Chromatographie - agregationchimie.free.fr

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IV

V

VI

VIIVIII

Martin VÉROT

Chromatographie

Ce polycopié s’adresse en premier lieu aux étudiants préparant l’agrégation de chi-mie à l’ENS de Lyon. Il correspond à un cours d’une durée de 4h pour des étudiants ayantdéjà pratiqué des méthodes chromatographiques lors de séances de travaux pratique lorsde leurs études. Il se focalise en premier lieu sur une approche plutôt liée à la chromato-graphie en phase vapeur, méthode pour laquelle il est plus simple et plus facile d’avoiraccès à des données quantitatives liées à la chromatographie. Les données temporellessont donc mise en avant, mais cela ne nuit pas à la généralité des approches discutées.

En tant que profane, la chromatographie reste un art subtil qui mêle modèles théo-riques physico-chimiques complexes et aspects pratico-pratiques. Les approches pure-ment phénoménologiques y côtoient abondamment des interprétations théoriques desplus complexes. Elle mélange allègrement différents pans entiers de la physico-chimie :cinétique, thermodynamique, statistique, diffusion, mécanique des fluides, interactionsmoléculaires, etc. J’ai beaucoup appris en créant ce polycopié, j’espère que le patchworkde mes lectures diverses est suffisamment bien soudé pour fournir une vision tout demême solide des bases de la chromatographie.

J’invite le lecteur à lire des ouvrages plus avancés parmi ceux cités dans la bibliogra-phie pour explorer plus en détail le domaine.

— La référence [1] est une bonne introduction en français.— Les références [2] et [3] sont plus complètes ;— La référence [4] est plus focalisée sur les aspects théoriques.— La référence [5] est plus spécifique à la CPV;— Les références [6] et [7] à l’HPLC.

Ce polycopié constituant au mieux une introduction aux méthodes chromatographiques.

J’espère que ce cours satisfera le lecteur. N’étant pas spécialiste du domaine, n’hésitezpas à m’envoyer vos remarques sur Twitter (@MartinVerot) ou mon adresse mail profes-sionnelle.

https://twitter.com/MartinVerot

Table des matières

1 Concepts de base et historique 51.1 Vocabulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51.2 Mesures directes et grandeurs caractéristiques d’un pic unique . . . . . . . . 71.3 Mesures liées à deux pics différents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101.4 Ce qu’il faut retenir . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2 Modèles théoriques et nombre de plateaux 132.1 Un modèle « statique » : le modèle de Craig . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.1.1 Hypothèses du modèle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132.1.2 Code python de démonstration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152.1.3 Conclusion et limites du modèle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

2.2 Notion de plateau et de hauteur de plateau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162.3 Équations donnant la hauteur de plateau en fonction de la vitesse moyenne 17

2.3.1 Équation de Van Deemter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172.3.2 Équation de Golay pour les colonnes capillaires . . . . . . . . . . . . 202.3.3 Équation de Knox pour la chromatographie en phase liquide . . . . 212.3.4 Une équation pour les gouverner tous et les lier? . . . . . . . . . . . 21

2.4 Ce qu’il faut retenir . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

3 Optimisation d’une séparation 233.1 L’optimisation, une affaire de compromis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233.2 Optimisations générales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

3.2.1 Optimisation de la résolution : facteurs d’influence globaux . . . . . 243.2.2 Longueur de la colonne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253.2.3 Structure de la colonne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

3.3 Optimisations pour la chromatographie en phase gaz . . . . . . . . . . . . . 263.3.1 Choix du gaz vecteur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263.3.2 Influence du dimensionnement de la colonne . . . . . . . . . . . . . . 283.3.3 Choix de la température . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283.3.4 Choix de la pression/du débit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

3.4 Optimisations pour la chromatographie en phase liquide . . . . . . . . . . . 313.4.1 Influence de la taille des particules et du garnissage . . . . . . . . . . 313.4.2 Choix de la pression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 313.4.3 Choix de la phase stationnaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323.4.4 Choix de l’éluant . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343.4.5 Gradient de température et pression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

3.5 Ce qu’il faut retenir . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

4 Méthodes chromatographiques 414.1 Chromatographie sur couche mince (CCM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

4.1.1 Méthodes de révélation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 424.2 Chromatographie en phase gaz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

4.2.1 Injection split ou splitless . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 424.2.2 Détecteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

4.3 Chromatographie haute performance en phase liquide (HPLC) . . . . . . . . 444.3.1 Injecteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 444.3.2 Détecteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

4.4 Chromatographie d’échange ionique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 454.5 Chromatographie d’exclusion stérique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 454.6 Ce qu’il faut retenir . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

5 Méthode analytiques 475.1 Méthodes quantitatives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

5.1.1 Méthode de l’étalon interne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 475.1.2 Méthode des ajouts dosés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

5.2 Identification (CPV) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 505.2.1 Indice de rétention de Kovats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 505.2.2 Indices de Rohrschneider-McReynolds – polarité des phases sta-

tionnaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 515.3 Ce qu’il faut retenir . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

Appendices 57A Démonstration de la relation de Purnell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57B Propriétés usuelles de quelques solvants courants . . . . . . . . . . . . . . . 58C Problèmes liés à la définition d’une vitesse moyenne . . . . . . . . . . . . . . 59D Aspects historiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

Chapitre 1

Concepts de base et historique

1.1 Vocabulaire

Les méthodes chromatographiques permettent la séparation de différents composés.Elles utilisent toute deux phases pour séparer des composés :

— une phase stationnaire qui est immobile ;— une phase mobile qui bouge dans une direction définie.

Il est possible de découper les méthodes chromatographiques en différentes grandesfamilles, un des découpages courants est de catégoriser en fonction de la méthode sous-jacente de séparation :

— La chromatographie d’adsorption dans lesquelles c’est essentiellement l’adsorptiondes composés sur une phase solide qui est responsable de la séparation.

— La chromatographie de partage dans laquelle la phase stationnaire est un liquideet où la séparation est essentiellement liée à la solubilité du composé dans la phasestationnaire.

— La chromatographie par échange ionique où la séparation repose sur une dif-férence d’affinité avec la phase capable d’échanger des ions. Cette méthode n’estutilisable que pour des molécules chargées.

— La chromatographie par exclusion stérique ou chromatographie d’exclusion oùla séparation repose essentiellement sur une séparation liée à des effets de taille oude forme.

— La chromatographie chirale où la séparation repose sur une différence d’affinitéavec la phase stationnaire qui est elle-même chirale.

Il est également courant de distinguer deux grandes finalités pour les méthodes chro-matographiques :

— La chromatographie analytique qui vise à séparer et analyser chacun des consti-tuants, le but premier est alors d’être en mesure d’avoir une séparation maximaleentre les composés afin de pouvoir identifier chacun des pics avec des métriquesparticulières. Les composés ne sont alors pas nécessairement utilisés après sépara-tion.

— La chromatographie séparative qui vise à séparer et récolter chacun des composés.L’objectif est alors de récolter un maximum des composés séparés tout en gardantune séparation suffisante.

Pour finir, différents acronymes décrives différentes méthodes globales de chromato-graphie :

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— La CCM (chromatographie sur couche mince) qui se réalise par dépôt sur uneplaque solide et permet en général une analyse qualitative de la composition dumélange.

— La GC (gaz chromatography), CPV/CPG (chromatographie en phase vapeur/gaz)qui sous-entend généralement l’utilisation d’un appareil avec un injecteur, une co-lonne et un détecteur où la phase stationnaire est un gaz (le plus souvent hélium,hydrogène, diazote).

— La colonne chromatographique généralement utilisée en tant que méthode sépa-rative et qui permet de récolter les constituants pour les ré-utiliser/analyser.

— l’HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) qui utilise des méthodes à hautepression et qui nécessite donc une pompe.

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1.2 Mesures directes et grandeurs caractéristiques d’un picunique

Lors de la chromatographie, il y a deux visions parallèles :— La distribution spatiale des composés à chaque instant ti fixé f (t = ti, z), elle est géné-

ralement difficilement accessible car il n’y a pas de méthode de détection en chacundes points de la colonne.

— Le chromatogramme qui correspond au relevé du signal fourni par un détecteuren sortie de colonne à la position zsortie : g

(t, z = zsortie)

). Il s’agit de l’équivalent

d’une photo finish et c’est en général la grandeur qui est directement accessible avecle détecteur placé en sortie de colonne. L’abscisse est alors temporelle.

Les deux visions sont évidemment reliées : le chromatogramme est la visualisation de lasuccession des valeurs en sortie de la colonne (figure 1.1).

tempstemps

temps

position z

z = zsortie

Figure 1.1 – Lien entre distribution spatiale et chromatogramme. En haut, la distributionspatiale de deux composés séparés par chromatographie, les courbes sont translatées

vers le haut au fur et à mesure que le temps d’élution augmente. En bas, lechromatogramme résultant qui est la mesure à z = zsortie en fonction du temps.

À partir du chromatogramme, il est possible de mesurer des grandeurs qui quantifientla qualité de la séparation.

Le principe de base de la chromatographie étant la différence d’affinité des composéspour la phase stationnaire et la phase mobile, il est utile de différencier :

— les effets liés au simple mouvement d’ensemble pour aller du début à la fin de lacolonne

— ce qui est dû aux interactions spécifiques du composé avec la phase stationnaire.

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Différentes grandeurs liées au chromatogramme permettent de le caractériser (figure1.2, à gauche). Ils sont liés au temps que met le composé à atteindre le détecteur :

— La plus simple est le temps de rétention tR : il s’agit du temps correspondantau maximum du chromatogramme par rapport à une origine temporelle « quel-conque ».

— Le temps de rétention est généralement mal défini car lié au déclenchement ma-nuel d’un chronomètre. Pour s’affranchir de la répétabilité du déclenchement, il estgénéralement utile de définir un temps de rétention réduit ou corrigé. Pour cela, ondéfinit le temps mort tM d’une colonne comme le temps nécessaire pour un com-posé non retenu d’arriver à la fin de la colonne. Pour la chromatographie en phasegaz, le temps mort est souvent assimilé au temps de rétention du solvant – on leconsidère suffisamment volatile et peu retenu. Mais dans l’absolu, déterminer lavaleur de tM peut nécessiter des expériences particulières.

— À partir de ces deux mesures, il est possible de définir un temps de rétention ré-duit ou temps de rétention corrigé t′R : t′R = tR− tM. Ce temps est indépendant dudéclenchement de l’acquisition et est donc mesurable avec plus de reproductibilité.

tM

tR

t'R

t

composé non retenu

composé d'intérêt

t

60,6

100,0

50,0

0,0

13,5

tR

Figure 1.2 – À gauche : illustration du temps de rétention tR, du temps mort tM et dutemps de rétention corrigé t′R. À droite, grandeurs utilisées pour caractériser un pic

symétrique gaussien.

Il est également possible de caractériser un pic du chromatogramme par sa largeur.Normalement, la forme idéale pour un pic est une forme gaussienne.

GtR ,σ(z) =1

σ√

2πexp

(− (t− tR)

2

2σ2

)(1.1)

La forme de ces pics peut s’expliquer via différents modèles qui seront vus plus loin.Dans ce cas, il y a un lien entre sa largeur à x% de la hauteur et son écart-type (figure 1.2à droite, tableau 1.1).

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Notation largeur en écart-type % de la hauteur du pic Nom

ω0,606 = 2σ 2σ 60,6 σ : écart-typeω0,500 = δ 2, 35σ 50,0 largeur à mi-hauteurω0,135 = ω 4σ 13,5 largeur du pic

Tableau 1.1 – Différentes largeurs utilisées pour caractériser la largeur d’un pic.

Pour chaque pic, il est possible de définir le facteur de rétention k :

k =t′RtM

(1.2)

En supposant un état de pseudo équilibre tout au long de la colonne et une constante departage identique sur toute la colonne, le facteur de rétention est égal au rapport entre laquantité de matière dans la phase stationnaire sur la quantité de matière dans la phasemobile.

Si jamais le pic n’est pas symétrique, il est alors possible de quantifier l’asymétrieen mesurant la largeur à gauche et à droite à 10% de la hauteur (figure 1.3). Le facteurd’asymétrie est alors égal à :

Fa = b/a (1.3)

En général, plutôt que de garder un pic asymétrique, il est préférable de changer lesconditions pour éviter une trop forte asymétrie. Une des causes fréquentes d’asymétrieest la saturation de la colonne. Si c’est le cas, il est nécessaire de diminuer la concentrationde l’analyte, le volume injecté ou d’utiliser un injecteur split (section 4.2.1).

a b

t

Figure 1.3 – Grandeurs permettant de caractériser un pic asymétrique

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1.3 Mesures liées à deux pics différents

tM

t'R;B

t'R;A

Figure 1.4 – Chromatogramme pour deux pics successifs.

Pour deux pics différents, le but est essentiellement de quantifier leur séparation. Pourcela, deux facteurs vont jouer : leur écartement – via le facteur de séparation – mais aussileur largeur. La résolution prend en compte les deux facteurs pour indiquer si les picssont justement ... « résolus ». Si ce n’est pas le cas, il est encore une fois nécessaire dechanger les conditions opératoires pour qu’ils le soit. L’optimisation de la résolution estl’objet du chapitre 3.

Facteur de séparation Le facteur de séparation pour deux composés est simplement leratio :

α =t′R,B

t′R,A=

kB

kA(1.4)

Avec t′R;A/B qui sont les temps de rétention corrigés pour les deux pics (figure 1.4). In-tuitivement, plus les composés ont un facteur de séparation élevé, plus il doit être faciled’éviter qu’ils se superposent.

Comme le facteur de séparation ne prend pas en compte la largeur des pics, il n’est passuffisant pour savoir si les pics se chevauchent ou non. Il permet tout de même d’avoirune idée qualitative du rapport des constantes de partage pour les deux composés.

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Résolution Il existe de nombreuses méthodes de calcul pour le calcul de la résolutiond’un pic. Peu importe la formule, le contenu physique reste le même. Chaque formulecorrespond à une norme différente mais n’affecte pas significativement la valeur trouvée.

Formule Référence et Commentaire

2tR,B − tR,A

ωB + ωAPharmacopée US ωA,B est la largeur défini comme l’intersectionentre les tangentes au point d’inflexion du pic et la ligne de base.

1, 18tR,B − tR,A

ω0,5;B + ω0,5;APharmacopée japonaise, européenne, britannique et allemandeω0,5;A,B est la largeur à mi-hauteur ou δ.

2, 15tR,B − tR,A

ω0,1;B + ω0,1;AEMG, Exponential modified gaussian ω0,1 = ω = 4σ

Tableau 1.2 – Différentes formules retenues pour mesurer la résolution. Pour lesdifférentes notations, voir la figure 1.2.

Si on suppose les deux pics de même hauteur et gaussiens, alors il est possible dedéterminer une valeur critique pour affirmer que les deux pics sont séparés. Pour cela,il faut que les aires sous chaque pic soient égales à l’aire du pic parfaitement gaussiencorrespondant. En pratique, deux pics sont dits résolus si la résolution est supérieure à1,5. (figure 1.5)

Figure 1.5 – Lien entre résolution et séparation des pics. À partir de R > 1, 5, les deux picspeuvent être considérés comme séparés.

Il existe d’autres formules pour exprimer la résolution en fonction d’autres paramètresindirects qui seront vus plus loin.

R =14

√NB

α− 1α

kB

1 + kB(1.5)

=

√N

2kB − kA

kA + kB + 2(1.6)

où N et NB sont appelés nombres de plateaux et seront explicités plus loin. L’équation(1.5) est appelée équation de Purnell et a l’avantage de décomposer la résolution en 3parties distinctes. Cela permet d’identifier certains termes capables d’augmenter la réso-lution s’ils sont modifiés.

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1.4 Ce qu’il faut retenir

— Notion de phase stationnaire et de phase mobile ;— Comprendre le lien entre chromatogramme et distribution spatiale ;— Les définitions et formules pour le temps mort, le facteur de rétention, le facteur

de séparation, la résolution.— savoir que des pics sont résolus si la résolution est supérieure à 1,5— la formule de Purnell (équation (1.5))

Chapitre 2

Modèles théoriques et nombre deplateaux

2.1 Un modèle « statique » : le modèle de Craig

Un premier modèle semi-statique permet d’avoir une première approche de la chro-matographie. Il s’agit du modèle de Craig. a Dans ce modèle, on cherche à décrire le plussimplement possible les phénomènes physiques expliquant la chromatographie : un mou-vement d’ensemble de la phase mobile le long de la colonne et une différence d’affinitéentre la phase mobile et la phase stationnaire pour le composé.

Ce modèle simplifié utilise un modèle purement thermodynamique pour décrire unsystème chromatographique qui est pourtant hors-équilibre dans son ensemble. Cela ades conséquences importantes sur les résultats qu’il est possible d’en tirer.

2.1.1 Hypothèses du modèle

— La colonne chromatographique est découpée arbitrairement en N subdivisions,chacune appelée plateau.

— Pour chacun des plateau, il y a un équilibre des solutés entre les deux phases : laphase stationnaire et la phase mobile. Pour chaque soluté Ai, il est possible d’écrireun équilibre de partage entre les deux phases :

KAi =[Ai]mobile[Ai]stationnaire

(2.1)

— La colonne suit des cycles de déplacement :— Après chaque phase d’équilibre thermodynamique, le contenu de la phase mo-

bile passe du plateau j au plateau j + 1 tandis que le contenu de la phase sta-tionnaire reste identique.

— Une nouvelle phase d’équilibre est atteinte— Il y a un nouveau déplacement de la phase mobile, etc..

a. Visiter l’applet et les photos correspondant au dispositif expérimental.

http://195.134.76.37/applets/AppletCraig/Appl_Craig2.html

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Injectionphase mobile

phase stationnaire

1

Équilibrephase mobile

phase stationnaire

b

a

Déplacementphase mobile

phase stationnaire

b

a


phase stationnaire

ba

a2

b2

ba

Déplacementphase mobile

phase stationnaire

ba b2

a2 ba


phase stationnaireba2 2b2a b3

a3 2ba2 b2a

Figure 2.1 – Principe du modèle de Craig pour décrire une colonne chromatographique.(Initialement, le modèle correspond à un appareillage qui a réellement ce mode de

fonctionnement.)

Initialement, la concentration dans le premier plateau est normée. Après l’équilibre, laquantité de matière en soluté A doit être conservée et l’équilibre thermodynamique doit êtrevérifié. Si on note a la concentration dans la phase stationnaire et b la concentration dans laphase mobile après le premier équilibre, alors :

a + b = 1 etba= K (2.2)

donc :

a =1

K + 1b =

KK + 1

(2.3)

Si on note : cmi,j (tk) et cs

i,j (tk) la concentration en soluté Ai sur le plateau j au temps tk pourla phase mobile et stationnaire respectivement après la phase d’équilibre, alors à l’étape sui-vante avant l’équilibre, les concentrations de la phase stationnaire sont inchangées tandisque celles de la phase mobile ont été décalées d’un plateau :

cs,0i,j (tk+1) = cs,0

i,j (tk) (2.4)

cm,0i,j (tk+1) = cm,0

i,j−1 (tk) (2.5)

La quantité totale de soluté dans le plateau j avant l’équilibre est égale à :

cm,0i,j (tk+1) + cs,0

i,j (tk+1) = ctoti,j (tk+1) (2.6)

15

Après l’équilibre, les équations à respecter sont analogues à celles vue précédemment :

cmi,j (tk+1) + cs

i,j (tk+1) = ctoti,j (tk+1) (2.7)

cmi,j (tk+1)

csi,j (tk+1)

= K (2.8)

On en déduit :

cmi,j (tk+1) = bctot

i,j (tk+1) (2.9)

csi,j (tk+1) = actot

i,j (tk+1) (2.10)

2.1.2 Code python de démonstration

Un code python pour simuler le modèle de Craig pour un ou deux composés est dispo-nible sur GitHub :

— Modèle de Craig pour un unique composé— Modèle de Craig pour deux composés avec calcul du facteur de séparation et de la

résolution.

Figure 2.2 – Capture d’écran d’un script python pour deux composés. Différents paramètressont modifiables en temps réel pour montrer leur influence sur le chromatogramme. Il estégalement possible de montrer la distribution spatiale en lien avec le chromatogramme.

https://github.com/MartinVerot/pyChromato/blob/master/Craig.py

https://github.com/MartinVerot/pyChromato/blob/master/Craig-compare.py

16

2.1.3 Conclusion et limites du modèle

La mise en application de ce modèle permet d’aboutir à différents résultats :— Le temps de rétention est d’autant plus grand que K est petit (plus grande affinité

pour la phase stationnaire).— Il est possible de montrer que les distributions suivent une loi binomiale qui pour

un grand nombre de plateau et après un temps suffisamment long donne unecourbe gaussienne – forme idéale d’un pic chromatographique.

— Le facteur de séparation α est égal au rapport des constantes d’équilibre pour cha-cun des composés. Ce modèle permet donc de faire le lien entre grandeurs ther-modynamique et temps de rétention corrigés.

— Pour plusieurs composés, plus le nombre de plateaux est grand, meilleure est laséparation.

Cependant, le modèle a également des limites, parmi lesquelles :— La diffusion est totalement négligée : il n’y a pas de diffusion explicite pour les

composés et le front d’élution ne présente aucune diffusion. (il manque la possibi-lité de se déplacer d’un plateau à l’autre au sein d’une phase)

— La résolution calculée est optimiste par rapport à une vraie colonne de chroma-tographie. En effet, le modèle fait des hypothèse de successions d’état d’équilibrealors que la colonne est globalement dans un état hors-équilibre lié à la mobilité de... la phase mobile.

— Implicitement, le débit et le nombre de plateau est relié alors que ce n’est pas for-cément le cas.

— Il décrit plutôt les chromatographies de partage que les chromatographies d’ab-sorption.

— Il ne peut pas décrire de pics asymétrique qui ne soient pas liés à la saturation.

2.2 Notion de plateau et de hauteur de plateau

Le modèle de Craig a fait apparaître la notion de plateau. Il permet également de mon-trer que plus le nombre de plateau est grand, plus la résolution de la colonne augmente.Cependant, le découpage en colonne est à priori totalement arbitraire. Il n’est pas possibled’anticiper à priori le nombre de plateaux au sein d’une colonne.

Il est pourtant important d’essayer d’avoir une estimation du nombre équivalent deplateau théorique. L’idée est de ramener le chromatogramme réel à celui qu’aurait donnéune colonne suivant le modèle de Craig avec un nombre de plateau permettant de repro-duire le chromatogramme réel. Cependant, le lien entre les deux grandeurs est abusif.Le modèle de Craig étant abusivement simpliste, il n’est pas possible de faire une cor-respondance exacte entre la notion de plateau dans le modèle de Craig et le nombre deplateau calculé à partir du chromatogramme réel.

Cela permet d’introduire différent concepts qui sont tous liés les uns aux autres :— Le nombre de plateaux qui est une indication de la performance de la colonne. Ce

nombre calculé est une grandeur totalement phénoménologique et n’a pas de signifi-cation concrète. Le but est de se ramener aux concepts de base du modèle de Craig.(voir le tableau 1.1 et la figure 1.2 pour la signification des grandeurs correspon-dantes) Les formules équivalentes existent pour calculer ce nombre de plateaux

17

pour des pics gaussiens symétrique : b

N =

(tR

σ

)2

= 16(

tR

ω

)2

= 5, 54(

tR

δ

)2

(2.11)

Si les pics sont asymétriques, il est possible d’utiliser la relation empirique suivante(relation de Foley et Dorsey) [8] :

N = 41, 7

(tR

ω0,1

)ab+ 1, 25

(2.12)

— La hauteur équivalente à un plateau théorique qui correspond à la hauteur d’unplateau, elle est notée H ou HEPT :

H = HEPT =LN

(2.13)

où L est la longueur totale de la colonne et N est le nombre de plateaux. Plus lavaleur est petite, mieux c’est.

Dans certains cas, le nombre de plateau peut être calculé avec le temps réduit plutôtque le temps de rétention absolu – on parle alors généralement de nombre de plateaueffectif. Cela change les valeurs trouvées mais pas la signification globale : plus le nombretrouvé est élevé, plus la séparation sera à priori bonne.

2.3 Équations donnant la hauteur de plateau en fonctionde la vitesse moyenne

Comme on a pu le voir, le modèle de Craig est insuffisant pour décrire précisémentle comportement physique des composés au sein d’une colonne de chromatographie. Ilexiste différents modèles théoriques qui permettent d’affiner et prévoir la hauteur de pla-teau en fonction de différents terme physiques liés au système. c

2.3.1 Équation de Van Deemter

L’équation la plus utilisée est celle de Van Deemter, dans ce modèle, la hauteur deplateau est donnée par la relation suivante :

HEPT = A +Bu+ Cu (2.14)

où A, B et C sont trois constantes et u est la vitesse moyenne de l’éluant au sein de lacolonne chromatographique (voir l’appendice C pour une discussion liée au calcul de u).Moyennant quelques hypothèses simples, il est possible de donner une relation analogueen fonction du débit volumique au sein de la colonne.

b. Certaines formules utilisent la dernière expression avec le facteur numérique 5,55 au lieu de 5,54.c. Le lecteur intéressé pourra lire la référence [4, chap. 7-8] pour des développements mathématiques

bien plus détaillés sur l’origine de chacun des termes et les très nombreuses équations possibles pour ajusterdes données expérimentales.

18

uoptu

HEPT

AB/u

Cu

Figure 2.3 – Allure typique d’une courbe de Van Deemter.

L’allure typique de la courbe correspondante est donnée figure 2.3. Elle présente sys-tématiquement un minimum pour une valeur optimale uopt.

uopt =

√BC

(2.15)

HEPTmin = A + 2√

BC (2.16)

Cette valeur optimale correspond à un nombre de plateau maximal. En pratique, la partieà droite de la courbe est généralement relativement plate et il peut être intéressant de seplacer à une valeur de u supérieure à uopt pour avoir des temps de rétention plus faibleset donc des temps d’analyse plus courts.

Pour l’optimisation des conditions, opératoires, il peut être utile de :— faire varier la valeur de u expérimentalement ;— mesurer la valeur expérimentale du nombre de plateaux pour en déduire les diffé-

rentes valeur de HEPT ;— tracer l’évolution de HEPT en fonction de u pour en extraire les valeurs de A, B et

C— si nécessaire, essayer d’estimer la valeur de uopt pour se placer dans des conditions

proches.

Constante A : Diffusion turbulente

Le terme A traduit la diffusion turbulente (ou eddy diffusion). Il correspond à l’existencede multiples chemins de longueur inégale le long de la colonne (figure 2.4) – pour unecolonne garnie (section 3.2.3). Ce terme étant lié à la structure des particules qui formentla phase stationnaire, elle ne dépend pas de la vitesse moyenne de la phase mobile.

Une des expressions utilisées pour A est :

A = 2λdP (2.17)

où :

19

Figure 2.4 – Diffusion turbulente : pour une colonne remplie, il y a une multiplicité dechemins au sein de la colonne dont la tortuosité dépend globalement de la régularité du

remplissage, du diamètre des particules et de leur régularité en terme de forme. Parconséquent, toute les particules de fluide ne parcourent pas le même trajet au sein de la

colonne.

— λ est un facteur généralement compris entre 0,8 et 1 qui traduit la régularité duremplissage. (En pratique, lambda peut être une fonction de u pour des modèlesplus complexes.)

— dP est le diamètre moyen des particules dans la colonne. En général, on cherche àavoir des particules les plus régulières possibles pour limiter autant que possiblela valeur de A.

Constante B : Diffusion longitudinale ou moléculaire

Le terme B est un terme qui existe toujours car il est lié à la diffusion naturelle ausein de la colonne : les composés présentant un pic de concentration dans la colonne,l’inhomogénéité entraîne forcément de la diffusion.

B = 2γDm (2.18)

— Ici, la diffusion peut avoir lieu dans un milieu confiné, le coefficient de diffusionà prendre en compte n’est donc pas forcément celui de la molécule au sein de laphase mobile. Le coefficient γ pour une colonne remplie est de l’ordre de 0,6 à 0,8et est appelé facteur d’obstruction.

— Dm est le coefficient de diffusion du composé au sein de la phase mobile.Par nature, le terme de diffusion est plus grand en phase gaz qu’en phase liquide. Ainsi, leterme de diffusion longitudinale est généralement négligeable pour la chromatographieen phase liquide alors qu’il est nécessaire de le prendre en compte en phase gazeuse. Plusle temps d’analyse est court (u élevé), moins la diffusion est importante.

En pratique, le terme diffusif en B/u est prépondérant pour de très faibles valeurs deu. Se placer à de faibles valeurs de u entraîne de nombreux désagréments liés à l’impor-tance de la diffusion :

— Lorsque u est faible, les temps d’analyse sont longs ce qui représente un coût éco-nomique et des opérations chronophages.

— Les pics sont de plus en plus étalés ce qui contribue à réduire fortement le rapportsignal sur bruit, la précision de l’intégration en est ainsi fortement affectée.

Constante C : coefficient de transfert de masse

Ce coefficient traduit le fait que la colonne ne soit pas à l’équilibre thermodynamiqueet qu’il y a donc des problèmes de cinétique d’échange et lié au fait d’avoir un systèmedynamique d’échange entre la phase mobile et la phase stationnaire. En pratique, il estpossible de décomposer le terme C en plusieurs composantes :

20

— un terme Cm qui vient du fait d’avoir une répartition des vitesses longitudinalesnon uniforme au sein de la colonne dans la phase mobile. En particulier, pour unecolonne capillaire en régime laminaire, le profil de vitesse est parabolique avec unefaible vitesse au niveau des parois et une vitesse maximale au centre de la colonne.De même, la vitesse à proximité des particules est fortement affectée par rapport àla vitesse au cœur de la phase mobile. Là encore, pour des colonnes remplies, il estpréférable d’avoir des particules les plus homogènes en taille et les plus régulières(sphériques) possibles.

— un terme Cs lié à la rapidité de la diffusion au sein de la phase stationnaire.

C = Cm + Cs (2.19)

Cm =C1ωd2

PDm

(2.20)

Cs = C2k

(1 + k)2

d2f

Ds(2.21)

où :— C1 et C2 sont des fonctions du facteur de séparation et seront considérés comme

des constantes ;— ω est lié au volume total de la phase mobile dans la colonne ;— Dm est le coefficient de diffusion du composé dans la phase mobile ;— Ds est le coefficient de diffusion du composé dans la phase stationnaire ;— dP est le diamètre des particules (figure 3.2)— d f est l’épaisseur de la phase stationnaire (pour de la chromatographie de partage,

figure 3.2)— k est le facteur de rétention du composé

Les deux termes Cm et Cs font intervenir des termes de la formed2

iD

qui correspondent àdes temps caractéristiques de diffusion. De même, les deux termes traduisent une aug-mentation de la dispersion avec la vitesse de la phase mobile : l’inhomogénéité de vitesseest d’autant plus prononcée que la vitesse moyenne est grande, tout comme le processusd’équilibre lié à la diffusion au sein de la phase stationnaire est loin d’être atteint si lavitesse augmente.

2.3.2 Équation de Golay pour les colonnes capillaires

Pour une colonne capillaire (cas courant pour la chromatographie en phase gaz), iln’y a pas de particules au sein de la colonne. Donc le terme A est nul dans l’équation deVan Deemter. L’équation correspondante est appelée équation de Golay qui est une formesimplifiée de l’équation de Van Deemter.

Dans ce cas particulier, pour B, le terme γ vaut 1, dans le terme C le terme ω peut êtrecalculé, tout comme les fonctions C1 et C2 :

HETP =Bu+ Cu =

2Dm

u+

1 + 6k + 11k2

24 (1 + k)2r2

Dmu +

2k

3 (1 + k)2

d2f

Dsu (2.22)

avec les notations déjà vues précédemment, r le diamètre interne de la colonne et k lefacteur de séparation.

21

2.3.3 Équation de Knox pour la chromatographie en phase liquide

Pour les chromatographie en phase liquide, plutôt que l’équation de Van Deemter,il est possible d’utiliser l’équation de Knox qui correspond à une équation empiriquede meilleur qualité pour faire un ajustement des données expérimentales, en particulierpour de l’HPLC. Pour cela, plutôt que la hauteur équivalente de plateau théorique, cetterelation donne une relation pour la hauteur de plateau réduite :

h =HETP

dP(2.23)

avec dP le diamètre des particules. De même, elle utilise la vitesse réduite qui est définiecomme :

ν =udP

Dm(2.24)

où u est la vitesse linéique moyenne et Dm le coefficient de diffusion au sein de la phasemobile.

h = Aν1/3 +Bν+ Cν (2.25)

2.3.4 Une équation pour les gouverner tous et les lier?

Derrière les différentes équations existantes, il faut voir qu’il y a différentes approchesthéoriques qui cherchent à reproduire des données expérimentales. Les systèmes chroma-tographiques étant très variés ne serait-ce qu’entre les différentes techniques et méthodesutilisées. Chaque modèle se concentre sur certains aspects tout en négligeant certainsautres. Ainsi, les équations de Van Deemter, Golay, Knox, Giddings, Horvath et Lin, etcne sont que des modélisations simplifiées de systèmes extrêmement complexes. Pour lesthéoriciens, le développement de modèles est un « sport » en soi. Du point de vue ex-périmental, la « bonne » équation est bien souvent ... celle qui correspond aux donnéesexpérimentales.

L’exercice est d’ailleurs d’autant plus compliqué que les équations utilisent bien sou-vent u la vitesse moyenne au sein de la colonne alors que son utilisation, son sens et sadéfinition n’a rien de trivial (voir l’annexe C).


— La notion de plateau théorique et de hauteur de plateau ;— la formule de calcul du nombre de plateaux (équation (2.11))— l’équation de van Deemter/Golay et les phénomènes physiques associés à A, B et

C ;

Chapitre 3

Optimisation d’une séparation

3.1 L’optimisation, une affaire de compromis

Pour optimiser la séparation, il est généralement possible de jouer sur un très grandnombre de facteurs. Certains sont plus difficiles à adapter que d’autres sur le plan pra-tique : ceux liés au matériel à disposition (injecteur, colonne, détecteurs, colonnes utili-sables, etc). D’autres sont au contraire beaucoup plus faciles à changer (débit, tempéra-ture, pression, gaz vecteur, etc). Le tout doit se faire en combinant essentiellement troiscontraintes qui sont toutes incompatibles les unes avec les autres :

— La vitesse pour avoir des temps d’analyse les plus courts possibles, mais cela cor-respond généralement à avoir une faible résolution ;

— La capacité pour pouvoir analyser correctement des échantillons les plus gros pos-sibles ou faire de la chromatographie préparative, mais cela nécessite généralementdes temps d’analyse plus longs et nuit à la résolution

— La résolution qui nécessite en général des temps d’analyse longs et de petites quan-tités à analyser. De plus, cela demande tout un protocole d’optimisation qui peutégalement être très chronophage.

vitesse

capacité résolution

Figure 3.1 – L’optimisation d’une séparation résulte de compromis à faire entre troisexigences : vitesse, capacité et résolution. Les conditions d’analyse réelles sont

nécessairement le résultat d’un compromis entre ces trois facteurs.

24

3.2 Optimisations générales

3.2.1 Optimisation de la résolution : facteurs d’influence globaux

La relation de Purnell (vue en 1.5) :

R =14

√NB

α− 1α

kB

1 + kB(3.1)

permet de décomposer la résolution en trois parties distinctes :— une liée au nombre de plateaux NB ;

— une liée au facteur de séparationα− 1

α;

— la dernière liée au facteur de rétentionkB

1 + kB.

Amélioration de α

α =t′R,B

t′R,A=

kB

kA(3.2)

Pour améliorer le terme lié au facteur de séparation, il faut augmenter autant que possiblela différence d’affinité – ce dernier est par définition supérieur à 1. Le gain est significatifpour 1 6 α 6 3, mais s’atténue très rapidement après (tableau 3.1). En général, il faut unevaleur de α supérieure ou égale à 1,5.

En utilisant le résultat du modèle de Craig, α est égal au rapport des constantes departage pour les deux composés entre la phase stationnaire et la phase mobile. Les gainsvont venir de l’optimisation des constituants des deux phases (mobile et stationnaire).

αα− 1

αα

α− 1α

1,0 0,00 2,5 0,601,1 0,09 3,0 0,671,2 0,17 4,0 0,751,3 0,23 5,0 0,801,4 0,29 6,0 0,831,5 0,33 7,0 0,861,6 0,38 8,0 0,881,7 0,41 9,0 0,891,8 0,44 10,0 0,901,9 0,47 100,0 0,992,0 0,50 1000,0 0,999

Tableau 3.1 – Valeur du terme lié au facteur de séparation α dans l’équation de Purnell.

25

Amélioration de kB

kB =t′R,B

tM(3.3)

Tout comme le facteur lié à la résolution, le terme lié au facteur de rétention augmentetrès fortement pour de faibles valeurs de kB mais tend rapidement vers sa valeur asymp-totique (tableau 3.2). Ainsi, pour une valeur comprise entre 5 et 20, le résultat est gé-néralement satisfaisant. Les valeurs élevées de kB correspondent également à des tempsd’analyse longs. Il n’est donc généralement pas profitable d’avoir une valeur trop grande.

kBkB

1 + kBkB

kB

1 + kB

0,0 0,00 4,0 0,800,1 0,09 5,0 0,830,2 0,17 6,0 0,860,3 0,23 7,0 0,880,4 0,29 8,0 0,890,5 0,33 9,0 0,900,6 0,37 10,0 0,910,7 0,41 20,0 0,950,8 0,44 30,0 0,970,9 0,47 40,0 0,981,0 0,50 50,0 0,982,0 0,67 100,0 0,993,0 0,75 1000,0 0,999

Tableau 3.2 – Influence du facteur de séparation sur la résolution via l’équation dePurnell.

Amélioration de NB La diminution de l’HEPT pour maximiser NB se fait via un grandnombre de paramètres qui seront discutés ci-après :

— les dimensions de la colonne ;— le gaz vecteur en CPV— la taille des particules pour une colonne remplie— le débit au sein de la colonne

3.2.2 Longueur de la colonne

Le facteur le plus simple pour augmenter le nombre de plateaux est de jouer sur lalongueur de la colonne. En première approximation, on pourrait penser que doubler lalongueur permette de doubler le nombre total de plateau. Cependant, en allongeant letemps d’analyse, on augment également l’étalement des pics en

√t. Le gain n’est pas

aussi important que prévu : la résolution entre deux pics suit « seulement » une loi en√L avec la longueur de la colonne. Ainsi, en CPV, il est courant d’atteindre la dizaine de

mètres pour la longueur des colonnes (voire la centaine de mètres).

R ∝√

NB ∝√

L (3.4)

26

Si la résolution est fixée (R > 1, 5)) il est alors possible de calculer la longueur optimaleminimale de la colonne : en se plaçant à uopt, il est possible de calculer HEPTmin (équa-tions (2.15) et (2.16)). Et donc en déduire la valeur minimale de la longueur de colonne enfonction des paramètres α, kB, A, B et C.

3.2.3 Structure de la colonne

Il existe deux grands type de colonne :— les colonnes garnies/remplies (packed columns) ;— les colonnes capillaires (capillary columns ou open type/tubular (OT)).Le choix va dépendre de différents facteurs :— Les colonnes garnies ont généralement une capacité beaucoup plus élevée que les

colonnes capillaires, elles sont privilégiées pour de la chromatographie séparative et lachromatographie en phase liquide.

— Les colonnes garnies imposent une résistance à l’écoulement beaucoup plus élevéeque les colonnes capillaires, ce qui impose d’avoir des colonnes (beaucoup) pluscourtes. Or la longueur est un moyen simple et efficace de gagner en résolution. Sila séparation est favorisée, alors le choix d’une colonne capillaire (ou dérivé) est privilégié.C’est le cas pour 90% des CPV.

— Dans le cas d’une colonne garnie, il y a par essence le terme A lié à la diffusion tur-bulente qui augmente forcément la hauteur minimale de plateau. Pour améliorerla résolution, il est donc à priori plus facile d’utiliser une colonne capillaire.

colonnes capillairesou open tubular (OT)

colonne garniepacked column

dP

r

dF

colonne WCOTwall-coated open tubular

colonne SCOTsupport-coated open tubular

colonne PLOTporous layer open tubular

support

phase stationnaire liquide

phase stationnaire poreuse

particules

Figure 3.2 – Types de colonne. Pour la chromatographie en phase liquide, le type le pluscourant correspond à des colonnes garnies, en phase gaz, la majorité des colonnes sont

capillaires et de type WCOT.

Les colonnes à garnissage et PLOT utilisent généralement une séparation par adsorp-tion sur la phase stationnaire alors que les colonnes de type WCOT et SCOT procèdentplutôt par partage entre la phase liquide et la phase stationnaire.

3.3 Optimisations pour la chromatographie en phase gaz

3.3.1 Choix du gaz vecteur

Parmi les différents choix possibles, trois gaz sont les plus courants : diazote, l’hélium,dihydrogène. D’autres choix sont bien évidemment possibles (argon, dioxyde de carbone,

27

etc). Les courbes de Van Deemter pour les trois gaz ont généralement l’allure de la figure3.3 (les autres paramètres étant fixés).

Figure 3.3 – Allure typique d’une courbe de Van Deemter pour le diazote, l’hélium et ledihydrogène.

Cela permet d’orienter le choix en fonction de différents critères :— La valeur de uopt est plus faible pour le diazote, cela correspond à des temps d’ana-

lyse plus longs que pour les deux autres gaz ;— La courbe présente un minimum plus prononcé pour le diazote, la plage d’utilisa-

tion optimale est donc plus restreinte que pour les autres gaz. Il est plus intéressantde travailler avec l’hélium ou le dihydrogène qui seront beaucoup moins sensibleà l’optimisation de la valeur de u ;

— La hauteur minimale pour le diazote est généralement plus faible que pour lesautres gaz. En travaillant à uopt, le diazote est un meilleur choix.

Au-delà des aspects purement scientifiques, des critères pratico-pratiques viennents’ajouter (tableau 3.3). Le choix du gaz vecteur peut également avoir des répercussionsau niveau du choix du détecteur.

Critère N2 He H2 commentaires

Coût $ $$$ $ H2 peut être généré facilement sur placeDangerosité +++ H2 est explosifInerte ++ +++ −Résolution + ++ ++Viscosité à 100°C(10−5 Pa · s)

2,12 2,32 1,04 Conditionne la perte de charge au sein dela colonne et le temps d’analyse

Temps d’analyse - + ++

Tableau 3.3 – Quelques critères de choix pour le gaz vecteur.

28

3.3.2 Influence du dimensionnement de la colonne

Diamètre de la colonne Pour une colonne capillaire, le terme Cs est négligeable. Enréutilisant l’équation (2.22), il est possible de montrer que la hauteur de plateau minimalepeut alors s’écrire :

HEPTmin = 2√

BC = 2

√√√√√√2Dm︸︷︷︸=B

1 + 6k + 11k2

24 (1 + k)2r2

Dm︸︷︷︸=C

= r

√1 + 6k + 11k2

3 (1 + k)2 (3.5)

Il faut donc avoir un rayon le plus petit possible. Cela permet de diminuer la hauteurde plateau minimale. Cependant, cela correspond également au fait d’avoir à augmenterla pression pour contrebalancer les effets liés à la viscosités qui augmentent lorsque lerayon diminue. En utilisant l’équation de Poiseuille pour un fluide compressible :

u ≈ r2Pin

16ηL

(γ2 − 1

)(3.6)

où Pin est la pression à l’entrée de la colonne, γ = Pin/Pout est le ratio entre la pressionen entrée et la pression en sortie (Pout), η est la viscosité du gaz et L la longueur de la co-lonne. Pour obtenir une résolution donnée avec γ donné, il est ensuite possible d’utiliserl’équation de Purnell pour avoir une expression du diamètre maximal : [4, p390-395]

r 6 R1 + k

kα

α− 1

√16ηDm

Pin (γ2 − 1)(3.7)

Épaisseur du film Les épaisseurs sont de l’ordre de 0,25 µm, avoir des films plus épaispermet d’augmenter la capacité mais au détriment de la résolution (augmentation duterme Cs dans l’équation de Van Deemter). De plus, plus le film est épais, plus il estdifficile de s’assurer qu’il résiste mécaniquement à l’usure.

Pour des colonnes de très faible diamètre et avec une petite capacité (film mince), la ca-pacité de la colonne est généralement faible pour une résolution élevée. Il est alors courantd’utiliser des injecteurs « split » (voir section 4.2.1) pour réduire la taille de l’échantillonet éviter le phénomène de saturation.

3.3.3 Choix de la température

Une équation phénoménologique analogue à celle de Van Deemter existe pour donnerl’influence de la température :

H = A′ +B′

T+ C′T (3.8)

En pratique, le fait de changer la température a de nombreuse implications :— les temps d’analyse ont tendance à être raccourcis, ce qui réduit également l’étale-

ment des pics ;— la température affecte la valeur de k qui est lié à une pseudo constante d’équilibre— le nombre total de plateau ne suit pas systématiquement la loi indiquée ci-dessus,

il faut donc faire une optimisation pour obtenir un bon compromis entre résolutionet temps d’analyse ;

29

— la température affecte également le débit du gaz, il faut alors prendre en comptele facteur de James et Martin pour s’affranchir des effets dus à la viscosité quidépendent de la température.

— En général, le gainage de la partie extérieure de la colonne (le plus souvent unpolymère qui entoure la silice) va limiter la température maximale (généralementde l’ordre de 250 °C). Pour pouvoir monter à des températures plus élevées, il fautque le gainage extérieur soit métallique.

— Il est possible de faire de la programmation en température plutôt que de faireune analyse isotherme pour améliorer la séparation. Les composés les plus dursà séparer sont ceux ayant une faible valeur de k (petit temps de rétention). Si laséparation est optimisée, cela correspond à un allongement significatif du tempsd’analyse pour les composés ayant déjà une valeur élevée de k avant l’optimisa-tion. L’idée est alors de commencer à une faible température pour « ralentir » laséparation initialement, puis d’augmenter progressivement la température de ma-nière à garder des temps d’analyse suffisamment courts pour les composés avecun grand facteur de séparation. Le processus d’optimisation peut être long maisil mène à des analyses plus rapides en faisant des compromis sur la résolution.L’utilisation de gradients de température use prématurément les colonnes par rap-port à une utilisation isotherme. Un exemple d’optimisation grâce à un gradientde température est donné figure 3.4

3.3.4 Choix de la pression/du débit

Le but est de travailler à la valeur de uopt pour chacun des composés. C’est la pressionqui est contrôlée pour adapter le débit et donc la valeur de u. La valeur de uopt peutdifférer d’un composé à l’autre. Le choix d’une unique valeur de u peut alors être limitant– en particulier pour des mélanges complexes comportant beaucoup d’espèces. Il est alorspossible d’adapter la vitesse lors de l’analyse (figure 3.4). Les variations de débit étantliée à des variations de pression, elles sont rapides et techniquement faciles à faire. (Parrapport aux variations de températures qu’il est beaucoup plus difficile de contrôler etd’optimiser sur le plan pratique.)

30

P

T

P

T

P

T

P

T

A

B

C

D

Figure 3.4 – Exemple d’optimisation de la séparation de 31 composés grâce à desgradients de température et de pression sur une colonne capillaire de 10 m (DB-5 et

StableWax). [9] A) À pression et température constants (T = 70 °C). La résolution esttrop insuffisante. B) Avec uniquement un gradient de température entre 30 et 90 °C. Larésolution est alors significativement améliorée pour les premiers composés à sortir. C)Avec gradient de température et saut de pression. La séparation est encore améliorée D)Avec gradient de température et programmation de pression : tous les pics sont résolus

sauf les deux premiers. Le tout en moins de deux minutes trente.

31

3.4 Optimisations pour la chromatographie en phase liquide

3.4.1 Influence de la taille des particules et du garnissage

La taille des particules joue un rôle important sur les termes A et Cm de l’équation deVan Deemter (équations (2.17) et (2.20)) :

A = 2λdP (3.9)

Cm =C1ωd2

PDm

(3.10)

En effet, plus les particules sont petites, plus l’écoulement est régulier et le terme de dif-fusion turbulente A est faible car il y a moins de différences entre les différents cheminsparcourus par les particules de fluide. Cela permet d’abaisser la valeur de HEPTmin. Lecoefficient Cm est aussi fortement réduit vu que la dépendance est quadratique vis à visdu diamètre des particules.

1086420

18

16

14

12

10

8

6

4

2

1,8 µm

HEPT (µm)

u (mm/s)

3,5 µm

5 µm

Figure 3.5 – Influence du diamètre des particules sur la hauteur de plateau théoriquepour le naphtalène sur une colonne colonne C18-silice (Mac-Mod Analytical). [3, p597]

Pour comparer des colonnes ayant des diamètres de particule différent, il est courantd’utiliser la hauteur de plateau réduite :

h =HEPT

dP(3.11)

3.4.2 Choix de la pression

Pour la chromatographie en phase liquide, les colonnes sont généralement garnies.Cela entraîne une résistance à l’écoulement bien plus importante que pour les colonnescapillaires.

La loi permettant de relier vitesse d’écoulement et pression (analogue de l’équation(3.6) pour une colonne garnie) est la loi de Darcy :

P = fuηL

πr2d2P

(3.12)

32

où f est un facteur qui dépend de la forme des particules et de la qualité du garnissage,u est la vitesse, η la viscosité du solvant, L la longueur de la colonne, r le rayon de lacolonne et dP le diamètre des particules.

La dépendance étant quadratique en r et dP, cela montre que les pressions exigéespeuvent rapidement être colossales. D’où un acronyme HPLC/CLHP où le P est parfoisun P de pression (pressure) ou de performance pour Chromatographie liquide haute per-formance/pression.

La perte de charge au sein de la colonne correspond également à un échauffement quipeut être significatif (de l’ordre de la dizaine de degrés) pour le solvant entre le centre etles bords de la colonne, mais aussi entre l’entrée et la sortie de la colonne.

dP (µm) temps de rétention (min) nombre de plateaux Pression (bar)

5,0 30 25000 193,0 18 42000 871,5 9 83000 7001,0 6 125000 2300

Tableau 3.4 – Effet de la taille des particules et de la pression pour une colonne théoriquede 33 µm de diamètre et 25 cm de long, pour un composé avec un facteur de rétention de

2, et un coefficient de diffusion de 6, 7 · 10−10 m2 · s−1 dans un mélange eauacétonitrile. [3, 10]

La taille des particules peut être donnée directement en µm ou alors en mesh. Ce chiffrecorrespond au nombre de particules que l’on peut placer bout à bout pour arriver à 1inch. Il existe des tables de conversion qui font référence à une norme. Cependant, il estsuffisant de retenir que la taille des particules diminue lorsque le mesh augmente. Lesgammes utilisées couramment correspondent à des mesh compris entre 70 et 400.

Il est aussi possible de jouer sur la porosité pour augmenter la surface spécifique – cequi augmente la capacité de la colonne. Il est alors possible de monter à des surfaces del’ordre du millier de mètres carrés par gramme de silice.

3.4.3 Choix de la phase stationnaire

Pour le choix de la phase stationnaire il existe deux grands types de surfaces :— Les phases polaires protiques (comme la silice ou l’alumine) qui constituent la ma-

jorité des phases stationnaires utilisées, on parle de chromatographie sur phasenormale (Normal phase chromatography) ;

— Les chromatographies sur phase inverse (Reverse phase chromatography) qui cor-respondent généralement à des phases stationnaires toujours à base de silice oualumine mais sur lesquelles des chaînes apolaires ont été greffées. La phase la plusutilisée correspond au greffage d’un alcane linéaire à 18 carbones (dénommée C18).

Colonnes à phase normale Le cœur des particules est de la silice (SiO2) ou de l’alumine(Al2O3), mais les groupements en surfaces sont plus variés (de type silanol, figure 3.6).Ils peuvent faire des liaisons hydrogène. Si le support a été chauffé pour éliminer toutel’eau, l’eau ou les composés peuvent s’adsorber très fortement sur la surface. Ainsi, pourl’alumine, il existe différentes catégories en fonction de la teneur en eau adsorbée avant

33

( (n

silanol silanol vicinaux silanols géminés pont siloxane

groupement réticulés

Si O Si

R'

R'

R

Phase normale

Phase inverse

Si

OO

O

OH

O

OH

O

Si

OH

OO

Si

O OO

OH

Si

HO

Si

O

Si

Si

OO

O

Si

OO

O

Si O Si

Figure 3.6 – Exemple de structure pour des phases stationnaire en phase normale et enphase inverse. Il existe différents groupements possibles en surface pour les phasesnormales (pour des phases stationnaires à base d’alumine, il existe les groupementsanalogues, les groupement aluminols étant analogue aux silanols). Pour les phases

inverses, la surface a été modifiée pour greffer des groupements apolaires.

utilisation – plus il y a d’eau, moins la colonne est activée et retiendra donc moins lescomposés polaires protiques. Globalement, plus l’éluant est polaire, plus sa force éluanteaugmente (équation (3.16)).

La silice est plutôt acide et se décompose aussi bien en milieu acide (pH < 2) qu’enmilieu basique (pH > 8). Il est possible d’augmenter la stabilité des particules en réticulantla structure avec des ponts éthyléniques.

Pour l’alumine, il est possible de travailler en milieu basique, cela est très utile pourretenir fortement les composés portant des groupes amine ou acide carboxylique.

Les colonnes à phase normale peuvent présenter différents inconvénients :— le temps de rétention des composés peu polaires peut être fortement affecté par la

teneur en eau de l’éluant ;— il peut y avoir une adsorption préférentielle d’un solvant si l’éluant correspond à

un mélange.

Colonnes à phase inverse Pour cette famille de phase stationnaire, c’est généralementun alcane linéaire de longueur variable qui est greffé (figure 3.6), la longueur privilégiéeétant 18. Il est également possible de varier le groupement R′ sur la chaîne latérale pouraugmenter la stabilité des particules (des groupement tertiobutyl plutôt que méthyl as-surent une stabilité accrue en milieu acide par exemple). Si les phases C18 dominent lemarché, il existe une infinité d’autres phases inverses avec tous les types de groupementgreffés possibles et imaginables. En général, il y a tout de même toujours une chaîne al-kyl de longueur 3 liée à l’atome de silicium pour assurer un peu de souplesse aux chaînelatérales et assurer un taux de greffage élevé.

L’avantage de ce type de phase est d’avoir une série éluotropique (section 3.4.4) inver-sée par rapport aux phases normales. Les solvant apolaires auront ainsi une force éluante

34

plus élevée que les solvant polaires ou polaires protiques. L’ordre d’élution est ainsi gé-néralement inversé pour les composés à analyser.

3.4.4 Choix de l’éluant

Comme pour la chromatographie en phase gaz, le fait de changer la colonne est rela-tivement onéreux et chronophage. Il est en général plus simple de changer l’éluant.

Précaution préalable à l’utilisation des solvants En pratique, pour l’HPLC, il est né-cessaire de filtrer le solvant pour éviter le bouchage (clogging) de la colonne. De même,il est nécessaire d’effectuer un dégazage pour réduire le bruit de fond au niveau du dé-tecteur et éviter toute réaction parasite entre le gaz et la phase stationnaire (oxydation,adsorption, dégradation). Ce dégazage peut être effectué avec un barbotage de gaz inerte(comme l’hélium) ou sous pression réduite.

Paramètres influençant le choix de l’éluant En pratique, le choix de l’éluant se fait visà vis des composés à analyser. Il y a une compétition entre l’adsorption des solutés et dusolvant sur la phase stationnaire. Quelle que soit la nature de la phase stationnaire, il y adonc une compétition entre les deux équilibres suivants :

Ai,(m) = Ai,(s) S(m) = S(s) (3.13)

où les Ai sont les composés à analyser et S est l’éluant. Les indices (m) et (s) indiquent lesphases mobile et stationnaire respectivement. La compétition directe peut s’écrire sous laforme :

Ai,(s) + n S(m) = nS(s) + Ai,(m) (3.14)

Force éluante d’un solvant ε0, optimisation vis à vis de la phase stationnaire En gé-néral, le but est d’essayer d’avoir un solvant qui a une affinité pour la phase stationnaireproche de celle des composés analysés pour avoir une séparation maximale. Les phasesstationnaires couramment utilisées étant la silice et l’alumine, il est possible de classifierles solvants entre eux en ne considérant que l’équilibre d’adsorption du solvant sur laphase stationnaire.

La grandeur utilisée pour ce classement est la force éluante ε0 définie par la relationsuivante :

ε0 =|∆adsG(S)|

ln(10)RTAm(3.15)

où ∆adsG(S) est l’enthalpie libre d’adsorption du solvant sur la phase stationnaire, Am estla surface occupée par l’éluant sur la surface une fois adsorbé.

La force éluante dépend de la phase stationnaire mais suit les mêmes tendances suralumine et sur silice (tableau 3), il existe une série éluotropique qui classe les solvantspar force éluante croissante (tableau 3) :

hexane/pentane < cyclohexane < dichlorométhane < diéthyl ether< acétate d’éthyle < éthanol < acétonitrile < eau (3.16)

Il est possible de moduler la force éluante en faisant des mélanges (figure 3.7).

35

0 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75

10 50 100

1 5 50 10010

0,5

1 5 10 50 100

1 105 20 50100

0,5 1 10 50100

10 50100

50 100

30 100501051

0,5 1 5 10 50100

20 60100

1 10 50100

10

1 5 10 50 100

50100

100,5 1 5 20 50100

1 5 10 50 100

2 3

2 3

2 3

2 3

3

0,5

5 20

2030

2030

20

2 3

2 3

30

0,5

ε0

5

chlorure d'isopropyle

dichlorométhanediéthyl-éther

acétonitrileméthanol

dichlorométhanediéthyl-éther


diéthyl-éther



méthanol

pentane

chlorure d'isopropyle

dichlorométhane

diéthyl-éther


Figure 3.7 – Force d’élution pour des mélanges de solvant courants sur silice. Pour avoirune force éluante donnée, on peut choisir le mélange souhaité. Par exemple, pour un

mélange de force éluante 0,55 ; il est possible de prendre un mélangedichlorométhane/méthanol 95 :5 v :v (ou un mélange acétonitrile/méthanol 97 :3).

Adapté de [7], tiré de [11]

Polarité de Snyder et décomposition, optimisation avec les solutés Snyder a établi uneéchelle de polarité P′ qui permet cette fois-ce de plutôt quantifier les interactions entresolvant et soluté (là où ε0 regarde les interactions phase stationnaire solvant). De plus, ila décomposé la contribution à la polarité de différents types d’interaction :

— interaction entre dipôles permanents (Keesom)— interaction entre dipôles induits (London)— interaction entre dipôles induits et permanents (Debye)— acidité (caractère donneur de proton)— basicité (caractère accepteur de proton)— interactions électrostatiques

Dans le modèle de Snyder, les interactions électrostatiques sont négligées, les interac-tions de van der Waals sont regroupées sous le terme de « dipolarité » (polarisabilité etpolarité). Cela permet de se ramener à trois types d’interactions uniquement.

En étudiant trois composés archétypaux de chacune de ces interactions :— l’éthanol (donneur de proton), xe— le 1,4-dioxane (accepteur de proton), xd— le nitrométhane (polaire et polarisable), xn

Snyder a décomposé son échelle de polarité en trois composantes xe, xd, xn telles que :

xe + xd + xn = 1 (3.17)

P′ (xe + xd + xn) = P′ (3.18)

Cela permet alors de décomposer la polarité en fonction de chacune des contributions.

36

Une fois cette décomposition faite pour différents solvants, il est possible de définir 8sous-domaines (figure 3.8) [12] :

I. Les éthers et amine aliphatiques ;

II. Les alcools aliphatique ;

III. la pyridine et le THF, amides (sauf le formamide), sulfoxydes

IV. les glycols, acide benzylique, le formamide et l’acide acétique

V. le dichlorométhane et le dichloréthane a

VI. les cétones aliphatiques, esters, sulfones, poly éthers, carbonate de propylène, 1,4dioxane et nitriles

VII. les composés aromatiques, aromatiques halogénés, éthers aromatiques et composésnitrés

VIII. les phénols et l’eau

I

II

IIIIV

V

VI

VII

VIII

Figure 3.8 – Triangle de Snyder permettant de décomposer les différents typesd’interaction responsables de la polarité du solvant. Quelques solvants usuels y sontreprésentés. THF : térahydrofurane, DMSO : diméthylsulfoxyde, ACN : acétonitrile,

DCM : dichlorométhane, AcOEt : acétate d’éthyle

a. Une publication ultérieure [13] a déplacé le dichlorométhane hors de la zone V par la suite.

37

Ainsi, les différents solvants couramment utilisés se répartissent assez largement surle triangle de Snyder. Il est alors possible de procéder à des optimisations supplémen-taires. En général, on prend trois solvants éloignés sur le triangle de Snyder :

— Pour l’HPLC sur phase inverse, les trois solvants les plus couramment utilisés sontl’acétonitrile, le méthanol et le THF. Les temps d’analyse étant généralement crois-sants, ils sont testés dans cette ordre (acétonitrile en premier, THF en dernier).

— Pour de la chromatographie sur phase normale, les trois solvants testés peuventêtre 1) l’éther isopropylique ou de méthyltertiobutyle,2) le chloroforme, 3) le 1,2-dichloroéthane (ou dichlorométhane).

Ensuite, pour chacun des trois solvants A, B, C, on effectue ensuite des tests en faisantdes mélanges de composition différente :

— solvants purs (points 1, 2, 3 de la figure 3.9) ;— mélanges 50/50 (points 4, 5, 6 de la figure 3.9) ;— mélange 33/33/33 (point 7 de la figure 3.9) ;— mélanges intermédiaires supplémentaires si nécessaire.

Lorsque la force éluante a été choisie pour optimiser la valeur de k (voir section 3.2.1), il estégalement possible de faire des mélanges de force éluotropique constante avec différentescompositions.

1

3

4

56

7

2

Figure 3.9 – Procédé d’optimisation de l’éluant. Deux choix couramment utilisés de triadede solvants sont donnés (en orange sur phase inverse, en violet sur phase normale). À

droite, la série de mélange effectuée pour optimiser la séparation. Pour un exempled’optimisation, voir [3, p620].

38

Gradient d’élution Si la composition de l’éluant est gardée constante tout au court del’élution, on parle d’élution isocratique. Cependant, cela n’est pas toujours suffisant pourobtenir simultanément une séparation correcte et des temps d’analyse courts.

De manière analogue à ce qui est fait pour la chromatographie en phase gazeuse, ilest possible de faire des gradients où cette fois-ci, c’est généralement la composition dusolvant qui est changée progressivement pour avoir une force éluotropique de plus enplus grande (figure 3.10).

temps (min)

temps (min)

Figure 3.10 – Exemple d’amélioration de la séparation avec un gradient d’élution (adaptéde [14, p239]). séparation d’oligomères de polystyrène avec 3 > n > 17. Mélange

tétrahydrofurane/eau à 35°C sur une colonne C18. Sans gradient en haut (mélange à 72%de THF) et avec une variation de 60 à 100% THF en 60 minutes en bas.

De manière générale, il y a une relation entre facteur de rétention et composition del’éluant pour un mélange A/B :

ln k = ln kA − SφB (3.19)

où k est le facteur de rétention, kA est le facteur de rétention pour le solvant A pur, S estune constante qui dépend de la colonne et de l’analyte et φB est le pourcentage de B dansle mélange.

L’utilisation de cette relation permet alors de pouvoir anticiper le gradient à appliquerpour optimiser la séparation. En général, l’ordre de grandeur de S varie peu. Souvent, lefacteur de rétention diminue pour tous les composés de manière analogue. Cependant, ilpeut y avoir des inversions d’ordre d’élution si la composition est changée. L’échantillonest alors dit irrégulier. L’optimisation est alors plus ardue car il faut éviter de tomberdans des zones de croisement au court de l’élution (figure 3.11).

39

Figure 3.11 – Exemple de tracé de l’équation 3.19 pour un mélange régulier à gauche etirrégulier à droite. (tiré de [14, p14]) a) mélange méthanol/eau sur colonne C18, 5µm,

25°C pour des composés phytosanitaires, 1 :Simazine, 2 : Monolinuron, 3 :Metobrumon,4 :Diuron, 5 : Propazine, 6 : Chloroxuron, 7 : Neburon, 8 :Prometryn, 9 :Terbutryn. b)mélange acétonitrile/solution tampon citrate à 25 mM sur colonne C18, 5µm, 32,1 °C.

1 :acide phtalique, 2 :acide 2-nitrobenzoïque, 3 : 4-chloroaniline, 4 :acide2-fluorobenzoïque, 5 :Acide 3-nitrobenzoïque, 6 :acide 2-chlorobenzoïque, 7 : acide

3-fluorobenzoïque, 8 :acide 2,6-diméthylbenzoïque, 9 :2-chloroaniline,10 :3,4-dichloroaniline, 11 :3,5-dichloroaniline

3.4.5 Gradient de température et pression

Les gradients de température ont un effet beaucoup moins marqué en phase liquidequ’en phase gaz. Les gradients de pression sont également moins utilisés qu’en phasegaz.

40


— le triangle des exigences en chromatographie et la nécessité de faire des compromis— pour optimiser la séparation, il faut N le plus grand possible (colonne longue),

1 6 α 6 3 et 5 6 kB 6 20— Pour la chromatographie en phase gaz :

— les avantages et inconvénients pour les différents gaz vecteurs (diazote peudangereux et peu cher, hélium généralement bien mais cher, dihydrogène plusrapide mais dangereux)

— qu’il faut un diamètre de colonne le plus petit possible pour augmenter la ré-solution

— l’importance de la température et la possibilité de faire des gradients de pres-sion et/ou température

— Pour la chromatographie en phase liquide :— l’influence de la taille des particules sur la hauteur de plateau— la notion de phase normale et phase inverse avec des exemples classiques— les paramètres de choix d’un éluant : force éluotropique, triangle de Snyder— la notion d’élution isocratique (éluant constant) ou non

Chapitre 4

Méthodes chromatographiques

4.1 Chromatographie sur couche mince (CCM)

Le plus souvent, les chromatographies sur couche mince sont réalisées sur plaque desilice (ou sur alumine). La grandeur usuellement calculée est le rapport frontal :

R f ,i =di

L(4.1)

où di est la distance de migration de l’espèce depuis la ligne de dépôt et L la distance totaleparcourue par l’éluant. Cette grandeur est indicative mais pas forcément reproductible àcause des états de surface différents d’une plaque à l’autre. Il est possible d’estimer lefacteur de rétention à partir du rapport frontal :

k ≈1− R f ,i

R f ,i(4.2)

couvercle

cuve d'élution

papier absorbant

plaque de silice

éluant

front d'élution

ligne de dépôtdi

L

couvercle

cuve d'élution

papier absorbant

plaque de silice

éluant

front d'élution

ligne de dépôtdi

L

Figure 4.1 – Allure typique d’une CCM en cours d’élution, à droite, une plaque avecdifférents dépôts.

En général, il est recommandé :— de présaturer la cuve avec un papier absorbant pendant 10 à 15 minutes minimum.

Le fait de pré-saturer la cuve en vapeur d’éluant permet une meilleure reproduc-tibilité en assurant la possibilité d’avoir une adsorption des molécules d’éluant enamont du front d’élution.

— de ne pas toucher la plaque avec ses doigts pour éviter d’en modifier la surface.— d’arrêter l’élution lorsque l’éluant arrive à environ 1 cm du bord de la plaque ;

42

— si possible, de vérifier avant élution que la quantité déposée est suffisante pourvoir un dépôt.

— de faire un co-dépôt qui contient tous les échantillons à analyser pour pouvoir voirsi la séparation est suffisante ;

4.1.1 Méthodes de révélation

Il existe une grande variété de méthode de révélation qui dépend des composés àanalyser, parmi les plus courante, on peut citer :

— révélation UV à 254 nm, c’est la méthode la plus courante pour les molécules orga-niques conjuguées. En pratique, la révélation est due à la présence d’une moléculefluorescente sur la silice (à priori des composés inorganiques à base de silicatesde zinc). Les composés organiques qui absorbent dans l’UV empêchent alors lafluorescence. Les tâches correspondent donc à l’absence de fluorescence sur la plaque.

— Révélation avec des indicateurs chimiques, les deux plus couramment utiliséssont le permanganate et l’acide phosphomolybdique, il faut ensuite chauffer lesplaques et il y a alors apparition de taches colorées au niveau des composés. Il estégalement possible d’utiliser du diiode ou des ions iodures.

4.2 Chromatographie en phase gaz

4.2.1 Injection split ou splitless

Les colonnes en CPV étant majoritairement capillaires avec un petit diamètre, leurcapacité est généralement très faible. Ainsi, même en injectant quelques µL, il est possiblede saturer la colonne. Si c’est le cas, cela se traduit par une forte asymétrie des pics. Pourcontourner ce problème, il existe des systèmes dits « split » qui permettent de fractionnerle contenu injecté dans la colonne. Seulement une fraction de ce qui est injecté entre auniveau de la colonne.

Il est ainsi possible d’utiliser trois modes d’injection :— split pour les échantillons concentrés ou nécéssitant une haute résolution. Il peut

y avoir décomposition de certains composés très volatiles. Il est possible d’estimerla fraction de l’échantillon qui entre dans la colonne à l’aide du split ratio :

SR =Qs

Qc(4.3)

où Qs est le débit dans la vanne split et Qc est le débit en entrée de la colonne (voirfigure 4.2). Le volume réellement analysé est alors à peu près égal à V0/SR où V0est le volume injecté. En pratique, il peut varier entre quelques unité et mille. Lesplit ratio est indicatif et non reproductible d’une injection à une autre, d’où les soucispour faire de l’analyse quantitative.En pratique, les flux doivent être tels que le flux en entrée du gaz vecteur Qg soittel que :

Qg = Qp + Qs + Qc (4.4)

avec Qp qui est généralement de l’ordre de 2 à 3 mL/min – ce flux permet d’éli-miner toutes les impuretés qui pourraient venir du septum; Qs est le débit dans lavanne split et Qc est le débit en entrée de la colonne.

43

gaz vecteur

purge septum

vanne split

colonne

Qs

Qc

Qp

Qg

septum

liner en verre

Figure 4.2 – Schéma d’un injecteur split.

— splitless pour les échantillons dilués. C’est un injecteur split pour lequel Qs = 0 quiest utilisé. Cependant, le temps d’entrée de l’échantillon dans la colonne est pluslong et cela peut nécessiter des précautions supplémentaires pour éviter de saturerla colonne avec le solvant.

— injection directe en tête de colonne ou « on column » : cette méthode consiste à injec-ter directement l’échantillon dans la colonne. Elle est la plus fiable pour faire del’analyse quantitative car elle simplifie au maximum l’injection, cependant, la ré-solution est beaucoup plus faible et le diamètre de la colonne doit être plus grandpour éviter les mêmes problèmes que pour les injections splitless (les seringuesdoivent également avoir un diamètre adapté à celui de la colonne).

4.2.2 Détecteurs

Il existe un grand nombres de types de détecteurs possibles, mais les trois plus cou-rants sont :

— Les détecteurs à ionisation de flamme;— Les catharomètres/mesure de conductivité thermique ;— Les spectromètres de masse.Pour plus de détails sur les types de détecteurs, leurs usages et limites, il est possible

de consulter les référence [3, p580] et [2, p725-726]

Détecteurs à ionisation de flamme Ils sont spécifiques aux composés organiques. Cesdétecteurs sont destructifs. Le coefficient de réponse n’est pas universel. Cette méthode estdestructive car il y a combustion des composés organiques en présence de dihydrogènepour former des radicaux CH• qui produisent ensuite des composés ionisables :

CH• + O• = CHO+ + e− (4.5)

La sensibilité dépend du gaz vecteur (moins sensible avec du diazote que de l’hé-lium). De plus, seulement un atome de carbone sur 100 000 produit un électron, cela restesuffisant pour avoir une limite de détection très faible.

44

Détecteurs de conductivité thermique Ces détecteurs étaient les plus courants aupa-ravant car très robustes et peu chers. Ils sont non destructifs. Ils sont cependant moinssensibles que les détecteurs à ionisation de flamme. De plus, ils sont d’autant plus sen-sibles que le gaz vecteur a une grande conductivité thermique, en pratique, seul l’héliumet le dihydrogène ont une conductivité suffisante pour que cette méthode soit efficace.

En pratique, un filament au tungstène est parcouru par un courant électrique. En pré-sence d’un analyte (avec une conductivité plus faible que le gaz vecteur), le filament subitune élévation de température et donc une augmentation de sa résistance. Le détecteurmesure alors la diminution de la tension (figure 4.3). Contrairement aux détecteurs à io-nisation de flamme, la sensibilité augmente lorsque le débit de la colonne diminue. Deplus, en pratique, il arrive d’utiliser deux détecteurs en parallèle : un avec uniquementdu gaz vecteur et l’autre branché sur la sortie de la colonne, la comparaison entre les deuxsignaux permet d’augmenter la sensibilité.

sortie de colonne

évacuation

filament au tungstène

I

U

Figure 4.3 – Principe d’un catharomètre. Inspiré de [3, p 580]

Spectromètre de masse Le domaine est trop vaste pour être discuté en détail. Le tempsd’analyse peut être critique dans certains cas.

4.3 Chromatographie haute performance en phase liquide(HPLC)

4.3.1 Injecteurs

Vous pouvez consulter la référence [3, p 611] pour plus de détails.

4.3.2 Détecteurs

Parmi les méthodes de détection les plus courantes :— spectroscopie UV-visible, dans ce cas, il est nécessaire de veilleur au cutoff dans

l’UV du solvant (voir le tableau 3).— la conductimétrie ;— la fluorescence— l’indice de réfraction (moins sensible) ;— la spectroscopie infra-rouge (moins sensible) ;— les capteurs électrochimiques ;— la spectrométrie de massePour plus de détails, il est possible de consulter les références [3, p 612-616] et [2, p

752-757].

45

4.4 Chromatographie d’échange ionique

La chromatographie d’échange ionique permet de séparer des ions par échange. Ilest possible d’échanger soit des cations, soit des anions. Un des critères essentiels est lasélectivité de la colonne pour un ion donné. En général, les ions fortement chargés, defaible rayon hydrodynamique, et de forte polarisabilité ont une affinité plus grande pourla colonne.

La phase stationnaire est souvent une résine polymère fonctionnalisée en surface. Pourcontrôler l’élution, c’est couramment le pH qui est changé (ou la force ionique).

La conductimétrie est une méthode de choix pour détecter le passage d’ions, même sielle est non sélective.

Parmi les applications à connaître :— pour de l’eau « distillée », qui est en fait le plus souvent désionisée après passage

sur du charbon actif puis sur des résines échangeuses d’anion (pour libérer OH−)et de cation (pour libérer H+) afin d’avoir en sortie une conductivité la plus faiblepossible.

— Pour la séparation des lanthanides et actinides, c’est la méthode qui a permis deles obtenir avec une grande pureté dans les années 1930. Cela a eu un rôle majeurdans le développement de la bombe atomique par la suite.

Pour de plus amples détails sur la sélectivité, les types de résines utilisables, il estpossible de se référer à la référence [3, p 635-646].

4.5 Chromatographie d’exclusion stérique

Cette méthode est généralement utilisée pour séparer des polymères, protéines ou na-noparticules. L’idée est d’avoir des pores ou cavités qui permettent de « filtrer » les mo-lécules en fonction de leur taille. Les plus petites particules sont piégées dans les poresde la phase stationnaire alors que les plus grosse molécules restent dans les plus groscanaux. Le temps de rétention diminue donc lorsque la taille des molécules augmente.Contrairement aux autres méthodes, la chromatographie d’exclusion stérique ne reposepas particulièrement sur des forces intermoléculaires pour séparer les différents compo-sés.

Pour les polymères, c’est généralement la séparation en fonction de la masse molairequi est visée, mais les caractéristiques géométriques peuvent altérer la qualité de la sépa-ration.

Pour de plus amples détails, il est possible de consulter les références [3, 6].


— la différence entre injection split/splitless/on-column avec les avantages et inconvé-nients associés (CPV)

— la détection par ionisation de flamme ou mesure de capacité thermique (CPV)— les différents types de détection utilisables en HPLC— l’existence de la chromatographie d’échange ionique, d’exclusion stérique, chirale

Chapitre 5

Méthode analytiques

5.1 Méthodes quantitatives

La chromatographie permet de faire de l’analyse quantitative. Bien que chaque mé-thode de détection ait ses particularités, en général, la quantité de composé est propor-tionnelle à l’aire du pic :

nBi = KBi Ai (5.1)

où Ai est l’aire du pic (supposé résolu), nBi est la quantité de matière du composé Bi, etKBi est une constante de proportionnalité propre à l’espèce Bi.

L’utilisation d’une droite d’étalonnage est généralement insuffisante pour mener àbien un dosage. En effet, les injections split ne sont pas totalement reproductible touscomme le volume injecté. a

Il existe tout de même des méthodes qui permettent de s’affranchir de ces problèmes,y compris sans machine automatique pour injecter.

5.1.1 Méthode de l’étalon interne

Pour cette méthode, il faut avoir à disposition un composé étalon, noté E qui :— soit en dehors de la zone de sortie des composés d’intérêt (mais suffisamment

proche) ;— avec une réponse (aire) proche de celle des composés à analyser— ne réagisse ni n’interagisse avec les composés ;— de pureté élevée ;— initialement absent de la solution à analyser ;— totalement soluble dans l’échantillon à analyser ;

De plus, il faut avoir accès à des échantillons purs de chacun des composés à quantifier.Le principe consiste à :

1. Effectuer un chromatogramme de référence avec un mélange parfaitement connupour avoir accès aux constantes KBi et KE ;

2. Effectuer un deuxième chromatogramme sur l’échantillon auquel on a ajouté l’éta-lon interne de manière à avoir une concentration parfaitement connue.

a. Sauf avec une machine automatique. et encore, malgré l’amélioration de la reproductibilité, il restenécessaire de faire un traitement statistique sur plusieurs injections pour avoir des résultats fiables.

48

Exploitation du chromatogramme de référence Pour tous les composés, la concentra-tion est connue et l’aire est mesurée expérimentalement donc :

KBi ∝nBi

AiKE ∝

nE

AE(5.2)

ou

KBi ∝[Bi]

AiKE ∝

[E]AE

(5.3)

Il est alors possible de remonter au coefficient de réponse relatif pour chacun des com-posés :

K′i =KBi

KE(5.4)

Exploitation du second chromatogramme Cette fois-ci, les aires sont mesurées et laconcentration de l’étalon interne et l’ensemble des K′i sont connus. On a donc :

Ai

AE=

KBi

KE

nBi

nE= K′i

nBi

nE(5.5)

il est ensuite facile d’en sortir nBi :

nBi = nEAi

AE× 1

K′i(5.6)

ou la relation analogue en concentration, le volume injecté étant le même pour tous lescomposés – avec l’hypothèse d’avoir vaporisé l’intégralité de l’échantillon.

Attention Pour la solution utilisée lors du premier chromatogramme, il est nécessairede la re-préparer régulièrement car les différents composés utilisés peuvent avoir desvolatilités différentes. Dans ce cas, la proportion relative des constituants peut évoluer.Cela fausse totalement la méthode qui repose lourdement sur l’exploitation du premierchromatogramme. Plus particulièrement l’hypothèse d’avoir des concentrations connueset précises pour chacun des composés à analyser.

49

5.1.2 Méthode des ajouts dosés

Pour cette méthode (non spécifique à la chromatographie [15]), il est nécessaire d’avoiraccès à un échantillon pur du composé à analyser. Elle est plus précise avec des détecteursayant une réponse linéaire. Elle est particulièrement indiquée lorsqu’il y a un effet dematrice – lorsque les autres composés à analyser influent sur la réponse du détecteur etempêchent donc la réalisation d’un dosage par étalonnage.

Elle suppose :— d’avoir identifié le composé à analyser— d’avoir accès au composé à analyser pur ;— d’avoir un pic résolu (c’est crucial, cela doit donc être testé en changeant les condi-

tions opératoires) ;— de connaître la loi de réponse du détecteur ;— que la loi de réponse soit valable sur l’ensemble de la gamme d’étude ;Pour cela, la méthode se base sur :

1. un chromatogramme sur l’échantillon brut ;

2. des chromatogrammes sur l’échantillon brut auquel on ajoute i fois une quantitéprécise et connue du composé d’intérêt ;

3. le tracé de la réponse en fonction du nombre d’ajouts à effectuer ;

4. l’extrapolation des données pour remonter à la quantité totale initiale.

Ici, on suppose la réponse linéaire (ce qui est le cas pour un détecteur à ionisation deflamme) :

Ai = KBi nBi (5.7)

Pour le premier chromatogramme :

A0 = Kn0 (5.8)

Ensuite, si on note n′ la quantité ajouté lors de chaque ajout, alors :

Ai = K(

n0 + i× n′)

(5.9)

Le tracé des différentes valeur de Ai en fonction de l’indice de l’ajout permettent deremonter à la valeur de K× n′ – donc à la valeur de K vu que n′ est connu.

À partir de ces différentes grandeurs, il est possible d’en déduire le nombre théoriqued’ajouts i0 (pas forcément un entier) qu’il aurait fallu faire au solvant pur pour avoir lesignal A0 :

i0 =A0

Kn′⇔ A0 = K i0n′︸︷︷︸

n0

(5.10)

Ce qui permet de remonter à n0.En pratique, les variations ne doivent être ni trop petites (largement au dessus du rap-

port signal sur bruit), ni trop grandes (pour rester dans le domaine de linéarité). Usuelle-ment, une variation du signal de l’ordre de 5 à 10% permet de vérifier ces deux conditions.

Attention La moindre espèce qui ait le même temps de rétention que le composé ana-lysé fausse complètement la méthode car dans ce cas on aurait A0 = Kn0 + K′nimpureté.Ce qui fausserait tout le traitement mathématique.

50

A0=Kn' i0 =Kn0

Kn'

i0

Ai

i

1

2

3

A0

A10

Figure 5.1 – Principe de la méthode des ajouts dosés. La réponse est tracée en fonction del’indice de chaque ajout (courbe bleue). 1) Cela permet de remonter au coefficient de

proportionnalité Kn′, puis 2) ensuite à la valeur de i0 qui est le nombre d’ajouts que l’onaurait dû faire en partant de rien du tout pour observer le signal A0. 3) La quantité

initiale est alors égale à n0 = i0n′.

5.2 Identification (CPV)

En tant que telle, la chromatographie n’apporte pas d’information précise sur le com-posé correspondant à un pic chromatographique. Si certaines méthodes de détectionspeuvent permettre une identification (spectrométrie de masse, UV-visible, IR), elles nesont pas systématiquement disponibles ou faciles à mettre en œuvre sur les quantitésanalysées – qui sont généralement faibles. Les temps de rétentions sont tout de même desgrandeurs caractéristiques des composés du moment que la chromatographie est effec-tuée dans les mêmes conditions.

5.2.1 Indice de rétention de Kovats

Le principe est d’avoir la longueur de l’alcane linéaire qui aurait le temps de rétentioncorrespondant à celui du composé d’intérêt. Le principe de base ne marche que pour deschromatogrammes effectués dans des conditions isothermes et isobares.

Pour des alcanes linéaires de longueur n > 5 :

log t′R,n = a× n + b (5.11)

où t′R,n est le temps de rétention corrigé de l’alcane de longueur n et a et b sont desconstantes déterminées par régression linéaire sur les données expérimentales.

Pour un composé quelconque avec un temps de rétention corrigé donné t′R, il est alorspossible d’en sortir l’expression de n′ telle que log t′R = a× n′ + b. (n′ n’étant alors plusforcément un entier.) L’indice de Kovats est alors égal à :

I = 100n′ (5.12)

51

Pour mesurer l’indice de Kovats, il est bien entendu préférable de prendre des com-posés dont le temps de rétention encadre celui du composé d’intérêt. Dans ce cas, il estd’usage de faire une interpolation entre les deux alcanes encadrant le composé :

I = 100

(n +

log t′R − log t′R,n

log t′R,n+1 − log t′R,n

)(5.13)

Cela peut également de facilement identifier l’alcane linéaire le plus proche qui seraitsusceptible de jouer le rôle d’étalon interne (section 5.1.1).

5.2.2 Indices de Rohrschneider-McReynolds – polarité des phases sta-tionnaires

Ces indices sont utilisés pour caractériser les phases stationnaires. Elles utilisent les co-lonnes apolaire à base de squalane b comme référence. Le principe est de mesurer l’indicede rétention de Kovats sur le squalane et sur la colonne étudiée pour différents composéstypiques (tableau 5.1). La démarche globale est en tout point analogue à celle de Snydervue en section 3.4.4 mais ici pour la phase stationnaire et non pour l’éluant.

Rohrschneider McReynolds Commentaire

Benzène Benzène effet inducteurÉthanol n-butanol donneur de proton2-butanone 2-pentanone interactions dipolairesNitrométhane Nitropropane interactions dipolairesPyridine Pyridine accepteur de proton

2-méthyl-2-pentanol donneur de protonIodobutane composé polarisable2-octyne composé apolaire1,4-dioxane accepteur de protoncis-hydrindane composé apolaire

Tableau 5.1 – Composés utilisés pour établir les indices de Rohrschneider-McReynolds.

Pour chaque composé, il est alors possible de mesurer la grandeur :

∆I = Icolonne − Isqualane (5.14)

ou Icolonne est l’indice de Kovats sur la colonne étudiée.Pour chacune des échelles, il est possible de sommer les valeurs de ∆I pour avoir une

idée de la la polarité de la colonne. Bien que limités dans leur application, ces indices fontpartie des constantes données dans les catalogues pour aider les utilisateurs à choisir leurphase stationnaire. Les indices de Rohrschneider sont maintenant moins utilisés et lesvaleurs ne sont pas données systématiquement pour tous les composés de McReynolds.

b. hydrocarbure ramifié éthylènique de formule C30H62 qui a joué un rôle historique dans le dévelop-pement des colonnes chromatographiques

52

Phase stationnare Benzène n-butanol 2-pentanone Nitropropane Pyridine Tmin Tmax

Squalane 0 0 0 0 0 20 125Apolane 87® 21 10 3 12 25 20 260OV-1® 16 55 44 65 42 100 375OV-101® 17 57 45 67 43 20 375Dexsil 300® 41 83 117 154 126 50 450OV-17® 119 158 162 243 202 20 375Tricresylphosphate 176 321 250 374 299 20 125QF-1 144 233 355 463 305 0 250OV-202/OV-210® 146 238 358 468 310 0 275OV-225® 228 369 338 492 386 20 300Carbowax 20M® 322 536 368 572 510 60 225DEGS 492 733 581 833 791 20 200OV-275® 629 872 763 1106 849 20 275

Tableau 5.2 – Indices de Rohrschneider-McReynolds pour quelques colonnes. Tmin etTmax sont les températures extrêmes d’utilisation des colonnes. [5, p62]


— l’utilisation de la méthode de l’étalon interne— le principe de la méthode des ajouts dosés et comment l’utiliser

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Appendices

57

A Démonstration de la relation de Purnell

Si ωB ≈ ωA (on suppose les deux pics relativement proches et que les quantités injec-tées sont similaires)

R = 2t′R,B − t′R,A

ωB + ωA(15)

=t′R,B − t′R,A

ω(16)

=14

√NB

t′R,B − t′R,A

tR,B=

14

√NB

t′R,B − t′R,A

t′R,B

t′R,B

tR,B(17)

=14

√NB

α− 1α

kB

kB + 1(18)

car :

NB = 16(

tR,B

ω

)2

⇔ 1ω

=14

√NB

1tR,B

(19)

et :

t′R,B − t′R,A

t′R,B=

α− 1α

(20)

t′R,B

tR,B=

t′R,B

t′R,B + tM=

kB

kB + 1(21)

BPr

opri

étés

usue

lles

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lvan

tsco

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ts

Solv

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25°C

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25FC

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1276

102

0,8

1,86

<–2

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25FC

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210

1291

174

2,6

1,9

<–2

–0,

25Is

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ane

197

1389

990,

4711

1,94

0,1

0,01

0,02

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20,

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Chl

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e22

014

0478

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VI

0,26

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achl

orur

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265

1457

770,

908

2,24

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rn-

buty

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220

1397

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0,19

2,8

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0,44

0,18

0,38

I0,

25Tr

iéth

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1398

890,

362,

41,

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560,

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0,54

Brom

oéth

ane

1421

380,

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42,

0V

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her

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680,

380,

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40,

480,

140,

38I

0,28

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hylt

erti

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ylét

her

215

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0,47

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514

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57,

33,

910

,33,

40,

560,

180,

25II

0,5

Fluo

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5,4

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0,24

0,32

0,45

VII

Chl

orur

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mét

hylè

ne23

314

2140

0,41

0,17

8,9

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0,29

0,18

0,53

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42D

ichl

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0,42

0,3

2-Pe

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0513

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26II

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1397

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anol

240

1385

971,

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isci

ble

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82Té

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380,

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I0,

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53Pr

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1370

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482-

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820,

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VII

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III

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5978

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0,65

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7718

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III

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0,95

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Prop

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cour

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].

59

C Problèmes liés à la définition d’une vitesse moyenne

Il est possible de définir la vitesse moyenne comme :

u =L

tM(22)

Cependant, cette définition se heurte à différents soucis liés à la physique des écoule-ments :

— pour des colonnes capillaires, le profil de vitesse est celui d’un écoulement de Poi-seuille (parabolique)

— pour des colonnes garnies, la vitesse des particules de fluide n’est pas homogèneau sein de la colonne.

— Il y a une perte de charge le long de la colonne qui fait que la vitesse moyennedécroît le long de la colonne.

— La compressibilité n’est pas nulle. Il est possible de montrer que cela impacte es-sentiellement le terme Cs de l’équation de Van Deemter. [4, p 275-281]

Normalement, il serait préférable d’utiliser la vitesse en sortie de colonne. Cet effet estbeaucoup plus marqué pour la chromatographie en phase gaz (compressibilité plus im-portante qu’en phase liquide).

D Aspects historiques

Plus de détails sont disponibles dans la référence [6, chap. 1]— 1901 (expérience)/1903 (article en russe) /1906 (article en allemand) : Mikhaïl Ts-

wett (ou Tsvet ou Tsvett) séparation de pigment naturels (chlorophylle et caroté-noïdes)

— 1931, PN 1939 : Richard Kuhn (adhérent aux thèses nazies), Winterstein et Ledererséparation des caroténoïdes et de vitamines.

— 1940-1944 : développement des résines échangeuses d’ion pour la séparation desproduits de fission

— 1941, PN 1952 : Martin & Synge introduction de la silice comme phase stationnairepour remplacer les argiles. Développement de la chromatographie de partage etdes aspects théoriques.

— 1944 : chromatographie sur papier— 1950 : Howard & Martin, chromatographie par phase inverse— 1952 : Tiselius gradient d’élution— 1956 : équation de Van Deemter— 1958 : équation de Golay— 1958 : Moore, Stein, Spackman analyse d’acide aminés par chromatographie d’échange

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Chromatographie - agregationchimie.free.fr

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