Caracterización de algunos compuestos de interés en los procesos de fermentación y tostado de dos especies de cacao Amazónico Miryam Lucía Solarte Rangel Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Ingeniería Agrícola y Alimentos Medellín, Colombia 2021
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Caracterización de algunos compuestos de interés en los
procesos de fermentación y tostado de dos especies de cacao Amazónico
Miryam Lucía Solarte Rangel
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Ingeniería Agrícola y Alimentos
Medellín, Colombia
2021
Caracterización de algunos compuestos de interés en los
procesos de fermentación y tostado de dos especies de cacao Amazónico
Miryam Lucía Solarte Rangel, Ing. Alimentos
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ingeniería Agroindustrial
Director:
Héctor José Ciro Velásquez, MSc., Ph.D
Codirectora:
Edith Marleny Cadena Chamorro, Ph.D
Línea de Investigación: Postcosecha
Grupo de Investigación: Ingeniería Agrícola
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias Agrarias, Área Curricular de Agro ingeniería y Alimentos
Medellín, Colombia
2021
Dedicatoria
A mi querido tío Miguel Ángel. Quedan en mi
memoria tus cantos, tu buen humor y la alegría
con que vivías cada momento, te amo y sé que
volveremos a encontrarnos.
Agradecimientos
Primeramente, a Dios y su hijo Jesucristo por darme la vida y hacer este objetivo posible.
Al profesor Héctor Ciro y la profesora Edith Cadena por su apoyo y orientación en el
desarrollo de esta investigación.
A los profesores Orlando Simón Ruiz y Diego Luis Durango, por su asesoría en las
metodologías analíticas aplicadas.
A mis compañeros de laboratorio de Procesos Agrícolas, por su compañía, apoyo y cariño.
A la Gobernación del Departamento del Putumayo y Minciencias por financiación a través
de la convocatoria No. 754-Formación De Capital Humano De Alto Nivel Para Las
Regiones –Departamento Del Putumayo.
A mi madre y mi esposo por apoyarme, animarme con sus palabras y creer en mí aún en
los momentos de dificultades. A mis hermanos y mi padrastro por su cariño y ser mi
motivación. A toda la familia Rangel Bolaños, por hacer especial cada momento y darme
su cariño, nuestra unión familiar me llena de orgullo, el contar con su amor hace felices
mis días.
Resumen y Abstract 5
Resumen
Theobroma bicolor y Theobroma grandiflorum cuyos nombres comunes son Maraco y
Copoazú respectivamente, hacen parte de la agroforestería de la región Amazónica
Colombiana, de sus semillas es posible fabricar un producto sucedáneo al chocolate
después de aplicar procesos de beneficio y transformación similares a los del cacao como;
fermentación, secado y tostado, además la fracción grasa de las semilla de T. bicolor y T.
grandiflorum poseen mayor contenido de ácidos grasos insaturados con respecto al cacao,
adicionalmente se ha reportado propiedades nutraceúticas a los extractos fenólicos. En la
fermentación se forman los compuestos precursores de sabor como aminoácidos libres y
azúcares reductores como glucosa y fructosa, además se reduce el contenido de
polifenoles y metilxantinas contribuyendo a reducir la astringencia y amargor. En el
proceso de tostado los compuestos precursores de sabor interactúan entre sí por medio
de la reacción de Maillard y se generan grupos de compuesto volátiles heterocíclicos
deseados para el aroma, de hecho, la condición de calidad del cacao está ligada al tipo y
cantidad de compuestos volátiles que proporcionan un perfil sensorial determinado, uno
de ellos son las pirazinas, un producto típico de la reacción de Maillard. Por lo tanto, para
profundizar en el conocimiento de estas dos especies se realizó un estudio que consistió
en determinar los compuestos fenólicos durante la fermentación y tostado de las dos
especies, también se evaluó la formación de compuestos precursores de sabor y
producción de pirazinas en la fermentación y en tostado infrarrojo a tres diferentes
temperaturas (110, 140 y 170°C). Las mazorcas de las dos especies se cosecharon en
zona rural del municipio de Puerto Asís (Putumayo), se retiró cerca del 30% de la pulpa y
se realizó un proceso de fermentación por cinco días, en las primeras 48h se conservó un
estado anaerobio, posteriormente se aireó la masa cada 24 horas por 3 min, cada día se
recolectó muestras y se congelaron para posteriormente realizar el proceso de secado y
los análisis de laboratorio. Las muestras para torrefacción se tomaron del último día de
6 Caracterización de algunos compuestos de interés en los procesos de fermentación y tostado de dos especies del
género Theobroma.
fermentación las cuales se secaron por radicación solar hasta alcanzar aproximadamente
el 9% de humedad. Para el tostado se tomó nibs de muestras fermentadas y secas y se
sometieron a un proceso de calentamiento usando un sistema Infrarrojo; el tostado inició
a 20°C, con una tasa de calentamiento de 20°C.min-1 hasta alcanzar las temperaturas de
110, 140 y 170°C, cada temperatura se mantuvo por 15 min, proporcionando tiempos de
tostado totales de 19,5, 21,0 y 22,5 minutos respectivamente. Se realizó una
caracterización fisicoquímica, actividad antioxidante y fitoquímica, análisis de azucares por
HPLC y composición volátil por micro extracción en fase sólida en modo de espacio de
cabeza (HS-SPME) y cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-
MS). Los análisis mostraron que el factor especie, como los tratamientos de fermentación
y tostado tienen un efecto significativo sobre el pH y acidez del cotiledón, compuestos
fenólicos, actividad antioxidante, azúcares y aminoácidos libres (p <0,05). El contenido de
polifenoles totales (TPC) y actividad antioxidante para el radical ABTS en granos sin
fermentar de Theobroma bicolor (TB) y Theobroma grandiflorum (TG) fueron de 60,50 GAE
marxianus, Torulopsis spp, entre otros microorganismos) hidrolizan los carbohidratos y
proteínas presentes en la pulpa que rodea los granos para convertirlos en etanol y dióxido
de carbono, a medida que la pulpa se degrada el pH disminuye (Castañeda, Rodríguez,
Lugo, 2016; Dircks, 2009). La segunda fase de la fermentación es la fase aerobia, es decir
en presencia de oxígeno, en esta etapa se da la formación de ácido acético y se presenta
un incremento en la temperatura (40°C) y el pH entre las 24 y 72 horas. Estas condiciones
son favorables para el crecimiento de bacterias de ácido láctico, que fermentan los
azúcares que producen ácido láctico y asimilan el ácido cítrico. La asimilación del ácido
cítrico hace que el pH de la pulpa aumente su valor de 3,5 a 4,2 permitiendo el crecimiento
de otras bacterias. Esto coincide con una rápida disminución en el dominio de la población
de levaduras, que se enfrenta a un agotamiento de las fuentes de energía (poca cantidad
de azúcar en la pulpa). Se da también una creciente concentración de etanol, producción
de calor, aumento del pH y una mayor aireación, lo que favorece el crecimiento de bacterias
del ácido acético que persisten hasta el final de la fermentación. Las bacterias del ácido
acético metabolizan el etanol y lo transforman en ácido acético a través de un proceso de
liberación de calor (exotérmico), que es el principal responsable del aumento final de la
temperatura en la masa de fermentación En esta fase se pueden alcanzar temperaturas
entre los 45 y 50°C aunque podría ser mayor en algunas otras fermentaciones. El etanol y
el ácido acético penetran el interior de la semilla originando la muerte del embrión y
desencadenan una serie de reacciones catalizadas por enzimas endógenas como la
15
proteólisis de proteínas de almacenamiento, generando péptidos y aminoácidos libres
(Beckett, 2009; Voigt et al., 1994), por otro lado los granos empiezan a hincharse debido a
la penetración del ácido acético y cambian de color en su interior debido a la degradación
de las antocianinas y oxidación de los polifenoles (flavonoles y procianidinas) por efecto
de la enzima polifenol oxidasa disminuyendo paralelamente también la astringencia
(Misnawi et al., 2003), estos cambios van desde los bordes hacia adentro y se forman
surcos o fisuras en la semilla por lo que el grano de cacao deja de ser plano, por lo tanto
el hinchamiento es una característica física de los granos de caca bien fermentados
(Ramos et al., 2020; Wacher, 2011; Misnawi, 2008; Procomer, 2019).
2.2.4 Secado
Después de la fermentación, los granos se secan hasta reducir el contenido de humedad
de 60% a 6 u 8% aproximadamente, para prevenir la infestación por moho durante
almacenamiento y también permitir que continúen las reacciones bioquímicas iniciadas en
los granos de cacao fermentados (Magi et al., 2012; Pareja, 2018). En esta etapa, continua
la degradación de los polifenoles y el ácido acético se evapora; dando lugar a nuevos
componentes de sabor y pérdida de la integridad de la membrana, induciendo la formación
de color marrón (Hansen et al., 1998; Alean, Chejne & Rojano et al., 2016; Kongor et al.,
2016). Durante el secado, los azucares reductores participan en las reacciones de
pardeamiento no enzimático conocidas como reacciones de Maillard para formar
fracciones volátiles de pirazinas (Kongor et al., 2016). Oberparleiter & Ziegleder, (1997)
han identificado compuestos de Amadori en granos de cacao secos y sin tostar, los
primeros intermediarios de la reacción de aminoácidos libres y glucosa. Aunque la
formación de estos compuestos de Amadori puede ser reversible en esta etapa, estas
reacciones iniciales son importantes porque los intermedios de Amadori se
descompondrán durante el tostado posterior en numerosos componentes volátiles.
El secado puede realizarse por medio solar o artificial. En un secado solar, la humedad de
los granos de cacao se elimina por el impacto directo de la radiación solar en el producto
con o sin circulación de aire natural, donde normalmente son necesarios de cinco a siete
días para reducir el contenido de agua. Para el secado artificial se utilizan secadores de
tipo convectivo, tardando entre dos y cuatro días para alcanzar la humedad (Beckett, 2009;
Dircks, 2009; Aldave, 2016). Sin embargo, es necesario un equilibrio entre la necesidad de
16 Caracterización de algunos compuestos de interés en los procesos de fermentación y tostado de dos especies del género
Theobroma.
conservar los granos y la necesidad de permitir que las reacciones durante el secado
continúen. La velocidad de secado es de crucial importancia para la calidad final de los
granos de cacao, no debe ser demasiado rápida, de lo contrario los granos retienen una
cantidad excesiva de ácido acético, lo que resulta perjudicial para el sabor, por otro lado,
una velocidad de secado demasiado lenta daría como resultado baja acidez y presencia
de mohos (Melgarejo et al., 2006; Guehi, Zahouli, Ban-koffi, Fae & Nemlin, 2010; Porras,
Torres, Gil & Martínez, 2018).
2.2.5 Tostado
Los granos fermentados y secos desarrollan precursores químicos que mediante la
torrefacción se transforman en el sabor y aroma típico del cacao. Este proceso continúa
promoviendo la disminución de parcial del ácido acético y la astringencia del grano, al
reducir las concentraciones de ácidos volátiles y detener la oxidación de los polifenoles,
respectivamente. Además, reduce la humedad y libera los granos de la testa (Castañeda
et al., 2016; (Vázquez et al., 2016; Álvarez, Pérez, Boulanger, Lares, Ssemat, Davrieuz ,
Cros, 2012). Sin embargo, los principales cambios derivan de las reacciones de Maillard y
Strecker. La reacción de Maillard en el grano de cacao ocurre entre los azúcares
reductores (glucosa y fructosa) y aminoácidos libres o péptidos de cadena corta (Palacios,
2016). La degradación de Strecker se produce cuando un carbonilo derivado de la reacción
de Maillard reacciona con otros aminoácidos libres del producto (Vázquez et al., 2016).
Estas reacciones generan una variedad de compuestos tales como alcoholes, ácidos
carboxílicos, aldehídos, cetonas, esteres, aminas y pirazinas, siendo estos últimos a los
que se les atribuye el aroma del chocolate (Zapata, Tamayo & Rojano, 2015; Jinap, 2004).
De acuerdo a Farah et al., (2012), las pirazinas son compuestos aromáticos de alto impacto
que contribuyen a obtener el aroma y sabores deseados en el cacao, dentro del grupo de
pirazinas, las de mayor impacto son 2-metilpirazina; 2,5- dimetilpirazina; 2,3,5-
trimethilpirazina y 2,3,5,6-tetrapirazina.
Para el tostado de la semilla de cacao existen diversas alternativas como el tostado
convencional y el pre tostado. El tostado convencional consiste en tostar las semillas aún
con cascarilla en hornos industriales a temperaturas comprendidas entre 100 y 150 °C
durante 15 o 45 minutos, respectivamente. El pre tostado, consiste en someter las semillas
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a un tratamiento térmico previo a temperaturas inferiores a 100 °C por cortos periodos de
tiempo (15 minutos) para desprender la testa de la semilla y posteriormente someterla de
manera directa a otros niveles de temperatura u otros procesos (Palacios, 2016). El tiempo
y la temperatura del proceso de tostado dependen de varios factores, como características
físicas y químicas de los granos, genotipo y el producto final deseado (Pareja, 2018;
Afoakwa, Paterson, Fowler, Ryan, 2008). De acuerdo a Ramli, Hassan, Said, Samsudin,
Aini (2006), las variedades criollas requieren temperaturas más bajas de tostión que las
variedades forasteras.
Etapas de la reacción de Maillard (S.T. Beckett, 2009)
● Inicial: Los azúcares reductores y aminoácidos forman compuestos de adición o
también denominados Amadori, los cuales a su vez forman glucosilaminas o
fructosilaminas, según el azúcar reductor inicial. Estas reacciones iniciales son
importantes para la formación de compuestos volátiles precursores del sabor.
● Intermedia: Implican las sustancias anteriores, así como la degradación de
Strecker. Cuando se calientan, la mezcla de grupos carbonilos y aminoácidos
pueden producir una variedad de aromas entre los que se incluye el del chocolate.
La última etapa de la fase intermedia incluye los aldehídos, cetonas y otros grupos
carbonillo que reaccionan para formar pirazinas, furanos y otras sustancias que se
encuentran en el chocolate (Fig. 2-2).
● Final. Las reacciones de pardeamiento provienen de la etapa final. Solamente
entonces pueden ser producidos los pigmentos insolubles pardo – oscuro llamados
melanoidinas.
18 Caracterización de algunos compuestos de interés en los procesos de fermentación y tostado de dos especies del género
Theobroma.
Figura 2-2: (a) Formación de aldehídos y aminocetonas a través de la degradación de aminoácidos por Strecker. (b) Conversión de aminoacetonas en pirazinas.
Fuente. Beckett, (2009)
2.2.6 Tostado Infrarrojo
El calentamiento es uno de los procesos térmicos más importantes en el procesamiento
de alimentos. El calor tradicionalmente se transfiere desde el exterior a la superficie del
alimento por convección y conducción y la temperatura de la superficie del alimento
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aumenta aún más hasta que el calor llega a través de la conducción al alimento provocando
cambios físicos y químicos. El aire caliente es uno de los métodos de tostado por
convección más simples, con bajos costos operativos, sin embargo, este sistema requiere
una alta temperatura energía y tiempo prolongado para tostar y resulta en efectos adversos
cambios en el producto final, principalmente debido a la Maillard reacción. En los métodos
de tostado convencionales, la superficie exterior de alimentos como las nueces está
demasiado tostada, mientras que el centro de la nuez no está perfectamente asado,
causando un tostado no uniforme, superficies quemadas y desarrollo de aromas
desagradables y sabor a quemado (Aboud et al., 2019). Para superar un tostado no
uniforme y sus inconvenientes, métodos novedosos como el calentamiento infrarrojo (IR)
tiene el potencial de mejorar el comportamiento del proceso de tostado, este método de
calentamiento está ganando importancia debido a un menor costo de energía, alta
eficiencia térmica, tamaño compacto de los equipos y alto coeficiente de difusión (Rastogi,
2012). El infrarrojo es energía en el rango del espectro electromagnético entre microondas
y luz visible, el IR tiene frecuencias desde aproximadamente 30 THz hasta
aproximadamente 430 THz y longitudes de onda de aproximadamente 0,75 a 1000 μm, y
se clasifica en tres regiones: IR de onda corta (0,75-2 μm infrarrojo cercano), IR de onda
media (infrarrojo medio de 2 a 4 μm) y IR de onda larga (infrarrojo lejano de 4 a 1000 μm).
En general, la radiación IR de onda larga es ventajosa para el procesamiento de alimentos
porque la mayoría de sus componentes absorben energía radiactiva en esa región del
espectro (Krishnamurthy et al., 2008). La radiación infrarroja (IR) es energía en forma de
ondas electromagnéticas y es más rápida en la transferencia de calor que mecanismos de
convección y conducción, el mecanismo de calentamiento infrarrojo emite energía que
interactúa con las moléculas de los alimentos y se convierte en calor que se conduce a
través de la masa de alimentos, por lo tanto, el calentamiento se produce de manera
uniforme en todo el volumen (Bhinder et al., 2019), sin embargo, una desventaja de esta
técnica es la restricción de su poder de penetración en alimentos con grande geometría,
por lo que la combinación del calentamiento infrarrojo y otros métodos de tostado como
aire caliente, microondas y otros estados de convección y conducción pueden superar esta
limitación, volviendo el proceso de tostado más eficiente y útil porque proporciona
resultados sinérgicos y se considera una solución actualmente conocida, como por ejemplo
IR-Aire caliente que ha sido utilizado ampliamente para secar y tostar productos agrícolas.
La combinación de estos métodos térmicos intensifica la transferencia de masa y calor,
20 Caracterización de algunos compuestos de interés en los procesos de fermentación y tostado de dos especies del género
Theobroma.
hay una distribución más uniforme del calor sobre el producto, reduciendo así el tiempo de
tostado, consumo de energía y aumentando la eficiencia del proceso, de hecho se ha
reportado que la combinación de IR con aire caliente para tostar nueces proporciona un
efecto sinérgico, lo que resulta en un proceso de tostado eficiente y reduce el requerimiento
de energía en un 31% en comparación con solo el aire caliente (Uysal et al., 2009) .
2.2.7 Compuestos aromáticos y polifenólicos en los granos de cacao.
La fracción volátil del aroma del cacao se origina a partir de los precursores formados
durante la fermentación y secado. El desarrollo del aroma de origen térmico en el caso del
tostado es un fenómeno complejo que depende de los parámetros del mismo y de la
composición química del grano. Alrededor de 600 compuestos volátiles han sido aislados
en el cacao tostado, entre las familias químicas más representativas se encuentran
Reisdorff, Rohsius, De Souza, Aparecida, Gasparotto, Lieberei (2004), realizaron estudios
in vitro para comparar la actividad proteolítica de las globulinas de almacenamiento en
semillas de Theobroma cacao, Theobroma grandiflorum y Theobroma bicolor y el potencial
de T. bicolor y T. grandiflorum para generar aroma similar al chocolate, encontrando que
las actividades de la endopeptidasa aspártica y la carboxipeptidasa en T. bicolor difieren
ligeramente de las del cacao. La especificidad de la carboxipeptidasa para los aminoácidos
hidrofóbicos fue bastante similar en estas dos especies. Debido a las altas cantidad de la
endopeptidasa aspártica en las semillas de cacao, las globulinas de la clase vicilina
desaparecen dentro de los primeros dos o tres días de fermentación. Dado que las
actividades enzimáticas de T. bicolor y T. grandiflorum fueron la mitad de las observadas
en T. cacao, el rendimiento máximo de precursores aromáticos en la fermentación de
semillas de T. bicolor y T grandiflorum puede ocurrir uno o dos días después. Voigt et al.,
(1994) encontraron que el tejido del cotiledón debe acidificarse a valores entre pH 5,0 y pH
5,5 durante la fermentación para garantizar la formación satisfactoria de los precursores
del aroma. En comparación con el cacao, el rango de pH para las actividades simultáneas
de las dos enzimas de T. grandiflorum se desplaza a un pH ligeramente más bajo, debido
al pH óptimo más ácido de la carboxipeptidasa. Además, la actividad endopeptidasa
aspártica de T.grandiflorum estuvo cerca de su mínimo a pH 5,0 mientras que, hacia un
valor ligeramente más ácido de pH 4,5, la actividad se acercó al 50% de su máximo. A
partir de estas observaciones in vitro, llegaron a la conclusión que, durante la fermentación
de semillas de T. grandiflorum, el pH de los cotiledones debe reducirse desde los valores
iniciales de aproximadamente pH 6,0 a un rango entre pH 5,0 y 4,5 para desencadenar
una actividad enzimática suficiente.
Los precursores de aromas desarrollados durante la fermentación interactúan en el
proceso de tostado para producir el deseado sabor a chocolate; por ello, el tostado es
considerado como la operación tecnológica más importante en el procesamiento de los
granos de cacao. Optimizar las condiciones de tostado de cacao significa aprovechar el
máximo el potencial aromático de las almendras (Amaiz, Gutiérrez, Pérez, Álvarez, 2012).
Según Afoakwa et al., (2008), los precursores de aromas como oligopéptidos y
28 Caracterización de algunos compuestos de interés en los procesos de fermentación y tostado de dos especies del género
Theobroma.
aminoácidos libres determinan el grado de los productos de la reacción de Maillard,
principalmente aldehídos y pirazinas que pueden formarse durante el tostado del cacao.
El tostado da como resultado la formación de principalmente tres metilpirazinas, la
tetrametilpirazina (TMP) alcanzan su nivel máximo a niveles de tueste medio,
trimetilpirazina (TrMP) aumenta de manera constante, mientras que la 2,5-dimetilpirazinas
(DMP) solo aumenta bajo condiciones de tostado fuerte ( Beckett, 2009).
Ramli et al., (2006) estudio la influencia de las condiciones de tostado en los granos de
cacao sobre los compuestos volátiles, sometió las muestras a un tostado con aire forzado
a 20, 30, 40 y 50 minutos a 120, 130, 140, 150, 160 y 170 °C, analizó la fracción volátil por
cromatografía de gases y espectrometría de masas. En adición, mediante un análisis
descriptivo cuantitativo, un panel de jueces entrenados evaluó la intensidad del sabor del
chocolate usando nueve escalas de calificación para los atributos de sabor; astringencia,
amargor, acidez, cacao y quemado. los principales compuestos aromatizantes
identificados fueron compuestos de alifáticos y grupos alicíclicos como alcoholes y ésteres,
y grupos heterocíclicos tales como pirazinas y aldehídos. Se identificaron un total de 19
componentes principales volátiles: nueve pirazinas (2,5-dimetil, 2,3-dimetil, 2-etil-6-metil-,
trimetil, 3-etil-2,5-dimetil, tetrametil, 2-etenil-6-metil y 3,5-dimetil-2-metilpirazina); cinco
aldehídos (5-metil-2-fenil-2-hexenal, benzaldehído, benzalacetaldehído y
benzenacetaldehído); una metilcetona (2-nonanona); dos alcoholes (linalool y 2-heptanol);
y dos ésteres (4-etilfenil acetato y 2-feniletil acetato). El perfil de sabor de los compuestos
identificados y producción óptima de los compuestos aromáticos principales (pirazinas,
aldehídos, cetonas, alcoholes) se presentó a una temperatura de 160°C por 30 minutos,
sin embargo, basados en la evaluación sensorial del chocolate, la mejor temperatura de
tostado fue de 150°C por 30 minutos, genero menor astringencia y bajo sabor amargo,
astringente y quemado, además menciona que compuestos como trimetilpirazina,
tetrametilpirazina y 5-metil-2-fenil-2-hexanal pueden ser buenos indicadores para la
evaluación del proceso de tostado.
29
3. Capítulo 3. Efecto de los procesos de fermentación y tostado sobre algunos compuestos que intervienen en la formación del sabor y aroma en las especies amazónicas Theobroma bicolor y Theobroma grandiflorum
Resumen gráfico
30 Caracterización de algunos compuestos de interés en los procesos de fermentación y tostado de dos especies del género
Theobroma.
3.1 RESUMEN
Theobroma bicolor y Theobroma grandiflorum son frutos endémicos de la Amazonía, de
sus semillas es posible obtener un producto sucedáneo al chocolate después de aplicar
procesos de beneficio y transformación similares al cacao como fermentación, secado,
tostado entre otros. Teniendo en cuenta la tendencia actual hacia el consumo de frutos
exóticos, el crecimiento del mercado del cacao y el interés de encontrar productos
diferenciadores por su sabor aroma, la presente investigación tuvo como objetivo dilucidar
los cambios en algunos compuestos de interés que contribuyen a la formación de sabor y
aroma como: contenido de polifenoles (TPC), capacidad antioxidante (AC), aminoácidos
libres, glucosa, fructosa y pirazinas al someter granos de T. bicolor (TB) y T. grandiflorum
(TG) a los procesos de fermentación natural y tostado infrarrojo a diferentes temperaturas.
El estudio se complementó con el perfil sensorial e identificación de compuestos
aromáticos mediante la técnica HS-SPME/GC-MS. Los análisis indicaron que los procesos
de fermentación y tostado tienen un efecto significativo sobre los compuestos
mencionados. Los valores de TPC y AC para el radical ABTS en granos sin fermentar de
TB y TG fueron de 60,50 mg/gms, 42,21 µmol TEAC/gms y 193,34 mg GAE/gms, 1783,48
µmol TEAC/gms respectivamente, después de la fermentación TPC y AC para el radical
ABTS se redujo en las proporciones: TB (37,10 y 34,34%) y TG (de 32,24 y 28,64%). En
el proceso de tostado TPC disminuyó por el incremento de la temperatura de tostado 110,
140 y 170°C en las siguientes proporciones: TB (25,58- 47,39- 66,83%) y TG (21,51- 38,60-
56,12%), la actividad antioxidante, aunque disminuyó con la temperatura de tostado se
encontró que las diferencias no fueron estadísticamente significativas entre algunos
tratamientos de tostado. La tetrametilpirazina (TMP) fue la única pirazina encontrada en
los granos fermentados y secos de las dos especies, los azúcares y aminoácidos libres
después del tratamiento fermentativo se incrementaron y se encontró en mayor contenido
de aminoácidos libres en TB con respecto a TG lo que posiblemente influyó en una mayor
formación de pirazinas en TB durante el tostado, la temperatura de tostado donde se
detectó específicamente mayor contenido de TMP fue 140°C donde se formó 32,14 y 19,58
31
µg/gms en TB y TG respectivamente. En los perfiles sensoriales se percibieron notas
aromáticas interesantes como frutales, nueces, madera y herbales, además de baja
presencia de los descriptores sensoriales ácido, amargo y astringente, sin embargo, el
descriptor de sabor a cacao fue bajo para T. grandiflorum y muy bajo en T. bicolor.
3.2 INTRODUCCIÓN
Theobroma bicolor y Theobroma grandiflorum cuyos nombres comunes son Maraco y
Copoazú respectivamente son plantas endémicas de la región Amazónica, se encuentran
distribuidas en algunos países de Centro y Sur América (Camacho et al., 2006; Melgarejo
et al., 2006; Marroquín et al., 2016). Las pulpas se caracterizan por un aroma y sabor frutal
agradable y representan aproximadamente el 40% del peso de los frutos, localmente se
utiliza la pulpa para la preparación de bebidas, dulces y mermeladas (Morales et al., 1994;
González et al., 2016), de sus semillas se obtiene un producto análogo al chocolate
después de aplicar procesos de beneficio y transformación similares al cacao como
fermentación, secado y tostado (Melgarejo et al., 2006; Galeano & Paladines, 2012). Cada
genotipo de cacao presenta un potencial de sabor único que puede atribuirse a su
composición intrínseca respecto a la cantidad y tipo de proteínas de almacenamiento
carbohidratos y polifenoles (Kongor et al., 2016;Afoakwa et al., 2008). El cacao está
compuesto principalmente por grasas, carbohidratos, proteínas, vitaminas, minerales y
metabolitos secundarios de interés biológico como polifenoles y metilxantinas (Samaniego
et al., 2020; Bertazzo et al., 2011), los polifenoles representan entre el 15 - 20% del licor
de cacao seco y desengrasado (Wollgast & Anklam, 2000), cerca del 60% del total de
polifenoles en los granos de cacao sin fermentar y seco son monómeros de flavanol
(epicatequina y catequina) y oligómeros de procianidina (Dreosti, 2000), la epicatequina es
el flavanol mayoritario y representa el 35% de los polifenoles totales (Lacueva et al., 2008),
respecto al contenido de metilxantinas se ha reportado que contiene aproximadamente
entre 1- 4 % de teobromina y 0,2 – 0,3 % de cafeína en granos de cacao seco y
desengrasado ( Afoakwa et al., 2008; De Sena et al., 2011; Samaniego et al., 2020).
El procesamiento puede alterar drásticamente la composición fitoquímica y las
propiedades sensoriales del cacao (Lemarcq et al., 2020). La fermentación es una etapa
crucial para el desarrollo del aroma y sabor del cacao, por lo tanto, el método y tiempo de
32 Caracterización de algunos compuestos de interés en los procesos de fermentación y tostado de dos especies del género
Theobroma.
fermentación adecuado, es clave para obtener un producto de calidad. El cacao sin
fermentar no presenta el sabor típico a chocolate, además, su sabor es amargo y
astringente (Kongor et al., 2016; Kadow, et al., 2013). La fermentación es una sucesión
microbiana que varía a medida que cambia el microambiente (temperatura, pH,
disponibilidad de oxígeno) (Dircks, 2009) y a su vez se generan compuestos precursores
de sabor como aminoácidos libres, péptidos y azúcares reductores, adicionalmente esta
etapa permite una reducción del contenido de polifenoles y metilxantinas por reacciones
de oxidación y fenómenos de difusión logrando disminuir el sabor astringente de los granos
de cacao. Los compuestos volátiles como ácidos, alcoholes y esteres incrementan durante
la fermentación, y confieren mejores características sensoriales al cacao en términos de
aroma (Afoakwa et al., 2013; Nazaruddin et al., 2006; Rodríguez et al., 2012). Se ha
comprobado que la cantidad y composición de aminoácidos libres y azúcares reductores
cambia durante la fermentación, Hashim et al., (1998) reportaron que, en la fermentación
de cacao durante seis días, el contenido de aminoácidos libres totales, aminoácidos
hidrófobos, péptidos y azúcares reductores aumentaron en las proporciones de 148, 280,
55 y 208%, respectivamente. Barrientos et al. (2019) evaluaron el efecto del proceso de
fermentación y secado solar sobre la calidad sensorial y química del cacao, encontraron
aumento en los descriptores de olor floral, lácteo, nuez, fruta, disminución del sabor acido
y astringente, reducción del contenido de antocianinas, polifenoles totales y sacarosa e
incremento de azúcares reductores después de la fermentación y secado. El tostado, es
otro paso importante para desarrollar aún más el sabor y aroma del cacao a partir de los
compuestos precursores formados durante la fermentación y secado (Afoakwa et al. 2008
; Brito et al., 2001) . Aminoácidos libres, péptidos y azúcares reductores interactúan en el
tostado a través de las reacciones de Maillard y la degradación de Strecker conduciendo
a una mayor formación de los compuestos aromáticos (Serra., 2005; J. Voigt et al., 1994).
Se han identificado cerca de 600 compuestos aromáticos en los granos y subproductos del
cacao, entre ellos están diferentes grupos de compuestos heterocíclicos de bajo peso
molecular como ácidos, alcoholes, aldehídos, cetonas, esteres, pirazinas, furanos,
furanonas, pironas, pirroles, nitrilos y sulfuros, entre otros (Frauendorfer & Schieberle,
2008; Aprotosoaie et al., 2016; Serra., 2005; Counet et al., 2002),particularmente las
pirazinas son compuestos predominantes y característicos del cacao fermentado y tostado
(Aprotosoaie et al., 2016; Ziegleder., 2009). El tiempo y temperatura de tostado a usar
33
depende de factores como el genotipo, defectos presentes en los granos, presentación de
la materia prima y producto final deseado, en general el proceso de tostado varía entre 15
- 45 minutos y temperaturas entre 130 -150°C (Krysiak et al., 2013; Ramli et al., 2006). El
tostado genera modificaciones fisicoquímicas como reducción de la humedad,
desnaturalización parcial de proteínas, formación del color marrón por reacciones de
pardeamiento no enzimático, así mismo permite disminuir el contenido de ácidos volátiles
y no volátiles, polifenoles y metilxantinas logrando disminuir aún más los sabores amargos,
ácidos y astringentes (Beckett., 2009; Afoakwa., 2016; Ramli et al., 2006). Ioannone et al.,
(2015) evaluaron tres temperaturas de tostado (125, 135 y 145°C) a diferentes tiempos (6
y 40 minutos), encontrando que las diferentes condiciones de tiempo y temperatura
influyeron significativamente en los compuestos fenólicos y actividad antioxidante, en
particular, el tostado a mayor temperatura y corto tiempo conservó mejor el contenido de
polifenoles, mientras que la actividad antioxidante se maximizó con un tostado a largo
tiempo y baja temperatura, resultados similares reportaron Suazo et al., (2014) quienes
investigaron el efecto del grado de fermentación (granos no fermentados, mal fermentados
y bien fermentados) y temperatura de tostado (110, 130 y 150°C) del cacao Trinitario sobre
el contenido polifenólico y actividad antioxidante, concluyendo que los compuestos
polifenólicos y actividad antioxidante disminuyen con el grado de fermentación mientras
que el tratamiento de tostado redujo el contenido de polifenoles excepto para el tratamiento
a 150ºC, paralelamente la actividad antioxidante incrementó con la temperatura de tostado.
El mercado actual del cacao busca productos diferenciadores (Ríos et al., 2017), además
hay una tendencia hacia el consumo de frutas exóticas con propiedades nutricionales y
funcionales (González et al., 2016). Oliveira & Genovese (2013) sugirieron que el perfil
fenólico y de ácidos grasos del licor de Copoazú puede ser superior al del cacao, por otra
parte T. bicolor se distingue por poseer un mayor contenido de proteína en la pulpa como
en el grano y tiene un mayor contenido de ácidos grasos insaturados en la fracción grasa
de la semilla con respecto al cacao (Reisdorff et al., 2004; Pérez et al., 2018; Díaz &
Hernández, 2020). Pérez et al. (2018) encontraron composiciones químicas equivalentes
y perfiles de proteínas variables entre las tres especies de Theobroma (T. cacao, T. bicolor,
T. grandiflorum) que pueden influir en un perfil aromático y sensorial único. En este
contexto, es necesario complementar información para las especies T. bicolor y T.
grandiflorum, en consecuencia, la presente investigación tiene como objetivo evaluar el
34 Caracterización de algunos compuestos de interés en los procesos de fermentación y tostado de dos especies del género
Theobroma.
comportamiento de algunos compuestos químicos como polifenoles, azúcares,
aminoácidos libres y pirazinas, así como la capacidad antioxidante en las etapas de
fermentación y tostado, adicionalmente se realizó evaluación del perfil sensorial y se
identificó los compuestos aromáticos presentes en las especies T. bicolor y T. grandiflorum.
3.3 Metodología
3.3.1 Proceso de fermentación y tostado
Las mazorcas de cacao T. grandiflorum y T. bicolor fueron obtenidas de fincas de las
veredas Buenos Aires y Puerto Vega, en el municipio de Puerto Asís (Putumayo-
Colombia). La fermentación se realizó con 9 kg de masa de granos de T. bicolor y T.
grandiflorum por separado, utilizando cajones de madera, con dimensiones 20x20x25 cm.
Previamente a la fermentación se extrajo aproximadamente el 30% de la pulpa, debido a
que el exceso de pulpa conduce a una alta producción de ácido acético durante la
fermentación afectando la calidad organoléptica del grano (Afoakwa et al. 2008). En la
fermentación se realizó el primer volteo después de 48 horas (fase anaerobia) y
posteriormente cada 24 horas (fase aerobia) hasta completar cinco días de fermentación
en condiciones agroecológicas de la zona. Se tomaron muestras diarias, las cuales fueron
congeladas y almacenadas para su posterior análisis. Las muestras se secaron con
radiación solar hasta un contenido de humedad aproximado del 9.0%. El proceso de
tostado se realizó según método reportado por Rojas et al., (2020); se retiró manualmente
la cascarilla de semillas fermentadas y secas, 14 g de nibs se tostaron usando un
analizador de humedad halógeno infrarrojo MB 45 ( Ohaus, Germany ). El tostado inició a
20°C, con una tasa de calentamiento de 20°C.min-1 hasta alcanzar las temperaturas de
110, 140 y 170°C, cada temperatura se mantuvo constante durante 15 minutos,
proporcionando tiempos de tostado totales de 19,5, 21,0 y 22,5 minutos respectivamente.
Todas las muestras fueron congeladas con nitrógeno líquido y molidas por 5 segundos
usando un molino de 80350R-Hamilton Beach. Las muestras en polvo se tamizaron usando
un sistema Tyler malla 80.
35
3.3.2 Acidez Total y pH
El análisis de acidez total y pH de la masa y granos de ambas especies se realizó mediante
un método potenciométrico, según lo reportado por Gil et al., (2018) y Nazaruddin et al.,
(2006) con algunas modificaciones: 4 g de pulpa se mezclaron con 36 mL de agua
destilada, utilizando un vortex a 3000 rpm x 60 seg, posteriormente se centrifugó a 10000
rpm por 15 min a 25°C. Sobre una alícuota de 5 ml del sobrenadante se registró el pH
usando un potenciómetro previamente calibrado. Para analizar el pH y acidez total en el
cotiledón a diez granos previamente secados hasta el 9% de humedad se retiró cáscara y
cascarilla y seguidamente se molieron en nitrógeno líquido. 3 g de muestra se mezclaron
con 27 ml de agua destilada a 90°C en un shaker con agitación media durante 1 hora,
posteriormente se filtró pasando la mezcla por un papel filtro No. 4. A una alícuota de 5 ml
del sobrenadante se midió directamente el pH, otra alícuota del mismo volumen se tituló
con NaOH (0,01 N) hasta alcanzar un pH de 8,1 (Nazaruddin et al., 2006). La acidez total
fue reportada como miliequivalente de NaOH por gramo de cotiledón seco. Todos los
análisis se realizaron por triplicado.
3.3.3 Polifenoles totales (TPC) y capacidad antioxidante (AC)
1 gramo de muestra seca y molida se desengrasó con 10 mL de hexano, seguido por
agitación 60 seg en vortex a 3000 rpm y baño de ultrasonido de 40 Hertz por 15 minutos a
25°C, posteriormente, se realizó centrifugación a 10000 rpm por 15 minutos a 25°C; el
sobrenadante se descartó, el procedimiento se repitió tres veces sobre el sólido, finalmente
el material se dejó secar a temperatura ambiente por 20 horas (Carrillo et al., 2014; Gil et
al., 2018; Ioannone et al., 2015). Los polifenoles totales (TPC) se determinaron por el
método colorimétrico Folin-Ciocalteu (Singleton & Rossi.,1965), para la obtención del
extracto fenólico y procedimiento de cuantificación de polifenoles totales se procedió según
método lo reportado por Ioannone et al., (2015) con modificaciones, a 0,5 g de muestra
baja en grasa se adicionó 7 mL de una solución acetona/agua/ ácido acético (70:29.5:0.5)
y se procedió en el siguiente orden: agitación en vortex a 3000 rpm por 60 seg, ultrasonido
(40 Hz) por 20 min, agitación media por 2 h a 30°C, finalmente el extracto fue centrifugado
a 14000 rpm por 15 min a temperatura ambiente. En un tubo de ensayo se adicionó 10 μL
del extracto fenólico, 10 μL del solvente inicial, 240 μL de agua destilada y 125 μL del
36 Caracterización de algunos compuestos de interés en los procesos de fermentación y tostado de dos especies del género
Theobroma.
reactivo Folin- Ciocalteu diluido en agua destilada en proporción de 1:1, se agitó por 60
seg y se dejó en reposo 6 min, posteriormente se adicionó 625 μL de Na2CO3 en solución
acuosa al 20% p/v; se agitó en vortex a 3000 rpm durante un minuto y se conservó en la
oscuridad durante 2 horas, posteriormente la absorbancia fue medida a 760 nm. Los
resultados se expresaron como mg equivalente de ácido gálico GAE por gramo de muestra
seca y desengrasada (mg GAE.gms). Para determinar la capacidad de inhibir el radical
libre ABTS+ (2,2′-azinobis (3-etilbenzotiazoline-6- ácido sulfónico) se realizó el
procedimiento reportado por Batista et al., (2016) con modificaciones, el radical se formó
como sigue; 38,8 mg de ABTS+ y 6,6 mg de persulfato de potasio fueron diluidos en 10 ml
de agua destilada, se homogenizó y se dejó reaccionar por 16 h en oscuridad. La solución
de trabajo del radical ABTS se diluyó con etanol hasta alcanzar una absorbancia de 0,70
± 0,02 a 734 nm. A 10 μL de extracto se adicionó 990 μL de la solución trabajo ABTS, se
agitó por 30 seg y se dejó reaccionar por siete min en oscuridad, finalmente se registró la
absorbancia a 734 nm. Para la cuantificación se realizó una curva de calibración de Trolox
con concentraciones entre 200-1800 μmol/L. Los resultados se expresaron como
capacidad antioxidante representada en μmol de Trolox equivalente (TEAC) por gramo de
muestra seca y desengrasada. Todas las mediciones se realizaron por triplicado.
3.3.4 Cuantificación de Azúcares: glucosa, fructosa y sacarosa
A un 1 g de muestra seca y desengrasada se adicionó 5 mL agua MilliQ a 70°C, se procedió
con agitación a 3000 rpm por 2 min, ultrasonido de 40 Hz por 20 min y centrifugación a
10000 rpm por 15 min y 25°C, posteriormente se retiró el sobrenadante, este procedimiento
se repitió tres veces sobre el sólido, finalmente todo sobrenadante resultante se aforó a 20
ml en un balón volumétrico. La muestra fue filtrada en membrana de nylon de 0,22 µm
previamente a la inyección. La cuantificación se realizó utilizando un sistema de
cromatografía líquida de alta eficiencia HPLC en un equipo Shimadzu Prominense con
detector de índice de refracción, software LabSolutions Lite versión 1.22 SP1, columna
Aminex HPX-87H 300 x 7.8 mm, fase móvil agua acidificada con ácido sulfúrico 5 mM, flujo
de 0.54 mLmin-1 a 52°C y un volumen de inyección de 10 µL para la determinación de
glucosa y fructosa y la columna HPX-87C, 300 x 7.8 mm, fase móvil agua Milli-Q, flujo 0,6
37
mLmin-1 a 87°C para la determinación de sacarosa. Las curvas de calibración se realizaron
en concentraciones entre 5 y 50 mg/L.
3.3.5 Aminoácidos libres y proteína total
Para la preparación del extracto, 1200 mg de muestra seca y desengrasando fueron
suspendidos en 7 mL de agua destilada, seguido por 2 min de agitación a 3000 rpm, baño
ultrasónico de 40 Hz por 20 min y centrifugación a 10000 rpm por 15 min a 25°C. Este
procedimiento se repitió tres veces sobre el sólido, los sobrenadantes se filtraron y se
aforaron en un balón volumétrico de 25 mL. El método se realizó de acuerdo con lo
reportado por Doi et al., (1981) con algunas modificaciones: 0,6 g de Ninhidrina fueron
diluidos en 60 mL de etanol al 99.5% y 7,5 mL de ácido acético, posteriormente mezclados
con una solución concentrada de cloruro de cadmio hemipentahidratado. Para la
cuantificación se realizó una curva patrón de L-Leucina concentraciones entre 20 y 400
mg/L. 50 μL del extracto fueron mezclados con 450 μL de agua y 1000 μL de solución de
Cd-Ninhidrina en tubos Eppendorf, se homogenizaron y se incubaron en un baño térmico
a 84°C durante 5 min, se enfriaron en un baño de hielo y finalmente se registró la
absorbancia a 507 nm. La determinación de proteína total se realizó según el método
volumétrico de Kjeldahl número 2.062 de AOAC (AOAC 1984).
3.3.6 Pirazinas y perfil de compuestos aromáticos
Los compuestos aromáticos incluidas las pirazinas se detectaron utilizando un equipo de
cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas GCMS-QP2010S
(Shimadzu, Japón). Los compuestos volátiles se extrajeron mediante la técnica de micro
y amaderado. Los panelistas también evaluaron los siguientes descriptores clasificados
como desagradable para el cacao: rancio, verde (crudo), sobre fermentado, moho y
terroso. Los valores medios de las puntuaciones dadas por los panelistas se presentan en
gráficos radiales.
3.3.8 Análisis estadístico
Para la etapa de fermentación se utilizó un análisis estadístico de medidas repetidas en el
tiempo, donde se analizó el tiempo y la especie como factores, siendo cada fermentador
una unidad experimental. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) y comparación entre
39
medias mediante la prueba de Tukey (p <0.05). Para evaluar el efecto del tostado se realizó
un diseño de parcelas divididas con dos factores: especie y temperatura, usando un
análisis de varianza y la prueba de Tukey (p <0.05) para identificar diferencias
significativas. Se realizó tres repeticiones para cada tratamiento de tostado. Para analizar
las correlaciones entre los compuestos químicos evaluados se aplicaron dos técnicas
exploratorias multivariadas, una matriz de correlación de Pearson y un análisis de
componentes principales PCA con una matriz de 40x7. Para todos los análisis se utilizó el
software estadístico R (Versión 0.98.1103).
3.4 Análisis de resultados y discusión
3.4.1 pH, temperatura y acidez total durante la fermentación
La Figura 3.1 presenta la variación de pH y temperatura durante el tiempo de fermentación
de granos de T.bicolor (TB) y T.grandiflorum (TG) por separado. fue evidente un efecto
significativo del tiempo de fermentación (p <0,05) sobre el pH y la temperatura. El pH inicial
de la masa fue de 6,95 y 3,36 para T. bicolor y T. grandiflorum respectivamente. La
dinámica del pH como de la temperatura presentó variación en el inicio de la fermentación
entre TB y TG, esto se debe principalmente a las características intrínsecas de cada
especie, mientras el pH de la pulpa de TB es cercano a 7,0, la pulpa de TG es ácida con
un pH aproximado a 3,5, como se sabe la pulpa es el sustrato disponible para el proceso
fermentativo, en consecuencia, determina el desarrollo microbiano y su metabolismo (
Afoakwa et al. 2012). Para TB el menor valor de pH se registró a las 48 horas de
fermentación, luego se incrementó significativamente hasta alcanzar un pH de 5,75 a las
120 h de fermentación. Entre las 72 y 96 horas no se presentó diferencias estadísticamente
significativas en el valor pH y la temperatura de la masa se incrementó desde el inicio del
proceso fermentativo alcanzando un valor máximo de 39,50°C a las 72 h. El pH de TG
alcanzó el valor más bajo (3,41) en las primeras 24 h, luego aumentó hasta 5,35, la
temperatura más alta (42,89°C) se registró a las 72 h de fermentación y fue disminuyendo
hasta llegar a 30,54°C en el último día de fermentación. Los cambios de temperatura y pH
en la fermentación de cacao se deben principalmente a la actividad microbiana (Leghems
et al.,2015), esta inicia con una fase anaerobia catalizada por levaduras endógenas que
40 Caracterización de algunos compuestos de interés en los procesos de fermentación y tostado de dos especies del género
Theobroma.
fermentan los azúcares presentes en la pulpa del grano generando, etanol e incremento
de la temperatura, hidrólisis de pectinas, disminución del ácido cítrico de la pulpa, y
lixiviados (Misnawi, 2008; Almeida et al., 2020), estas condiciones favorecen el crecimiento
de las bacterias acido lácticas que metabolizan la formación de ácido láctico, etanol,
manitol, ácido acético, entre otros compuestos, finalmente bacterias ácido acéticas
transforman estos metabolitos intermedios en ácido acético generando simultáneamente
agua, CO2 e incremento de la temperatura en condiciones aerobias (Schwan &
Wheals,2004).
Fig 3.1. Seguimiento de temperatura y pH durante la fermentación de T. bicolor y T. grandiflorum
El efecto del tiempo de fermentación sobre el pH y la acidez de los cotiledones se presenta
en la Figura 3.2. El menor valor de pH para TB fue de 4,51 alcanzado a las 72 horas de
fermentación y para TG fue de 4,46 a las 48 horas. Valores similares de pH fueron
reportados por Melgarejo., et al (2006) en la fermentación de T. bicolor y T. grandiflorum.
El incremento de la acidez y disminución del pH en el cotiledón se debe a la difusión del
6,95
4,72
3,88
4,60
5,41
5,75
3,563,41
3,65 3,72
4,22
5,35
26,73
33,56
34,6139,50
35,58
32,14
26,82
32,62 34,37
42,89
36,70
30,54
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
40,0
45,0
50,0
0 24 48 72 96 120p
H
Tem
per
atu
ra (
°C)
Horas de fermentaciónpH TB pH TG T°C TB T°C TG
41
ácido acético sobre los tejidos celulares de la semilla (Afoakwa et al. 2013). Voigt et al.,
(1994) menciona que la acidificación en los granos durante la fermentación es clave para
garantizar la formación del sabor en el cacao, por lo tanto, el control del pH es determinante
para garantizar la actividad enzimática de las proteasas presentes en el cacao, se ha
reportado 3,8 el pH óptimo para la endopeptidasa aspártica y 5,8 para la serina
exopeptidasa. La acidificación más el incremento de la temperatura provocan la muerte
celular de la semilla y catalizan reacciones enzimáticas deseadas sobre los azúcares y
proteínas de almacenamiento (Misnawi, 2008; Schwan & Wheals, 2003).
Fig 3.2. pH y acidez total en los cotiledones de T. bicolor and T. grandiflorum durante la fermentación
3.4.2 Evaluación de polifenoles y actividad antioxidante durante la
fermentación y tostado a diferentes temperaturas.
Cambios en el contenido de polifenoles totales (TPC) y capacidad antioxidante (AC)
durante el tiempo de fermentación para granos de Theobroma bicolor (TB) y Theobroma
grandiflorum (TG) se presentan en la figura 3.3. Acorde al análisis estadístico, en TPC y
5,49
5,02
4,64 4,51 4,55
4,99
5,205,11
4,46
4,784,91
5,13
1,34
1,53
1,82
1,91
1,87
1,63
1,49
1,64
1,87
1,82
1,76
1,58
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
1,8
1,9
2,0
0 24 48 72 96 120
pH
Aci
dez
Tit
ula
ble
-m
eq N
aOH
/g
Horas de fermentaciónpH TB pH TG TA-TB TA-TG
42 Caracterización de algunos compuestos de interés en los procesos de fermentación y tostado de dos especies del género
Theobroma.
AC se presentó diferencias estadísticamente significativas entre especies y tiempos de
fermentación (p < 0.05). Se destaca que TPC como AC fue considerablemente mayor para
TG en comparación con TB. Para los granos de T. bicolor, el valor de TPC no presentó
diferencias estadísticamente significativas entre las 96 h y 120 h, para T. grandiflorum se
presentaron diferencias estadísticamente significativas en todos los tiempos de
fermentación. Para las dos especies (T. bicolor y T. grandiflorum) , los valores de TPC y
AC disminuyeron de forma lineal (R2 > 0,97) con el tiempo de fermentación, la pérdida de
TPC como de AC fue más rápida para T. grandiflorum, esto se debe posiblemente a una
mayor disponibilidad de polifenoles en los tejidos celulares de la semilla de TG, como
también a una mayor permeabilidad de la semilla de TG. Los valores iniciales registrados
de TPC y AC son los siguientes: para T. bicolor 60,50 mg GAE/gms, 42,21 µmol TEAC
/gms y para T. grandiflorum al inicio 193,34 mg GAE/gms, 1783,48 µmol TEAC/ gms. El
tiempo de fermentación donde se evidenció mayor pérdida de TPC fueron 72 - 96 h (T.
bicolor) y 96 - 120 h (T. grandiflorum), y el porcentaje de pérdida de TPC después de los
cinco días de fermentación fueron 37,10% (T. bicolor) y 32,24% (T. grandiflorum).
43
Fig 3.3. Contenido de polifenoles totales y actividad antioxidante durante el tiempo de fermentación de granos de T. bicolor (A) y T. grandiflorum (B). GAE: Ácido gálico equivalente,TEAC: Capacidad antioxidante equivalente Trolox, ABTS: radical 2,2′-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid).
25
30
35
40
45
50
30
35
40
45
50
55
60
65
70
0 24 48 72 96 120
Act
ivid
ad A
nti
oxi
dan
te µ
mo
l TEA
C/g
ms
Co
nte
nid
o d
e p
olif
eno
les
tota
les
mg
GA
E/g
ms
Horas de fermentación
T. Bicolor
TPC AC_ABTS
A
1000
1200
1400
1600
1800
2000
120
130
140
150
160
170
180
190
200
0 24 48 72 96 120
Act
ivid
ad A
nti
oxi
dan
te µ
mo
l TEA
C/g
ms
Co
nte
nid
o d
e p
olif
eno
les
tota
les
mg
GA
E/g
ms
Fermentation hours
T. grandif lorum
TPC AC_ABTS
B
Fig STYLEREF 1 \s 3. SEQ Figura \* ARABIC \s 1 3. Contenido de polifenoles totales y actividad antioxidante durante el tiempo de fermentación de T. bicolor )(A) y T. grandiflorum(B). GAE: Ácido gálico equivalente,TEAC: Capacidad antioxidante equivalente Trolox, ABTS: radical 2,2′-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid).
44 Caracterización de algunos compuestos de interés en los procesos de fermentación y tostado de dos especies del género
Theobroma.
La pérdida de los compuestos fenólicos y capacidad antioxidante en el tiempo de
fermentación ha sido reportada en el cacao fermentado durante cinco y seis días
(Nazaruddin et al., 2006; Afoakwa et al., 2012; Barrientos et al., 2019) y en Copoazú
fermentado por diez días (Cuellar et al., 2017). Porras et al., (2019) encontraron una
disminución del 28.44% en el contenido total de polifenoles después de 132 h de
fermentación en una mezcla de cinco clones de cacao, con una tendencia similar Cuellar
et al., (2017) reportaron una reducción del 61,26% de TPC después de diez días de
fermentación, Nazaruddin et al., (2006) encontraron una reducción del contenido (-) -
epicatequina y (+) -catequina después de someter granos de cacao a diferentes
tratamientos de fermentación, para lo cual el porcentaje perdido varió de 6 a 17% y de 0,95
a 1,62%, respectivamente.
La reducción del contenido total de polifenoles son un efecto deseado en la fermentación
ya que estos compuestos contribuyen a aumentar los sabores amargos y astringentes (
Kongor et al., 2016; Misnawi., 2008; Júnior et al., 2020), este fenómeno se debe
principalmente al aumento de la permeabilidad de la semilla y drenaje de líquidos
exudados, por lo tanto, es consecuente la pérdida de polifenoles y metilxantinas presentes
en los tejidos celulares del cotiledón (De Brito et al., 2001; Do Carmo Brito et al., 2017;
Brunetto et al., 2007), así mismo es importante mencionar una posible pérdida de
polifenoles por efecto de las reacciones de oxidación catalizadas por la enzima polifenol
oxidasa (no determinada en este estudio) generando taninos condensados de alto peso
molecular (Afoakwa et al., 2012; Wollgast & Anklam, 2000) que a su vez pueden formar
complejos con proteínas y minerales (Misnawi, 2008;Reed, 1995). Diferentes
investigaciones han informado la actividad biológica de los polifenoles presente en el
cacao, el efecto protector de estos compuestos sobre las enfermedades cardiacas y sus
propiedades anticancerígenas se deben en parte a su capacidad de captación de radicales
libres y actividad antioxidante (Schinella et al.,2010; Pérez et al.,2012), esto explica el alto
índice de correlación de Pearson de 0.92 de CPT con AC encontrado en este estudio,
después de 5 días de fermentación; para TB el CPT y AC disminuyeron un 37,10 y 34,4 %
respectivamente, al igual que para TG donde la disminución de CPT fue de 32,24% y
28,64% de AC, estos resultados son similares a los presentados por Do Carmo Brito et al.,
(2017) quienes reportaron una reducción del 31% del contenido de fenoles totales después
45
de 7 días de fermentación del cacao, paralelamente la capacidad de barrido de los
extractos fenólicos para el radical ABTS también disminuyó un 39%.
Posterior al proceso de tostado, los resultados de los compuestos fenólicos y actividad
antioxidante de nibs de T. bicolor y T. grandiflorum sometidos a las temperaturas de
tostado propuestas (110°C, 140°C, 170°C), revelan variabilidad del efecto de tostado entre
las especies y temperaturas, donde el contenido fenólico como la actividad antioxidante
disminuyó con el incremento de la temperatura de tostado (p <0,05). Sin embargo, la
capacidad antioxidante para el radical ABTS en los nibs de TG sometidos a las
temperaturas de tostado de 110 y 140°C y de los nibs de TB en las temperaturas de 140 y
170°C, no mostraron diferencias significativas (p > 0,05). De acuerdo con la Figura 3.3, el
contenido de polifenoles disminuyó con el incremento de la temperatura de tostado (p
<0.05) mostrando la siguiente reducción porcentual para las temperaturas 110°C, 140°C,
170°C de 25,58%, 47,39%, 66,83% para TB y 21,51%, 38,60%, 56,12% para TG,
respectivamente. Una tendencia similar reportaron Stanley et al., (2018) en granos de
cacao sometidos a un proceso de tostado por 40 minutos a 100, 130, 150, 170 y 190°C,
los polifenoles totales disminuyeron en 9,7, 18,5, 12,5, 29,3 y 39.9% respectivamente, de
igual manera Mazor et al., (2011) encontraron una disminución del 14% de TPC en granos
de cacao sometidos a un proceso de tostado entre 140 y 150°C por 20 min, por otra parte
Cuellar et al., (2017) obtuvieron una pérdida de polifenoles después de someter granos de
Copuazú a los procesos de fermentación, secado y tostado del 77,30%. El contenido de
polifenoles disminuye a altas temperaturas y tiempo de tostado debido a que son
estructuras moleculares termolábiles (Mazor et al., 2011), así como por modificaciones
estructurales como la epimerización. (Hurst et al., 2011) informaron reducción del
contenido de (-) – epicatequina y (+) - catequina por efecto del tostado y tratamiento con
álcali, Kothe et al., (2013) reportaron la pérdida de epicatequina y procianidinas en el cacao
a temperaturas de tostado entre de 100 y 140°C, los autores informaron que el grado de
epimerización y pérdida de flavonoles en el tostado de cacao depende principalmente de
la temperatura, sin embargo, la procedencia geográfica de la materia prima también influyó
significativamente.
46 Caracterización de algunos compuestos de interés en los procesos de fermentación y tostado de dos especies del género
Theobroma.
Fig 3.4. Contenido de polifenoles totales y actividad antioxidante en nibs de T. bicolor (A) y T. grandiflorum (B) sometidos a tres diferentes
temperaturas de tostado. Los resultados se expresan en base seca y desengrasada. TPC: Contenido de polifenoles totales expresados en mg
(frutal), 2-metilbutil isobutirato, butirato de fenetilo y propanoato de pentilo (manzana). Un
éster comunmente reportado en el cacao es el 2-fenil-etil-acetato, segun Schnermann y
Schieberle, (1997) y Rodriguez et al., (2012) el 2-fenil-etil-acetato contribuye de manera
significativa al aroma del cacao y se le atribuyen aromas frutales y florales. En este
experimento se detectó 2-fenil-etil-acetato en las dos especies, en muestras tostadas y sin
tostar, sin embargo, TG presentó mayor abundancia relativa con el tratamiento de tostado.
Marseglia et al., (2020) reportó que cacao de la variedad Criollo considerado fino de aroma
tiene un mayor contenido de 2-Fenil-etil-acetato con respecto a las variedades Forastero y
Trinitario. Los esteres proporcionan el carácter afrutado a muchas bebidas fermentadas
(Meersman et al., 2016), en el cacao confieren un atributo positivo con notas frutales y
florales (Ascrizzi et al., 2017; Toker et al, 2020).
Compuestos terpénicos con notas cítricas y florales también fueron identificados en las dos
especies, sin embargo, el área relativa con el tratamiento de tostado no se incrementó
considerablemente. Otros compuestos como pirroles, furanonas, furanos y pironas
58 Caracterización de algunos compuestos de interés en los procesos de fermentación y tostado de dos especies del género
Theobroma.
también fueron detectados, la mayoría de estos compuestos se incrementaron o se
detectaron únicamente por efecto del tratamiento de tostado. En el grupo de pirroles
detectados se encontró 1-metil-2-acetilpirrol en las dos especies TB y TG y 2,4-pirrolidiona
únicamente en TG, según lo informado por Aprotosoaie et al., (2016) 1-metil-2-acetil-pirrol
contiene un aroma deseado a chocolate dulce y se forma a través de la reacción de Maillard
y la degradación de Strecker a partir del aminoácido prolina durante el secado y tostado.
Compuestos como furanonas, furanos y pironas se generan durante el secado y tostado
(Ziegleder, 2009), según lo mencionado por Ducki et al., (2008) estos compuestos son
productos de las reacciones de fragmentación y caramelización de azúcares, Hinneh et
al., (2019) reportaron un incremento de furanonas y furanos en cacao por efecto del
incremento de la temperatura de tostado, algunos de ellos tienen un aroma deseado para
el cacao como 2,5-dimetil-4-hidroxi-3(2H)-furanona (fresa, caramelo), furaneol (frutal,
nueces) y gamma-butyrolactona (caramelo y dulce).
59
Fig 3.6. Distribución media de área relativa de los principales grupos de compuestos aromáticos en Maraco y Copuazú sin tostar y tostados. TB: T. bicolor, TG: T. grandiflorum, UR: sin tostar, R140°C: Tostado 140 grados centígrados.
Tabla 3.3. Identificación y área relativa promedio de compuestos volátiles identificados por HS-SPME/GC-MS en licor de
Maraco y Copoazú tostado y sin tostar
Grupo Compuestos aromáticos Descriptores de aroma b TB-UR TB-R140°C TG-UR TG-R140°C
Otros Dimethyldisulfide Sulfurous, gasoline - 551125.33 - -
b Descripción de aromas de los compuestos de las referencias: (Aprotosoaie et al., 2016); (Rodríguez et al., 2011); (Hinneh et al., 2019); (Serra., 2005). Todas las mediciones se realizaron por triplicado. TB: T. bicolor, TG: T. grandiflorum, UR: Unroasted, R140°C: Roasting 140 degrees Celsius
3.4.6 Análisis de componentes principales
62 Caracterización de algunos compuestos de interés en los procesos de fermentación y tostado de dos especies del género
Theobroma.
Para complementar el estudio se realizó una matriz de correlaciones Pearson y un análisis
de componentes principales PCA para analizar conjuntamente las diferentes variables
evaluadas en T. bicolor (TB) y T. grandiflorum (TG) antes y después de la fermentación y
en los nibs de cada especie sometidos a tres temperaturas de tostado. Las variables
incluidas en para el PCA fueron: contenido de polifenoles totales (TPC), actividad
antioxidante ABTS (AC), azúcares, aminoácidos libres y contenido de pirazinas totales. No
se incluyó las metilxantinas teniendo en cuenta que en algunos tratamientos no fueran
detectados y por lo tanto los datos no presentaron normalidad. En la Figura 3.7 se
evidencia que el componente 1 explicó el 44,4% y el componente 2 el 37,6% de la
variabilidad total, sumando así el 82% de la varianza explicada. La Figura 3.8, PCA Biplot
presenta grupos variables e individuos relacionadas con los estados de procesamiento,
muestras no fermentadas, fermentadas y tostadas a diferentes temperaturas. El
componente 1 explica las variables aminoácidos libres, glucosa, fructosa y sacarosa y el
componente 2 los polifenoles totales, actividad antioxidante y Pirazinas.
Fig 3.7. Gráfico de sedimentación. Varianza explicada por componentes.
63
Fig 3.8. Análisis de los components principales de las variables: polifenoles totales, actividad antioxidante, azúcares, aminoácidos libres y pirazinas en muestras de T. bicolor y T. grandiflorum. La gráfica PCA Biplots muestra la influencia de las especies y la temperatura de tostado.
El análisis PCA también representa los individuos que están asociados a los componentes,
por ejemplo, las muestras de T. grandiflorum sin fermentar, sin tostar y tostadas a 110 y
140°C, así como las muestras de T. bicolor sin fermentar y sin tostar se representaron en
mayor proporción en el componente 1 ya que en estas muestras no se detectó pirazinas o
estaban presentes en bajas cantidades, además estas muestras tenían en común un alto
contenido de polifenoles y actividad antioxidante, como era de esperarse en este
componente se ubicaron la mayor parte de las muestras de T. grandiflorum, ya que como
se evidenció en los análisis previos, la especie TG presentó mayor abundancia de
polifenoles totales y actividad antioxidante en todos los tratamientos propuestos,
especialmente en los granos de TG sin fermentar, por lo tanto, estas muestras están
representadas en el segundo cuadrante del gráfico Biplot proyectando gráficamente un
mayor contenido de estos compuestos, por otro lado, las muestras de TB tostadas a 110,
140 y 170°C y de TG tostadas a 170°C se visualizan en el componente 2 eje negativo
donde se expresan mayoritariamente las pirazinas, estas representaciones en el plano son
posibles evidenciarlas debido a que este grupo de muestras presentaron mayor contenido
de pirazinas, menor contenido de polifenoles y actividad antioxidante.
64 Caracterización de algunos compuestos de interés en los procesos de fermentación y tostado de dos especies del género
Theobroma.
El PCA (Figura 3.8) y la matriz de correlaciones de Pearson (Figura 3.9) mostraron una
relación negativa entre el contenido de pirazinas y el contenido de azúcares reductores y
aminoácidos libres, por lo tanto, su relación es inversa, mientras se incrementa el contenido
de pirazinas disminuye el contenido de glucosa, fructosa y aminoácidos libres, como ya se
discutió antes esto se debe básicamente al consumo de los precursores de sabor formados
en la fermentación (aminoácidos libres, péptidos y azucares reductores) durante el proceso
de tostado por medio de una serie de reacciones químicas complejas, entre ellas la
reacción de Maillard (Voigt et al., 1994). Un producto típico formado en esta reacción son
las pirazinas, unos de los tantos compuestos volátiles que contribuyen positivamente a
mejorar el perfil de aroma del cacao (Ramli et al., 2006; Frauendorfer & Schieberle, 2008),
por otro lado, se encontró una relación positiva entre polifenoles totales y la actividad
antioxidante para el radical ABTS, lo cual es congruente con lo reportado en diferentes
investigaciones donde han encontrado propiedades antioxidantes (antirradicales y
quelantes) en los compuesto fenólicos del cacao (Nazaruddin et al., 2006; Hatano et al.,
2002; Othman., et al , 2007). La matriz de correlaciones de Pearson mostró una relación
negativa entre polifenoles y pirazinas lo cual coincide con lo reportado por Misnawi et al.,
(2004) al estudiar el efecto de la concentración de polifenoles en el licor de cacao sobre la
formación de pirazinas en el proceso de tostado, ellos encontraron que el incremento de
polifenoles disminuye la formación de pirazinas durante el tostado, los investigadores
explican que este fenómeno se debe a que los polifenoles presentan una fuerte tendencia
a reaccionar con otros compuestos, formando complejos con proteínas y polisacáridos, en
consecuencia, una alta concentración de polifenoles disminuye la disponibilidad de los
compuestos precursores necesarios para la formación de pirazinas, por otro lado,
mencionan además que los compuestos fenólicos también pueden unir parte de las
pirazinas durante el tostado, reduciendo la concentración de pirazinas.
65
Figura 3.9. Matriz de correlación (Pearson) de las variables evaluadas en muestras de T. bicolor y T. grandiflorum.
3.5 Conclusiones
Las especies T. bicolor y T. grandiflorum difieren significativamente en los compuestos que
interviene en la formación del sabor y aroma. El contenido fenólico, capacidad antioxidante
y metilxantinas fue mayor para T. grandiflorum y el contenido de aminoácidos libres y
azúcares reductores mayor en T. bicolor, estos compuestos a su vez sufren cambios
importantes por efecto de los tratamiento de fermentación y tostado, estas variaciones
permitieron obtener perfiles sensoriales y compuestos aromáticos particulares para cada
especie, por ejemplo en T. bicolor resaltó el sabor dulce y aroma a nueces, malta, fruta
fresca y en T. grandiflorum el sabor medianamente amargo y astringente (debido a su alto
contenido de polifenoles) y notas aromáticas a cacao, café tostado, y herbales. Se encontró
Tetrametilpirazina en los granos fermentados secos y nibs tostado de las especies T.
bicolor y T. grandiflorum, y fue la única pirazina que se encontró en las muestras
66 Caracterización de algunos compuestos de interés en los procesos de fermentación y tostado de dos especies del género
Theobroma.
fermentadas y secas de las dos especies, sin embargo, no fue la pirazina mayoritaria en
las muestras tostadas como ha sido reportado ampliamente para el cacao.
4. Capítulo 4. Conclusiones y recomendaciones
4.1 Conclusiones
● Con los resultados de la presente investigación se comprobó que los procesos de
fermentación y tostado influyen en la modificación de compuestos de interés como
polifenoles, actividad antioxidante, aminoácidos libres y azúcares reductores en los
granos de T. bicolor y T. grandiflorum. La fermentación disminuyó conjuntamente
el contenido fenólico y actividad antioxidante, debido probablemente a reacciones
de oxidación y fenómenos de difusión y lixiviación, lo que permitió reducir la
astringencia y acidez de los granos. La fermentación generó un efecto positivo en
la formación de compuestos precursores de sabor como aminoácidos libres y
azúcares reductores en las dos especies. Las semillas de TB sin fermentar
presentaron un mayor contenido de proteína con respecto a TG, característica que
posiblemente influyó en la formación de una mayor cantidad de aminoácidos libres
en la fermentación debido a la actividad de enzimas proteolíticas endógenas de los
granos.
● El proceso de tostado redujo el contenido de polifenoles totales, aminoácidos libres
y azúcares reductores con el incremento de la temperatura. La actividad
antioxidante, aunque disminuyó con la temperatura no se encontró diferencias
estadísticamente significativas entre algunos tratamientos de tostado, lo que
sugiere probablemente la formación de compuestos con actividad antioxidante. El
proceso de tostado también incidió en la composición y formación de compuestos
aromáticos deseados como pirazinas alcoholes, aldehídos y cetonas. Las pirazinas
68 Caracterización de algunos compuestos de interés en los procesos de fermentación y tostado de dos especies
del género Theobroma.
en nibs tostados de TB y TG se lograron cuantificar, el contenido total de pirazinas
incrementó con el aumento de la temperatura, particularmente en el cacao una
pirazina comúnmente reportada como un compuesto de alto impacto en el aroma
del cacao es la Tetrametilpirazina (TMP) la cuál fue detectada en los granos
tostados y sin tostar de TB y TG, la temperatura de tostado donde se alcanzó mayor
contenido de TMP fue a 140°C en las dos especies.
● En la evaluación sensorial se demostró que el descriptor de sabor a cacao es bajo
para TG y casi imperceptibles para TB. En TB resalta el sabor dulce y aroma a
nueces, malta, fruta fresca y en TG el sabor medianamente amargo (probablemente
a su alto contenido de polifenoles) y notas aromáticas a cacao, café tostado y
herbales.
● Los compuestos aromáticos como aldehídos, alcoholes, cetonas y pirazinas se
incrementaron por efecto del tostado debido a la generación de las reacciones de
Maillard resultado de la interacción de aminoácidos y azúcares reductores. Las dos
especies (TB y TG) fermentadas y tostadas contienen compuestos aromáticos de
interés que proporcionan aromas de interés como; frutales, herbales, madera y
nueces reportadas en estudios previos en el cacao fino de aroma.
4.2 Recomendaciones
● Teniendo en cuenta la escaza implementación del proceso de tostado de cacao
utilizando tecnología infrarroja se recomienda plantear un diseño experimental para
evaluar el tostado convectivo y tostado infrarrojo y su incidencia sobre los
compuestos fitoquímicos y volátiles de las especies de Theobroma.
● Realizar un estudio robusto de análisis sensorial y de compuestos volátiles
mediante la tecnología HS-SPME/GC-MS en los granos tostado de T. bicolor y T.
Capítulo 4. Conclusiones 69
grandiflorum para obtener correlaciones entre los compuestos aromáticos que dan
aromas específicos en los perfiles sensoriales de cada especie.
● Desarrollar y caracterizar productos elaborados a partir de las especies T. bicolor y
T. grandiflorum con el objetivo de potencializar su uso a nivel alimentario.
A. Anexo 1 : Análisis estadísticos
Los Anexos son documentos o elementos que complementan el cuerpo del trabajo y que
se relacionan, directa o indirectamente,
Manova polifenoles y actividad antioxidante para Maraco y Copoazú