Compuestos bioactivos en diferenciación, proliferación y muerte de células madre José Alberto Carrodeguas Villar [email protected] http://bifi.es/
Jul 08, 2015
�Compuestos bioactivos en diferenciación, proliferac ión y muerte de células madre
José Alberto Carrodeguas Villar
[email protected]://bifi.es/
iPS
Patologías que se pueden tratar con células madre
• Enfermedad de Parkinson• Diabetes tipo I• Artritis• Quemaduras• Enfermedades cardiovasculares• Cáncer• Daño en la médula espinal• Enfermedades de la retina
Problemas que puede presentar la terapia con células madre
• Transmisión de virus
• Enfermedades animales
• Crecimiento incontrolado, formación de teratomas
• Crecimiento no dirigido
Diferenciación
Proliferación/muerte
Diferenciación
Proliferación/muerte
Factores que determinan la diferenciación de células madre a tipos celulares concretos
Hipótesis
En colecciones de compuestos químicos (quimiotecas) debe haber moléculas capaces de inducir diferenciación celular específica, muerte o proliferación en células madre
Ensayo
Línea celular de células madre modificada genéticamente para expresar un gen reportero bajo el control de un promotor específico de un tipo celular.
GFP: fluorescencia
Luciferasa: luminiscencia
Línea celular
• Células madre embrionarias de ratón modificadas genéticamente: AMPIGX-7 (CGR8)
• Expresan GFP bajo el control de un promotor específico de cardiomiocitos
• Emiten fluorescencia verde cuando se diferencian a cardiomiocitos
500µm500µm 500µm
1d EBs 2d EBs 3d EBs
5d EBs 7d EBs6d EBs
4d EBs
500µm 500µm 500µm
10d EBs
500µm500µm500µm 500µm
1d EBs 2d EBs 3d EBs
5d EBs 7d EBs6d EBs
4d EBs4d EBs
500µm 500µm 500µm
10d EBs
500µm
Preparación de cuerpos embrioides
Luciferasas secretadas
DIFERENCIACIÓN CLONES METRIDIA LUCIFERASA
0
5000
10000
15000
20000
25000
M1 M2 M3 M4 M5 M6 M14 CGR8 Medio
Clones
2000 células/EB
500 células/EB
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
CGR8 M1 M5 M6 M14
RLU
C-VerapamilForskolinCiclosporina A
Diferenciación
Proliferación/muerte ���������
Ensayo
XTT: proliferación celular (actividad mitocondrial)
Línea celular: CGR8
Contracribado: MEFs
Apoptosis: MEFs DKO Bax/Bak, caspasas, etc.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
CPT
Gro
up 1
Gro
up 2
Gro
up 3
Gro
up 4
Gro
up 5
Gro
up 6
Gro
up 7
Gro
up 8
Gro
up 9
Gro
up 1
0Gro
up 1
1Gro
up 1
2Gro
up 1
3Gro
up 1
4Gro
up 1
5Gro
up 1
6Gro
up 1
7Gro
up 1
8Gro
up 1
9Gro
up 2
0Gro
up 2
1Gro
up 2
2Gro
up 2
3Gro
up 2
4Gro
up 2
5Gro
up 2
6Gro
up 2
7Gro
up 2
8Gro
up 2
9Gro
up 3
0Gro
up 3
1Gro
up 3
2Gro
up 3
3Gro
up 3
4Gro
up 3
5Gro
up 3
6Gro
up 3
7Gro
up 3
8Gro
up 3
9Gro
up 4
0
Grupos de 4 compuestos/pocillo
0
20
40
60
80
100
120
140
CPT 26A 26B 26C 26D
Compuestos químicos
ESCs
MEFs
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
CPT
Gro
up 1
Gro
up 2
Gro
up 3
Gro
up 4
Gro
up 5
Gro
up 6
Gro
up 7
Gro
up 8
Gro
up 9
Gro
up 1
0Gro
up 1
1Gro
up 1
2Gro
up 1
3Gro
up 1
4Gro
up 1
5Gro
up 1
6Gro
up 1
7Gro
up 1
8Gro
up 1
9Gro
up 2
0Gro
up 2
1Gro
up 2
2Gro
up 2
3Gro
up 2
4Gro
up 2
5Gro
up 2
6Gro
up 2
7Gro
up 2
8Gro
up 2
9Gro
up 3
0Gro
up 3
1Gro
up 3
2Gro
up 3
3Gro
up 3
4Gro
up 3
5Gro
up 3
6Gro
up 3
7Gro
up 3
8Gro
up 3
9Gro
up 4
0
Grupos de 4 compuestos/pocillo
0
20
40
60
80
100
120
140
CPT 26D 199A 223A
Compuestos Químicos
ESCs
MEFs
BrdU ELISA
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Cont
rol D
MSO CPT
P4F2P4
A3
P4E3P4
D5
P4D6
P4H8
P5B2P5
C2P5
B3P5
B5P5
C5P5
A6P5
B6P5
C6
P5E7
P5F8
P5FG
8
Back
grou
nd
Blan
k
Compuestos Químicos
ESCs
MEFs
XTT
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Cont
rol D
MSO CPT
P4F2
P4A3
P4E3
P4D5
P4D6
P4H8
P5B2
P5C2
P5B3
P5B5
P5C5
P5A6
P5B6
P5C6
P5E7
P5F8
P5FG
8
Compuestos Químicos
ESCs
MEFs
Viabilidad celular
Diferenciación celular
Muerte celular
Proliferación celular
Actividad mitocondrial
Efecto en diferenciación EB
Mecanismos moleculares
hES y iPS
Mecanimos moleculares
Mecanismos moleculares
En marcha
En marcha
En marcha
Ensayos muerte iPS. Colaboración con Xavier Doss (NY)
Ensayos en ratones Estudio en teratomas. Colaboración con Eduardo Romanos.
Luciferasa. Colaboración con Agapios Sachinidis (Colonia)
Planes
Celia ConesaVerónica TomeyJavier Sancho
Agapios Sachinidis. Universidad de Colonia
Michael Xavier Doss. Masonic Medical Research Laboratory, NY
Programa Aragonés de Medicina Regenerativa (PAMER)