Martha Hengst 09 junio 2015 Biotecnología Marina BT 925/ I-2015 Compuestos Bioactivos producidos por organismos marinos autótrofos
Martha Hengst09 junio 2015
Biotecnología MarinaBT 925/ I-2015
Compuestos Bioactivos producidospor organismos marinos autótrofos
¿Qué son los compuestos bioactivos?
• Son metabolitos secundarios• Compuestos no usados para metabolismo esencial (ej: Div. celular)• No impiden la sobrevivencia: pueden afectarla• Se producen en distintas etapas de la vida• Varían en cada organismo: especie específicos• Muy estudiados en plantas (aleloquímicos)
Ej: hormonas, antibióticos, aleloquímicos y toxinas.
Ambientes marinos:Una gran fuente de nuevos compuestos bioactivos
75% del planeta son océanos ~11.000 m profundidad ↓ Temperaturas: excepto trópicos ↓ materia orgánica > 3,5% sal (35 g/L) pH alcalino (8) Alta presión (> con Profundidad) ↓ Oxígeno disuelto
Gran diversidad de hábitats y especies
Tridimensional
Diversidad de organismos marinosvs diversidad de CB
Esponjas
Métodos de búsqueda en la naturaleza: algas
¿Cómo se buscan estos compuestosen la naturaleza?
Se utilizan simultáneamenteestrategias dependientes eindependientes de cultivo
• Las rutas para la biosíntesis demetabolitos secundarios sonmúltiples y complejas.
• Los operones mas estudiadosson los que codifican para laspolicétido sintetasa (PKS)y para péptidos no ribosomales(NRPS).
• Policétido sintetasas• Péptidos no ribosomales
Cluster de genes involucrados en la síntesis de sustancias bioactivas sonampliamente distribuidos entre organismos no relacionados filogenéticamente
Curr Opin Biotechnol. Author manuscript; available in PMC 2011
Por qué el interés por los organismos marinos escreciente…
Suplementos alimenticios
Pigmentos & antioxidantes
Cosméticos
Inmunoestimulantes
Diversidad de macroalgas en ambientes marinos~ 27.000 spp en el mundo
Gracillaria chilensisUlva lactuca Macrocystis pyrifera
ChlorophytaAlgas verdes
RodophytaAlgas rojas
PhaeophytaAlgas pardas
Microalgas eucariontes marinas
Pediastrum
Diatomeas (Crisófitos)
Euglena
Peridinium
Dinoflagelados
Brevetoxina
Alexandrium catenella
Efecto de los compuestos producidospor algas
• ↓ palatabilidad
• ↓ Pastoreo
• Antimicrobianos
• ↓ crecimiento
• Antioxidantes• (-) Proliferación celular
Alta diversidad química de compuestos producidos por algas
• Toxinas (marea roja) Paralizante Diarreica Amnésica
2009. Ciencias Marinas 35(4): 345-358
• Antifouling
EFECTOS SINÉRGICOS
Naturaleza de los compuestos producidospor algas
Liposolubles: Pigmentos, Carotenoides, Clorofila aÁcidos Grasos (PUFAs)
• Ácidos grasos insaturados: antioxidantes:Capturan radicales libres derivados de peroxidación lipídica.
• Tocoferoles (vit E): capturan radicales libres. Integridad demembranas celulares.
• Terpenoides: defensa contra depredadores, ↓producción deEROs por UV, Síntesis de vitaminas.
Radicales libres: átomos o moléculas altamente reactivas con un electróndisponible para aparearse
Metabolitos secundarios de micro ¯oalgas
Hidrosolubles: Polifenoles, Vit C, Polisacáridos
• Fluorotaninos (pardas), bromofenoles (rojas), ácidosfenólicos y ácidos cinámicos.
• Secuestran: O2.-, OH., H2O2 y óxido nítrico.
• Generan poder reductor, (-) peroxidación lipídica y quelaniones Fe2+.
• (-) apoptosis inducida por H2O2.
• Retardan envejecimiento celular.
HidrosolublesFluorotaninos
• (+) actividad de enzimas antioxidantes SOD, CAT y GPx (Ciclo Halliwell-Asada).
• Función: antioxidantes, neuroprotectores (↓ radicales libres)
Metabolitos secundarios de micro ¯oalgas
PolisacáridosPolisacáridos sulfatados:
Galactanos (rojas), alginatos y fucoidanos (pardas)
• Secuestran radicales libres → → → antioxidantes
Ej. Ratas efecto hepatoprotector en tratamientos conparacetamol.
↓ peroxidación lipídica↑ actividad de enzimas antioxidantes SOD, CAT y GPx↑ niveles de glutatión (GSH)
H2O2 + 2GSH ------- GSSG + 2H2O
Glutatión reductasa
Metabolitos secundarios de micro ¯oalgas
Reacción de lipoperoxidación: radicales libres – SOS
Casos de estudioBioactivos de algas
Effects of secondary metabolitesfrom marine algae on feeding bythe sea urchin, Lytechinusvariegatus. Oliver J. McConnell, Patricia A.Hughes, Nancy M. Targett and Joyce Daley
1982. Journal of Chemical Ecology 8(12): 1437-1453.
• Metabolitos secundarios de algas afectan la herviboría por erizos de mar.• Caulerpa prolifera y Cymopolia barbata producen terpenos.• Caulerpenina: neurotoxina• Cymopol: (-) sínt de ADN, arresto ciclo celular, muerte celular (anticáncer).
• La inhibición ocurre independiente de la edad de los erizos, del período dehambruna, salinidad y temperatura.
Effects of secondary metabolites from marine algae on feedingby the sea urchin, Lytechinus variegatusOliver J. McConnell, Patricia A. Hughes, Nancy M. Targett and Joyce Daley
Porcentaje de biomasa algalconsumida por L. variegatus
Caulerpa spp
• Caulerpenina (neurotoxina)• (-) Na+/K+-ATPasa• ↓ secuestro intracelular H+• ↑ pH medio circundante
Algas asesinas invasoras
1996. J Biochem Toxicol. 11(5):243-50; 2001. Neuroscience 107: 519-526
Las algas poseen mecanismo de defensa químicos para evitar la herbivoría
Himanthalia elongata (macroalga parda) y Synechocystis sp. (cianobacteria) Antioxidantes y antimicrobianos: ácidos grasos Fitol, fucosterol, neofitadieno, ac. palmítico, ac. palmitoleico y ac. oleico.
Screening for bioactive compoundsfrom algae. Plaza M, Santoyo S, Jaime L, García-Blairsy ReinaG, Herrero M, Señoráns FJ, Ibáñez E.
2010. J Pharm Biomed Anal. 51(2): 450-455
Himanthalia elongata Synechocystis sp
Fluorotaninos: polifenoles de plantas y algas Asociados a la pared celular o solubles Su nivel de producción varía con nutrientes, edad, herbivoría. Inhiben enzimas digestivas (α-amilasa y α-glucosidasa) Efectos anti-diabetes = disminuyen absorción de carbohidratos.
Antiinflamatorios: (-) proliferación céls cancerígenas. (-) cáncer de colon
Actividad antioxidante
Contents of soluble, cell-wall-bound and exuded phlorotannins inthe brown alga Fucus vesiculosus, with implications on theirecological functions. Riitta Koivikko, Jyrki Loponen, Tuija Honkanen, and Veijo Jormalainen
2005. Journal of Chemical Ecology 31(1): 195-212
Bioactivos de Microalgas Eucariontes
PUFAs, pigmentos, toxinas Dinoflagelados, diatomeas Forman mareas rojas (red tides, HABs [harmful algal blooms],
FAN [Floraciones de algas nocivas]) Alexandrium, Dinophysis, Prorocentrum y Pseudonitzschia
Distribución mundial de A. catenella
• Microalgas y Cianobacterias: ↑ diversidad de compuestos bioactivos.
• Compuestos alelopáticos: Efectos inhibitorios contra depredadores ycompetidores (~10 m alrededor en plantas).
• Alcaloides, péptidos cíclicos, terpenos, compuestos orgánicos volátiles.
• Toxinas: inhibidores enzimáticos o interfieren con receptores demembrana.
• Mecanismo de acción: diversos• (-) fotosíntesis, (+) estrés oxidativo, parálisis celular.
• Rol ecológico: efectos negativos sobre fotótrofos, invertebrados yvertebrados.
• No se conoce el rol de los alcaloides en la naturaleza: (plantas,acumuladores de N).
Algal and cyanobacterial secondary metabolites in freshwaters: acomparison of allelopathic compounds and toxins. Jesephine Leflaive,Loïcten-Hage
2007. Freshwater Biology 52(2): 199-214
El cambio de color en el agua depende de:
Tipo de organismo involucrado Concentración de los organismos Profundidad en la que se distribuyen
Marea Roja: Red Tides
Se conocen cerca de 27.000 especies de microalgas planctónicas ybentónicas.
Hábitat: ambientes húmedos, dulceacuícolas, estuarinos y marinos. 405 spp forman florecimientos, 131 spp son tóxicas o nocivas. NO existe un catálogo que incluya todas las especies Su descripción completa aun no está disponible
Fitoplancton
Diatomeas (100.000 spp) Dinoflagelados (>100.000 spp) Silicoflagelados Coccolitofóridos (300 spp) Fitoflagelados Bacterias Cianobacterias
Grupos taxonómicos del Fitoplancton
Grupostaxonómicos del
Fitoplancton
Accionespreventivas
Toxinas en Microalgas Eucariontes
Diatomeas producen Acido Domoico Aminoácido que compite con glutamato en cerebro
Toxina amnésica (Amnesic Shellfish Poisoning [ASP]) Producida por Pseudonitzschia y Nitzschia navis-varingica. Se bioacumula en moluscos, crustáceos y peces. Produce degeneración neuronal por influjo excesivo de calcio y agua →
Necrosis cerebral Neurotoxina → pérdida de memoria reciente, daño cerebral y muerte. No se inactiva con calor o frío. Hitchcock: “The birds”
Acido domoico
Pseudonitzchia sp
Ac domoico
Toxinas en Microalgas Eucariontes
Toxinas producidas por dinoflagelados (Prorocentrum,Dinophysis)
Toxina diarreica (Diarrheal shellfish poisoning [DSP]) La intoxicación produce diarrea, vómitos y calambres Acido Okadaico → (-) desfosorilación en céls intestinales ↑ permeabilidad al agua → deshidratación
Acido Okadaico
Dinophysis
Toxinas de Microalgas Eucariontes
Alta similitud genética entre cepas de A. catenella chilenas y lasprovenientes del resto del mundo
• Produce saxitoxina (neurotoxina)• Paralytic shellfish poisoning (PSP)
Alexandrium catenella
Villanueva 2005. Biografía y análisis retrospectivo de Alexandrium catenella (Dinoflagelado) en la zona Austral de Chile
La temperatura es uno de los factores que ↑ la biomasa de células
Bioactivos de Microalgas EucariontesAplicaciones biotecnológicas
• Producción de PUFAs: Acidos grasos poliinsaturados• Omega 3, 6 y 9: prevención de enfermedades cardiovasculares yAlzheimer, ↓ depresión, (-) cáncer.• EPA (ac. eicosapentaenoico C20:5, n3) y DHA (ac. docosahexaenoicoC22:6)
Bioactivos de Microalgas Eucariontes
• Existen pocas cepas productoras de EPAy DHA en alta concentración.
• Schizochytrium (DHA), Crypthecodinium(DHA), Phaeodactylum (EPA).
• La mayoría de las investigaciones estáncentradas en la búsqueda de nuevascepas y la optimización del cultivo.
• DHA y ac γ-linoleico: uso farmacológico,cosmético, alimentario.
Bioactivos de Microalgas Eucariontes
• Carotenoides• Astaxantinas y cantaxantinas
• Dunaliella: proteínas (60%), lípidos(β-caroteno, 6-18%), glicerol(10%), vitaminas.• Precursor de Vit A
• Haematococcus pluvialis:astaxantina (antioxidante)• Es el mas poderoso de losantioxidantes
Dunaliella Haematococcus
Bioactivos de Microalgas: Carotenoides
• Carotenoides
Haematococcus pluvialis
Cultivo H. pluvialis
Cultivo raceways
Bioactivos de Microalgas: Carotenoides
Astaxantina (terpeno) Antioxidante
Bioactivos de Microalgas Eucariontes
• Secuestro de CO2• Reducción de gas invernadero• Obtención de biomasa:
• Proteínas• Lípidos• Carbohidratos
• Biocombustibles:• bioetanol: azúcares• biopetróleo: ácidos grasos
Cyanobacteria secondary metabolites:the cyanotoxins (Procariotas)W.W. Carmichael
• Cianobacterias son algas verde-azules (No algas verdaderas).
• Fuente de vitaminas y proteínas.
• Fuente de químicos, biocombustibles y bioactivos.
• Antitumorales, anticáncer, antibióticos, antimicóticos, antivirales,antioxidantes.
• Producción de toxinas: citotoxinas, neurotoxinas, hepatotoxinas
• Primer reporte de toxinas desde cianobacterias
• "a thick scum like green oil paint, some two to sixinches thick. Wildlife which drank the water died rapidlyand terribly”.
• Principalmente en agua dulce
Toxinas en cianobacterias
Microcistina
1992. Journal of Applied Bacteriology 72: 445-459
Nodularina
Toxinas en cianobacterias
J. Sep. Sci. 2006, 29: 399 – 404
Electropherograms of seven PSTs obtained from CITP/CZE analysis. The standard solution used in theexperiments contained 9.3 lM dcSTX, 12.0 lM STX, 9.2 lM NEO, 7.4 lM GTX-2, 8.9 lM GTX-3, 13.2 lM GTX-1, and4.4 lM GTX-4. The experimental conditions were 30 mM morpholine buffer (pH 5.3), 14 kV separation voltage,1.2 min duration time in the CITP process and 10 mM formic acid (pH 2.7) as the terminating electrolyte.
PSTParalytic Shellfish Toxins
1 especie = muchas toxinas
Moléculas formadas por 53 péptidos cíclicos o anularesemparentados entre sí.
Intoxicación:Los péptidos activan retracción de células hepáticas →separación de células vecinas → las células que formancapilares sinusoides se separan → La sangre inunda lostejidos → Shock
Hepatotoxinas
Actúan sobre el citoesqueleto celularAfectan principalmente a filamentos intermedios y
microfilamentos.
Intoxicación: Inducen contracción del citoesqueleto → Pérdida de
interdigitaciones → Separación de células → Necrosishepática.
Mecanismo acción Hepatotoxinas
Proteínas inhibitorias de fosfatasasFosfatasas y Quinasas: regulan estado de
fosforilación de proteínas
Intoxicación:Descontrol de las quinasas → Fosforilaciónexcesiva de microfilamentos y filamentosintermedios → aumenta la velocidad de disociacióny pérdida de subunidades.
Mecanismo acción Hepatotoxinas
Quinasas y fosfatasas: Regulación de la divisióncelular → Activación de Factores de transcripción →(+) velocidad de formación de tumores
¿Por qué las toxinas actúan preferentemente a nivel delhígado?
Los hepatocitos poseen transportadores específicos quefacilitan el movimiento de las toxinas.
Mecanismo acción Hepatotoxinas
Sustancias capaces de dañar células, pero no llegan amatar a organismos pluricelulares.
Se cree que estas toxinas en el pasado podrían habertenido alguna función más crítica, además de actuarsólo como medio de defensa.
Ej. En la división celular de Cianobacterias
Citotoxinas
Síntomas de intoxicación por cianotoxinas :
Parálisis Pérdida del conocimiento Pérdida del equilibrio y movilidad Convulsiones Espasmos
Enriquecimiento de ambientes acuáticos con N y P (detergentes yfertilizantes).
Cianobacterias: fijan N Aumento de la biomasa de cianobacterias Aumento de la concentración de toxinas por unidad de volumen Dosis crecientes de toxinas contribuyen a la formación de tumores
Causas que favorecen el crecimiento de blooms(HAMBs: harmful microalgal blooms)
Anabaena
Cianotoxinas
Cilindrospermopsis raciborskii
STX, GTX2, GTX3, dcSTX, dcGTX2, dcGTX3
Cilindrospermopsina
• La toxina es un alcaloide: derivado de aminoácidos• Resistente a T⁰ y pH• Rápida degradación con luz solar• Inhibe síntesis de glutatión y proteínas• Induce necrosis de hepatocitos y acumulación de lípidos en hígado y riñones.
Stx: saxitoxinas; GTX, goniautoxinas, dcGTX: decarbamoigoniautoxinas
Cianotoxinas
Anabaena circinalis
STX, GTX2, GTX3, dcSTX, dcGTX2, dcGTX3
Anatoxina a-S-
• La toxina es un alcaloide producido por 4 géneros distintos• Neurotoxina: parálisis respiratoria (Paralytic Shellfish Poisoning)• Bloquea receptores de acetilcolina → (-) contracción muscular: calambres yparálisis• Conocida como "Very Fast Death Factor“ (bovinos).
Mecanismo acción Anatoxina
Imita a la acetilcolina
Condición normal:Neuronas liberan acetilcolina → se une a receptor → se abre canaliónico → (+) contracción muscular → cierre del canal → Receptoreslibres para nuevas moléculas de acetilcolina → Acetilcolinesterasadegrada acetilcolina → evita la hiperestimulación muscular.
Intoxicación:Anatoxina-a no es degradada por la acetilcolinesterasa ni otra enzimaeucariótica → estimulación permanente de contracción muscular →Calambres y parálisis.
No hay cura
Cianotoxinas
Saxitoxinas
• Neurotoxina producida por cianobacterias y dinoflagelados (eucariotas).• Se bioacumula en moluscos.• Termoestable• Soluble en agua• Produce parálisis por envenenamiento por consumo de moluscos• Bloquea los canales de sodio dependientes de voltaje.• Parálisis respiratoria (Paralytic shellfish poisoning)• No existe antídoto
Impiden liberación de acetilcolina.Condición normal:Impulso viaja por axón según flujo iones Na+ y K+ →→ axón terminallibera Neurotrasmisores (Ac).
Intoxicación:Bloquean flujo de iones →→ (-) secreción acetilcolina.
Principalmente producidas por dinoflagelados, menos conocidas lasproducidas por Anabaena.
Mecanismo acción Saxitoxina yNeosaxitoxina
Cuadro clínico:Muy variable en intensidad y duración (hasta 72 horas desde la ingesta delmarisco contaminado)
Hormigueo (parestesia) y adormecimiento de la zona perioral yde extremidades.
Debilidad muscular cervical (incapacidad para mantener lacabeza erguida)
Disfagia, disartria, disfonía y dificultad para deglutir. Dificultad para caminar: Síndrome vertiginoso. Náuseas, vómitos, cefalea. Puede causar muerte por parálisis respiratoria. La mortalidad está en relación directa con la cantidad de toxina
ingerida.
Síntomas mas frecuentes
Intoxicación mínima: Hormigueo en labios, lengua, cuello y extremidades Náuseas, mareo y cefaleaModerada: Dificultad para hablar Debilidad de piernas y brazos Hormigueo, sensación de cuerpo extraño, sensación de
ceguera y disnea (falta de aire).Severa: parálisis muscular severa.
Síntomas de intoxicación
• Sonda nasogástrica• Inducción del vómito• Lavado gástrico• Hidratación parenteral (suero)• Apoyo ventilatorio• Aumento de la volemia• Inducción de la diuresis• Drogas vasoactivas
Tratamiento