UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA “Efecto de Beauveria bassiana y Lecanicillium lecanii sobre larvas de Heliothis virescens en condiciones de laboratorio.” TESIS PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO – MICROBIÓLOGO Br. LIZETH NOHELY TORO CARRANZA TRUJILLO – PERU 2014 Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis. DIRECCION DE SISTEMAS DE INFORMÁTICA Y COMUNICACIÓN
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y
PARASITOLOGÍA
“Efecto de Beauveria bassiana y Lecanicillium lecanii sobre larvas de
Heliothis virescens en condiciones de laboratorio.”
TESIS
PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE
BIÓLOGO – MICROBIÓLOGO
Br. LIZETH NOHELY TORO CARRANZA
TRUJILLO – PERU
2014
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
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AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE
TRUJILLO QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE
BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO
Dr. Orlando Velásquez Benítez
RECTOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
Dra. Vilma Julia Méndez Gil
VICE-RECTORA ACADÉMICA
Dra. Flor Marlene Luna Victoria Mori
VICE-RECTOR ADMINISTRATIVO
Dr. Santiago Antonio Uceda Duclos
SECRETARIO GENERAL DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE
TRUJILLO
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AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE
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BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO
Dr. José Mostacero León
DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Dr. William Zelada Estraver
SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Dra. Bertha Soriano Bernilla
DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
Dr. Juan José Guevara Gonzáles
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y
PARASITOLOGÍA
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DEL ASESOR
El que suscribe : Ms. C. Juan Hector Wilson Krugg, asesor de la presente tesis
titulada: “Efecto de Beuaveria bassiana y Lecanicillium lecanii sobre larvas de Heliothis
virescens en condiciones de laboratorio”.
CERTIFICA:
Que ésta ha sido desarrollada, de acuerdo al reglamento establecido por la
Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en
conformidad con su correspondiente proyecto y que el informe ha sido redactado
acogiendo las observaciones y sugerencias alcanzadas.
Por lo tanto, autorizo a Lizeth Nohely Toro Carranza, continuar con el trámite
del reglamento correspondiente.
Trujillo, Julio del 2014
Ms.C. Juan Héctor Wilson Krugg
Profesor Asociado del Departamento Académico
de Microbiología y Parasitología
Código 4527
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PRESENTACIÓN
Cumpliendo con las disposiciones establecidas por el Reglamento de Grados y
Títulos de la Universidad Nacional de Trujillo, presento a su consideración y
elevado criterio la presente Tesis titulada: “Efecto de Beauveria bassiana y
Lecanicillium lecanii sobre larvas de Heliothis virescens en condiciones de
laboratorio”. Con el cual pretendo obtener el título profesional de Biólogo-
Microbiólogo.
Trujillo, Julio del 2014
Br. Lizeth Nohely Toro Carranza
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MIEMBROS DEL JURADO
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Dra. Manuela Lujan Velásquez
PRESIDENTE
--------------------------------------------
Ms. C. Juan Héctor Wilson Krugg
SECRETARIO
------------------------------------------------
Ms. C. Eduardo Muñoz Ganoza
VOCAL
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APROBACIÓN
Los profesores que suscriben, Miembros del Jurado Dictaminador, declaran que
la presente tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales, siendo
aprobada por UNANIMIDAD.
--------------------------------------------
Dra. Manuela Lujan Velásquez
PRESIDENTE
--------------------------------------------
Ms. C. Juan Héctor Wilson Krugg
SECRETARIO
------------------------------------------------
Ms. C. Eduardo Muñoz Ganoza
VOCAL
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DEDICATORIA
A Dios por darme la voluntad y fuerza para no dejarme
vencer por las adversidades, permitiéndome cumplir un
objetivo más en mi vida.
A mis padres José Toro y Lourdes Carranza, por ser los
mejores padres, quienes me han ayudado a crecer como
persona y como profesional; con mucho amor les dedico
todo mi esfuerzo, trabajo y todos mis logros, pues ellos han
sido mi apoyo en todo momento velando por mi bienestar,
integridad y educación. Ambos me enseñaron que todo es
posible con trabajo y esfuerzo.
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AGRADECIMIENTOS
Mi más profundo agradecimiento a mi asesor Ms. C. Juan Héctor Wilson Krugg por
brindarme su asesoramiento, apoyo y sus consejos en base a su amplia experiencia para
la realización de este proyecto.
A David Malque, Katherine Chacón, Karen Avalos, Yuseff Rojas, Melissa Santa Cruz y
Nadiezdha Burgos, por la información y apoyo brindado en la realización de este
trabajo.
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INDICE
Pág.
Autoridades de la Universidad Nacional de Trujillo ........................................................ ii
2.2 Obtención de cultivo joven de Beauveria bassiana y Lecanicillium
Lecanii………………………………………………………………………….…….7
2.3 Propagación y Estandarización del Inóculo .................................................... 7
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En la tabla 1 observamos los síntomas y signos presentados por las larvas
de H. virescens inoculadas con B. bassiana y L. lecanii ........................................... 12
Figura 1.Larva de Heliothis virescens con síntomas y/o signos luego de ser
inoculadas con B. bassiana: A. Sin inocular (control) B. Presentando
melanización (se observa el oscurecimiento en comparación al control)
C. Cubierta con micelio (signo) ................................................................................. 13
Figura 2. Larva de Heliothis virescens con síntomas y/o signos luego de
ser inoculadas con L. lecanii: A.Sin inocular (control) B.Presentando
melanización (se observa el oscurecimiento en comparación al control)
C. Cubierta con micelio (signo) ................................................................................. 14
Figura 3. Porcentaje de mortandad de larvas de Heliothis virescens inoculadas
con una concentración de 106con/ml de Beauveria bassiana y Lecanicillium
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Anexo 1. Esquema de Ciclo biológico de Heliothis virescens
Anexo 2. (A) Instalación de la cámara de crianza de adultos y pupas de Heliothis
virescens (B) vista interior de la cámara de crianza (C) instalación del
sistema de crianza de larvas.
Anexo 3. (A)Cámara para cópula de Heliothis virescens, (B) vista interna de la
cámara para cópula.
Anexo 4. Observación microscópica del microcultivo de Beauveria bassiana
recuperada de larvas de Heliothis virescens.
Anexo5. Observación microscópica del microcultivo de Lecanicillium lecanii
recuperada de larvas de Heliothis virescens.
Anexo6. Porcentaje de mortandad de larvas de Heliothis virescens producido por
una concentración de Beauveria bassiana y Lecanicillium lecanii en
condiciones de laboratorio.
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Anexo7. Análisis estadístico de las medias de los porcentajes de mortandad de
larvas de Heliothis virescens producidas por la aplicación de Beauveria
bassiana y Lecanicillium lecanii (a) ANOVA de un factor (Análisis de
varianza de un factor), (b) Prueba de Tukey y Duncan
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RESUMEN
Se determinó el efecto de la concentración de Beauveria bassiana y Lecanicillium
lecanii sobre larvas de Heliothis virescens en condiciones de laboratorio, además se
utilizó Tween 80 al 0.1% como control. Para esto se recolectaron 180 larvas de H.
virescens, los que fueron transportados al laboratorio de Fitopatología de la
Universidad Nacional de Trujillo para su crianza y obtención de nuevas larvas. La
evaluación se realizó colocando 2 grupos de 20 larvas, las cuales son ejemplares
problema y otro grupo de 20 larvas que son ejemplares testigo, haciendo de este
ensayo una suma de 3 repeticiones. Se inoculó por aspersión una concentración de
106 conidias/mL de B. bassiana y 106 conidias/mL de L. lecanii a cada uno de los
grupos problema, mientras que al control solo se le inoculo Tween 80 al 0.1%,
incubándose luego a temperatura ambiente. Se evaluó diariamente hasta los catorce
días después de la inoculación, anotándose los síntomas y signos observados:
lentitud en movimiento, pérdida de apetito, melanización, muerte y aparición de
micelio sobre las larvas muertas, las cuales fueron colocadas en cámara húmeda
para que el hongo culmine de realizar su colonización. Asimismo el mayor
porcentaje de mortandad de larvas se dio frente a B. bassiana 97.5% mientras que
el tratamiento con L. lecanii dio una mortandad de 87.5%, por lo que el análisis
estadístico encontró que existe diferencia significativa entre el porcentaje de
mortandad de la plaga frente a los dos hongos. Al analizar el efecto de los dos
tratamientos en cada aplicación se concluye que el mayor porcentaje de mortandad
de las larvas se obtuvo con B. bassiana mientras que frente al L. lecanii se encontró
menor mortandad.
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ABSTRACT
It was determined the effect of the concentration of Beauveria bassiana and
Lecanicillium lecanii on larvae of Heliothis virescens in laboratory conditions, also
use Tween 80 to 0.1 % as control. For this were collected 180 larvae of H. virescens,
which were transported to the laboratory of Phytopathology of the National University
of Trujillo for his breeding and obtain new larvae. The evaluation was carried out by
placing 2 groups of 20 larvae, which are exemplary problem and another group of 20
larvae that are exemplary witness, making this test a sum of 3 repetitions. The inoculum
by spraying a concentration of 106 conidia/mL of B. bassiana and 106 conidia/mL of L.
lecanii to each of the groups problem, while the control only was inoculated Tween 80
to 0.1 %, then simmer to ambient temperature. Was assessed daily up to fourteen days
after the inoculation, chalking up the symptoms and signs observed: slowness in
movement, loss of appetite, melanization, death and the appearance of mycelium on the
dead larvae, which were placed in humid camera for the fungus culminate to make its
colonization. Also the highest percentage of mortality of larvae was in front of B.
bassiana 97.5 % while the treatment with L. lecanii it gave a mortality of 87.5%, so
that the statistical analysis found that there is a significant difference bewtween the
mortality rate of the plague in front of the two fungus. In the analysis of the effect of the
two treatments in each application it was concluded that the highest percentage
mortality of the larvae were obtained with B. bassiana while in front of the L. lecanii is
found lower mortality.
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INTRODUCCION
La agricultura ha sufrido frecuentemente la devastación de las cosechas por los
ataques de las plagas. La lucha contra estas plagas constituye una de las principales
preocupaciones de la mayoría de los agricultores, no solo por las afectaciones y
pérdidas ocasionadas por estos organismos, sino por los costos de las medidas de
control y las limitaciones que se producen para la comercialización de los productos
agrícolas.1
Una plaga se define como un organismo que reduce la disponibilidad, calidad o
valor de recursos valiosos para los humanos, estos recursos pueden ser plantas que
son dañadas por plagas la mayoría insectos; los cuales tienen una gran
adaptabilidad, es decir que se acomodan a muchas condiciones y situaciones
ecológicas del mundo.2
En algunas zonas agrícolas de Lima, Ancash y La Libertad se registra como una
plaga principal a Heliothis virescens, causando severos daños en el espárrago; que
es un cultivo de gran exportación en el Perú, el cual se produce mucho más en la
costa norte cerca de Trujillo, por las condiciones climáticas especiales y atención a
la naturaleza cíclica de la planta permiten su cultivo todo el año.3, 4 Las primeras
infestaciones por esta especie se observaron a fines de 1993 e inicios de 1994,
alcanzando niveles alarmantes en algunos fundos, mientras que en otros recién se
les registro en 1995 con el carácter de plaga clave.5, 6
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Heliothis virescens, es un lepidóptero que ataca a diversos cultivos entre ellos el
espárrago (Asparagus officinalis Linnaeus).7,8 La hembra de H. virescens, deposita
los huevos en forma aislada, pero próximos de preferencia en flores y tejido tierno
en una cantidad de 400 huevos por noche, son de color blanco cuando recién
puestos y su forma es de una cúpula ligeramente surcada.8,9 Las larvas tienen de 5
a 6 estadios con muy pocos caracteres peculiares varía mucho en coloración que
puede ser verde clara, amarillenta, verde oscura, colorada y en gris muy oscuro; su
cuerpo está cubierto de tubérculos donde se insertan pelos finos observándose
siempre en el cuerpo de la oruga un brillo especial que le da la apariencia del
terciopelo, pudiendo alcanzar un tamaño de 3.5 cm; comienzan alimentándose del
tejido foliar luego perforan tallos y comen frutos pero también roe la corteza de la
planta como otros noctuidos del follaje.6,10 El ciclo de desarrollo (huevo, larva,
pupa, emergencia de adultos), toma un mes en el verano y las altas temperaturas y
presencia de flores favorecen el incremento del insecto.11
Si bien los insecticidas químicos han permitido un control eficaz de H. virescens
por un tiempo, el problema se ha agravado debido a las aplicaciones
indiscriminadas para su control.12 Las larvas son difíciles de controlar una vez que
alcanzan el tercer estadio causan severos daños al esparrago lo que determino el
empleo de insecticidas organofosforados, piretroides, inhibidores de síntesis de
quitina en mezclas que determinaron un rápido desarrollo de resistencia.13,14 La
evidencia más común de resistencia involucra a la permitrina, haciendo difícil su
control por medios químicos, incrementando los costos de producción causando
residuos no adminisibles tanto en la planta como en el suelo, un desequilibrio en la
entomofauna benéfica y un impacto negativo sobre el ambiente.15,16,17
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Tomando en cuenta lo antes mencionado es esencial el establecimiento del manejo
integrado de esta plaga mediante control biológico porque así se conserva el
ambiente y permite obtener productos limpios, es decir libres de residuos de
plaguicidas y permitiendo obtener altos niveles de producción;18,19 además son
inofensivos para las personas y al contrario de muchos productos fitosanitarios
puede ser muy selectivo lo que redunda tanto en una mayor eficacia al tratarse
únicamente el problema real como en una mayor seguridad en su manejo, menor
interferencia en otros elementos del medio agrícola evitando resurgimiento de
plagas secundarias y no existe problemas con intoxicaciones ni presenta resistencia
de las plagas.20,21
Una alternativa para el control biológico de esta plaga es la utilización de hongos
entomopatógenos, que son un grupo de microorganismos ampliamente conocidos en
todo el mundo, existiendo más de 750 especies reunidas en 100 géneros; siendo hoy
en día la Clase Deuteromycetes la más promocionada en el control de plagas.22,23 El
uso de estos microorganismos ha ido aumentando en la agricultura en los últimos
años debido al gran potencial que tienen en el manejo de insectos, puesto que tiene
la particularidad de parasitar a todos los órdenes de insectos en sus diferentes
estadios durante su ciclo biológico, siendo una alternativa eficiente al uso de
insecticidas químicos, considerados altamente nocivos para la salud del hombre y
los ecosistemas, representando una alternativa ecológica sostenible.24, 25,26
Los hongos entomopatógeno inician el proceso de infección cuando las esporas
viables entran en contacto con la superficie del integumento del hospedero. 27 Una
vez establecido el contacto, factores ambientales como la humedad relativa y una
temperatura adecuada van a favorecer a la germinación de la espora y a la posterior
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formación del tubo germinativo y el apresorio, dentro del cual se disemina; la
reproducción del patógeno ocurre entre las 48 y 60 horas aproximadamente.28,29 Al
morir el hospedero las hifas penetran la cutícula desde el interior y emergen a la
superficie iniciando así la diseminación del hongo, este tiempo de colonización
puede variar de tres a once días.30,31
Dentro de los hongos considerados como entomopatógenos se tiene a B. bassiana,
del cual se han obtenido mas de treinta y ocho cepas entomopatogenas pudiendo
atacar a los insectos plagas pertenecientes a los órdenes Homoptera, Orthoptera,
Coleoptera y Lepidoptera.32, 33 Por otro lado Lecanicillium lecani, que es un
entomopatógeno que aparece frecuentemente sobre afidos pero también fue
reportado atacando insecto del orden Coleoptero, Diptera y Hymenoptera. Siendo
considerados tanto a B. bassiana y L. lecanii, como hongos entomopatógenos de
gran potencial que tienen un amplio espectro de acción. 27,34
Beauveria bassiana, se caracteriza por presentar esporas de 5 a 7.5µm de largo por
2.3 a 3.5µm de ancho, cilíndricas a ovales, produce colonias que pueden tener uno o
muchos matices de verde y presenta conidias globosas a subglobosas de 2 a 3µm
con estigmas en forma de zigzag de color blanco cremoso.35 Presenta un crecimiento
lento, circular, llegando alcanzar 20 mm de diámetro en 10 días, aspecto lanoso,
apareciendo en forma de polvo debido a las abundantes conidias, colonia de color
blanca en un principio tornándose amarillenta posteriormente en la parte del centro,
textura blanda y superficie plana.36, 37 Los factores favorables para este hongo son
humedad relativa mayor a 70% y una temperatura que oscile entre 22 a 26° C, lo
que va permitir que una vez que el insecto sea cadáver el hongo lo cubra con un
polvo blanco. 38
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Lecanicillium lecanii de la Clase Deuteromycetes se caracteriza por presentar
fiálides que son alargadas y se estrechan desde la base, presentándose en verticilos
de 2 – 6, apareados o solitarios sobre hifas o apicalmente sobre ramas cortas. Las
conidias son hialinas generalmente elípticos de 2.5 a 7 um son envueltas por una
masa gelatinosa de forma esférica y normalmente emiten dos tubos germinativos.39,
40 Las condiciones favorables para este hongo son humedad relativa encima de 85%
y temperatura entre 20 a 25°C. Los cadáveres de insectos atacados por este hongo,
presentan un aspecto algodonoso de color blanco crema o amarillo. L. lecanii
produce la toxina bassinolide que ha sido aislada del micelio del hongo y que
también es producido por Beauveria bassiana. 41
Si bien es cierto Beauveria bassiana y Lecanicillium lecanii tienen efecto sobre los
lepidópteros y considerando que la aplicación de estos hongos entomopatógenos no
contaminan el medio ambiente ni generan resistencia en el insecto a diferencia de
los insecticidas, además teniendo en cuenta la resistencia de Heliothis virescens a
diferentes químicos, que es una plaga distribuida a nivel mundial y que no solo
afecta al espárrago sino también al garbanzo, algodón, arveja, papa, vid y otros
cultivos, ocasionando grandes pérdidas en la agricultura; dicho trabajo tiene como
objetivo conocer el efecto de B. bassiana y L. lecanii sobre los estadios larvarios de
H. virescens en condiciones de laboratorio.
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MATERIAL Y METODO
1. Material de estudio
Cultivo puro de Beauveria bassiana, proporcionado por el
laboratorio de Fitopatología del Departamento de Microbiología y
Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad
Nacional de Trujillo.
Cultivo puro de Lecanicillium lecanii, proporcionado por el
laboratorio de Fitopatología del Departamento de Microbiología y
Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad
Nacional de Trujillo.
180 larvas de Heliothis virescens recolectados de cultivos de
garbanzo del pueblo de Collambay, localizado en el Distrito de
Simbal
2. Procedimiento
2.1 Recolección, crianza de adultos y obtención de larvas de Heliothis
virescens.
De los cultivos de garbanzo ubicado en el pueblo de Collambay ubicado
en el Distrito de Simbal, Provincia Trujillo, Región La Libertad, se
recolectó 180 ejemplares de Heliothis virescens, estadío larvario, los que
fueron llevados al laboratorio de Fitopatología para su crianza.
Para la crianza de larvas de H. virescens se utilizó recipientes de plástico
de 100mL, adaptados para permitir el intercambio gaseoso y evitar la
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fuga de los especímenes. En el fondo de cada uno se colocó hojas de
garbanzo hasta una altura de 2cm, depositándose luego las larvas. Los
recipientes se taparon y se mantuvieron a temperatura ambiente. Después
de 20 días se obtuvieron pupas que fueron colocadas cada una en
recipientes de plástico de 100mL sin tapa dentro de cámaras de crianza
con las siguientes dimensiones 25cm x 30cm x 50cm, cubiertas con tul
fino, siendo la base y la parte posterior de triplay forradas en su interior
con papel toalla; en esta cámara emergieron los adultos, los que fueron
seleccionados en hembras y machos. (Anexo 2)
Para la obtención de huevos, se pasaron una hembra con dos machos en
una cámara de cúpula y en cada una de ellas se colocaron dos pequeños
recipientes, uno con agua y el otro con una solución de azúcar, los cuales
fueron depositados en la base de la cámara. Cuando la hembra realizó las
posturas, se extrajeron los huevos con un pincel y se colocaron cada
huevo sobre hojas frescas de garbanzo dentro de un recipiente de
plástico, las que sirvieron de alimento cuando eclosionaron. (Anexo 3)
2.2 Obtención de cultivo joven de Beauveria bassiana y Lecanicillium
lecanii
Se sembró por puntura B. bassiana y L. lecanii en frascos pequeños
conteniendo Agar Sabouraud, incubándose a 25 ± 0.1 ºC durante 7 días.
2.3 Propagación y Estandarización del Inóculo
Se preparó una suspensión de Beauveria bassiana en solución estéril de
Tween 80 al 0.1%, la cual se utilizó para propagar el hongo en ASb
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inclinado (contenido en frascos planos), se utilizó 0.1mL de la
suspensión del hongo, se incubó a 25 ± 0.1 ºC hasta la formación de
esporas. Posteriormente se le agregó una solución acuosa de Tween 80 al
0.1% para obtener las esporas. La suspensión de esporas fue colocada en
un matraz estéril. Luego se estandarizó en cámara de Neubauer a la
concentración de 106conidias/mL, las que sirvieron de inóculo. Los
mismos pasos se siguieron para preparar y estandarizar el inóculo de
Lecanicillium lecanii.
2.4 Inoculación
La muestra estuvo constituida por 180 larvas de H. virescens, de las
cuales 2 grupos de 20 larvas cada uno fueron ejemplares problema y otro
grupo de 20 larvas fueron ejemplares testigo, realizando un total de 3
repeticiones. A los ejemplares problema se les inoculó por aspersión una
suspensión acuosa de Tween 80 al 0,1% con la concentración utilizada de
106esporas/mL de B. bassiana. Se siguieron los mismos pasos para el
caso de Lecanicillium lecanii. Mientras que a los ejemplares testigo se les
inoculó por aspersión una solución acuosa de Tween 80 al 0,1%, tratando
en lo posible, de suministrar la misma cantidad de inóculo al testigo y al
problema.
Para este procedimiento se realizó la puesta de larvas de H. virescens en
hojas de garbanzo, una por recipiente el cual estaba adaptado para
permitir el intercambio gaseoso y evitar la fuga de los especímenes.
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2.5 Evaluación de la actividad entomopatógena de Beauveria bassiana y
Lecanicillium lecanii
Después de la inoculación se evaluó cada 24 horas la aparición de
síntomas y/o signos de la infección micótica que presentaron las larvas
problema en comparación a los testigos. La observación de cada una de
las larvas y el posible progreso de la infección micótica se realizó
diariamente anotando la aparición de síntomas como lentitud en
movimiento, pérdida de apetito, melanización, u otros, que se produjeron
durante el ensayo, siendo el tiempo máximo de observación 14 días
(tanto problema como testigo).
2.6 Recuperación e identificación de Beauveria bassiana y Lecanicillium
lecanii.
Esto se realizó con la finalidad de confirmar que la causa de la muerte de
las larvas de H. virescens por la acción de los hongos inoculados;
consistió en colocar los especímenes muertos en cámara húmeda e
incubados a temperatura ambiente, una vez emergido el micelio se
extrajo con ayuda de una asa microbiológica para realizar el
microcultivo comparado e identificado según las claves taxonómicas de
Barnett. (Anexo 4 y 5)
2.7 Análisis de Datos
Los datos obtenidos se procesaron utilizando el paquete estadístico SPSS
v.20, aplicando un análisis de varianza simple para comparar las medias
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de mortalidad producida por el hongo evaluado; aplicándose, el análisis
postanava mediante la prueba de Tukey.42 (Anexo 7)
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RESULTADOS
En la tabla 1 observamos los síntomas y signos presentados por las larvas de H.
virescens inoculadas con B. bassiana y L. lecanii.
En la figura 1 y 2 se muestran la melanización así como el crecimiento miceliar
en las larvas de H. virescens inoculadas con B. bassiana y L. lecanii
respectivamente.
En la fgura 3 se observa que B. bassiana fue el hongo que ocasionó el mayor
porcentaje de mortandad en las larvas de H. virescens.
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Tabla1. Síntomas y signos presentados por larvas de Heliothis virescens inoculadas con
Beauveria bassiana y Lecanicillium lecanii.
Síntomas y/o signos
observados
Conidios /mL
Control Beauveria bassiana Lecanicillium
lecanii
0* 106 106
Pérdida de apetito - + +
Escasa movilidad - + +
Melanización - + +
Muerte - + +
Aparición de micelio - + +
Momificación - + +
(*) Representa al control
(+) Presencia
(-) Sin presencia
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Figura 1.Larva de Heliothis virescens con síntomas y/o signos luego de ser inoculadas
con B. bassiana: A. Sin inocular (control) B. Presentando melanización (se
observa el oscurecimiento en comparación al control) C. Cubierta con micelio
(signo).
A
C
B
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Figura 2. Larva de Heliothis virescens con síntomas y/o signos luego de ser inoculadas
con L. lecanii: A. Sin inocular (control) B. Presentando melanización (se
observa el oscurecimiento en comparación al control) C. Cubierta con micelio
(signo).
A B
C
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Figura 3. Porcentaje de mortandad de larvas de Heliothis virescens inoculadas con una
concentración de 106con/mL de Beauveria bassiana y Lecanicillium lecanii
respectivamente.
a: p<0.05, existe diferencia significativa
a CONTROL B. bassiana 106 L. lecanii 106
Conidias/mL
a
a
a
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DISCUSION
La mayoría de los insectos plaga son muy susceptibles frente al ataque de hongos
entomopatógeno y a menudo ocasionan una alta reducción de su población. Durante el
proceso de infección de las larvas de Heliothis virescens por Beauveria bassiana y
Lecanicillium lecanii, estas fueron presentando diversos cambios fisiológicos
producidos como respuesta frente al ataque y al mecanismo de acción de los hongos
entomopatógeno (Tabla 1).
Para que estos cambios ocurran debe producirse inicialmente la adherencia de la espora
de B. bassiana y L. lecanii a la cutícula del insecto o también esta puede ingresar a
través de la cavidad bucal, espiráculos y otras aberturas externas del insecto.43
Sabiendo de las posibles vías de acceso de las esporas de los hongos entomopatógenos,
la aplicación de B. bassiana y L. Lecanii se realizó por medio de aspersión para que el
ingreso de la espora a las larvas de H. virescens sea por las diferentes vías. Así la
espora ingresa y realiza el proceso de germinación mediante el cual se forma uno o
varios tubos germinativos, los cuales por crecimiento y alargamiento dan origen a las
hifas.44
La germinación de las esporas en gran parte depende de la humedad ambiental,
temperatura y en menor grado de las condiciones de luz y nutricionales ya que el nivel
del agua es determinante en el crecimiento de los hongos y pequeñas diferencias en los
niveles de humedad relativa después de la aplicación de conidias, pueden determinar
de un modo u otro el éxito del hongo en el control de insectos plaga.33, 45
También se menciona que puedes diferenciarse tres fases en este mecanismo: Adsorción
o inmovilización, contacto y adhesión propiamente dicha. En la adhesión puede
intervenir sustancias simples o complejas que participan en la fijación del propágulo;
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algunas de estas moléculas son conocidas como lecitinas, que son proteínas o
glucoproteinas de origen inmunológico pero que pueden provocar in vitro fenómenos
semejantes a reacciones inmunológicas37; de modo que Beauveria bassiana pudo
haberse favorecido por alguno de estos factores para producir un mayor porcentaje de
mortandad de larvas de Heliothis virescens en comparación a Lecanicillium lecanii
(Figura 3).
La penetración de la cutícula de la larva por conidias germinadas, ocurre como resultado
de una combinación entra la degradación enzimática de la cutícula y la presión
mecánica por el tubo germinal. El modo de penetración principalmente depende de las
propiedades de la cutícula, grosor, esclerotización y la presencia de sustancias
antifúngicas y nutricionales de las larvas de H. virescens. En la penetración participan
dos mecanismos: El físico debido a la presión mecánica de la hifa rompe las áreas
membranosas esclerosadas y el químico que es resultante de la acción enzimática
principalmente de proteasas, lipasas y quitinasas 23, 46; ya que la cutícula está formada en
un 70% aproximadamente de proteínas, lo que explica que la proteasas son las enzimas
clave en la penetración de la cutícula.
Después de la penetración de las hifas, estas se diseminas vía hemolinfa, producen
blastosporas y cuerpos filamentosos de hifas que invaden el sistema inmune del
hospedero multiplicándose rápidamente en los tejidos. En el hemocele se producen
toxinas y enzimas como proteasas, lipasas y quitinasas, que matan al insecto al
consumir todos los nutrientes.47 B.bassiana y L. lecanii evitan la defensa inmune del
insecto por desarrollo de protoplastos que no son reconocidos por la población de
hemocitos de insecto, formando cuerpos hifales, multiplicándose , dispersándose
rápidamente y produciendo micotoxinas.43
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Las micotoxinas que producen estos hongos, son metabolitos fúngicos secundarios que
son parte de los mecanismos de infección y pueden dar lugar a una respuesta toxica en
diferentes organismos48; así pues los síntomas como pérdida de apetito, escaza
movilidad y melanización (Tabla 1), que son debido a la presencia de las toxinas
secretadas por el patógeno cuando entra en contacto con la hemolinfa del huésped.
Referente a la melanización observada en las larvas (Figura 1B y 2B), es un mecanismo
de defensa del huésped, en la cual están presentes compuestos fenólicos que
regularmente están libres en la hemolinfa y que son germicidas no específicos; es así
que H. vriescens frente al ataque de B. bassiana y L.lecanii realiza el proceso de
fagocitosis, el cual se da cuando las concentración de los microorganismos son bajas
pero a mayor concentración también se forman nódulos debido a que las melaninas se
depositan sobre la superficie del patógeno invasor para luego encapsularlo y evitar la
propagación, produciéndose entonces la coloración del insecto.49,50 Este proceso es
observado en las larvas inoculados con conidias de Beauveria bassiana y Lecanicillium
lecanii (Figura 1A y 2B), a diferencia de las larvas inoculadas con Tween 80 al 0.1% no
presentaron ningún cambio fisiológico debido a que este inóculo no causa ningún
proceso infectivo en el insecto por ese motivo es considerado como el control.
Es importante recalcar que existen otros tipos de toxinas que produce B. bassiana, tales
como la beuvericina que poseen una acción insecticida, los beauverólidos que tienen
una fuerte acción inmunomoduladora, las dextruinas que inducen la parálisis flácida y la
contracción muscular visceral del insecto (Tabla 1) y la presencia de oospereina,
bassianina, acido oxálico, bassianolido, enniatinas y ácido dipinolico 51,52; en cambio L.
lecanii produce una serie de toxinas como ácido dipicolinico, acido oxálico,
bassianolido, que muestra una fuerte acción insecticida tanto por ingestión como por
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inyección51; sin embargo Beauveria bassiana produce mayor diversidad de toxinas que
Lecanicillium lecanii lo que pudo ser un factor para que el efecto de B.bassiana
ocasione mayor mortalidad en larvas de H. virescens que L. lecanii (Figura 3).
Luego de sobrepasados los mecanismos de defensa del insecto este muere y el hongo
entomopatógeno entra en la fase de colonización. Si la disponibilidad de agua es alta los
hongos emergen al exterior a través de la cutícula y esporulan sobre el cadáver y se da
la momificación de la larva33, como se observó después de 2-3 días de haber sido
colocadas las larvas en cámara húmeda e incubadas a temperatura ambiente (Figura 1C
y 2C). En el insecto, el hongo puede sobrevivir por algunos meses y eventualmente
producirá espora cuando tenga condiciones favorables.
En relación al porcentaje de mortandad ocasionado por B. bassiana (97.5%) y L. lecanii
(87.5%) sobre las larvas de H. virescens (Figura 3), se observa que existe diferencia
significativa lo que significa que L. lecanii ocasiona menor porcentaje de mortandad en
las larvas del insecto en comparación a la mortandad producida por B. bassiana; la cual
pudo ser ocasionada por diversos factores como temperatura(que puede ocasionar la
perdida de patogenicidad y estabilidad del patógeno), humedad relativa (puede
intervenir en las fases del ciclo de infección del hongo), proceso de adherencia de la
espora, lo relacionado con el hongo (concentración y tiempo de vida media), espectro de
acción o las diferentes toxinas producidas por estos hongos que según Jegorov51 y
Borges52 et al. ,B. bassiana tiene mayor variedad de toxinas y mayor espectro de acción,
lo que le favorece en el modo de acción sobre las larvas de H. virescens y va permitir
que su aplicación en campo tenga un resultando eficiente, obteniendo un buen control
sobre la plaga sin ocasionar gran inversión de dinero, disminuyendo perdidas en la
agricultura y sin dañar el ambiente.
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CONCLUSIONES
Beauveria bassiana y Lecanicillium lecanii presentan efecto entomopatógeno sobre
larvas de Heliothis virescens en condiciones de laboratorio
Beauveria bassiana produce mayor porcentaje de mortandad sobre las larvas de
Heliothis virescens que Lecanicillium lecanii en condiciones de laboratorio.
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RECOMENDACIÓN
En relación a la crianza de las larvas de Heliothis virescens es recomendable se críen
una por recipiente ya que la larva de mayor desarrollo tiende a comerse a la más
pequeña por causa de su hambre voraz, no quedando satisfecha solo con las hojas del
garbanzo, por cual también se recomienda adicionarle un alimento como la coronta la
maíz, el cual satisface su necesidad de alimentarse.
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ANEXOS
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Anexo 1. Esquema de Ciclo biológico de Heliothis virescens (A) huevo
(B) larva (C) pupa (D) adulto.
A. Ovo: 3- 4 días
C. Pupa: 8 - 10 días
D. Longevidad: 10 - 12 días B. Larva: 20-23 días (6 estadios)
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Anexo 2. (A) Instalación de la cámara de crianza de adultos y pupas de Heliothis
virescens (B) vista interior de la cámara de crianza (C) instalación del
sistema de crianza de larvas.
A
C
B
C
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Anexo 3. (A)Cámara para cópula de Heliothis virescens, (B) vista interna de la
cámara para cópula
A
B
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Anexo 4. Observación microscópica del microcultivo de Beauveria bassiana
recuperada de larvas de Heliothis virescens.
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Anexo 5. Observación microscópica del microcultivo de Lecanicillium lecanii
recuperada de larvas de Heliothis virescens.
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Anexo 6.Porcentaje de mortandad de larvas de Heliothis virescens producido por una
concentración de Beauveria bassiana y Lecanicillium lecanii en condiciones
de laboratorio.
TRATAMIENTO
NUMERO DE LARVAS MUERTAS
PROMEDIO
PORCENTAJE
DE
MORTANDAD R1 % R2 % R3 %
Control 1 5 0 0 1 5 0.7 2.5
B.bassiana 10+6 20 100 19 95 20 100 19.7 97.5
L.lecanii 10+6 18 90 17 85 18 90 17.7 87.5
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Anexo 7. Análisis estadístico de las medias de los porcentajes de mortandad de larvas
de Heliothis virescens producidas por la aplicación de Beauveria bassiana y
Lecanicillium lecanii (a) ANOVA de un factor (Analisis de varianza de un
factor), (b) Prueba de Tukey y Duncan
a. ANOVA de un factor
PORCENTAJE DE MORTANDAD DE LARVAS DE Heliothis virescens
b. Prueba de Tukey y Duncan
PORCENTAJE DE MORTANDAD DE LARVAS DE Heliothis virescens
Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 3.000.
Suma de
cuadrados Gl Media
cuadrática F Sig. Inter-grupos 16350.000 2 8175.000 981.000 .000 Intra-grupos 50.000 6 8.333 Total 16400.000 8
Concentracion N
Subconjunto para alfa = .05
2 3 1 HSD de Tukey(a) Control 3 3.3333
Lecanicillium 3 88.3333 Beauveria 3 98.3333 Sig. 1.000 1.000 1.000
Duncan(a) Control 3 3.3333 Lecanicillium 3 88.3333 Beauveria 3 98.3333 Sig. 1.000 1.000 1.000
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