contenant a g/l de glucose. D'autre part
nous observons une forte acidification du milieu dont le pH passe de 6 à 2,6.
1. starkeyi n'exige aucun facteur de croissance, puisque d'une part
elle pousse sur milieu synthétique et d'autre part son taux de croissance n'est
pas accru par la présence de l'extrait de levure. Par contre, une source d'azote
assimilable est indispensable à son développement (figure 9), ce qui confirme
l'opinion de Starkey (33) suivant laquelle cet organisme ne fixe pas l'azote
atmosphérique. Cependant, le pH des cultures sans azote fixe (courbe 4) diminue
sensiblement, ce qui indique que la levure oxyde ·quand même le glucose en acides.
Nous avons calculé le temps de génération des cultures sur ammonium
en traçant les courbes de croissance sur papier semi-logarithmique. Le taux de
croissance (nombre de générations à l'heure) est égal à l'inverse du temps de
génération. La pente des droites obtenues ne varie pas sensiblement suivant la
source de carbone utilisée : nous obtenons des temps de génération de 6,9 heures
sur mannitol, 7 heures sur glucose, et 7,2 heures sur glucose plus extrait de
levure, donc une moyenne de 7 heures environ qui représente un taux de croissance
de 0,143 génération à l'heure.
Nous avons dosé le glucose et mesuré la densité optique dans les cul
tures. A partir des résultats obtenus on trace la courbe donnant la masse de
levure en fonction de la quantité de glucose consommé (figure 10). La pente de la
droite obtenue nous permet de calculer le rendement pondéral de la croissance.
Pour une culture sur glucose avec ammonium, ce rendement est de 28 % ; pour une
culture carencée en azote il n'est que de 3 %environ.
sante pour compléter le volume à 3 ml ; KOH à 20 7.. 0.1 ml (puits central)
phase gazeuse. air. La température est de 32°. Un système ne contenant pas de
substrat est utilisé pour mesurer la respiration endogène.
Comme l'ont noté Heick et Stewart (12) pour ~. lipofer. la consommation
d'oxygène devient linéaire 20 à 30 minutes après le temps zéro dans le cas du
glucose. 60 minutes après le temps zéro dans le cas des autres sources de car
bone. En opérant toujours dans les mêmes conditions et en calculant les - Qo
entre 60 et 90 minutes. la reproductibilité est satisfaisante comme nous le 2
montre le Tableau l qui donne les résultats obtenus lors de deux expériences
effectuées avec des cellules provenant de cultures différentes. Les sources de
carbone donnant les activités respiratoires les plus élevées sont le glucose.
l'acétate, le xylose. le mannitol et le succinate ; par contre nous n'avons pas
observé d'oxydation du pyruvate et du lactate.
TABLEAU 1.- Mesure de la respiration de l'oxygène en présence
de différents métabolites carbonés par 1. starkeyi
Il
Substrat Activités respiratoires (- QO )2
Exp. nO 1 Exp. nO 2 Moyenne
Endogène 5,6 5,7 5,65.:!:. 0,05
Glucose 31,2 32,9 32,0 .:!:. 0,8
Mannitol 12,8 15,6 ,14,2 .:!:. 1,4
Citrate 3,2 1,8 2,5.:!:. 0,7
Succinate 15,2 13,6 14,4 .:!:. 0,8
Acétate 21,6 24,3 22,9 .:!:. 1,3
Pyruvate 2,0 2,0 2,O.:!:. 0,0
Lactate 1,6 1,4 1,5 .:!:. 0,1
Xy10se 17,6 17,1 17,4 .:!:. 0,3
Les valeurs des - Q02 pour les différents substrats ont
été corrigées pour la respiration endogène.
Les - Q02 sont exprimés en ~1 d'02 consommé par heure
et par mg (poids sec) de levure.•
35
36
b) Action des inhibiteurs
Nous avons recherché si la respiration de l'oxygène en présence de
glucose est sensible à l'azothydrate de sodium. à l'arsénite et au fluoracétate.
Nous avons employé la même technique que précédemment; l'inhibiteur est placé
dans la coupe avec les cellules. Nous avons également étudié l'action de ces
inhibiteurs sur la respiration endogène. Pour cela on s'est servi de systèmes
ne contenant pas de glucose. Le Tableau II présente les résultats obtenus. La
respiration endogène est fortement inhibée par l'azothydrate et le fluoracétate ;
par contre elle est insensible à l'arsénite. La respiration mesurée en présence
de glucose est également fortement inhibée par l'azothydrate. mais. contrairement
à la respiration endogène. elle est insensible au fluoracétate et fortement
inhibée en présence d'arsénite.
Le fait que la respiration endogène soit fortement inhibée par le
fluoracétate semble indiquer que le métabolisme endogène emprunte surtout le~
cycle de Krebs pour oxyder les substances de réserve ; ceci est vraisemblable.-puisque les principales réserves cellulaires sont constituées par des acides gras
dont l'oxydation est liée à cette voie métabolique. Il est également normal que
la respiration en présence de glucose soit inhibée par l'arsénite qui empêche
la décarboxylation oxydative du pyruvate en acétyl-CoA. et entraîne l'accumula
tion de pyruvate. Le fait que la respiration en présence de glucose soit insen
sible au fluoracétate peut s'expliquer de la manière suivante: cet inhibiteur
bloque le fonctionnement du cycle de Krebs. mais laisse inchangée l'oxydation
du NADH2 ou du NADPH2 produits en dehors de celui-ci.
v - CONCLUSIONS
Nous n'avons pas décelé de besoin en facteur de croissance pour
~. starkeyi C 79. Le taux de croissance est faible : 0.143 génération par heure.
Le rendement de croissance est également bas : 28 %. Ce dernier paramètre est
sensiblement le même avec le glucose et le mannitol. Ce sont le glucose. l'acé
tate. le xylose. le mannitol et le succinate qui fournissent les activités
respiratoires les plus élevées ; par contre. avec le lactate. le pyruvate et le
citrate les valeurs obtenues sont très faibles. Ceci est peut-être lié à un
37
TABLEAU II.- Pourcentages d'inhibition de la respiration de l'oxygène
chez,b.. starkeyi.
Pourcen tage d'inhibitionInhibiteur
Glucose Endogène
Azothydrato de Na •••• 4 mH 81 61
Arsénite de Na •••• 2 mU 46 0
Arsénite de Na •••• 4 mM 64 0
Fluoracétate ••••O.8 mM 0 25.5
Fluoracétate •••• l mM 0 50
Chaque résultat représente la moyenne d'au moins deux détermi
nations faites avec des cellules provenant de cultures différentes.
38.
problème de perméabilité cellulaire. La respiration endogène correspond vraisem
blablement à l'utilisation des réserves lipidiques, et en particulier à l'oxyda
tion des acides gras. Nous ne savons pas si le cycle de Krebs fonctionne en
présence de glucose. Par contre, l'arsénite inhibe l'oxydation de ce substrat
carboné. On devrait donc observer une accumulation de pyruvate à partir du
glucose en présence de cet inhibiteur ; ceci sera étudié par la suite.
Le faible rendement de la croissance, ainsi que la forte acidification
du milieu suggèrent que des acides s'accumulent dans les cultures. Nous revien
drons sur ce point au chapitre suivant.
39 ,
CHAPITRE IV
. ," ,ACCUHULATION DES ACIDES ORGANIQUES
DANS LE MILIEU DE CULTURE
l - ACIDE GLUCURONIQUE
Slodki et Wickerham (31) ont extrait du milieu de culture de~. starkeyi
et~. 1ipofer les polysaccharides synthétisés sur milieu riche contenant du
glucose comme source de carbone et d'énergie. Ils ont obtenu un rendement d'en
viron 20 % en polysaccharides par rapport au glucose consommé. Ces polymères
sont composés pour un tiers d'acide glucuronique. Nous avons dosé cet acide pro
duit dans les milieux de culture et suivi son accumulation afin de savoir à quel
moment sont synthétisés les polysaccharides. Pour cela nous avons utilisé la
méthode au carbazo1e qui, rappelons-le, permet de doser les acides uroniques sous
ses formes libre et conjuguée. Comme le glucose interfère, nous avons emp10yé t des
cultures sur mannitol avec ou sans source d'azote. Les courbes de production
d'acide glucuronique et de densité des cultures se trouvent sur la figure 11.
L'identité des spectres d'absorption des produits fournis par l'action du carba
zole sur un échantillon d'acide glucuronique pur et sur le surnageant de culture
indique que l'on a bien affaire à un acide uronique et non à un sucre réducteur.
Pour les cultures sur mannitol avec azote, nous obtenons 750 mg d'acide
glucuronique pour 10 g de polyol utilisé, ce qui correspond à un rendement de 7 %.
Ceci est en accord avec les résultats de Slodki et Wickerham (31) qui indiquent
pour ~. starkeyi un rendement de 20 % en polysaccharides dont un tiers, soit
6,8 %, est composé d'acide glucuronique. Pour les cultures sans azote, seulement
42 mg de cet acide sont formés et cela tout au début de l'incubation; cette
phase de développement, très courte, s'explique par l'utilisation des faibles
traces d'azote contaminant le milieu. Ensuite, la croissance et la production
d'acide glucuronique s'arrêtent. Nous avons dosé l'acide dans le milieu de cul
ture sur glucose en fin de croissance lorsque le sucre est épuisé. On trouve des
quantités comparables à celles obtenues à partir du mannitol.
Les résultats représentent les moyennes de deux déterminations faites
sur des extraits provenant de cultures différentes. En parenthèses
figure l'aliment carboné présent dans la culture.
48
49
2) Lorsque L. starkeyi est cultivé sur glucose, on trouve une activité
mannitol-déshydrogénase uniquement avec le NADP ;
3) Par contre, quand cette levure croIt sur mannitol, on retrouve
l'activité précédente en présence de NADP et l'on observe en plus une activité
mannitol-déshydrogénase avec le NAD. La réversibilité des réactions précédentes
a été vérifiée en mettant en évidence une réduction du fructose en présence de
NADH2 ou de NADPH2 •
Les deux activités mannitol-déshydrogénases mesurées, l'une en présence
de NAD, l'autre en présence de NADP, sont-elles dues à la même déshydrogénase ou
à deux enzymes distincts 1 Pour le savoir, nous avons fait des mesures avec des
systèmes contenant ces deux accepteurs d'électrons. On observe qu'il y a additi
vité des activités mesurées dans le cas des systèmes contenant uniquement le NAD
ou le NADP. Ceci suggère l'existence de deux mannitol-déshydrogénases distinctes.
Nous avons vérifié que les extraits de cultures sur mannitol de
~. starkeyi ne catalysent pas la réduction du fructose-6-P aux dépens du NADH2ou du NADPH2 , ce qui établit l'absence de mannitol-l-phosphate-déshydrogénase.
Les résultats précédents suggèrent que le mannitol subit les transfor