癌への遺伝子・ウイルス治療薬 と肝疾患への再生医薬 平成20年11月14日 南九州発新技術説明会 小戝 健一郎 鹿児島大学大学院医歯学総合研究科 先進治療科学専攻 運動機能修復学講座 遺伝子治療・再生医学分野 教授 (兼任) 1. 久留米大学高次脳疾患研究所 客員教授 2. 聖マリアンナ医科大学 客員教授 3. 岐阜大学医学部 特別協力研究員 (連絡先)電話 099-275-5219 E-mail: [email protected]
癌への遺伝子・ウイルス治療薬
と肝疾患への再生医薬
平成20年11月14日 南九州発新技術説明会
小戝 健一郎
鹿児島大学大学院医歯学総合研究科 先進治療科学専攻
運動機能修復学講座 遺伝子治療・再生医学分野 教授
(兼任) 1. 久留米大学高次脳疾患研究所 客員教授2. 聖マリアンナ医科大学 客員教授3. 岐阜大学医学部 特別協力研究員
(連絡先)電話 099-275-5219E-mail: [email protected]
1. 癌への革新的なウイルス/遺伝子治療薬
• 年間癌死亡数は依然増加していることからも、既存の治療法では癌の根治は不可能で、革新的な治療法の開発が必要。
• 遺伝子治療はその有力候補の一つで、臨床試験で安全性は確証できた一方、既存の方法では治療効果に限界があった。
• 革新技術開発や事業化にも、根幹技術であるベクターの独自開発が最重要事項だが、本邦の取り組みは乏しい。
• 現在、癌遺伝子治療で有望なベクター/戦略は、CRA(癌制限増殖アデノウイルス)だが、標準化できる効率的作製法がないため、既存のものは単純なCRAであり、「医薬として安全性、治療効果のさらなる向上が難しい」、「ベクター受託販売の事業化もできない」という技術的問題が残っていた。
研究背景、従来技術とその問題点
1. 癌への革新的なウイルス/遺伝子治療薬
1. 効率的なm-CRA作製技術• 従来の「非効率な手作り」状況を克服する「標準化m-CRA作製法」を
初めて開発。• 桁違いの作業効率(ex. 従来の「手作り」で専門家が1つのCRA作製に
半年かけていた作業が、テクニシャンでも一、二ヶ月で10〜20個作れる)→初めてCRAベクターの受託作製事業が可能
• 次世代のm-CRA医薬(従来の単純CRAと一線を画す、安全性と治療効果の両方が向上した、高度なm-CRA医薬を開発できる技術
2. サバイビン反応性m-CRA(癌治療医薬)• このm-CRA作製技術で、従来有望なテロメラーゼ反応性CRAを癌治
療医薬の性能で遥かに凌ぐサバイビン反応性m-CRAを開発→医薬化を進めている
新技術の特徴、従来技術との比較(要点)
癌の既存治療法の限界と新治療法開発の社会的要請
癌は未だに本邦、先進国の最多死因!
•本邦の年間癌死亡数 32万人
•本邦の年間癌発症者数 53万人
これらの問題を克服するため
革新的な治療法の革新的な治療法の開発が必要開発が必要!!!!
遺伝子治療はアデノウイルスp53の一般医薬販売→遺伝子医薬の市場基盤も形成中
JST大学発ベンチャー創出推進 (H19年度採択
→H22ベンチャー起業予定)
第3次対がん10カ年総合戦略(厚生労働科学研
究)革新的治療法の開発の分野(小戝班)
正常細胞→ウイルスは非増殖
→正常細胞の障害無し
癌細胞→ウイルスが増殖
→癌細胞を殺傷
原発巣
遠隔転移巣
癌特異的増殖型ウイルスを腫瘍内へ注射
癌細胞特異的にウイルスが増殖し癌細胞を殺す
既存の治療法では癌の根治は不可能•多発転移癌への効果的治療法はない•癌のみを特異的に治療できない
癌遺伝子治療の歴史と臨床化の現状(1)1990年 初の遺伝子治療臨床試験(ADA欠損症)
1991年 癌に対する遺伝子治療開始
現在 遺伝子治療の世界の1300以上の臨床プロトコールにおいて、主対象疾患(67%)は癌、主使用ベクター (25%)はアデノウイルス(ADV)
• 全16(内、癌10)プロトコール•• オリジナルオリジナル性乏しい?( ベクター/治療遺伝子の知財権利無しなら・・・知財権利無しなら・・・)
本邦の現状と問題点
医薬化できず医薬化できず、本邦本邦の国民福祉国民福祉と経済の向上に繋がり難い?と経済の向上に繋がり難い?
癌遺伝子治療の歴史と臨床化の現状(2)1990年 初の遺伝子治療臨床試験(ADA欠損症)
1991年 癌に対する遺伝子治療開始
臨床試験
ベクター 遺伝子導入法(投与法)
治療遺伝子 ①臨床試験の結論と医薬化の現状/②問題点
①90年代初頭
レトロウイルス
Ex vivo サイトカイン ①②治療効果乏しく、経費莫大で、臨床化ならず
②90年代後半〜
非増殖型ADV
In vivo(腫瘍単結節への注射)
自殺遺伝子、サイトカイン遺伝子など多種
①安全で、一部が一般医薬化実現/②治療効果未だ不十分
③2000年代〜現在
癌優位増殖型ADV (CRA)
In vivo( 腫瘍単結節への注射)
増幅ウイルスの癌溶解効果が主体
①臨床試験で安全で治療効果も改善/②癌特異化、治療効果が完全ではない
現在 遺伝子治療の世界の1283の臨床プロトコールにおいて、主対象疾患(67%)は癌、主使用ベクター (25%)はアデノウイルス(ADV)
④
我々の技術
多因子で癌特異化m-CRA
In vivo( 腫瘍単結節注射→微小遠隔転移癌)
増幅ウイルスの癌溶解効果+癌特異的に作用する治療遺伝子
研究レベルでは、格段に増強した精密な癌特異標化と治療効果→革新的医薬の潜在能力
癌遺伝子治療用のアデノウイルスの変遷従来の「非」増殖型アデノウイルス(90’前半〜)
○ 作製法が確立。臨床化で安全だが・・
X 遺伝子「未」導入癌細胞からの再発
ベクターの腫瘍内投与
癌結節遠隔転移巣
周囲の癌巣
ADVゲノムΔE1
治療遺伝子
m-CRA(多因子で精密に癌特異化する増殖型アデノウイルス)の迅速効率な作製法を独自開発
P1:増殖制御
E1A
LoxH
(1) (3) (4)(2)
E1B
E1B∆55K
Promoter A Promoter B
I-CeuI PI-S
ceI
pA
kanr pUC ori
E1A∆24
P2:治療遺伝子導入
(5) (6)
LoxP治療遺伝子
tetrR6Kγ ori
pA
Promoter C
P3: ADV
I-Ceu
I
PI-S
ceI
PacI
Adenovirus genome
Sw aI
ITR PacI
ITRFiber
(7以上)
ampr pUC ori
遺伝子治療+
溶解性ウイルス療法
◎ 癌への遺伝子導入効率の向上。癌溶解性作用
△ 単一因子で癌の特異化が未だ不十分
X 効率的作製法なし」→手作りで非効率な研究
CRA(癌特異的増殖型アデノウイルス)(90’後半〜)
ADVゲノムE1
タイプ 2タイプ 1
ADVゲノムE1
ΔRb, p53結合領域 癌特異的プロモーター
溶解性ウイルス療法遺伝子治療
(1) E1A発現用Promoter(2) Rb結合領域欠損(3) E1B発現用Promoter(4) E1B55kDの欠損(5) 治療遺伝子発現用Promoter(6) 治療遺伝子(7) Fiber改変など
(8) ・・・・・・
7因子以上の腫瘍特
異化因子を挿入可能
独自開発の初めての標準化m-CRA作製技術
P1:増殖制御
E1A
LoxH
(1) (3) (4)(2)
E1B
E1B∆55K
Promoter A Promoter B
I-Ceu
IN
otI
Mlu
ISn
aBI
PI- S
ceI
BG
HpA
Nde
IM
feI
EcoR
VSalI
kanr pUC ori
E1A∆24or or
P2:治療遺伝子導入
(5) (6)
LoxP
治療遺伝子
tetrR6Kγ ori
BGHpA
Age
IA
paI
StuI
XhoI
Sac I
Promoter C
P3: ADV
I-Ceu
I
PI-S
ceI
PacI
Adenovirus genome
SwaI
ITR PacI
ITRFiber
(7以上)
ampr pUC ori
Cre → DH5α+ Tet
293細胞
P1
Kanr pUC
P2
Tetr R6Kγ
P3
Ampr
P1+2
pUC Tetr
P1+2+3Ampr
Tetr
I / PI ライゲーション→ DH5α+ Amp
293細胞
P1
Kanr pUC
P1+2+3Ampr
Tetr
P3
Ampr
P1+3
Ampr
P2
Tetr R6Kγ
Cre → DH5α+Tet
I / PI ライゲーション→ DH5α+ Amp
P1
Kanr pUC
P3
Ampr
P1+3
Ampr
P2
Tetr R6Kγ
恒常的Cre発現293細胞
I / PI ライゲーション→ DH5α+Amp
3プラスミドシステム3プラスミドシステムパーツ作製
→自由に組み合わせ1. 1. パーツ化パーツ化
①①増殖部、増殖部、②②治療遺伝子、治療遺伝子、③③ADVADV
2. 2. 融合融合
①①リコンビネーションリコンビネーション②②Unique ligationUnique ligation
3. 3. セレクションセレクション①①OriOri、、②②抗生剤耐性抗生剤耐性((AmpAmprr, , KanKanrr TetTetrr))
•Nagano S et al. Kosai K. Gene Ther (2005) •国際出願→欧米日指定国移行中(JST特許支援事業)
基本特許1
新開発m-CRAのSurvivin依存性m-CRAは画期的癌治療薬となる(特許2)
Survivinとは?
1. Inhibitor of apoptosis gene family 2. G2/M期に最大発現しmicrotublesへ作用 3. ほとんどの癌で高発現、正常組織では発現が未検出 4. 発現レベルと癌患者の悪性度が相関
Survivin依存性CRAADV genomeE1
EGFPE1BΔ55KSurvivinpromoter
CMVpr CMVpr(wt or mt)E1A
正常細胞• Survivin 発現 (-)• ウイルス増殖/細胞障害 (+/-)
1 3 5 7日後
癌細胞• Survivin 発現 (++〜+++)• ウイルス増殖/細胞障害 (+++)
全種類全種類の癌
が治療適応医薬特許
HE染色
×20
×100
Surv.CRAはマウスの皮下腫瘍(骨肉腫)を劇的に殺し縮小させる
Kamizono J. et al. & Kosai K. Cancer Res (2005)国際出願→米日指定国移行
肉眼的解析
組織学的解析
非増殖型ADV(コントロール)
広範囲な壊死
顕微鏡観察では生存癌細胞
はない
腫瘍結節の壊死化
Surv.CRA wt Surv.CRA mt
我々が開発したSurvivin依存性CRAを既存では最高のCRAと性能比較
Surv.CRAwtTert.CRAwtAd.∆E1
1 3 5 7Days after infection
EGFP
-pos
itive
cel
ls (%
)
HepG2 HOS-MNNG
020406080
100
#
* * * ** *
*WI-38
** * *
CRAのウイルス増殖速度
正常線維芽細胞肝癌 骨肉腫
1 3 5 7 1 3 5 7
020406080
100120140160180
HepG2 HOS-MNNG WI-38
Ad.Surv-LacZAd.Tert-LacZ
Rel
ativ
e pr
omot
er a
ctiv
ity
(% o
f Ad.
CM
V-La
cZac
tivity
)
Promoter活性
正常線維芽細胞肝癌 骨肉腫
Days after virus injection
Surv.CRAwt
Ad.ΔE1Tert.CRAwt
0 4 7 11 14 18 21 25 28 32 35Tu
mor
vol
ume
(mm
3 )0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
* * *
マウス腫瘍モデルでの腫瘍抑制効果
結節内は癌細胞死で癌治療効果はさらに大
Survivin
TERT
MKN-1
MKN-45
HCT-15
LoVo Colo-205
HepG2
Hep3B
Hela HOS-MNNG
KHOS-NP
SaOS-2
293 Neg.Osteo-blast
WI-38
mRNA (内因性発現レベル) 癌 正常細胞
我々のSurvivin依存性CRAは(初期型ですら)、既存では最高のTelomerase依存性CRAを、癌特異性(安全性)、癌治療効果の両面で凌ぐ Cancer Res (2005)/ 国際出願→米日指定国移行
技術面のまとめ
原権利 ①m-CRA作製方法(試薬) ②サービビン反応性m-CRA(医薬)
新規性 世界初で「唯一」の技術 新規の癌治療医薬
競争優
位性
• 事業化しうる他技術はない
(累乗レベルの効率の違
い)*従来のCRA作製:専門家のみ可能で、「手作業」で半年に1個作製。
*本法:素人の技術員でもプロトコールに従い一度に複数検体を扱い1ヶ月に20〜30個以上を作製。
• 癌治療医薬として従来の
CRAより遥かに優れた性能
を持つm-CRAを作製可能
•(我々にとっての)初期型
ですら、既存で最高のCRA(テロメラーゼ依存性
CRA)を、癌特性(安全
性)、癌治療効果の両面で
凌ぐ
→最高性能のCRA癌治療薬
•我々のm-CRA化技術で、
さらに優れた癌治療薬に改
良されている
事業構想
試薬(研究支援)事業
医薬開発事業
GMP医薬
供給事業
1. m-CRAの受託作製販売(300〜 万円/件)
2. カスタムメードm-CRAの販売3. m-CRA作製キット、各オプションパーツ試
薬の販売
m-CRAベクター(特許1)
細胞移植療法
特許3:心疾患の遺伝子医薬
特許4:肝疾患の再生医薬
移植細胞
特許6:ES細胞再生医学
その他特許
m-CRAのGMP 医薬供給(数千万円〜2億円
/臨床試験第一相)
癌治療薬
1. Survivin反応性CRA(特許2)• 脳腫瘍、消化器癌、骨軟部• 適応拡大(全癌に対応の能力)• 改良型のSurvivin依存性m-CRA
2. 同様に新規の第二、第三弾、・・・m-CRA癌治療医薬を次々に開発→一般医薬化
3. 癌幹細胞を治療するm-CRA医薬(全く新規の治療法)
1. 癌への革新的なウイルス/遺伝子治療薬<事業化>
平成22年4月にベンチャー創業予定
企業への期待
①m-CRAの受託作製販売の試薬(一部医薬)事業•研究者向けの受注販売を試薬メーカーと提携したい•創薬、製薬企業と、共同で癌治療薬を開発(委託作製)したい
②Surv.m-CRA(癌治療)の医薬事業•臨床試験予定のSurv.m-CRA(臨床試験先、GMP医薬供
給先の海外施設はほぼ確定)だけでなく、開発中の第二、第三弾の新規m-CRA医薬も含め、製薬企業と提携・共同
で医薬開発・事業展開したい
2. 肝疾患の再生治療薬
• 肝疾患への既存の医薬は、対症療法にすぎない。つまり直接的に「病気の進展を止め治癒を促す」根治医薬は未だない。
• 現在注目される再生医療の中でも真に理想的な戦略は、「生体内で臓器を再生治癒」する医療である。肝臓は生後も再生能力を保持しているため、その可能性がある。
• 我々はHGF(肝細胞増殖因子)が、直接的に「肝細胞死を強力に阻止し、肝細胞再生を誘導する」、肝疾患への根治医薬となる可能性を見いだした。これは蛋白質製剤として魅力的シーズであるが、一方でHGFは物質特許も複雑で、既に世界中で研究がなされている。
研究背景、従来技術とその問題点
再生医学(医療)
(2)体外で新たに再建した細胞や組織を移植
(再建医学)
心筋細胞神経細胞多くの臓器
(1)生体の元来の再生能を利用して生体内で再生
(生体内再生医学)
血球細胞肝細胞皮膚血管細胞
骨髄幹細胞臓器幹細胞ES(胚性幹)細胞
薬剤組み換え蛋白遺伝子治療
急性肝炎(本邦で年間数万人?発症)↓1〜2%(約1000人?)が劇症肝炎へ進展
↓60〜70%が死亡
劇症肝炎とFas•原因
肝炎ウイルス(>90%)、薬剤、その他
•病態ウイルス感染肝細胞への過度の免疫などによる異常なアポトーシス(細胞死)亢進
•治療法根治療法なし
•予後不良(70%の死亡率;数日〜数週間)
生体内再生治療ー我々はまずHGFでこの革新治療手法を示したー
HGF
急性肝炎
劇症肝炎
死亡
FasTNF-α
壊死
Kosai K, et. al. BBRC (1998)Kosai K, et. al. Hepatology (1999)
HGFSaline
HGF: 肝細胞増殖因子肝再生の本体の因子
Kosai K, et. al. Hum Gene Ther (1998)肝再生
治癒
劇症肝炎は治療できる
生体内で治療と再生→ 最適の再生医療
但し、HGFはやり尽くされている
→同じ治療手法で、新しい物質の探索へ!
遺伝子治療研究によるHB-EGFとCD9の生体内機能の解明と治療法開発
IntegrinIntegrin
CD9CD9
HBHB--EGFEGF
心、肝:①臓器形成因子。②成体の障害後も発現上昇
• 膜4回貫通蛋白; MRP-1• IntegrinとHB-EGFと複合体形成• proHB-EGF作用を増強
• 卵に発現し、受精の際に精子と卵の融合に必須の膜蛋白
肝臓
肝障害後にHGFより先にHB-EGFが発現、慢性
肝炎でHB-EGFは高発現→HB-EGFは肝栄養因
子でありそう→新たな肝再生治療薬になる?
Miyado K., Kosai K., et al. Science (2000)
心臓
Ushikosi H, et al. & Kosai K. Lab Invest (2005)
① 心筋細胞死に無影響② 血管新生作用無し③ 線維化、筋線維芽細
胞、マクロファージの集積を促進
④ 心筋細胞肥大
リモデリング促進、病態悪化の中心的因子XX--galgal染色染色TTC/Evans BlueTTC/Evans Blue
心筋梗塞後に梗塞巣周囲でHB-EGF遺伝子強発現
HB-EGFの肝障害抑制作用、
肝再生促進作用を検証!
ADV injection Anti-Fas injectionSacrifice (36h)
Sacrifice (24h)
0 24 48 72 96 108 hours
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
HB-EGFはHGFより強力な肝治療(保護+再生)作用を持つ
Ad.dE1.3
血清
ALT
値(
IU/L
) 60
70
50
40
30
20
10
0
Ki-6
7-po
sitiv
e ce
lls(%
)
Ad.dE1.3Ad.HGF
P=0.22
*
*
*
Ad.HGFAd.HB-EGF
* *
P=0.66
# P<0.05
#
P=0.72
*
Ad.HB-EGF
肝障害 肝再生
結論1. マウスのFas誘導劇症肝炎へのアデノウイルスによるHB-
EGF、HGF肝遺伝子治療は、肝障害を強力に抑制し、肝再生
を強力に誘導した2. 肝障害抑制作用(肝酵素)は、HB-EGFの方がHGFより強力
であった。3. 肝細胞への抗アポトーシス作用(TUNEL染色、肝病理組織)
は、HB-EGF、HGFとも同等に強力であった。4. 肝再生誘導作用(Ki67免疫染色)はHB-EGF、HGFとも強力
だが、特に早期の肝再生はHB-EGFの方がより強力であった。
HB-EGFはHGFより強力な新規の肝疾患(急性肝
炎!劇症肝炎!肝障害一般)治療薬になる
NC Khai et al. & Kosai K. J Hepatol (2006)
急性肝炎(本邦で年間数万人?発症)↓
1〜2%が劇症肝炎へ進展↓
60〜70%が死亡(根治療法なし)
肝疾患を生体内で再生治療するHB-EGF医薬(特許3)
HB-EGF
急性肝炎
劇症肝炎
死亡
FasTNF-α
壊死
肝再生
治癒
劇症肝炎は治療できる
1. 画期的な肝再生治療薬(肝障害をみつけたらHB-EGFの注射で病気が治る
→臨床化し易い)
2.2. HBHB--EGFEGFはHGFよりさらに治療効果、再生効果が強い
3. 新規性高い(特許性高い;まだHGFほど研究されてない)
4. 急性肝炎への蛋白質製剤としての開発は、極めて現実的である。
5. 他の肝疾患へも適応拡大できる
J Hepatol (2006)日米欧に指定国移行中(JST特許支援事業)
2. 肝疾患の再生治療薬<事業化>
企業への期待
まずはHB-EGFの蛋白質製剤として、製薬
企業と提携・共同で医薬開発したい
お問合わせ先
鹿児島大学
産学官連携推進機構 産学官連携部門中武貞文
TEL 099−285−8491FAX 099−285−8495e-mail [email protected]
*技術については小戝(連絡先1頁目記載)へ