Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria 68 Editorial Científica Universitaria – Secretaría de Ciencia y Tecnología Universidad Nacional de Catamarca ISBN: 978-987-661-125-1 3.1.- Introducción Se cree que los antioxidantes son esencialmente importantes por la capacidad que tienen de proteger a las macromoléculas biológicas contra el daño oxidativo. Entre los más conocidos figuran los tocoferoles, el ácido ascórbico, los flavonoides, antocioaninas, carotenoides y ácidos fenólicos [1] . Uno de los procedimientos más aplicados por la comunidad científica para evaluar la actividad antioxidante, es el método del DPPH. Este es un método espectrofotométrico en el que se utiliza el radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo, que tiene un fuerte color violeta y una intensa banda de absorción a 515 nm. Cuando una solución de DPPH se mezcla con una sustancia que puede donar átomos de hidrógeno, capaz de estabilizarlo, el color violeta intenso decae a un color residual amarillo pálido del grupo picril aún presente, con la consecuente disminución de la absorbancia [2] . Estudios recientes vinculados a la capacidad antirradicalaria de extractos simples de hoja y madera de olivo señalan a los extractos de madera con acetato de etilo y etanol, en ese orden, como los responsables de la mejor capacidad de captura del RL DPPH. En tanto, para la hoja, el etanol fue el solvente que generó el extracto de mayor actividad antioxidante [3] . La presente investigación pretende evaluar la actividad antirradicalaria de extractos de hoja y madera de olivo de la variedad Arbequina, procedente del Valle Central de Catamarca, a través del método basado en la determinación del porcentaje de inhibición de radicales libres, usando como radical modelo el compuesto 2,2-difenil-1-picril- hidracilo (DPPH). 3.2.- Objetivos del presente capítulo Determinar la capacidad de captura de radicales libres de los extractos de hojas y madera derivados de la poda de olivos de la variedad Arbequina, aplicando el método del DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo). Comparar la capacidad de captura de radicales libres de los extractos obtenidos según el material vegetal, el solvente empleado y la concentración de los extractos entre sí y con otros antioxidantes.
24
Embed
Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria on line/DIGITESIS/Tesis de... · Agua bidestilada Solución de etanol acuoso al 50% Acetato de etilo ... Evidentemente,
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
68 Editorial Científica Universitaria – Secretaría de Ciencia y Tecnología
Universidad Nacional de Catamarca ISBN: 978-987-661-125-1
3.1.- Introducción
Se cree que los antioxidantes son esencialmente importantes por la capacidad que tienen
de proteger a las macromoléculas biológicas contra el daño oxidativo. Entre los más
conocidos figuran los tocoferoles, el ácido ascórbico, los flavonoides, antocioaninas,
carotenoides y ácidos fenólicos [1]
.
Uno de los procedimientos más aplicados por la comunidad científica para evaluar la
actividad antioxidante, es el método del DPPH. Este es un método espectrofotométrico
en el que se utiliza el radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo, que tiene un
fuerte color violeta y una intensa banda de absorción a 515 nm. Cuando una solución de
DPPH se mezcla con una sustancia que puede donar átomos de hidrógeno, capaz de
estabilizarlo, el color violeta intenso decae a un color residual amarillo pálido del grupo
picril aún presente, con la consecuente disminución de la absorbancia [2]
.
Estudios recientes vinculados a la capacidad antirradicalaria de extractos simples de
hoja y madera de olivo señalan a los extractos de madera con acetato de etilo y etanol,
en ese orden, como los responsables de la mejor capacidad de captura del RL DPPH. En
tanto, para la hoja, el etanol fue el solvente que generó el extracto de mayor actividad
antioxidante [3].
La presente investigación pretende evaluar la actividad antirradicalaria de extractos de
hoja y madera de olivo de la variedad Arbequina, procedente del Valle Central de
Catamarca, a través del método basado en la determinación del porcentaje de inhibición
de radicales libres, usando como radical modelo el compuesto 2,2-difenil-1-picril-
hidracilo (DPPH).
3.2.- Objetivos del presente capítulo
Determinar la capacidad de captura de radicales libres de los extractos de hojas y
madera derivados de la poda de olivos de la variedad Arbequina, aplicando el
método del DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo).
Comparar la capacidad de captura de radicales libres de los extractos obtenidos
según el material vegetal, el solvente empleado y la concentración de los
extractos entre sí y con otros antioxidantes.
Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
69 Editorial Científica Universitaria – Secretaría de Ciencia y Tecnología
Universidad Nacional de Catamarca ISBN: 978-987-661-125-1
3.3.- Materiales y métodos
3.3.1.- Preparación de las muestras
Método modificado de reducción del radical 2,2-difenil-1-picrihidracilo (DPPH), según
Brand-Willians W. et al (1995) [4].
Reactivos:
2,2-difenil-1-picrihidracilo (DPPH)
Metanol absoluto
Agua bidestilada
Solución de etanol acuoso al 50%
Acetato de etilo
Extractos hoja- etanol 50% (EHE)
Extractos hoja- acetato de etilo (EHAc)
Extractos madera- etanol 50% (EME)
Extracto madera- acetato de etilo (EMAc)
I. Preparación de solución stock de DPPH
Se pesan con precisión de 0,1 mg una masa de 0,05 g de DPPH en vaso de precipitado
previamente tarado. Se disuelve en metanol grado analítico, se trasvasa a matraz aforado
de 25 ml y se enrasa para conseguir una solución de 5,07 x 10-3
M. La solución se
almacena en recipiente ámbar, recubierto en papel aluminio a 0 ºC [5]
.
II. Preparación de solución estándar de DPPH
A partir de la solución stock de DPPH se prepara una solución de 7,4 x 10-5
M [3]
en
metanol grado analítico. La solución se coloca en recipiente ámbar, recubierto en papel
aluminio a 0 ºC. La solución estándar de DPPH debe ser preparada en momentos
previos de su utilización y no ser sometida a un almacenamiento superior a las seis
horas, debido a que se produce una disminución en la absorbancia de la disolución,
hecho que esta relacionado con la reducción de las moléculas de radical libre [5]
.
III. Preparación de las disoluciones de extracto fenólico
Se preparan, por quintuplicado, soluciones de 100, 300 y 600 ppm en extracto a partir
de los extractos de hoja y madera por separado.
Se obtienen las soluciones de 600 ppm en extracto, diluyendo y enrasando con etanol
acuoso al 50%. Para la preparación de las soluciones de 300 y 100 ppm en extracto se
diluye la solución de 600 ppm enrasando con etanol acuoso al 50%.
Para obtener las soluciones con acetato de etilo absoluto se sigue la misma metodología
enrasando con este solvente (Anexo 4; Fotos A.4.33 a A.4.36).
Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
70 Editorial Científica Universitaria – Secretaría de Ciencia y Tecnología
Universidad Nacional de Catamarca ISBN: 978-987-661-125-1
3.3.2.- Determinación de la capacidad antirradicalaria
Para cada extracto de hoja y madera de olivo se sigue la metodología que se detalla a
continuación, siendo la misma una modificación del procedimiento descripto por von
Gadow et al., (1997) [6]
.
Se coloca en celda de vidrio la disolución estándar de DPPH y se mide inmediatamente
su absorbancia en espectrofotómetro a una longitud de onda de 515 nm. Respetando una
relación extracto: DPPH 1,6:1, se miden 0,187 ml de la disolución de extracto
concentrado (soluciones de extracto a 100, 300 o 600 ppm según corresponda), se
coloca en vaso de precipitado de 50 ml y se adicionan sobre el mismo 4 ml de
disolución estándar de DPPH. Se homogeniza la mezcla y se coloca rápidamente en
celda de vidrio. Finalmente se sigue la cinética de reacción de la mezcla durante 30
minutos leyendo las absorbancias en un espectrofotómetro a 515 nm (Anexo 4; Fotos
A.4.37 a A.4.42).
Se calcula el porcentaje de inhibición de radicales libres (PI) de cada uno de lo extractos
según la siguiente expresión:
Cálculo: PI = [(At = 0 min - At =15 min) / At = 0 min] x 100
Donde: PI: Porcentaje de inhibición.
At = 0 min: Absorbacia inicial del DPPH.
At =15min: Absorbacia a los 15 minutos de producida la mezcla de extracto:DPPH.
3.4.- Resultados y discusión
3.4.1.- Comportamiento de los extractos de hojas
En la tabla 3.1 se exponen los resultados de los máximos, mínimos, medianas,
promedios, desviaciones estándar y los coeficientes de variación de cinco repeticiones
de los PI de radicales libres DPPH, de los dos extractos de hojas de olivo evaluados.
Medidas
descriptivas
Concentración en extracto (ppm)
100 300 600
Extractos
HE HAc HE HAc HE HAc
Máximo 92,34 51,84 94,19 95,03 93,42 95,12
Mínimo 88,90 44,99 91,48 92,64 92,02 91,63
Mediana 91,55 50,27 92,61 94,16 92,54 91,86
Media 91,21 49,00 92,70 93,96 92,68 92,82
DE 1,36 2,73 0,93 0,87 0,53 1,56
CV % 1,49 5,57 1,00 0,93 0,57 1,68
Tabla 3.1. Medidas descriptivas de los PI de extractos etanólicos y con acetato de etilo de hojas de
olivo para 100, 300 y 600 ppm (Extracto:DPPH = 1,6:1; 15 min.).
Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
71 Editorial Científica Universitaria – Secretaría de Ciencia y Tecnología
Universidad Nacional de Catamarca ISBN: 978-987-661-125-1
Cinco de las seis soluciones de extractos de hoja de olivo de la variedad Arbequina
analizadas (HE 100, 300 y 600 ppm y HAc 600 y 300 ppm), presentan un efecto
inhibitorio del RL DPPH superior al 90% (Tabla 3.1) y en consecuencia predicen una
elevada capacidad antioxidante. Comparados éstos con la capacidad de captura de
radicales libres DPPH de soluciones de 500 ppm de BHA que registra un PI medio de
83,6 % y de BHT que sólo alcanza a inhibir el 50,3% de los radicales libres a los quince
minutos de iniciado el ensayo [7]
, se pone en evidencia la alta capacidad de capturar RL
DPPH de los extractos de hoja en ambos solventes. El extracto con menor rendimiento
es HAc 100 ppm que a los quince minutos de iniciado el ensayo alcanza a inhibir el
50,27% de los radicales libres. Sin embargo, presenta mayor poder de inhibición que el
BHT a 250 ppm [7]
, que manifiesta un PI de 28,6%. Por su parte, el extracto con la
mejor respuesta es HAc 300 ppm con un PI equivalente a 94,16%, seguido por los
extractos HE a la misma concentración, HE 600 ppm, HAc 600 ppm y HE 100 ppm.
Al comparar estadísticamente, mediante la prueba de Kruskal Wallis, las medianas de
los extractos con PI superiores al 90%, se revela que el extracto HE 100 ppm muestra
un PI de RL DPPH significativamente menor que el extracto HAc 300 ppm (p<0,0278)
(Tabla 3.2). Mientras que, entre el resto de los extractos, el análisis no acusa la
influencia del solvente ni las concentraciones ensayadas sobre el comportamiento
antirradicalario de los extractos de hoja de olivo (Anexo 3; Tabla A.3.13).
Evidentemente, a elevadas concentraciones en extracto, los compuestos obtenidos a
partir de los extractos etanólicos y con acetato de etilo de hojas de olivo, presentan
mayor actividad en la matriz metanólica de radicales libres DPPH y por tanto exhiben
mayor capacidad antioxidante.
Tabla 3.2. Medianas de los PI de extractos etanólicos de hojas de olivo a 100, 300 y 600 ppm y
extractos con acetato de etilo de hojas de olivo a 300 y 600 ppm.
En el gráfico 3.1 se presentan los resultados de la mediana de cinco repeticiones de la
capacidad antioxidante, expresada como el PI calculado a los quince minutos de
producirse la mezcla extracto: DPPH, en una proporción 1,6:1, de los dos extractos de
Extractos Medianas*
HE 100 ppm 91, 55 A
HE 300 ppm 92,61 AB
HE 600 ppm 92,54 AB
HAc 300 ppm 94,16 B
HAc 600 ppm 91,86 AB
* Letras distintas indican diferencias significativas al 5%
Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
72 Editorial Científica Universitaria – Secretaría de Ciencia y Tecnología
Universidad Nacional de Catamarca ISBN: 978-987-661-125-1
hojas de olivo a las tres concentraciones evaluadas (100, 300 y 600 ppm). En tanto que,
en el gráfico 3.2 se exponen los valores, pero en relación a los solventes empleados.
91,55%
92,61%
92,54%
50,27%
94,16%
91,86%
100
300
600C
on
cen
tració
n/
pp
m
PI
HAc
HE
Gráfico 3.1. Actividad antioxidante de los extractos de hojas de olivo expresada en términos de
medianas de PI a 100, 300 y 600 ppm (Extracto:DPPH= 1,6:1; 15 min.).
A 600 y 100 ppm son los extractos etanólicos los que muestran mayor capacidad de
capturar RL de DPPH. A 600 ppm el extracto HE presenta una actividad 0,73% superior
a HAc, mientras que a 100 ppm los extractos etanólicos superan a los extractos de
acetato de etilo en un 45,09%, comportamiento que puede explicarse, si se tiene en
cuenta que estos extractos presentan una proporción superior al 60% en ODF;
estructuras químicas relacionadas, según diferentes fuentes, con la bioactividad de los
compuestos fenólicos [10]. Esto coincide con lo reportado por Pérez Bonilla et al (2003)
[3], quienes concluyen que para las hojas de olivo, el etanol fue el solvente que generó el
extracto de mejor actividad antioxidante. A pesar de esto, a 300 ppm es el extracto con
acetato de etilo el que tiene el mejor PI, con una actividad antirradicalaria de un 1,65%
superior a la del EHE, destacándose por sobre los demás extractos, aunque la diferencia
con el extracto etanólico a igual concentración es despreciable (Tabla 3.2). Puede
notarse, de acuerdo a los porcentajes presentados, que al disminuir las concentraciones
en extracto las diferencias en la capacidad de capturar radicales libres por parte de los
extractos en los distintos solventes se va haciendo más evidente.
Se esperaría observar una actividad antioxidante relativa a las concentraciones de
ensayo, sin embargo, probablemente por causa de la abundante concentración fenólica
de los extractos no puede distinguirse tal comportamiento [8; 9]
. Las disoluciones
etanólicas de 600, 300 y 100 ppm en extracto poseen una cantidad tan elevada de
fenoles que aún a 100 ppm, la capacidad inhibitoria del extracto es próxima a la de las
Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
73 Editorial Científica Universitaria – Secretaría de Ciencia y Tecnología
Universidad Nacional de Catamarca ISBN: 978-987-661-125-1
concentraciones superiores. Mientras tanto, los extractos con acetato de etilo que
presentan una concentración de fenoles importante, pero significativamente inferior a la
de los etanólicos, ponen en evidencia recién a 100 ppm la incidencia de la disminución
de la concentración de los extractos sobre la capacidad inhibitoria de radicales libres
DPPH, ya que el PI disminuye respecto al PI del extracto a 600 ppm, en 1,87 veces.
En el gráfico 3.2, se observa claramente que los extractos etanólicos de hojas de olivo, a
las tres concentraciones evaluadas, manifiestan una respuesta prácticamente idéntica
frente al sistema de prueba radicalaria DPPH, registrándose PI próximos entre sí. Este
hecho confirma, además de lo argumentado anteriormente en cuanto a la concentración
de fenoles y a la influencia de mayor proporción de ortodifenoles de los extractos
etanólicos sobre la actividad antirradicalaria, un comportamiento ligado a la naturaleza
de los CF extraídos. Por su parte, los extractos con acetato de etilo, que presentan menor
contenido en fenoles que los extractos etanólico, exhiben un comportamiento
diferenciado. A 300 y 600 ppm los PI son próximos entre sí y a su vez el extracto HAc
300 ppm resulta ser el mejor de los extractos de hojas evaluados. Mientras que, a 100
ppm se observa una actividad antioxidante notablemente inferior a la de los extractos
más concentrados de acetato de etilo y a los extractos etanólicos (Gráfico 3.1). Es decir,
que en los extractos de acetato de etilo se encuentra el más activo y el menos eficaz de
todos los extractos foliares ensayados, dependiendo de la concentración en extracto
empleada.
91,55%
50,27%
92,61%
94,16%
92,54%
91,86%
HE
HAc
Extr
acto
s
PI
600 ppm
300 ppm
100 ppm
Gráfico 3.2. Actividad antioxidante de los extractos de hojas de olivo en función de los solventes de
extracción, expresada en términos de medianas de PI a 100, 300 y 600 ppm (Extracto:DPPH= 1,6:1;
15 min.).
Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
74 Editorial Científica Universitaria – Secretaría de Ciencia y Tecnología
Universidad Nacional de Catamarca ISBN: 978-987-661-125-1
Para ambos solventes, los mayores PI se registran a 300 ppm, lo que permite suponer
que para la relación estequiométrica extracto:DPPH utilizada esta concentración resulta
ser la más apropiada y permite que los antioxidantes presentes en los extractos
manifiestan de mejor forma su poder inhibitorio. A pesar de ello no se encuentran
diferencias con los extractos de 600 ppm.
Por lo expuesto, se puede señalar que las concentraciones en extracto aplicadas tienen
incidencia en la evaluación de la capacidad antioxidante, pero no sería este factor el
responsable absoluto de la actividad inhibitoria de los extractos. Los resultados
obtenidos evidencian además que la naturaleza química de tales extractos tiene una
marcada influencia en la actividad antiradicalaria, si se considera que los solventes
empleados, de polaridades distintas, extraen de acuerdo al fenómeno de partición,
compuestos activos con diferentes capacidades de inhibir la actividad radicalaria.
En los gráficos 3.3 y 3.4 se presentan la disminución de las medianas de la absorbancia
a través del tiempo de las mezclas de DPPH con los extractos en etanol: agua y en
acetato de etilo a 100, 300 y 600 ppm. Mientras que, en las tablas 3.3 y 3.4 se detallan
las lecturas de las mediciones de absorbancia (A) efectuadas cada 36 segundos durante
los treinta minutos que dura el ensayo y los valores de PI correspondientes a dichas A.
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
0 500 1000 1500 2000
Tiempo/s
Ab
so
rban
cia
515 n
m
HE 600 ppm
HE 300 ppm
HE 100 ppm
Gráfico 3.3. Medianas de las absorbancias, en función del tiempo, de las mezclas extracto:DPPH =
1,6:1 de las soluciones de 100, 300 y 600 ppm en extracto de hojas de olivo con etanol al 50%.
En el gráfico 3.3 puede notarse el comportamiento instantáneo del extracto etanólico de
600 ppm, que a los 5 segundos de iniciada la reacción pasa de tener una absorbancia de
0,727 a 0,080, inhibiendo casi un 90% (89,15%) del DPPH. Si bien la capacidad
Capítulo III: Determinación de la capacidad antirradicalaria
75 Editorial Científica Universitaria – Secretaría de Ciencia y Tecnología
Universidad Nacional de Catamarca ISBN: 978-987-661-125-1
antioxidante de los extractos de 300 y 100 ppm, evaluada para el mismo tiempo, es
inferior a la del extracto de 600 ppm, éstos son excelentes inhibidores de RL DPPH.
Tabla 3.3. Absorbancia y PI de los tres extractos etanólicos de hojas de olivo a lo largo de 30’.