UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE FARMÁCIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIENCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA A SAÚDE CAROLINE DECKMANN NICOLETTI DESENVOLVIMENTO DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4,0% (p/p) COM POLISSORBATO 80 COMO AGENTE SOLUBILIZANTE NITERÓI 2015
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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIENCIAS APLICADAS A PRODUTOS
PARA A SAÚDE
CAROLINE DECKMANN NICOLETTI
DESENVOLVIMENTO DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4,0% (p/p) COM POLISSORBATO 80
COMO AGENTE SOLUBILIZANTE
NITERÓI
2015
CAROLINE DECKMANN NICOLETTI
DESENVOLVIMENTO DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4,0% (p/p) COM POLISSORBATO 80
COMO AGENTE SOLUBILIZANTE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Aplicadas a Produto para a
Saúde da Faculdade de Farmácia da Universidade
Federal Fluminense, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em Ciências
Aplicadas a Produtos para Saúde.
Campo de Confluência: Tecnologia Farmacêutica.
Orientadora:
Prof.a Dr.ª Débora Omena Futuro
Co-Orientador:
Prof. Dr. Raphael Cruz
Niterói, RJ
2015
N 643 Nicoletti, Caroline Deckmann
Desenvolvimento de géis de papaína a 4,0% (p/p) com polissorbato 80 como agente solubilizante/ Caroline Deckmann Nicoletti; orientadora: Débora Omena Futuro. – Niterói, 2015. 113f. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal Fluminense, 2015. 1. Géis 2. Papaína 3. Concentração Micelar Crítica 4. Cicatrização de feridas I. Futuro, Débora Omena II. Título
CDD 541.34513
CAROLINE DECKMANN NICOLETTI
DESENVOLVIMENTO DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4,0% (p/p) COM POLISSORBATO 80
Carolina, que estiveram comigo tornando os momentos no laboratório mais agradáveis e
produtivos.
À Patricia, minha irmã da UFF, que me apoiou, deu força, sendo um exemplo de
companheirismos nas boas e más horas. As horas de laboratório foram muito mais fáceis ao
seu lado. Impossível esquecer o dia em que fiz a primeira placa de atividade proteolítica, você
estava lá e segurou minha mão, literalmente.
À amiga Sandra, que aceitou o desafio de me ensinar a língua inglesa, tão assustadora para
mim. Somente com os seus ensinamentos foi possível iniciar essa jornada.
À minha família, que mesmo de longe, me apoiou e acreditou em mim.
A todos, sinceramente muito obrigada!
É preciso que eu suporte duas ou três larvas se quiser conhecer as borboletas.
Antoine de Saint-Exupéry
RESUMO
NICOLETTI, C.D. Desenvolvimento de géis de papaína a 4,0% (p/p) com polissorbato 80 como agente solubilizante. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para a Saúde, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense, 2015. A papaína é uma enzima proteolítica utilizada no tratamento de feridas. É parcialmente solúvel em água e tem baixa estabilidade em preparações farmacêuticas, dessa forma os géis com concentrações de papaína acima de 1% podem apresentar precipitados. O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de géis de papaína a 4% (p/p) usando tensoativos como agente solubilizante. Como fase inicial do estudo realizou-se a determinação da Concentração Micelar Crítica (CMC) por meio da medida de tensão superficial de geis de papaína a 4,0% (p/p) com e sem L-cisteína e diferentes concentrações de polissorbato 80. Novas preparações foram desenvolvidas usando-se concentrações de polissorbato e L-cisteína que resultavam na completa solubilização da papaína. O estudo de estabilidade dos géis de papaína a 4,0% (p/p) com polissorbato 80 foi planejado e executado a partir de desenho experimental fatorial 33 em amostras armazenadas sob refrigeração por 30 dias. As variáveis independentes estipuladas foram concentração de L-cisteína, concentração de polissorbato 80 e o tempo de armazenagem; a variável dependente avaliada foi a concentração de papaína ativa. Todas as amostras foram analisadas quanto à manutenção das características sensoriais e físico-químicas. Durante o período de avaliação as preparações conservaram-se como géis homogêneos, mantendo-se estáveis quanto aos valores de pH, de viscosidade e de estabilidade termodinâmica. Estas amostras não apresentaram mudanças no seu comportamento reológico. As preparações estudas apresentaram concentrações de papaína ativa entre 90 e 110% apos 24 horas de preparo, mas não foi possível a manutenção desta atividade durante o período de estudo. As avaliações estatísticas decorrentes do desenho experimental fatorial resultaram em gráficos de superfície de resposta e de contorno, que demonstraram que o tempo é o fator de maior influência sobre a perda da atividade da papaína nas preparações em gel. A L-cisteína interfere favoravelmente para a manutenção da atividade, mas sua ação isolada é incapaz de sobrepor-se ao efeito do tempo. A associação da L-cisteína e do polissorbato 80 também apresenta ação favorável a manutenção da atividade enzimática, que se torna evidente somente nas maiores concentrações estudadas para estes adjuvantes. Palavras-chave: Papaína; Concentração Micelar Crítica; Atividade proteolítica; Desenho experimental fatorial
ABSTRACT
NICOLETTI, C.D. Development of papain gels at 4.0% (w/w) with polysorbate-80 as solubilizing agent. Dissertation (Master’s degree). Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para a Saúde, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense, 2015. Papain is a proteolytic enzyme used in the treatment of wounds. It is partially soluble in water and has low stability in pharmaceutical preparations thus gels with papain above 1% concentration may have precipitated. This study aimed to the development of papain gels at 4% (w / w) using surfactants as solubilizing agent. As the initial phase of study was carried out to determine the critical micellar concentration (CMC) by action of surface tension of papain gels at 4.0% (w / w) with and without L-cysteine and different concentrations of polysorbate 80. New preparations were developed using concentrations of polysorbate and L-cysteine resulted in complete solubilization of papain. The stability study of papain gels at 4.0% (w / w) polysorbate 80 was planned and carried out from 33 factorial experimental design for samples stored under refrigeration for 30 days. The independent variables were prescribed concentration of L-cysteine, concentration of polysorbate 80 and the storage time; the evaluated dependent variable was the concentration of active papain. All samples were analyzed for the maintenance of sensorial and physicochemical characteristics. During the evaluation period preparations presented as homogeneous gels, remaining stable as the pH, viscosity and thermodynamic stability. These samples showed no changes in their rheological behavior. The preparations studied showed ative papain concentrations between 90 and 110% after 24 hours of preparation, but it was not possible to maintain this activity over the study period. The statistical evaluations resulting from the factorial experimental design resulted in response surface graphs and contour, showing that time is the most influential factor on the loss of papain activity in preparations gel. L-cysteine favorably affects the maintenance of the activity, but its action alone is unable to override the effect of the time. The combination of L-cysteine and polysorbate 80 also presents favorable action to maintain the enzyme activity, which becomes evident only at the highest concentrations investigated for these adjuvants. Keywords: Papain; Critical Micelle Concentration; Proteolytic activity; Factorial experimental design
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Estrutura geral dos polímeros de carboxivinil .........................................................21
Figura 2: Estrutura tridimensional da papaína, onde os dois domínios da cadeia principal estão
representados em verde e o sítio catalítico, em azul.................................................................23
Figura 3: Representação das forças atrativas na superfície a no meio do líquido. ...................33
Figura 4: Tensão superficial de solução de tensoativo x concentração, com formação de
Para um sistema conter moléculas de tensoativos (monômeros) dispersos em água é
necessário estar abaixo do CMC, enquanto que acima dessa concentração o sistema possui
duas fases em equilíbrio: igual a do caso abaixo do CMC e outra contendo micelas de
tensoativos. Neste caso a formação de micelas não é uma agregação progressiva de
monômero de tensoativo e sim um processo de uma etapa, pois leva a formação de uma fase
separada de uma solução aquosa (modelo de separação de fase) (BINANA-LIMBELE,
ZANA, 1989). Outro exemplo de propriedades das soluções micelares é a associação gradual
de monômeros para a formação de uma única micela (número de agregação). A combinação
dessas duas características somadas gera a expressão para a energia livre padrão de
micelização (SHAW, 1975; SINKO, 2008).
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Os agregados formados acima de uma concentração crítica tem morfologias variadas,
As micelas formadas por tensoativos não-iônicos mostram um aumento de polaridade do
núcleo em direção à superfície polioxietileno-água. A interface núcleo-solução aquosa (parte
polar) é uma “paliçada” extremamente hidratada, e esta distribuição anisotrópica favorece a
inserção de diversas moléculas, ou seja, permite a solubilização (SINKO, 2008; PRAZERES,
2012).
Outros estudos demonstram que a CMC irá diminuir com o aumento de grupos
espaçadores1, bem como com a substituição destes por hidroxilas, porém o primeiro tem
maior efeito na diminuição da CMC (TIWARI, 2011).
Soluções de tensoativos aniônicos, catiônicos e não-iônicos foram usadas acima de
suas concentrações micelares críticas para testar a solubilidade de um fármaco insolúvel em
água (Artemotil). Os resultados evidenciam um aumento na solubilidade mediante a
solubilização micelar nas duas primeiras soluções, enquanto que para soluções não-iônicas a
melhoria na solubilização foi pequena (KRISHNA, FLANAGAN, 1989, apud SINKO, 2008).
Outro grupo de pesquisa testou a solubilização de óleo de hortelã-pimenta em água usando o
polissorbato 20 como solubilizante, obtendo resultados diferentes entre misturas homogêneas,
gel aquoso, solução límpida e separação de fases, dependente das concentrações dos 3
componentes (O'MALLEY; PENNATTI; MARTIN, 1958, apud SINKO, 2008). Para a
preparação de formulações límpidas de vitamina A monofásica, a quantidade mínima
presumível de tensoativo para a solubilização da vitamina foi determinada pelo diagrama de
fase (BOON et al., 1961, apud SINKO, 2008).
Os tensoativos podem ser classificados como não iônicos e iônicos, onde os não
iônicos não fornecem íons na solução aquosa e a sua solubilidade neste meio se dá devido as
seus grupamentos funcionais hidrofílicos. Os tensoativos iônicos apresentam cargas elétricas
na parte hidrofílica que formam íons carregados positiva ou negativamente, ao se dissociarem
em água (ROSSI et al., 2006).
1 Grupos espaçadores: também chamado de grupo ligante, refere-se a uma cadeia de hidrocarbonetos.
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2.4.3 Complexos Proteína-Tensoativos
Um dos excipientes mais comuns empregados para controlar as interações
interfaciais das proteínas são os tensoativos não-iônicos, por exemplo, os polissorbatos
(KAMERZELL et al., 2011; LEE et al., 2011; OHTAKE, 2011).
Os tensoativos ao aumentarem a solubilização de proteínas, a partir da interação
direta e ligações hidrofóbicas na superfície protéica, irão cobrir e proteger a mesma de outras
interações indesejáveis. (KAMERZELL et al., 2011).
As proteínas, dentre elas as enzimas, como a papaína, são moléculas de superfície, ou
seja, tendem a adsorver e acumular-se nas interfaces, ficando assim muito suscetíveis à perda
de sua atividade, que também poderá ocorrer pelo desdobramento estrutural e pequenas
agregações moleculares. Algumas modificações de formulações, como mudança do pH e uso
de excipientes, são úteis para minimizar as interações interfaciais das proteínas
(KAMERZELL et al., 2011; LEE et al., 2011; OHTAKE, 2011).
Misturas de proteínas e tensoativos provocam alterações isotérmicas nas interfaces, e
essas mudanças de valores de adsorção, em função do tensoativo, fornecem informações de
grande relevância sobre a composição e propriedades estruturais dessa camada
(KAMERZELL et al., 2011).
Kamerzell e colaboradores (2011) sugerem que ao reduzir a tensão superficial, bem
como a energia livre do sistema, os tensoativos também reduzirão a interação proteína-
proteína e proteína-superfície, uma vez que haverá competição com a proteína para adsorver
nas interfaces. Além disso, teremos um sistema energeticamente desfavorável a adsorção da
proteína na interface (GRAY, 2009). Lee e colaboradores (2011) acrescentam, que
tensoativos aumentam a estabilidade conformacional da proteína e o desdobramento da
energia livre associada à desnaturação/agregação. Lee e colaboradores (2011) e Ohtake
(2011) completam, que a proteção protéica por de tensoativos poderá ocorrer por um dos
mecanismos ou por ambos, ou seja, pelo impedimento da adsorção e/ou pela estabilização da
proteína em solução inibindo a aproximação e conseqüente agregação (Figura 5).
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Figura 5: Mecanismos de estabilização de proteínas por surfactantes, que podem (a) posicionar-se na interface e
evitar a adsorção de proteínas, ou (b) se associam com as proteínas e preferencialmente, assim, evitar a aproximação e agregação (Adaptado: LEE et al. (2011)).
O efeito protetor do tensoativo sobre a proteína estará correlacionado com a CMC,
seja pela formação micelar, ou pela simples solubilização por interações hidrofóbicas. Desta
forma sendo diretamente ligado à concentração da proteína quanto do tensoativo (GRAY,
2009; KAMERZELL et al., 2011; LEE et al., 2011).
Comumente, adiciona-se tensoativos aniônicos e não iônicos, para prevenir a
adsorção de proteínas às superfícies e desta forma estabilizar macromoléculas (BAM;
RANDOLPH; CHELAND, 1995). Por outro lado, concentrações elevadas de tensoativo
podem desestabilizar estas mesmas macromoléculas (KATAKAM; BELL; BANGA, 1995). A
concentração de tensoativo sobre a agregação de proteínas supõe uma ação protetora
correlacionada com a concentração micelar crítica do tensoativo (WANG; JOHNSTON,
1993).
O esquema apresentado no Quadro 1 refere-se a uma mistura de proteína-tensoativo
idealizada e em equilíbrio. É uma referência útil para explicar as observações de sistemas de
maior complexidade. No entanto, por razões teóricas e práticas, as medições do verdadeiro
equilíbrio interfacial, geralmente, não são possíveis e tão claras no caso de misturas de
proteína-tensoativo reais (LEE et al., 2011). Os resultados na prática poderão ser variáveis,
conforme a proteína, o tensoativo, suas concentrações e o meio em que ambas encontram-se
(GRAY, 2009).
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Quadro 1: Quadro das 5 regiões de interações proteínas-tensoativos e interface.
Região 1: Concentrações baixíssimas de tensoativos:
Região 2: Concentrações baixas
de tensoativos:
Região 3: Concentrações moderadas de tensoativos:
Região 4: Concentrações altas de
tensoativos:
Região 5: Concentrações mais altas de tensoativos
(> CMC):
Poucas moléculas de tensoativos têm pouco,
ou nenhum, efeito sobre a tensão
superficial.
O aumento da concentração de
tensoativos diminui a tensão superficial,
levando ao inicio da formação de complexos de
proteínas-tensoativos
Há interações consideráveis entre
proteínas-tensoativos e superfície.
A interação proteína-tensoativo induz ao deslocamento da
proteína pra o interior do líquido (afastando-a
da superfície).
A proteína fica completamente
afastada da superfície. A proteína torna-se
revestida pelos tensoativos.
Representação esquemática da diminuição da tensão superficial associadas a cinco momentos distintos a interação da proteína-tensoativo e interações de tensoativo na interface (Adaptado: LEE et al. (2011) e GRAY (2009)).
É possível observar cinco momentos distintos de interação proteína-tensoativo
dependente da concentração de tensoativos. Na primeira fase a concentração de tensoativos é
nula ou baixíssima, não havendo efeito sobre a tensão superficial, a qual seria a mesma que a
de uma solução pura de proteína; as interações proteínas-tensoativos e nas interfaces são
limitadas. Na segunda fase, na qual ocorre uma mínima adição de tensoativos, observa-se
queda na tensão superficial. Esse fenômeno ocorre graças ao posicionamento do tensoativo na
interface ar-água, mesmo que haja também algumas moléculas dispersas no líquido. Nesta
pequena concentração já se inicia a formação de complexos de proteínas-tensoativos, porém
ainda bastante restritos. Com o crescente aumento de tensoativos observa-se a terceira fase,
onde as interações entre proteínas-tensoativos e superfície tornam-se apreciáveis. A tensão
superficial entra em um platô, a partir do favorecimento energético para a ligação entre o
tensoativo e a proteína. Provavelmente nesse intervalo, a CMC registrada para o tensoativo
em meio isento de proteínas é ultrapassada. Com uma concentração progressiva de
tensoativos registra-se a quarta fase e há interações significantes entre proteínas-tensoativos e
superfície. Estas interações induzem as proteínas a afastarem-se da superfície ao serem
deslocadas para o interior do líquido. Na quinta fase, a partir do aumento contínuo de
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tensoativos na solução, é alcançada a CMC, a qual é específica para a concentração de
proteína utilizada no experimento, portanto, não há mais tensoativos para adsorver na
superfície, uma vez que há forte interação entre as moléculas de tensoativo e a superfície. A
proteína torna-se revestida pelos tensoativos e fica completamente afastada da superfície. Se
houver ainda aumentos progressivos na concentração de tensoativos, esses não produzirão
alteração na tensão superficial, ou seja, manter-se-á dentro deste platô já atingido (GRAY,
2009; LEE et al., 2011).
2.4.4 Polissorbatos
Os polissorbatos (Tweens®) são um grupo de substâncias com características
anfifílicas, sua estrutura molecular esta representada na Figura 6. São tensoativos não-iônicos
derivados polioxietilênicos de ésteres de sorbitano (LAWRENCE, 2006). Possuem ações:
surfactante; emulsionante de preparações estáveis de emulsões farmacêuticas O/A e A/O;
solubilizante de diversas substâncias, dentre óleos essenciais e vitaminas solúveis em óleos;
como agente molhante, dispersor e suspensor de formulações orais e parenterais, onde o uso
varia conforme a concentração (Tabela 2) (AULTON, 2005; LAWRENCE, 2006;
FERREIRA, 2008). São compatíveis com substâncias aniônicas e catiônicas, além de muito
resistentes a mudanças de pH (FERREIRA, 2008).
Figura 6: Estrutura química geral dos polissorbatos. O alifático (hidrofóbico) caudas de polissorbato 20 e 80
pode variar em comprimento e grau de insaturação, enquanto que o teor de óxido de polietileno (PEO) mantém-se constante. (Fonte: LEE et al., 2011)
(Alifático)
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Tabela 2: Uso x Concentração dos polissorbatos
Uso Concentração (%)
Agente Emulsionante
Utilizado isoladamente em Emulsão O/A 1-15
Utilizado em combinação com os emulsionantes hidrofílicos em emulsões de O/A
1-10
Usado para aumentar as propriedades de retenção de água de pomadas
1-10
Agente Solubilizante
Para componentes ativos pobremente solúveis em bases lipofílicas
1-10
Agente Molhante
Para componentes ativos insolúveis em bases lipofílicas 0,1-3
Fonte: LAWRENCE, 2006.
A miscibilidade dos polissorbatos é extremamente abrangente, indo desde com água,
álcool, glicerina, propilenoglicol, polietilenoglicol 400, chegando até ser miscível em óleos
vegetais e mineral (FERREIRA, 2008). Os polissorbatos são bastante hidrofílicos, logo o seu
valor de EHL é alto (Tabela 3) (SYNKO, 2008).
Os tensoativos não-iônicos mostram-se vantajosos graças a baixa toxicidade e
irritabilidade. São também bastamente usados em produtos cosméticos, alimentares, e nas
formulações farmacêuticas por via oral, parenterais (IV e IM), retal, vaginal e tópica, sendo
geralmente, considerados como materiais não tóxicos e não irritantes (AULTON, 2005;
LAWRENCE, 2006; SINKO, 2008). Segundo Ferreira (2008) usa-se a 1% em preparações
oftálmicas. No entanto, existem relatos pontuais de hipersensibilidade a polissorbatos após o
seu uso tópico e intramuscular (LAWRENCE, 2006).
Os tensoativos não-iônicos têm menor efetividade como agentes antibacterianos do
que os demais. Além disso, os polissorbatos reduzem a atividade antimicrobiana de
Figura 7: Representação esquemática das alterações microscópicas de volume causada por processo de associação de um surfactante não iônico a géis de carbômero.(Adapatado de BARREIRO-IGLESIAS,
ALVAREZ-LORENZO, CONCHEIRO, 2003).
Figura 8: Etapas da associação do tensoativo ao polímero; A) a concentração do tensoativo esta superior a
concentração de agregação crítica (CAC) e dá-se inicio a associação entre os dois componentes; B) a concentração do tensoativo esta acima do ponto de saturação do polímero (PSP). (Adaptado de Guerra, 2008).
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Os resultados mostram que, ao escolher a proporção apropriada do tensoativo mais
adequada, é possível modular o escoamento, as propriedades elásticas e o microambiente
difusional de géis de carbômero, sem perder a capacidade gelificação dependente do pH, o
que poderia melhorar a adequação dos géis de carbômero para entrega de fármaco por de
diferentes rotas (BARREIRO-IGLESIAS, ALVAREZ-LORENZO, CONCHEIRO, 2003).
2.5 OUTROS ADJUVANTES
Em quaisquer formas farmacêuticas que contenham adjuvante, se faz necessária a
verificação da interação destes com o próprio fármaco, pois estas podem ocorrer, porém isso
deverá ser apurado no momento da formulação do medicamento (AULTON, 2005).
Como citado por Ohtake (2011), osmólitos também podem ser usados na
estabilização de proteínas. Osmólitos tem a função de proteger as proteínas da desnaturação e
perda de função. Rodrigues (2006) relata que: “aminoácidos e carboidratos são considerados
osmólitos compatíveis, pois agem como estabilizadores protéicos, e mesmo em altas
concentrações não afetam a função da proteína”. Dentre os osmólitos encontramos a categoria
de aminoácidos. Zulli (2007) afirma que a presença de cisteína nas formulações de papaína
ativa a sua atividade por redução do sítio catalítico.
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3. OBJETIVO
Desenvolver géis de papaína 4% (p/p) com uso de tensoativo para obtenção de
preparações homogêneas.
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Realizar desenvolvimento farmacotécnico e caracterização de géis de papaína a 4%
(p/p) utilizando tensoativo como agente solubilizante.
Estudar a estabilidade de géis de papaína a 4% (p/p) quanto a sua descrição sensorial,
pH, potencial zeta, reologia e atividade proteolítica.
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4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 MATERIAIS
a) Matérias-primas
• Ácido acético glacial P.A. – Proquímios
• Água purificada de Osmose Reserva
• Água ultra-pura Purelab Flex - Veolia
• Carbômero 940 - AQUPEC HV-505 – Farmos
• Cloridrato de Carbobenzoxi-L-fenilalanil-L-arginina 4-metilcumarina-7-amid (N-CBZ-
PHE-ARG-7-MCA), grau de pureza analítico – Sigma Aldrich
O método faz uso de um anel de platina (Método Du Noüy), acoplado a um
tensiômetro, o qual eleva o anel em direção a superfície e registra o aumento de força
necessária para tal, sendo o valor dado quando a força atinge o seu valor máximo necessário
para desprender um anel de uma superfície, ou seja, quando há a aplicação da máxima força
para o rompimento do filme superficial. Existe uma relação conhecida entre a força de
separação e a tensão superficial, sendo esta representada pela expressão abaixo:
Equação 1:
γ = βF 4πR
Onde: F = refere-se ao empuxo sobre o anel, R = o raio médio do anel e β = um fator de correção, utilizado para compensar o sentido não vertical das forças de tensão.
O anel de platina foi previamente limpo em ácido forte ou na chama, o qual foi
colocado no aparelho em seu devido local e tarado. A amostra foi colocada na cubeta própria
e, posteriormente, foi repousado perfeitamente na horizontal. Graças a uma portinhola acrílica
de proteção foi possível fazer as leituras de tensão superficial com total isenção de
perturbações físicas externas.
O anel seco é introduzido na interface, submerso a uma profundidade de molhagem
pré-estabelecida, aproximadamente 1 cm abaixo da superfície, e em seguida puxado para
cima, em direção a superfície. Ao imergir este anel à preparação e dar inicio ao processo, o
próprio aparelho promove sua retirada e mede a força necessária para o desprendimento do
anel da superfície. Essa força é registrada e dada ao final, juntamente com o desvio padrão
dessa mensuração. O sistema foi programado para registrar a medida de cinco (5) tensões
superficiais fazendo posteriormente uma média destas leituras. Foram consideradas somente
as leituras que tiveram desvio padrão inferior a 10.
O anel foi submergido por mais duas vezes na mesma amostra e destas três leituras
foram feitas as médias. A leitura de tensão superficial foi feita em duas porções da amostra,
uma na parte superior e outra na porção intermediária, sendo feita a média dessas duas
amostragens. Portanto foi feita média de um total de 6 leituras de cada amostra. Além da
triplicata de lote.
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Avaliação de géis de papaína a 4,0% (p/p) com tensoativo por potencial zeta
A medição do potencial zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p) das amostras das duas
série (Tabelas 5A e B) foram feitas em temperatura ambiente de 25ºC, 24 horas após a
incorporação da papaína e dos coadjuvantes ao gel. A leitura foi efetuada no mesmo dia em
que se procedeu a diluição das amostras a uma concentração de 2,0% (p/p) em água ultra-
pura. As medições foram feitas em duas alíquotas por amostra, sendo uma da porção superior
do frasco e outra de sua porção inferior. As amostras foram formuladas em triplicadas.
Os valores foram observados e avaliados pelo do programa Zetasizer Software 7.01.
O potencial zeta foi medido em cubeta apropriada (Figura 10) no aparelho Zetasizer®
Nanoseries – Nano ZS90 – Malvern Instruments localizado no laboratório de DLS (Dynamic
Light Scattering ), sala 104, Instituto de Química da UFF.
Figura 10: Cubetas para análise de potencial zeta em aparelho Zetasizer® Nanoseries – Nano ZS90 – Malvern
Instruments
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4.2.2 Caracterização de géis de papaína a 4% (p/p) utilizando tensoativo como agente solubilizante
O estudo da CMC possibilitou estabelecer uma faixa de concentrações do tensoativo
onde a papaína e a L-cisteína encontravam-se nas condições ideais de solubilidade para uma
preparação farmacêutica. Informações obtidas pela literatura permitiram a determinação da
faixa de concentração de L-cisteína seriam utilizadas neste estudo. (MIURA, 2012) As
formulações planejadas para as etapas seguintes do trabalho foram definidas tendo por base
um desenho experimental fatorial de 33. As variáveis independentes foram à concentração de
cisteína e de polissorbato e o tempo de armazenagem. O desenho experimental com seus
diferentes níveis esta representado na Tabela 6 e 7. Os géis formulados foram avaliados em
tempos diferentes, sendo que os dados obtidos logo após a sua preparação foram utilizados
Figura 17: Representação gráfica do calculo das equações de reta usadas para o estabelecimento da CMC no
gráfico de tensão superficial dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série sem cisteína
Equação 5:
y = -78,667x + 222,59 R2 = 0,6713
Equação 6:
y = -2,9915x + 207,08 R2 = 0,4296
Onde: y = Tensão Superficial; x = Concentração de Tensoativo (polissorbato 80) (%; p/p); R2= coeficiente de correlação linear
O trabalho de Barreiro-Iglesias, Alvarez-Lorenzo e Concheiro (2003) que estudou a
interação entre polissorbato 80 e carbômeros demonstra a alta tensão na superfície do sistema,
pois na presença de carbômero, a concentração de polissorbato 80 na superfície diminui à
medida que o tensoativo é adsorvido sobre o polímero, de forma a estabilizar-se no interior da
rede polimérica.
69
A diferença dos valores de CMC que se observa entre as duas séries de géis, com e
sem cisteína, pode ser devido a presença de cargas efetivas produzidas pela cisteína em
solução alterando a organização das micelas.
Este achado é semelhante ao obtido no estudo feito por Guzmán (2010), estudo este
que observou a influência de ânios, como a Cisteína, sobre as propriedades físicas dos
líquidos, os quais alteram: a solubilidade de líquidos iônicos em água; a formação micelar e
tão logo a tensão superficial.
Guzmán (2010) verificou que na presença de ânions pode-se observar que a tensão
superficial é reduzida, porém a formação de agregados é desfavorecida.
Quando se compara a ação de íons cloreto e brometo sobre a formação de micelas em
sistemas aquosos, indicando que o tamanho dos íons não é, por si só, suficiente para inibir o
processo de agregação que ocorre a uma faixa de concentração baixa, sendo a explicação
baseada na coatropicidade2 do ânion brometo, ou seja, estes são mais facilmente adsorvidos
sobre a superfície dos agregados, reduzindo assim, a repulsão eletrostática e facilitando a
agregação. Enfim, com o tamanho aumentado do ânion a solubilidade do líquido iônico em
água é bastante reduzida, o que dá a entender a ocorrência da formação de uma nova fase
líquida intermediária, termodinamicamente mais estável, que à formação de agregados
(GUZMÁN, 2010).
Cabe ressaltar que o raio cristalográfico da cisteína é igual a 5,156x10-10m
(HARDIRNG e LONG; 1968) enquanto que o do cloreto esta entre 1,41x10-10 e 2,00x10-10 m
(TUBINO e SIMONI; 2007), ou seja encontra-se na mesma ordem de grandeza, sendo o raio
cristalográfico da cisteína apenas entre 2,58 e 3,65 vezes maior.
Em suma, quando se aumenta o tamanho do ânion a solubilidade do líquido iônico
em água é consideravelmente reduzida, sugerindo a formação de uma segunda fase líquida,
onde se tem um líquido iônico puro termodinamicamente mais estável do que a formação de
agregados em solução, ou seja, um grande ânion reduz a tensão superficial, diminuindo
também a CMC, mas não favorece a formação de agregados. Desta forma pode-se dizer que
os ânions poderão induzir a separação de fases, ainda antes da possibilidade de agregação
(GUZMÁN, 2010). 2 Coatropicidade: poder de desestabilizar uma molécula, desde a água ou até mesmo uma enzima, enquanto que cosmotropicidade é o poder de estabilizá-la (MEDEIROS, 2013).
70
Os géis que utilizam carbômero 940 como excipiente podem sofrer alterações na
consistência em função dos valores de pH alcançados na preparação final. Conhecendo-se esta
fragilidade dos produtos optou-se por verificar se todas as preparações utilizadas para o
cálculo do CMC encontravam-se dentro da faixa de pH condizente com a consistência mais
estável dos géis de carbomero (pH 5,5 e 7,0). Os valores de pH das preparações, apresentados
na Tabela 11, indicam que todos os géis avaliados encontravam-se dentro da faixa de pH onde
a viscosidade sofre menor influência. Cabe ressaltar que o valor de pH do gel base foi de 6,14
(±0,17).
Tabela 11: Valores de pH dos géis de papaína a 4,0% (p/p) das duas séries de preparações.
pH*
Preparações Série 1 Preparações Série 2
G1.5 C/CYS ZERO 5,95 (±0,31) G1.5 S/CYS ZERO 5,77 (±0,26)
A partir da visualização da Figura 22 pode-se dizer que todas as amostras
apresentaram comportamento pseudoplástico, pois a viscosidade absoluta diminui
gradativamente com o aumento da velocidade de rotação e, consequentemente, da taxa de
cisalhamento. Este comportamento é o desejável quanto à preparação semi-sólida de uso em
feridas, pois se almeja que o produto espalhe-se facilmente sem escorrer.
Avaliação do potencial zeta
Os valores de potencial zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1 estão
registrados na Tabela 17 e na Figura 23. Observa-se que os valores de potencial zeta de todas
as preparações estão acima de |30| mV indicando que estes géis são termodinamicamente
estáveis.
Tabela 17: Valores de potencial zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1
Preparações (% p/p) Potencial Zeta (mV)*
P1 (0,000% Cys / 0,4% P80) -42,25 (±0,64)
P2 (0,000% Cys / 0,7% P80) -37,00 (±7,50)
P3 (0,000% Cys / 1,0% P80) -39,80 (±5,37)
P4 (0,025% Cys / 0,4% P80) -43,40 (±5,80)
P5 (0,025% Cys / 0,7% P80) -55,00 (±2,12)
P6 (0,025% Cys / 1,0% P80) -49,95 (±5,59)
P7 (0,050% Cys / 0,4% P80) -49,30 (±0,71)
P8 (0,050% Cys / 0,7% P80) -49,45 (±0,35)
P9 (0,050% Cys / 1,0% P80) -52,50 (±0,57)
Legenda; Cys = L-Cisteína; P80 = Polissorbato 80 *Média de seis determinações para cada concentração com desvio padrão
81
P1
P7 P8P9
P5* P6
P2* P3P4
-65,00
-55,00
-45,00
-35,00
-25,00
-15,00
-5,00
Po
ten
cial
Zet
a (m
V)
Figura 23: Histograma dos valores de potencial zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1
Os géis P2 e P5 diferem estatisticamente dos demais e entre si, em nível de
significância de 0,05. A preparação P2 em sua composição não possui cisteína e contem 0,7%
(p/p) de polissorbato 80, enquanto P5 é composto por 0,025% (p/p) de cisteína e 0,7% (p/p)
de polissorbato 80.
Concentração de Papaína ativa a partir da avaliação da Atividade Proteolítica
Curva de Calibração
Os resultados obtidos na curva de calibração da papaína padrão secundário 30.000
USP-U/MG (Merk), são representados na Tabela 18 e Figura 24.
82
Tabela 18: Resultados experimentais obtidos na curva de calibração da papaína padrão
secundários 30.000 USP-U/MG.
Concentração
(USP-U/mg)
Velocidade* (unidades
de fluorescência/min) CV%
0,45 86,69 (±6,16) 7,11
0,75 147,95 (±24,41) 16,50
1,50 307,90 (± 34,74) 11,28
3,00 679,95 (± 84,49) 12,43
3,75 878,92 (± 93,82) 10,67
*Média de três determinações para cada concentração com desvio padrão
Curva de Calibração
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00
Concentração (USP-U/mg)
Velocidade(Fluorescência/min)
Figura 24: Curva de Calibração da papaína 30.000 USP-U/mg
A equação da reta obtida a partir da curva de calibração (equação 7) indica que o
valor do coeficiente de correlação linear (R2) é 0,9985.
Equação 7:
y = 240,47x - 34,213 R2 = 0,9985
Onde: y = velocidade do aumento de unidade de fluorescência por minuto; x = concentração de papaína em USP-U por mg; R2= coeficiente de correlação linear
83
A partir dos dados representado na Tabela 18, Figura 24 e Equação 7, pode-se
observar a proporcionalidade entre a concentração de papaína padrão secundário (30.000USP-
U/mg) e o aumento da velocidade na reação de formação de composto fluorescente. O
coeficiente de correlação linear (R2) foi igual a 0,9985; o que corresponde ao valor de
coeficiente de correlação (R) igual a 0,9992, atendendo ao critério mínimo de aceitação de
valor de R>0,99. A obtenção deste valor demonstra linearidade do método analítico
empregado, sendo que o conceito de linearidade encontra-se na Resolução nº 899 da ANVISA
(BRASIL, 2003) descrito como “a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar
que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra,
dentro de um intervalo especificado”.
Os nove dos géis de papaína a 4,0% (p/p) (P1 a P9) foram avaliados quanto a sua
atividade proteolítica usando-se a metodologia desenvolvida por Miura (2012).
Os valores da concentração de papaína ativa dos géis de papaína a 4,0% (p/p) obtidos
a partir da avaliação da atividade proteolítica no decorrer das primeiras 24 horas (D1) estão
apresentados na Tabela 19 e Figura 25.
Tabela 19: Valores de unidade de fluorescência e concentração de papaína ativa dos géis de
(3) Tempo (L) -51,23 9,97 -5,14 0,00 -71,37 -31,09 Tempo (Q) 14,23 17,31 0,82 0,42 -20,74 49,20 1L por 2Q 50,58 12,72 3,98 0,00 24,88 76,27 1Q por 2L -15,78 12,21 -1,29 0,20 -40,45 8,88 1Q por 2Q 15,57 22,18 0,70 0,49 -29,22 60,37 1Q por 3L -11,21 12,21 -0,92 0,36 -35,88 13,45 1Q por 3Q 10,02 21,18 0,47 0,64 -32,76 52,80 2L por 3Q -17,86 12,15 -1,47 0,15 -42,39 6,67
A Tabela 28 que apresenta os efeitos dos fatores sobre a atividade proteolítica da
papaína e indica que o tempo, a concentração de cisteína e de polissorbato 80 são
estatisticamente significativos, a 5% de significância. Os resultados mostram que a
concentração de papaína ativa foi afetada negativamente pelo tempo (p = 0,00) e pela
presença de polissorbato 80 (p = 0,00) enquanto a L-cisteína interfere positivamente em sua
atividade (p = 0,02). O diagrama de Pareto (Figura 40) demonstra pelos valores de t (41), em
ordem decrescente, quais os efeitos e interações são significativas a um coeficiente de 95%. A
partir destes dados pode-se perceber que o fator de maior relevância corresponde ao tempo
(efeito = -51,23) em sua forma linear, o qual influencia negativamente a concentração de
papaína ativa. A interação do tensoativo linear com a cisteína na forma quadrática influencia
positivamente a atividade proteolítica (efeito = 50,58). Em contrapartida, o fator de terceira
maior relevância é o tensoativo linear, visto isoladamente, que influencia de forma negativa a
101
atividade (efeito = -37,88). A L-cisteína linear é um fator que influencia favoravelmente a
concentração de papaína ativa (efeito = 32,00). Os demais fatores são de menor relevância
uma vez que se encontram fora do limite de coeficiente de 95%, tanto superior quanto
inferior.
-0,441386
0,4731011
-0,59114
0,7020703
0,8217801
-0,918235
-1,29234
-1,47039
2,490308
-3,64542
3,975538
-5,13787
p=0,05
Estimativa dos Efeitos Padronizados (Valores Absolutos)
Tensoativo (Q)
1Q por 3Q
Cisteína (Q)
1Q por 2Q
Tempo (Q)
1Q por 3L
1Q por 2L
2L por 3Q
(2) Cisteína (L)
(1) Tensoativo (L)
1L por 2Q
(3) Tempo (L)
Figura 40: Diagrama de Pareto dos efeitos padronizados.
Papaína ativa(USP-U/mg)
280 260 240 220 200 180
0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1
Polissorbato 80(%; p/p)
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
Cis
teín
a (%
; p/
p)
Figura 41: Gráficos de Superfície de resposta e curva de contorno para a concentração da papaína ativa em
função da concentração de Cisteína e de Polissorbato 80, fixando o Tempo em D1
A Figura 41 apresenta os gráficos de superfície de resposta e curva de contorno para a
concentração da papaína ativa em função da concentração de L-cisteína e de polissorbato 80,
fixando-se o tempo em D1. Estes gráficos explicam melhor os efeitos das variáveis
independentes sobre a atividade da papaína e indicam que os melhores resultados são obtidos
em duas regiões. A área que representa os valores mais altos de papaína ativa é fruto da
presença dos maiores valores de L-cisteína e polissorbato 80. A outra região indica valores
medianos de L-cisteína (0,020 a 0,030%) associados a baixas concentrações de polissorbato
80 (0,3%). Também é possível afirmar que altas concentrações de cisteína (acima de 0,050%)
102
e baixas concentrações de polissorbato, próximas da concentração micelar crítica,
desfavorecem a atividade proteolítica.
Papaína ativa(USP-U/mg)
260 240 220 200 180
0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1
Polissorbato 80(%; p/p)
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
Cis
teín
a (%
; p/
p)
Figura 42: Gráficos de Superfície de resposta e curva de contorno para a concentração da papaína ativa em
função da concentração de Cisteína e de Polissorbato 80 fixando o Tempo em D7
Papaína ativa(USP-U/mg)
240 220 200 180 160
0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1
Polissorbato 80(%; p/p)
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
Cis
teín
a (%
; p/
p)
Figura 43: Gráficos de Superfície de resposta e curva de contorno para a concentração da papaína ativa em
função da concentração de Cisteína e de Polissorbato 80 fixando o Tempo em D15
0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1
Polissorbato 80(%; p/p)
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
Cis
teín
a (
%; p
/p)
Figura 44: Gráficos de Superfície de resposta e curva de contorno para a concentração da papaína ativa em
função da concentração de Cisteína e de Polissorbato 80 fixando o Tempo em D23
103
Papaína ativa(USP-U/mg)
220 200 180 160 140
0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1
Polissorbato 80(%; p/p)
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
Cis
teín
a (%
; p
/p)
Figura 45: Gráficos de Superfície de resposta e curva de contorno para a concentração da papaína ativa em
função da concentração de Cisteína e de Polissorbato 80 fixando o Tempo em D30
As Figuras 42 a 45 apresentam os gráficos de superfície de resposta e curva de
contorno para a concentração da papaína ativa em função da concentração de cisteína e de
polissorbato 80, fixando-se os tempos em D7, D15, D23 e D30, respectivamente. As áreas
observadas em D1 como sendo as que apresentam as melhores condições para a atividade da
enzima estão presentes nestes gráficos, mas as concentrações de papaína ativa obtidos são de
menor valor.
Com a avaliação comparativa de todos os gráficos fica evidente que o tempo é o fator
de maior influência sobre a manutenção da atividade proteolítica e, conseqüentemente, da
concentração de papaína ativa. A presença da cisteína e polissorbato 80 nos limites superiores
que foram estudados, 0,06% e 1,1% respectivamente, usados isoladamente nas preparações
irão agir de forma prejudicial ao sistema. Porém quando associados, há uma interação desses
componentes que contribui para a manutenção da concentração ativa de papaína.
Nota-se que há uma demonstração do quanto é sensível a interação entre a cisteína e o
polissorbato 80 na manutenção da atividade da papaína, sugerindo que os melhores resultados
ocorrem quando os dois adjuvantes encontram-se na proporção de 1:15.
Os resultados das análises dos gráficos de superfície e contorno indicam que novos
estudos devem ser realizados de maneira a avaliar o efeito de maiores concentrações de L-
cisteína e polissorbato 80 sobre a atividade da papaína. Existe um grande saldo positivo no
estudo de superfície resposta realizado, pois conseguiu-se provar a grande importância da
presença da L-cisteína na manutenção da atividade, mesmo que este adjuvante não favoreça
os melhores valores de atividade em D1. Foi possível, então, ampliar as observações feitas por
Miura (2012) em seus primeiros trabalhos.
104
6. CONCLUSÕES
O presente trabalho dedicou-se ao desenvolvimento e caracterização de géis de
papaína a 4% (p/p) destinados ao tratamento de lesões tissulares utilizando polissorbato 80
como agente solubilizante. Para o emprego deste tensoativo realizou-se o estudo da
concentração micelar crítica de modo a estabelecer em que faixa de concentração que o
insumo deveria ser utilizado. Os resultados apontam que este objetivo foi atingido, pois todas
as preparações estudadas apresentaram aspecto homogêneo, sem a presença de precipitados
mesmo na presença de L-cisteína e durante o estudo de estabilidade. Os estudos do potencial
zeta das preparações indicaram que as preparações são termodinamicamente estáveis e as
análises feitas durante o estudo de estabilidade confirmaram a estabilidade do sistema durante
a armazenagem das amostras sob refrigeração no período de 30 dias.
O estudo de géis de papaína a 4% (p/p) usando-se polissorbato 80 também contou com
a avaliação da interferência da L-cisteína sobre os produtos e na atividade enzimática da
papaína. A inclusão deste aminoácido nas preparações modifica os valores da concentração
micelar critica e de potencial zeta do sistema.
Como fruto dos achados iniciais procedeu-se um planejamento da composição das
formulações que participariam do estudo de estabilidade tendo como base um desenho
experimental de 33. As variáveis independentes consideradas foram concentração de L-
cisteína (valores entre 0,000 e 0,050% p/p); concentração de polissorbato 80 (valores entre
0,400 e 1,000% p/p) e o tempo de estudo. A avaliação das características das amostras nos 30
dias de estudo permitiu concluir que a estratégia tentada foi eficiente para obter-se
preparações homogêneas e estáveis quanto a suas características sensoriais e físico-químicas,
mas não conseguiu evitar a perda a atividade da papaína com o tempo. A preparação com
maiores valores de papaína ativa em D1, o gel P3, que apresentava na formulação 1,0% (p/p)
de polissorbato 80, sem L-cisteína, foi a preparação que teve maior taxa de redução de
atividade em 07 dias, sugerindo que a ausência deste aminoácido influencia na perda da
atividade.
105
As avaliações estatísticas decorrentes do desenho experimental fatorial possibilitaram
estudar a influencia das variáveis independentes, concentração de polissorbato 80, de L-
cisteína e o tempo, sobre a concentração de papaína ativa nos géis. O efeito do tempo sobre a
atividade enzimática mostrou-se muito grande, possivelmente o sistema aquoso do gel
desfavorece a estabilidade do sítio ativo da enzima. O efeito da L-cisteína foi favorável à
proteção da enzima com o tempo, mas sua ação isolada não foi suficiente para sobrepor a ação
do tempo. Observa-se que o efeito associado da presença de polissorbato 80 e L-cisteína
conseguiram contrapor-se, em parte, ao efeito do tempo. A análise dos gráficos de superfície
de resposta indicou que as melhores condições para obterem-se géis de papaína 4% (p/p) com
os maiores valores de papaína ativa as concentrações dos dois adjuvantes devem estar nos
seus maiores valores (L-Citeína 0,05% e Polissorbato 80 1,00%).
Sugestões para pesquisas futuras
• Estudar formulações semi-sólidas de papaína em concentrações maiores de polissorbato
80 e L-cisteína.
• Verificar outras bases não aquosas para a manutenção da atividade da papaína.
• Testar outros adjuvantes que favoreçam a manutenção do sítio ativo da papaína
reduzido.
• Pesquisar novos tensoativos e agentes solubilizantes
106
7. REFERÊNCIAS
ARNON, R. Papain. Methods in Enzymology. v. 19, p. 226-244, 1970.
ATTWOOD, D., ELWORTHY, P.H. LAWRENCE, M.J. J. Pharm. Pharmacol. 41. 585. 1989. apud SINKO. P.J. Físico-Farmácia e Ciências Farmacêuticas. Artmed. 5 ed. 2008.
ATTWOOD, D. et al. Solubilization of Indomethacin by Polysorbate 80 in Mixed Water-Sorbitol Solvents. J. Pharm. Pharmacol. 41. 83. 1989. apud SINKO. P.J. Físico-Farmácia e Ciências Farmacêuticas. Artmed. 5 ed. 2008.
AULTON, M.E. Delineamento de Formas Farmacêuticas. 2 ed. Porto Alegre: Artmed, 2005.
AZULAY, R.D. Dermatologia. 5 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008.
BAM, N.B.; RANDOLPH, T.W.; HCLELAND, J.L. Stability of protein formulations: investigation of surfatant effects by a novel EPR. Spectroscopis Technique. Pharmaceutical Research. v. 12, n. 1, p. 2-10. 1995.
BARREIRO-IGLESIAS, R.; ALVAREZ-LORENZO, C.; CONCHEIRO, A. Poly(acrylic acid) microgels (carbopol® 934)/surfactant interactions in aqueous media Part I: Nonionic surfactants. International Journal of Pharmaceutics. v. 258, p. 165–177, 2003.
BERNARD, D. et al. Analysis of proteins with caseinolytic activity in a human stratum corneum extract revealed a yet unidentified cysteine protease and identified the so-called "stratum corneum thiol protease'' as Cathepsin L2. Journal of Investigative Dermatology. v. 120, n. 4, abr., p. 592-600, 2003.
BINANA-LIMBELE, W., ZANA, R., Electrical conductivity study of the self-association of ionic surfactants in solution in ethyleneglycol, formic acid and formamide. Colloid & Polymer Science. n. 267, p. 440-447. 1989.
BLANES, L. Tratamento de feridas. Baptista-Silva JCC, editor. Cirurgia vascular: Guia ilustrado. São Paulo: 2004. Disponível em: <http://www.bapbaptista.com>. Acesso em 16 mar. 2013.
BOATENG, J. S. et al. Wound Healing Dressings and Drug Delivery Systems: A Review. Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 97, n. 8, ago., p. 2892-2923, 2008.
BONN, P.F.G., COLES, C.L.J., TAIT, M. J. Pharm. Pharmacol. n.13. 200T, 1961. apud SINKO. P.J. Físico-Farmácia e Ciências Farmacêuticas. Artmed. 5 ed. 2008.
BRASIL, Ministério da Saúde, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RE nº 899, de 29 de maio de 2003. Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 02 jun. 2003.
BRASIL, Ministério da Saúde, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Guia de Estabilidade de Produtos Cosméticos. v. 1, p. 11-22, Brasília, 2004.
107
BRASIL, Ministério da Saúde, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução - RE Nº 1, de 29 de Julho de 2005. Guia para a realização de estudos de estabilidade. Brasília, 2005.
BRASIL, Ministério da Saúde, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC nº 49, 23 nov. 2010. Farmacopéia Brasileira, 5ª ed., Brasília, 2010.
BRASIL, Ministério da Saúde, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Formulário Nacional. 2 ed. Brasília, 2011.
BROCKLEHURST, K. Papain and related proteins. Nature. v. 345, p. 394. 1990.
CAI, L.; GOCHIN, M.; LIU, K. A facile surfactant critical micelle concentration determination. Chem. Commun. v. 47, p. 5527-5529, 2011.
CAMARGO, S.M.P.L.O. Estudo combinado do ultra-som pulsado de baixa intensidade e da papaína na cicatrização de úlcera por pressão no atendimento domiciliar. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação Interunidades em Bioengenharia, Universidade de São Paulo, 2006.
CAPUCHO, H. C. Desenvolvimento de formulações tópicas contendo papaína para o tratamento de feridas. Dissertação de Mestrado em Ciências Farmacêuticas, USP - Ribeirão Preto, 2007.
CESARETTI, I.U.R. Processo fisiológico de cicatrização da ferida. Pelle Sana. v. 2, p. 10-12, 1998.
CHAUD, M.V. et al. Solid dispersions with hydrogenated castor oil increase solubility, dissolution rate and intestinal absorption of praziquantel. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. vol. 46, n. 3, jul./set. 2010.
COMPARINI, A. et al. Metodologia de superfície de resposta: uma introdução nos softwares R e Statistica. Disponível em: < http://www.icmc.usp.br/CMS/Arquivos/ arquivos_enviados/BIBLIOTECA_113_RT_376.pdf> Acesso em: 03 mar. 2015.
DALTIN, D.. Tensoativos: química, propriedades e aplicações. São Paulo: Blucher, 2011.
DAL-BÓ, A. G., Associação de micelas mistas de surfactantesaniônicos com o polímero hidrofobicamente modificado etil(hidroxietil) celulose(EHEC). Dissertação (Mestrado) Programa de Pós-Graduação em Química. Universidade Federal de Santa Catarina – UFSC. Florianópolis. 2007
DAMASCENO, B.P.G.L. et al. Microemulsão : um promissor carreador para moléculas insolúveis. Ver. Ciênc. Farm. Básica Apl. v. 32, n. 1, p. 9-18, 2011.
DAWKINS G. et al. Antibacterial effects of Carica papaya fruit on common wound organisms. West Indian Med J. v. 52, n. 4, p. 290-292, 2003.
DECLAIR, V. Tratamento de úlceras crônicas de difícil cicatrização com ácido linoléico. Jornal Brasileiro de Medicina. v. 82, p. 36-41, 2002.
DEF. Dicionário de Especialidades Farmacêuticas: DEF 2002/03. 31º Ed. Rio de Janeiro. Produção JBM (Jornal Brasileiro de Medicina). Edição de Publicações Científicas. p. 502. 2002.
108
EXCIPIENTES em destaque: Carbopols (carbômeros). International Journal of Pharmaceutical Compounding. Edição Brasileira. v.1, n. 1, p 28-29. nov./dez. 1998.
FALANGA, V. Wound bed preparation and the role of enzymes: a case for multiple actions of therapeutic agents. Wounds - A Compendium of Clinical Research and Practice. v. 14, n. 2, p. 47-57. 2002.
FERNANDES, L.L. Panorama dos curativos com carboximetilcelulose para o tratamento de feridas e queimaduras utilizando técnicas de avaliação de tecnologia em saúde. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-graduação em Engenharia Metalúrgica e de Materiais, COPPE, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro. RJ. 2012.
FERREIRA, A.M. et al. Revisão de Estudos Clínicos de Enfermagem: Utilização de Papaína para o Tratamento de Feridas. R Enfermagem. UERJ, n.13, p. 382-9, 2005.
FERREIRA, A.O. Guia Prático de Farmácia Magistral. v. 1, 3 ed., São Paulo: Phamabooks, 2008.
FERREIRA, A.M. et al. Atividade antibacteriana in vitro de géis com diferentes concentrações de papaína. Rev. Elet. Enf. [Internet]. v.10, n.4, p.1035-40, 2008. Disponível em: <http://www.fen.ufg.br/revista/v10/n4/v10n4a15.htm>. Acesso em: 21 mai. 2013.
FLINDT, M. Health and safety aspects of working with enzymes. Process Biochemistry. v. 13, n.8, p.3-7, 1978. Apud ZULLI, G. Desenvolvimento de uma matriz polimérica para incorporação e liberação controlada de papaína. Dissertação (Mestrado). Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, Universidade de São Paulo, 2007.
FLORENCE, A. T., ATWOOD, D. Princípios Físico-químicos em Farmácia. 2ª.ed. São Paulo: Pharmabooks, 2011.
GOMES, F.S.L.; CARVALHO, D.V. Tratamento de ferida: Revisão da literatura. Rev. Min. Enf. n. 6, p. 67-72, 2002.
GOULART, G.A.S. Obtenção e caracterização de micropartículas de quitosana contendo papaína. Tese (Doutorado) Faculdade de Engenharia Química. Universidade Estadual de Campinas. Campinas. São Paulo. 2006.
GRAY, W.D.; Surfactant Effects on Adsorption of Recombinant Factor VIII (rFVIII) at the Air-Water Interface. (Project for the degree). Science in Chemical Engineering. Oregon State University, University Honors College. 2009.
GUERRA, J.P.V.T.A. Coacervação em sistemas aquosos contendo xantana, poli(etilenoimina) e dodecil sulfato de sódio. Trabalho de conclusão de curso (Graduação em Química), Centro de Ciências Físicas e Matemáticas – Departamento de Química. Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 2008.
GUZMÁN, N.M. et al Efecto del catión, del anión y del co-ión sobre la agregación de líquidos iónicos en solución acuosa. Quim. Nova. v. 33, n. 8, p. 1703-1708, 2010.
HARDING, M.M.; LONG, H.A. The Crystal and Molecular Struture of L-Cysteine. Acta Cryst. v. B24, p. 1096-1102. 1968.
109
HAX, G. Comparando os efeitos da utilização da papaína e AGE em lesões cutâneas: estudo experimental. Dissertação de Mestrado em Ciências da Saúde, PUC-RS, 2009.
INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONISATION OF TECHNICAL REQUIREMENTS FOR REGISTRATION OF PHARMACEUTICALS FOR HUMAN USE (ICH) Guidance for Industry: Q8(R2) Pharmaceutical Development. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. 2 rev, nov, 2009. 29p.
KAMERZELL T.J. et al. Protein–excipient interactions: Mechanisms and biophysical characterization applied to protein formulation development. Advanced Drug Delivery Reviews. v.63, p. 1118–1159, 2011.
KANAOKA, Y. et al. Sunthesis of a Key Fluorogenic Amide, L-Arginine-4-methylcoumaryl-7-amide (L-Arg-MCA) and Its Derivatives. Fluorescence Assays for Trypsin for Trypsin and Papain. Chem.Pharm. Bull. v. 25, n. 11, p. 3126-3128. 1977.
KATAKAM, M.; BEL, L.N; BANGA, A.K. Effect of surfactants on the physical stability of recombinant human growth hormone. J. Pharm. Sci. v.84, n. 6, p. 713-716. 1995.
KIMMEL, J.R.; SMITH, E.L. Crystalline papain. I. Preparation, specificity, and activation. Journal of Biological Chemistry. v. 207, p. 515-530, 1954.
KISIDAY, J. et al. Natl. Acad. Sci. USA n. 99, 9996. 2002 apud SINKO. P.J. Físico-Farmácia e Ciências Farmacêuticas. Artmed. 5 ed. 2008.
LEE, H.J., et al. J. Molecular origins of surfactant-mediated stabilization of protein drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. v. 63, p. 1160–1171. 2011.
LENTH, R.V. Response-surface methods in R, using rsm. Journal of Statistical Software. v. 32, n. 7, p. 1-17, 2009.
LEONARDI, G. R.; GASPAR, L. R.; CAMPOS, P. M. B. G. M. Estudo da variação do pH da pele humana exposta à formulação cosmética acrescida ou não das vitaminas A, E ou ceramida, por metodologia não invasiva. Anais Brasileiros de Dermatologia, 2002, v. 77, n. 5, p. 563-569.
LOFTSSON, T. et al, The effect of water-soluble polymers on drug-cyclodextrin complexation. International Journal of Pharmaceutics. n. 110, p. 169-177. 1994.
110
LOFTOSSON, T.; FRIRIKSDÓTTIR, H.; GUMUNDSDÓTTIR, T.K. The effect of water-soluble polymers on aqueous, solubility of drugs. International Journal of Pharmaceutics. v. 127, p. 293-296, 1996.
LOFTOSSON, T.; FRIRIKSDÓTTIR, H. The effect of water-soluble polymers on the aqueous solubility and complexing abilities of β-cyclodextrin. International Journal of Pharmaceutics.v. 163, p. 115-121, 1998.
MACIEL, E.A.F. Prevalência de feridas em pacientes internados em um hospital filantrópico de grande porte de Belo Horizonte. Dissertação (Mestrado). Escola de Enfermagem, Universidade Federal de Minas Gerais, 2008.
MANDELBAUM, S.H.; DI SANTIS, E.P.; MANDELBAUM, M.H.S. Cicatrização: conceitos atuais e recursos Auxiliares Parte I. An. bras. Dermatol. Rio de Janeiro, n. 78, v. 4, p. 393-410, jul./ago. 2003a.
______Cicatrização: conceitos atuais e recursos Auxiliares Parte II. An. bras. Dermatol. Rio de Janeiro, n. 78, v. 5, p.525-542, set./out. 2003b.
MAHATO, R.I.; NARANG, A.S. Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery. 2 ed. 2012.
MEDEIROS, J.; KANIS, L.A. Avaliação do efeito de polietilenoglicóis no perfil de extratos de Mikania glomerata Spreng., Asteraceae, e Passiflora edulis Sims, Passifloraceae. Revista Brasileira de Farmacognosia. v. 20, n. 5, out./nov., p. 296-802. 2010.
MEDEIROS, G. A et al. Enzimas e Líquidos Iônicos: Uma Combinação Promissora para um Biodiesel Limpo. Rev. Virtual Quim. n.5, v. 1, p. 74-94, 2013.
MILLER, J. N.; MILLER, J. C. Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 4ª ed., Nova Jersey: Pearson Education/Prentice Hall, 2000.
MIRANDA, J.C. et al. Cyclodextrins and ternary complexes: technology to improve solubility of poorly soluble drugs. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. vol. 47, n. 4, oct./dec. 2011.
MIURA, D. Desenvolvimento farmacotécnico e estudo de estabilidade de géis de papaína destinados ao tratamento de feridas. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde. Faculdade de Farmácia. Universidade Federal Fluminense. 2012.
MONETTA L. Uso da papaína nos curativos feitos pela enfermagem. Revista Brasileira de Enfermagem. v. 40, n. 1, p. 66-73, 1987.
MOSQUETA, V.D.F., Penetração de bases dermatológicas. Parte II. Revista Anfarmag. p 8-10, set./out. 1996.
NAEEM, A.; FÁTIMA, S.; KHAN, R.H.. Characterization of partially folded intermediates of papain in presence of cationic, anion and non-ionic detergents at low pH. Biopolymers. Wiley Periodicals, Inc. v. 83, p. 1-10. 2006.
111
OHTAKE, S., KITA, Y.; ARAKAWA, T. Interactions of formulation excipients with proteins in solution and in the dried state. Advanced Drug Delivery Reviews. v. 63, p. 1053–1073, 2011.
O'MALLEY,W.J., PENNATTI, L., MARTIN, A. J. Am. Pharm. Assoc. Sci. Ed. 47. 334. 1958. apud SINKO. P.J. Físico-Farmácia e Ciências Farmacêuticas. Artmed. 5 ed. 2008.
OZLEN, S.; Cosmetic composition containing alpha hydroxyacids, salicylic acid, and enzyme mixture of bromelain and papain. Biotechnology Advances. v. 4, n.4, p. 562, 1996.
PEREIRA, Â.L.; BACHION, M.M. Tratamento de feridas: análise da produção científica publicada na Revista Brasileira de Enfermagem de 1970-2003. Rev. Bras. Enferm. n. 58, v. 2, p. 208-13, mar./abr. 2005.
PIEPER, B.; CALIRI, M.H.L. Nontraditional wound care: a review of the evidence for the use of sugar, papaya/papain, and fatty acids. Journal of Wound, Ostomy and Continence Nursing. v. 30, n. 4, p. 175-183, 2003.
PINTO, C.A.S.O. Estudo comparativo da estabilidade de formulações cosméticas contendo papaína livre e modificada. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Fármacos e Medicamentos, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo. 2005.
PINTO, C.A.S.O. et al. Comparative study of the stability of free and modified papain incorporated in topical formulations. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. v. 47, n. 4, p. 751-760, out./dez. 2011.
PIRES, P.A.R. Síntese e Propriedades de Soluçõe de Tensoativos Catiônicos e Derivados de (3-dimetilaminopropil)amidas de Ácidos Carboxílicos. (Tese de Doutorado). Universidade de São Paulo. Instituto de Química. São Paulo. SP. 2002.
PRAZERES, T.J.V et al. Determination of the critical micelle concentration of surfactants and amphiphilic block copolymers using coumarin. Inorganica Chimica Acta. v. 381, p. 181–187, 2012.
PRISTA, L.N.; ALVES, A.C.; MORGADO, R.; LOBO, J.S. Tecnologia Farmacêutica. I, II e III Volume. 5 ed. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 1995.
RAKHIMOV M.R. Pharmacological study of papain from the papaya plant cultivated in Uzbekistan. Eksp Klin Farmakol. n. 63, v. 3, p. 55-7, Rússia. 2000.
RODRIGUES, A.P.O.; Estudo dos efeitos de osmólitos de ocorrência natural “betaína e óxido de trimetilamina” na transmissão neuromuscular, na junção mioneural e no processo de acoplamento excitação-contração de músculo estriado esquelético de mamífero. (Dissertação de Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, do Setor de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Paraná – UFPR. Curitiba. PR. 2006.
ROL, J.L et al., Revisão de estudos clínicos de enfermagem: utilização de papaína para o tratamento de feridas. Revista de Enfermagem. UERJ, n. 13, p. 382-9, 2005.
112
ROSSI, C.G.F.T. et al. Tensoativos: uma abordagem básica e perspectivas para aplicabilidade industrial. Rev. Univ. Rural. Sér. Ci. Exatas e da Terra. Seropédica. RJ: EDUR, v. 25, n.1-2, p. 73-85, 2006.
RUAS, G.W. et al. Desenvolvimento de sistema de liberação de papaína para uso tópico. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Universidade São Paulo. SP. 2006. Disponível em: <https://uspdigital.usp.br/siicusp/cdOnlineTrabalhoVisualizarResumo? numeroInscricaoTrabalho=1827&numeroEdicao=14>. Acesso em 03 fev. 2015.
RUCKENSTEIN, E., SHULGIN I. Solubility of drugs in aqueous solutions Part 1. Ideal mixed solvent approximation. International Journal of Pharmaceutics. n. 258, p. 193–201. 2003a.
RUCKENSTEIN, E., SHULGIN I. Solubility of drugs in aqueous solutions Part 1: Binary nonideal mixed solvent. International Journal of Pharmaceutics. n. 260, p. 283–291. 2003b.
SANCHEZ NETO, R. Aspectos morfológicos e morfoméricos da reparação tecidual de feridas cutâneas de ratos com e sem tratamento com solução de papaína a 2%. Dissertação de Mestrado em Técnica Operatória e Cirúrgica Experimental da Escola Paulista de Medicina. 48 p. 1991.
SANGEETHA, K.; ABRAHAM, T.E., Chemical modification of papain for use in alkaline medium. Journal of molecular catalysis B: Enzymatic. v. 38, p. 171-177. 2006.
SANTOS, V.L.C.G. Avanços tecnológicos no tratamento de feridas e algumas aplicações em domicílio. In: Duarte, YAO & Diogo MJD. Atendimento domiciliar: um enfoque gerontológico. São Paulo: Atheneu. p. 265-306. 2000.
SANTOS, E.P.. Enzimas em cosmetologia. Cosmetic & Toiletries. Edição em Português. v. 13, p. 66-71. 2001.
SATHISH, H.A.; KUMAR, P.R.; PRAKASH, V. Mechanism of solvent induced thermal stabilization of papain. International Journal of Biological Macromolecules. v. 41, p. 383-390, 2007.
SHAW, D.J. Introdução à química dos colóides e de superfícies. São Paulo: Editora da Universidade de São Paulo. 185 p. 1975.
SILVA, R.L.da; VOLPATO, N.M. Meios para dissolução de comprimidos de nimesulida: ação dos tensoativos. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. v.38, n. 2, p. 163-172, abr./jun. 2002.
SILVA, L. M. Efeitos benéficos da papaína no processo terapêutico de lesões de pele. In: JORGE S.A., DANTAS S.R.P.E. Abordagem multiprofissional no tratamento de feridas. São Paulo: Atheneu, p. 123-31, 2003.
SILVA, L.R.. Utilizacion del gel de la papya para la remoción de la caries - reporte de un caso con seguimiento clínico de un año. Acta odontol. venez. v. 43, n. 2, Caracas. mai. 2005.
SIM, Y.C. et al. Stabilizaion of papain and lysozyme for application to cosmetic products. Biotechnol. Lett., v. 22, p. 137-140. 2000.
113
SINKO. P.J. Físico-Farmácia e Ciências Farmacêuticas. Artmed. 5 ed. 2008.
SMITH, E.L.; KIMMEL, J.R.; BROWN, D.M. Crystalline papain. II. Physical studies; the mercury complex. Journal of Biological Chemistry. v. 207, p. 533-549, 1954.
SZABÓ, A. et al. Spectroscopic studies of stability of papain in aqueous organic solvents. Journal of Molecular Catalysis B: Enzimatic. v. 41, p. 43-48. 2006.
TIWARI, A.K.; SOWMIYA, S.M.; SAHA, S.K. Study on premicellar and micellar aggregates of gemini surfactants with hydroxyl substituted spacers in aqueous solution using a probe showing TICT fluorescence properties. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry. v. 223, p. 6–13, 2011.
TRAVERSA, E. Desenvolvimento de formulações cosméticas contendo papaína e avaliação da sua eficácia depilatória sobre o folículo piloso. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Fármacos e Medicamentos, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, 2003.
TREVISAN, B. P. Avaliação da tensão superficial, parâmetros reológicos e atenuação acústica de suspensões de açaí. Dissertação (Mestrado) Programa de Pós-Graduação em Engenharia Mecânica e Área de Concentração em Térmicas e Fluídos. Escola de Engenharia de São Carlos. Universidade de São Paulo. 2011.
TUBINO, M.; SIMONI, J. de A. Determinação experimental dos raios cristalográficos dos íos sódio e cloreto. Quim. Nova. v. 30, n. 7, p. 1763-1767. 2007.
USP XXXI: United States Pharmacopeia. Convention, RockVille, MD. p. 2911-2912. 2008.
WALSH, G.; HEADON, D.. Protein Biotechnology. Ed. John Wiley & Sons. Chichester, Cap. 6. 1994.
WANG, P-L.; JOHNSTON, T.P. Enhenced stability of two model proteins in an agitated solution environment using poloxamer 407. J. Parenter. Sci. Technol. v. 47, p. 183-189, 1993.
VELASCO, M.V.R. Desenvolvimento e padronização de gel contendo papaína para uso tópico. 144 p. Dissertação de Mestrado. Faculdade de Ciências Farmacêuticas de São Paulo. Universidade de São Paulo. São Paulo. 1993.
VILLANOVA, J.C.O.; ORÉFICE, R.L.; CUNHA, A.S. Aplicações Farmacêuticas de Polímeros. Polímeros: Ciência e Tecnologia. v. 20, n. 1, p. 51-64, 2010.
YOUNG-CHU, S. et al. Stabilization of papain and lysozyme for application to cosmetic products. Biotechnology Letters. n. 22, p. 137-140, 2000.
ZHUANG, P.; BUTTERFIELD, D.A. Desnaturation studies of active-site labeled papain using electron paramagnetic resonance and fluorescence spectroscopy. Biophys. J. v. 60, p. 623-628, 1991.
ZULLI, G. Desenvolvimento de uma matriz polimérica para incorporação e liberação controlada de papaína. Dissertação (Mestrado). Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, Universidade de São Paulo, 2007.