Capitolo 6 – Bioaccumulo Mytilus galloprovincialis ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere 495 Capitolo 6 – Bioccumulo su Mytilus galloprovincialis 6.1 Il Campionamento La campagna di campionamento per le indagini di bioaccumulo è stata eseguita nel mese di Dicembre 2008, utilizzando un protocollo di trapianto di mitili (Mytilus galloprovincialis) prelevati da una popolazione naturale (Cicero e Di Girolamo, 2001). Gli organismi sono stati prelevati da una mitilicoltura di Portonovo (Ancona) e in parte immediatamente traslocati nella stessa area (TC041), utilizzata come sito di riferimento per valutare l’effetto della procedura di traslocazione. Entro le 24 h, gli organismi sono stati traslocati in due siti posti nell’area del Terminale. Le due stazioni di campionamento erano state inizialmente previste in prossimità del Terminale e a tale scopo durante le attività di monitoraggio nella fase di bianco erano state ubicate strutture di biomonitoraggio contenenti i mitili trapiantati (Mytilus galloprovincialis); a causa tuttavia della intensa attività di pesca a strascico che abitualmente si svolge nella zona sono state successivamente sistemate in una posizione più protetta, in corrispondenza dell’impianto di mitilicoltura “VISMA”. Le due stazioni (TC039, TC040) di campionamento sono state mantenute nel medesimo impianto di mitilicoltura anche per la fase di cantiere. La posizione delle stazioni con il dettaglio delle coordinate geografiche è riportata nel Capitolo 3 par. 3.2. In ciascun sito è stato trapiantato un numero di individui compreso tra 200 e 300, di taglia compresa approssimativamente tra il 70 % e il 90 % delle dimensioni massime della popolazione da cui sono stati raccolti. Il periodo di esposizione degli organismi, scelto in funzione del raggiungimento delle condizioni di equilibrio, è stato di circa 4 settimane. Al termine di tale periodo gli organismi sono stati recuperati e mantenuti ad una temperatura costante di circa +4°C, avvolti in panni umidi fino al momento della dissezione dei tessuti, avvenuta in laboratorio entro 24 ore dal momento del prelievo. Per ogni stazione di campionamento, sono stati preparati, a seconda delle analisi di laboratorio da eseguire, un diverso numero di replicati, ciascuno costituito dalle intere parti molli di più organismi. Per la determinazione dei metalli, degli IPA, degli organostannici, dei PCB e dei pesticidi sono stati preparati tre replicati; per la determinazione dei VOC due replicati; per la determinazione dei parametri microbiologici è stato preparato un replicato. Subito dopo la dissezione e la relativa suddivisione nei replicati, i tessuti sono stati posti alla temperatura di -20°C fino alle successive fasi di preparazione per le analisi. Le analisi microbiologiche sono state condotte invece nel più breve tempo possibile senza ricorrere al congelamento dei tessuti.
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Capitolo 6 – Bioccumulo su Mytilus galloprovincialis · 2008, utilizzando un protocollo di trapianto di mitili (Mytilus galloprovincialis) prelevati da una ... 2977 e IAEA 406 e
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una presenza leggermente maggiore di IPA derivanti da processi di combustione in corrispondenza
delle stazioni prossime al terminale. Si tratta tuttavia di concentrazioni contenute che non evidenziano
impatti significativi.
Capitolo 6 – Bioaccumulo
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Tabella 6.2.1.2.1: Concentrazioni di IPA espresse in µg/g in Mytilus galloprovincialis – fase di cantiere – Dicembre 2008. Stazione TC039M TC040M TC041M
Replicato I II III media I II III media I II III media
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Terminale Mitili, Cantiere Dicembre 2008, Concentrazioni medie di IPA nelle tre stazioni
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
nafta
lene
acen
aftene
fluore
ne
fenan
trene
antra
cene
fluora
ntene
piren
e
benz
o(a)an
trace
ne
crise
ne
benz
o(b)flu
orante
ne
benz
o(k)flu
orante
ne
benz
o(a)pir
ene
diben
zo(a,
h)antra
cene
benz
o(g,h,i
)perile
ne
indeno
(1,2,3,
c,d)pi
rene
µg/g
s.s
.
TB039MTB040MTB041M
Figura 6.2.1.2.1: Concentrazioni di IPA totali espresse in µg/g nei mitili delle tre stazioni – fase di cantiere – Dicembre 2008. Confrontando le concentrazioni di IPA totali determinate nei mitili nelle varie campagne succedutesi
nel tempo (figura 6.2.1.2.2) si nota come, nelle due stazioni situate in prossimità del terminale, i livelli
della campagna di cantiere di dicembre 2008 risultino leggermente maggiori di quelli riscontrati nelle
ultime due campagne di bianco (febbraio e marzo 2007) e inferiori a quelli della campagna di gennaio
2007. Tale andamento è giustificato dalle fluttuazioni stagionali delle concentrazioni di IPA nei mitili
legate ai cicli biologici degli organismi. Nella stazione di controllo si riscontrano invece, per la
campagna di cantiere, concentrazioni leggermente inferiori anche alle ultime due campagne di bianco.
Nel complesso si può tuttavia concludere che le variazioni di livelli di IPA nei mitili indagati siano da
ricondurre essenzialmente alla variabilità stagionale legata ai cicli biologici piuttosto che ad impatti
antropici nell’area.
TC039M TC040M TC041M
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Terminale Mitili: Concentrazioni medie di IPA totali nelle campagne di cantiere di bianco
0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0.300
0.350
TB039M TB040M TB041M
stazione
µg/g
s.s
.
Cantiere Dic 2008Bianco Marzo 2007Bianco Febbraio 2007Bianco Gennaio 2007Bianco Luglio 2006
Figura 6.2.1.2.2: Confronto tra le concentrazioni medie di IPA totali in mitili determinate nelle tre stazioni nelle campagne di cantiere e di bianco.
T039M T040M T041M
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6.2.2 Metalli
6.2.2.1 Materiali e metodi
Campionamenti e prelievo degli organismi
Per ogni stazione di campionamento, sono stati preparati 3 replicati, ciascuno costituito dalle intere
parti molli di più organismi, dei quali sono stati registrati i parametri relativi alla dimensione delle valve
(lunghezza) ed al peso dei tessuti. Subito dopo la dissezione e la relativa suddivisione nei replicati, i
tessuti sono stati posti alla temperatura di -20°C fino alle successive fasi di preparazione per le analisi.
Procedura analitica
Una volta scongelati, i tessuti sono essiccati in stufa a ventilazione forzata per 48h alla temperatura di
35°C, quindi omogeneizzati mediante un mulino a lame.
Il metodo prevede la digestione dei tessuti mediante mineralizzazione. Vengono prelevati 0,5g circa di
campione (peso secco) e trasferiti in reattori di teflon, dove si addizionano 1ml di H2O2 e 7ml di HNO3.
I contenitori prima di essere inseriti nel forno a microonde, vengono chiusi utilizzando una coppia
serraggio di 22 m/N. Ciò permette alla miscela acido-campione di raggiungere temperature e pressioni
molto elevate. Il ciclo operativo impiegato per la mineralizzazione prevede 4 min a 800 Watt e 100°C,
0 min a 800 Watt e 120° C, 5 min a 1000 Watt 200 °C, 15 min a 1000 Watt e 200 °C, ventilazione e
raffreddamento (20 min).
Dopo il ciclo di mineralizzazione i campioni sono raffreddati a temperatura ambiente e portati al
volume di 25 ml.
I Bianchi Analitici sono preparati con soluzioni composte da 1ml di H2O2 + 7 ml di HNO3 e processati
con le stesse modalità operative utilizzate per la mineralizzazione dei campioni.
Determinazioni analitiche
La determinazione di Cu, Fe, Ni ,Mn, Zn, Cr e Ba è stata effettuata mediante Spettrofotometria in
Emissione Atomica ICP-OES Sequenziale ( Varian- Liberty AX); il Cd, l’As e il Pb sono stati analizzati
mediante Spettrofotometria in Assorbimento Atomico con sistema di atomizzazione a fornetto di
grafite e correzione del fondo mediante effetto Zeeman (Varian, SpectrAA 220Zeeman); per il
mercurio si è utilizzata la tecnica della concentrazione su amalgama d’oro, desorbimento e rivelazione
con spettrofotometro UV (spettrometria atomica DMA-80).
Per valutare l’adeguatezza del metodo analitico sono stati stimati alcuni parametri di qualità come
l’accuratezza, il limite di quantificazione ed il recupero. Il limite di quantificazione per ciascun metallo,
relativo alla metodica impiegata, viene riportato in tabella 6.2.2.1.1.
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Tabella 6.2.2.1.1: Metalli: limiti di quantificazione. Parametro Limite di quantificazione (mg/kg)
Piombo 0,050 Cadmio 0,010 Arsenico 2,00
Bario 2,00 Cromo 1,00 Rame 1,00 Ferro 10,00
Manganese 1,50 Nichel 1,00 Zinco 1,00
Mercurio 0,0005
L’accuratezza è stata valutata mediante l’analisi di materiali di riferimento certificati: Standard Reference
Material 2976 (mussel tissue); i risultati ottenuti sono riportati in tabella 6.2.2.1.2.
Tabella 6.2.2.1.2: SRM 2976: Valori certificati e relative percentuali di recupero.
Allo scopo di monitorare le proprie prestazioni analitiche il laboratorio partecipa dall’Ottobre 2003 al
circuito di Laboratory Performance Studies organizzato dal QUASIMEME (Quality Assurance
Laboratory Performance Studies for Environmental Measurements in Marine Samples) eseguendo, con
cadenza semestrale, l’analisi di campioni incogniti inviati dall’ente organizzatore e comunicando i propri
risultati allo scopo di confrontarli con i valori assegnati.
6.2.2.2 Risultati
Nella tabella 6.2.2.2.1 sono riportati i valori di concentrazione per i vari elementi (mg/kg di peso
secco) misurati nei tessuti di Mytilus galloprovincialis nella campagna di dicembre 2008.
La stazione TC041 è considerata stazione di bianco ed è stata prelevata a Portonovo (Ancona).
Le concentrazioni misurate risultano essere pressoché omogenee tra la stazione di controllo e le stazioni
esposte. In alcuni casi si registrano concentrazioni medie leggermente inferiori nella stazione di
controllo rispetto alle altre due stazioni; questo è vero soprattutto per mercurio e cadmio. Per il Hg il
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valore medio osservato nei campioni prelevati a Portonovo risulta pari a 0,087 mg/kg p.s., mentre i
valori medi registrati nelle stazioni TC039 e TC040 sono rispettivamente 0,2010 mg/kg p.s. e 0,2217
mg/kg p.s.; per il Cd i campioni della stazione TC041 mostrano una concentrazione media pari a 0,656
mg/kg p.s., a fronte di valori medi pari a 1,927 mg/kg p.s. nella stazione TC039 e 1,227 mg/kg p.s.
nella stazione TC040.
Viceversa, per alcuni analiti si registrano concentrazioni maggiori nel controllo; in particolare per Ferro,
Manganese e Bario.
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Tabella 6.2.2.2.1: Concentrazioni di metalli espresse in mg/kg in Mytilus galloprovincialis – fase di cantiere – campagna Dicembre 2008. Area Terminale – Mytilus galloprovincialis – Cantiere – Dicembre 2008
Pb Cd As Ba Cr totale Cu Fe Mn Ni Zn Hg Stazione Replicato mg/kg
media 1,185 0,656 2,48 5,21 2,69 5,77 793,12 26,25 1,00 117,71 0,08667 Nelle figure 6.2.2.2.1-11 sono rappresentate le concentrazioni medie ottenute nella campagna di cantiere e nelle quattro campagne di bianco, per ciascun
metallo.
Si osserva che per cadmio, cromo, ferro, nichel e zinco, i valori misurati risultano superiori nella campagna di cantiere di dicembre 2008 rispetto agli anni
precedenti; però per il cromo e il ferro tale comportamento si registra anche nella stazione di controllo spaziale (TC041), ragion per cui per questi metalli
si può supporre che l’aumento di concentrazione non sia direttamente correlabile ai lavori di cantiere.
Per quanto riguarda l’arsenico si evidenzia che nella campagna di cantiere i valori diminuiscono in tutte le stazioni.
Tutti gli altri metalli mostrano differenze non significative con le altre campagne di monitoraggio.
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Figura 6.2.2.2.1: Concentrazioni medie di piombo (mg/kg p.s.) in tessuti di Mytilus galloprovincialis, campagne di bianco (luglio ’06, gennaio ’07, febbraio ’07 e marzo ’07) e campagna di cantiere (dicembre 2008) nelle tre stazioni (T039, T040 e T041).
Figura 6.2.2.2.2: Concentrazioni medie di cadmio (mg/kg p.s.) in tessuti di Mytilus galloprovincialis, campagne di bianco (luglio ’06, gennaio ’07, febbraio ’07 e marzo ’07) e campagna di cantiere (dicembre 2008) nelle tre stazioni (T039, T040 e T041).
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0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
s taz 039 s taz 040 s taz 041
mg/Kg
Ars en ico
lu g lio '0 6 g e n n a io '0 7 fe b b ra io '0 7 m a rzo '0 7 d ice m b re '0 8
< LO Q
Figura 6.2.2.2.3: Concentrazioni medie di Arsenico (mg/kg p.s.) in tessuti di Mytilus galloprovincialis, campagne di bianco (luglio ’06, gennaio ’07, febbraio ’07 e marzo ’07) e campagna di cantiere (dicembre 2008) nelle tre stazioni (T039, T040 e T041).
Figura 6.2.2.2.4: Concentrazioni medie di Bario (mg/kg p.s.) in tessuti di Mytilus galloprovincialis, campagne di bianco (luglio ’06, gennaio ’07, febbraio ’07 e marzo ’07) e campagna di cantiere (dicembre 2008) nelle tre stazioni (T039, T040 e T041).
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Figura 6.2.2.2.5: Concentrazioni medie di cromo (mg/kg p.s.) in tessuti di Mytilus galloprovincialis, campagne di bianco (luglio ’06, gennaio ’07, febbraio ’07 e marzo ’07) e campagna di cantiere (dicembre 2008) nelle tre stazioni (T039, T040 e T041).
Figura 6.2.2.2.6: Concentrazioni medie di rame (mg/kg p.s.) in tessuti di Mytilus galloprovincialis, campagne di bianco (luglio ’06, gennaio ’07, febbraio ’07 e marzo ’07) e campagna di cantiere (dicembre 2008) nelle tre stazioni (T039, T040 e T041).
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0
80
160
240
320
400
480
560
640
720
800
s taz 039 s taz 040 s taz 041
mg/Kg
Ferro
lu g lio '06 g enna io '07 febb ra io '07 m a rzo '07 d ice m bre '08 Figura 6.2.2.2.7: Concentrazioni medie di ferro (mg/kg p.s.) in tessuti di Mytilus galloprovincialis, campagne di bianco (luglio ’06, gennaio ’07, febbraio ’07 e marzo ’07) e campagna di cantiere (dicembre 2008) nelle tre stazioni (T039, T040 e T041).
Figura 6.2.2.2.8: Concentrazioni medie di manganese (mg/kg p.s.) in tessuti di Mytilus galloprovincialis, campagne di bianco (luglio ’06, gennaio ’07, febbraio ’07 e marzo ’07) e campagna di cantiere (dicembre 2008) nelle tre stazioni (T039, T040 e T041).
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Figura 6.2.2.2.9: Concentrazioni medie di nichel (mg/kg p.s.) in tessuti di Mytilus galloprovincialis, campagne di bianco (luglio ’06, gennaio ’07, febbraio ’07 e marzo ’07) e campagna di cantiere (dicembre 2008) nelle tre stazioni (T039, T040 e T041).
Figura 6.2.2.2.10: Concentrazioni medie di zinco (mg/kg p.s.) in tessuti di Mytilus galloprovincialis, campagne di bianco (luglio ’06, gennaio ’07, febbraio ’07 e marzo ’07) e campagna di cantiere (dicembre 2008) nelle tre stazioni (T039, T040 e T041).
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ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere 512
Figura 6.2.2.2.11: Concentrazioni medie di mercurio (mg/kg p.s.) in tessuti di Mytilus galloprovincialis, campagne di bianco (luglio ’06, gennaio ’07, febbraio ’07 e marzo ’07) e campagna di cantiere (dicembre 2008) nelle tre stazioni (T039, T040 e T041).
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6.2.3 Policlorobifenili (PCB) e Pesticidi organoclorurati
I Policlorobifenili (PCB) sono una classe di sostanze di origine antropica molto utilizzata in passato per
le particolari proprietà dielettriche che li rendono ottimi isolanti termo-elettrici e quindi adatti ad una
grande varietà di usi (fluidi dielettrici negli accumulatori, trasformatori, fluidi idraulici, oli lubrificanti,
additivi, ecc). Sono sostanze persistenti, tossiche e bioaccumulabili, che sono diventate ubiquitarie
nell’ambiente, ragione per cui si trovano livelli di “background” diversi da zero anche in zone lontane
da possibili fonti dirette o indirette. I PCB che hanno una conformazione co-planare “diossina simili”
suscitano particolare interesse per la loro tossicità.
I pesticidi organoclorurati sono sostanze di origine antropica ad attività insetticida il cui meccanismo
d’azione è prevalentemente a danno del sistema nervoso; le loro caratteristiche chimico-fisiche li
rendono, unitamente ai PCB, sostanze di elevata rilevanza ambientale per le loro caratteristiche di
persistenza e tossicità. Alcuni di questi composti, come per esempio i DDT, danno origine a prodotti
metaboliti (DDD e DDE) che risultano altrettanto tossici e persistenti dei prodotti di partenza.
Queste sostanze organoclorurate sono caratterizzate da una elevata stabilità chimica, ragione per cui
nell’ambiente vengono scarsamente degradati per azione chimica o biologica, hanno bassa solubilità in
acqua ed elevata lipofilicità. Per queste caratteristiche queste sostanze tendono, nell’ambiente acquatico,
ad accumularsi nei sedimenti e nel biota.
6.2.3.1 Materiali e metodi
Il principio del metodo prevede l’estrazione con solvente dei PCB e pesticidi clorurati da organismi
marini, successiva purificazione e determinazione gas-cromatografica con rivelatore a cattura di
elettroni (ECD). Si tratta di un rivelatore selettivo particolarmente sensibile a sostanze elettroaffini e
quindi, adatto all’analisi di composti alogenati che possiedono questa caratteristica.
L’estrazione dagli organismi (mitili o vongole) è stata effettuata mediante sonicazione con miscela di
solventi utilizzando un bagno ad ultrasuoni termostatato. Si pesano 1-2 g di campione liofilizzato ed
omogeneizzato, si aggiungono una spatola di sodio solfato anidro (trattato in muffola a 400°C per 6
ore) e 20 ml di una miscela n-esano/diclorometano (70:30 v/v). Si addiziona il surrogato e dopo aver
agitato bene, il campione viene posto in un bagno ad ultrasuoni per 30 minuti alla temperatura di 40°C;
si dibatte per 30 minuti, si centrifuga e si allontana l’estratto organico raccogliendolo in una beuta. Si
effettuano quindi due successive estrazioni del campione aggiungendo 10 ml della stessa miscela e
ripetendo la procedura con ultrasuoni e dibattimento; gli estratti, separati dal campione dopo
centrifugazione, vengono riuniti nella stessa beuta di raccolta, portati a piccolo volume mediante
rotavapor e purificati.
Capitolo 6 – Bioaccumulo
ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere 514
L’estratto concentrato è ripreso con 3x1 ml di n-esano e trasferito su colonna cromatografica impaccata
con 2,5 g di gel di silice disattivato al 15% e 1 cm di sodio solfato anidro. Il gel di silice utilizzato nella
purificazione è stato preparato nel seguente modo: attivato in stufa a 130°C per 16 ore, quindi posto a
raffreddare in essiccatore e disattivato mediante aggiunta del 15% di acqua bidistillata estratta con
diclorometano; il gel così trattato non viene utilizzato prima di 24 ore.
Si lascia percolare la soluzione avendo cura di non mandare a secco la colonna e si effettua quindi la
ripartizione dei PCB e pesticidi in due frazioni ottenute eluendo la colonna prima con 10 ml di n-esano
e poi con10 ml di una miscela n-esano/diclorometano (50:50). Le due frazioni separate, raccolte in
beuta, vengono concentrate a piccolo volume con l’evaporatore rotante, quindi vengono addizionate
con il PCB 209 in qualità di standard interno e portate ad un volume finale di 1 ml con isottano; infine
si trasferiscono in un vials per autocampionatore, per l’analisi gas-cromatografica.
Per quanto riguarda i campioni di mitili aventi maggiore contenuto lipidico, si è resa necessaria una
prima purificazione su Florisil. L’estratto organico, concentrato a piccolo volume, viene trasferito su
colonna cromatografica impaccata con 2,5 g di questo adsorbente e 1 cm di sodio solfato anidro; il
Florisil utilizzato è attivato in stufa a 130°C fino al momento dell’analisi. A questo punto si ripartiscono
i PCB e i pesticidi in un’unica frazione eluendo la colonna con 20 ml di Diclorometano; la frazione,
concentrata su rotavapor, è pronta per la purificazione su gel di silice.
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DDs
La sommatoria dei DDs (somma del 2,4 e 4,4 DDT, 2,4 e 4,4 DDD, 2,4 e 4,4 DDE), mostrata in
figura 6.2.3.2.4, va da 5,97 ng/g p.s. rilevati nella stazione TC040M a 7,34 ng/g p.s. della stazione
TC041M che corrisponde al campione di controllo.
0
3
5
8
10
TC039M TC040M TC041M
stazioni
Σ D
Ds n
g/g
p.s.
0
3
5
8
10
TC039M TC040M TC041M
stazioni
ng/g
p.s.
Σ DDE Σ DDD Σ DDT
Figura 6.2.3.2.4: Bioaccumulo dei DDs nelle tre stazioni di campionamento – fase di cantiere – Dicembre 2008.
Analizzando gli isomeri del DDT e dei suoi metaboliti si osserva che il DDE, in particolare il 4,4 DDE
è più abbondante degli altri.
TC039M
49%
28%
23%
Σ DDE Σ DDD Σ DDT
TC040M
56%
32%
12%
Σ DDE Σ DDD Σ DDT
TC041M
43%
34%
23%
Σ DDE Σ DDD Σ DDT
Figura 6.2.3.2.5: Percentuale di DDE, DDD e DDT nelle tre stazioni di campionamento – fase di cantiere – Dicembre 2008.
Come mostra la (figura 6.2.3.2.5) le percentuali relative di DDE, DDD e DDT determinate nei campioni
di mitili, sono simili tra loro nelle stazioni TC039M e TC041M mentre nella stazione TC040M è più
bassa la percentuale dei DDT e più alta quella dei DDE.
Capitolo 6 – Bioaccumulo
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HCB (Esaclorobenzene)
L’Esaclorobenzene è stato rilevato in tracce solo nella stazione TC039M dove è poco superiore al limite
di rilevabilità del metodo.
HCHs
La concentrazione degli esaclorocicloesani, espressa come sommatoria degli isomeri alfa, beta e gamma
(figura 6.2.3.2.6), è di 0,27 ng/g p.s. nella stazione TC039M e di 0,34 ng/g p.s. nella stazione
corrispondente al controllo TC041M.
0,0
0,2
0,3
0,5
0,6
TC039M TC040M TC041M
stazioni
α+β+
γ H
CH n
g/g
p.s.
0,0
0,2
0,3
0,5
0,6
TC039M TC040M TC041M
stazioni
ng/g
p.s.
α-HCH γ-HCH β-HCH
Figura 6.2.3.2.6: Bioaccumulo degli HCHs nelle tre stazioni di campionamento – fase di cantiere – Dicembre 2008.
Analizzando la distribuzione dei tre isomeri si nota la presenza del lindano (γ-HCH) in tutte e tre le
stazioni e del β-HCH nella sola stazione TC040M.
Aldrin e Dieldrin
L’Aldrin è sempre al di sotto del limite di quantificazione del metodo, pari a 0,10 ng/g.
Il Dieldrin è stato rilevato nella sola stazione TC040M ed è pari a 0,34 ng/g p.s.
Riguardo all’analisi dei contaminanti organici clorurati effettuata nei campioni di mitili trapiantati
durante la fase di cantiere si nota che, rispetto al campione di controllo prelevato nell’area da cui
provengono i mitili naturali (TC041M), non c’è un palese incremento di concentrazione dei composti
determinati.
Per quanto riguarda i PCB si osserva una concentrazione leggermente superiore nella stazione TC040M
dove troviamo una percentuale maggiore anche dei PCB “diossina –simili”.
Per quanto riguarda invece i pesticidi clorurati, in particolare i DDs e gli HCHs, notiamo una
Capitolo 6 – Bioaccumulo
ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere 522
concentrazione leggermente superiore nel campione di controllo.
Solo l’esaclorobenzene e l’aldrin, assenti nel campione di controllo sono stati rilevati in tracce nelle due
siti di trapianto.
Confronto tra la fase di bianco e la fase di cantiere relativo al bioaccumulo di policlorobifenili e
pesticidi clorurati.
Per il confronto dei dati di bioaccumulo tra la fase di bianco e la fase di cantiere relativo ai campioni di
mitili trapiantati nell’area del terminale, sono state messe in relazione la campagna di bianco di gennaio
2007 e la campagna di cantiere di dicembre 2008.
Confronto gennaio 2007 – dicembre 2008.
Le sommatorie dei PCBs, dei DDs e degli HCHs, le concentrazioni dell’HCB, dell’Aldrin e del Dieldrin
determinati nei campioni di Mytilus galloprovincialis per le due campagne, sono mostrate nelle figure
6.2.3.2.7-11.
Bianco - Gennaio 2007
0 5 10 15 20 25
TB039M
TB040M
TB041M
Staz
ion
i
ng/g p.s.Σ PCBs
Canriere - Dicembre 2008
0 7 14 22 29 36
TC039M
TC040M
TC041M
Staz
ion
i
ng/g p.s.Σ PCBs
Figura 6.2.3.2.7: Sommatoria dei PCB - Confronto tra fase di bianco gennaio 2007 e fase di cantiere dicembre 2008.
Bianco - Gennaio 2007
0 2 4 6 8 10
TB039M
TB040M
TB041M
Staz
ion
i
ng/g p.s.Σ DDs
Canriere - Dicembre 2008
0 2 4 6 8 10
TC039M
TC040M
TC041M
Staz
ion
i
ng/g p.s.Σ DDs
Figura 6.2.3.2.8: Sommatoria dei DDs - Confronto tra fase di bianco gennaio 2007 e fase di cantiere dicembre 2008.
Capitolo 6 – Bioaccumulo
ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere 523
Bianco - Gennaio 2007
0,0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5
TB039M
TB040M
TB041M
Staz
ion
i
ng/g p.s.Σ HCHs
Canriere - Dicembre 2008
0,0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5
TC039M
TC040M
TC041M
Staz
ion
i
ng/g p.s.Σ HCHs
Figura 6.2.3.2.9: Sommatoria degli HCHs - Confronto tra fase di bianco gennaio 2007 e fase di cantiere dicembre 2008.
Bianco - Gennaio 2007
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
TB039M
TB040M
TB041M
Staz
ion
i
ng/g p.s.HCB
Canriere - Dicembre 2008
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
TC039M
TC040M
TC041M
Staz
ion
i
ng/g p.s.HCB
Figura 6.2.3.2.10: Concentrazioni di HCB - Confronto tra fase di bianco gennaio 2007 e fase di cantiere dicembre 2008.
Bianco - Gennaio 2007
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
TB039M
TB040M
TB041M
Staz
ion
i
ng/g p.s.Aldrin Dieldrin
Canriere - Dicembre 2008
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
TC039M
TC040M
TC041M
Staz
ion
i
ng/g p.s.Aldrin Dieldrin
Figura 6.2.3.2.11: Concentrazioni di Aldrin e Dieldrin - Confronto tra fase di bianco gennaio 2007 e fase di cantiere dicembre 2008.
Dalla figura si nota come i PCBs determinati nella fase di cantiere siano, in assoluto, più alti di quelli
riscontrati nella fase di bianco ma, rispetto al relativo campione di controllo TC041M, la
concentrazione dei PCB nei campioni trapiantati è paragonabile.
Capitolo 6 – Bioaccumulo
ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere 524
Per i DDs non si evidenzia, invece, una grande differenza di concentrazione tra la campagna di cantiere
e quella di bianco sia per la stazione di controllo che per le stazioni del terminale.
Per gli esaclorocicloesani la situazione è inversa, ovvero la concentrazione nei campioni prelevati nella
fase di bianco è mediamente più alta di quella riscontrata nella fase di cantiere ma, così come per i
PCBs, i valori determinati nei due siti del terminale sono proporzionali a quelli della relativa stazione di
controllo.
Per quanto riguarda l’esaclorobenzene e il Dieldrin si nota una differenza tra le due campagne; nella
fase di cantiere nella stazione di controllo sono entrambi assenti e si evidenzia un bioaccumulo di HCB
e Dieldrin rispettivamente nelle stazioni TC039M e TC040M. Nella campagna di bianco erano invece
presenti sia nel controllo che nelle altre stazioni comunque nello stesso ordine di grandezza.
Infine, l’Aldrin non è mai stato rilevato in entrambe le campagne.
Capitolo 6 – Bioaccumulo
ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere 525
6.2.4 Composti Organostannici
6.2.4.1 Materiali e metodi
La determinazione di composti organostannici (TBT – Tributilstagno, DBT – Dibutilstagno e MBT –
Monobutilstagno) nei campioni di biota è stata effettuata basandosi sulle metodiche adottate da Binato et
al. (1998) e Morabito et al. (1995, 2001). La procedura analitica consiste in una serie di fasi sequenziali:
estrazione, derivatizzazione, purificazione e infine determinazione analitica mediante analisi
gascromatografica accoppiata a un rivelatore a spettrometria di massa a trappola ionica (GC/MS/MS).
Al campione liofilizzato e omogeneizzato è stato aggiunto come standard interno TTBT
(tetrabutilstagno). Il campione è stato estratto in bagno a ultrasuoni con una soluzione di tropolone
0,05% p/v in metanolo, previa acidificazione. Il surnatante è stato separato mediante centrifugazione e
quindi sottoposto a estrazione con diclorometano, previa aggiunta di una soluzione di NaCl 10% p/v in
acqua Milli-Q. L’estratto è stato concentrato e quindi ripreso in n-esano. I solventi usati sono per analisi
di pesticidi residui. L’estratto è stato derivatizzato con reattivo di Grignard. Dopo eliminazione del
reattivo in eccesso, la fase organica è stata concentrata e purificata su colonnine riempite di Florisil.
L’eluato (n-esano) è stato concentrato a volume noto e iniettato in GC/MS/MS.
La determinazione analitica è stata effettuata mediante Gascromatografo accoppiato ad uno
Spettrometro di massa (GC/MS/MS).
Gascromatografo: modello TRACE GC (ThermoQuest)
Detector: Spettrometro di massa a trappola ionica modello PolarisQ (Thermofinnigan)
Per la quantificazione sono state utilizzate curve di calibrazione preparate con soluzioni standard di
TBT, di DBT e di MBT, con TTBT come standard interno. L’accuratezza della metodica è stata
valutata da analisi ripetute di materiale certificato di riferimento.
6.2.4.2 Risultati
I valori di concentrazione di TBT, di DBT e di MBT determinati nei campioni di mitili (Mytilus
galloprovincialis) prelevati nel corso della campagna di campionamento del dicembre 2008 sono elencati
nella tabella 6.2.4.2.1. Per ciascun composto, i dati di concentrazione riportati sono espressi sia come
rapporto della massa dell’analita come catione (rispettivamente (C4H9)3Sn+ per il TBT, (C4H9)2Sn2+ per il
DBT, (C4H9)Sn3+ per il MBT) per grammo di campione secco, che come rapporto della massa
dell’analita come stagno (Sn) per grammo di campione secco. Per ogni campione, ottenuto dall’unione
di tutte le parti molli di più individui, omogeneizzate e liofilizzate, sono state analizzate tre repliche.
Capitolo 6 – Bioaccumulo
ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere 526
Tabella 6.2.4.2.1: Concentrazioni di TBT, di DBT e di MBT nei Mytilus galloprovincialis. Valori espressi come concentrazioni sul peso secco (s.s.) – fase di cantiere.
TBT DBT MBT
ng Sn ng Sn ng Sn Stazione Replicato ng TBT g-1 p.s. g-1 p.s.
ng DBT g-1 p.s. g-1 p.s.
ng MBT g-1 p.s. g-1 p.s.
I 331 136 13 7 <6 <4 II 337 138 15 8 <6 <4 III 300 123 12 6 <6 <4
TC039M
media 323 132 13 7 <6 <4
I 307 126 16 8 <6 <4 II 313 128 17 9 <6 <4 III 350 143 16 8 <6 <4
TC040M
media 323 132 16 8 <6 <4
I 107 44 11 5 <6 <4 II 330 135 13 7 <6 <4 III 327 134 13 7 <6 <4
TC041M
media 255 104 12 6 <6 <4
Il TBT è stato rilevato in tutti i campioni analizzati di Mytilus galloprovincialis ed è sempre risultato il
composto butilstannico più abbondante. Il TBT è stato rilevato anche in tutti i campioni di controllo. Il
DBT è risultato sempre presente anche se nelle concentrazioni poco al di sopra del limite di
determinazione (8 ng DBT g-1 s.s., 4 ng Sn g-1 s.s.). Il MBT è risultato inferiore al limite di
determinazione (6 ng MBT g-1 s.s., 4 ng Sn g-1 s.s.) in tutti i campioni analizzati.
Nella Figura 6.2.4.2.1 è rappresentato l’andamento delle concentrazioni di TBT nei campioni di Mytilus
galloprovincialis nella campagna di dicembre 2008 (fase di cantiere) e nelle quattro campagne di fase di
bianco (valori medi per ogni stazione).
Capitolo 6 – Bioaccumulo
ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere 527
Variazioni temporali del TBT nei mitili
0
20
40
60
80
100
120
140
lug-
06
gen-
07
feb-
07
mar
-07
dic-
08
Data
ng S
n g-1 s
.s.
TC039 TC040 TC041 (controllo)
Figura 6.2.4.2.1: Concentrazioni di TBT in mitili. Stazioni TC039, TC040 e TC041 durante le quattro campagne di fase di bianco e durante la campagna di fase di cantiere del dicembre 2008. Valori espressi come ng Sn g-1 sul peso secco – fase di cantiere.
In ciascuna delle campagne confrontate, le concentrazioni di tributilstagno (TBT) rilevate nei mitili
sono risultate molto simili tra le due stazioni in vicinanza del Terminale (TC039 e TC040), mentre i
valori riscontrati nell’area di controllo (TC041) non hanno seguito lo stesso andamento. Rispetto ai
valori rilevati durate la fase di bianco, le concentrazioni di TBT nei campioni di dicembre 2008 risultano
significatamene più elevati sia nelle stazioni vicine al Terminale (132 ng Sn g-1 s.s.) sia nell’area di
controllo (104 ng Sn g-1 s.s.). Durante la fase di cantiere il dibutilstagno (DBT) è stato riscontrato in
tutti tre siti d’indagine, mentre durante la fase di bianco soltanto la stazione di controllo (TC041) in
marzo 2007 risultava inquinata da questo composto. Valori di concentrazione di DBT in dicembre 2008
(6 – 8 ng Sn g-1 s.s.) sono comunque comparabili con valore misurato durante l’ultima campagna della
fase di bianco (10 ng Sn g-1 s.s.)
In base al confronto tra le concentrazioni di composti organostannici nelle stazioni del Terminale
(TC039 e TC040) e nella stazione di controllo (TC041) rilevate durante la fase di cantiere e durante le
campagne di bianco, l’esistenza di differenze significative tra le due fasi del progetto indica che durante
attività di cantiere si è manifestato un accumulo di tributilstagno, e in misura ridotta di dibutilstagno, nei
mitili prelevati sia nell’area del Terminale sia nell’area di controllo a Portonovo.
Come è già stato osservato durante la fase di bianco, elevati valori di concentrazione di TBT durante i
mesi invernali possono essere causati da numerosi fattori, tra cui una minore degradazione dei composti
organostannici nella colonna d’acqua (bassa irradiazione solare e temperatura), e variazioni stagionali
nel metabolismo dei mitili, con un aumento del peso corporeo nel periodo primaverile-estivo, che
Capitolo 6 – Bioaccumulo
ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere 528
determina un effetto di diluizione delle concentrazioni dei composti organostannici, insieme a una più
attiva depurazione (Chandrinou et al., 2007), o anche variazioni nelle immissioni di contaminanti
nell’ambiente, tra cui una maggiore risospensione dei sedimenti.
Mentre le variazioni dei livelli di TBT osservate tra le quattro campagne della fase di bianco risultano
piuttosto limitate, con valori che rientrano comunque all’interno di un intervallo di concentrazioni
basse, relativamente a quanto riportato nella letteratura scientifica, nella fase di cantiere è stato
osservato un incremento da composti organostannici, non direttamente riconducibile all’attività di
cantiere del terminale in quanto i valori risultano paragonabili all’area di controllo. Non è da escludere
l’eventuale input di contaminazione determinato da apporti fluviali che potrebbe aver contribuito al
bioaccumulo di butilstannici nei mitili nel sito di controllo. Il bivalve Mytilus galloprovincialis è
ampiamente utilizzato nel biomonitoraggio dei composti organostannici. Alcuni studi pubblicati su
mitili provenienti dal bacino Adriatico riportano un ampio intervallo di concentrazioni, con valori di
TBT compresi tra 118 e 3456 ng Sn g-1 s.s. per aree marine costiere (Nemanic et al., 2002; Boscolo et al.,
2004) e tra 16 e 3290 ng Sn g-1 s.s. per ambienti lagunari, in particolare per la Laguna di Venezia (Binato
et al., 1998; Gallina et al., 2000; Bortoli et al., 2003; Boscolo et al., 2004; ARPAV, 2004). I livelli di TBT
determinati nei campioni di mitili dell’area di Terminale risultano comparabili con i valori citati e sono
indicativi di una situazione di contaminazione moderata.
La distribuzione relativa dei composti butilstannici determinati in Mytilus galloprovincialis mostra la
predominanza del TBT rispetto a DBT e MBT. La prevalenza del TBT sui prodotti di degradazione
segue l’andamento generalmente riscontrato negli studi pubblicati nella letteratura scientifica su questa
specie, a cui è attribuita una scarsa capacità di degradazione del TBT (Bortoli et al., 2003). Il DBT è
stato rilevato in tutti campioni analizzati durante la campagna di dicembre 2008, ma sempre con valori
poco superiori al limite di determinazione. Il rapporto TBT/DBT in tutte tre stazioni è tra 16,5 e 18,9
(sulla base delle concentrazioni espresse come Sn). La prevalenza del TBT rispetto agli altri composti
butilstannici può indicare sia la tipologia delle fonti di questi inquinanti nell’ambiente acquatico,
derivanti principalmente dall’impiego del TBT in vernici antivegetative, sia una presenza di immissioni
relativamente recenti nell’ambiente.
Nel complesso, quindi, sia le due stazioni dell’area del Terminale sia la stazione di controllo sono
risultate caratterizzate da un moderato grado di contaminazione di composti butilstannici.
Capitolo 6 – Bioaccumulo
ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere 529
6.2.5 Composti Organici Volatili (VOC)
Con la denominazione di Composti Organici Volatili (VOC) viene indicato un insieme di sostanze in
forma liquida o di vapore, con un punto di ebollizione che va da un limite inferiore di 50-100 °C a un
limite superiore di 240-260 °C. I composti che rientrano in questa categoria sono più di 300. La loro
presenza nell’aria è dovuta principalmente alla combustione incompleta dei combustibili fossili,
all’evaporazione di solventi e di carburanti ed alla combustione del materiale vegetale. Di questa
categoria fanno parte gli idrocarburi alogenati quali i derivati alogenati del metano e dell’etilene.
6.2.5.1 Materiali e metodi
Sono stati analizzati in campioni di organismo marino i seguenti composti volatili organoalogenati:
Cloroformio, Tetracloruro di Carbonio, Tricloroetilene, Bromodiclorometano, Tetracloroetilene,
Bromoformio.
I campioni di organismo sono stati campionati in vials di vetro ambrato da 40 ml del tipo “EPA
Washed” con tappo a vite e setto in Silicone/Teflon a tenuta, contenente ancoretta magnetica e pre-
pesati. La matrice organica prelevata in quantità corrispondente a circa 10 grammi, è stata sminuzzata
rapidamente, posta nel vial, immediatamente sigillata e congelata.
Prima della determinazione, i vials sono stati ripesati ed il contenuto calcolato per differenza.
L’estrazione è stata effettuata addizionando il campione di 10 ml di acqua bidistillata “organic free” e
sonicando per 30 minuti alla temperatura di 40°C. Il vial viene quindi posto in un autocampionatore per
acque e sedimenti modello 4552 accoppiato ad un Purge and Trap “Eclipse” modello 4660 entrambi
della OI Analytical.
Il metodo prevede lo strippaggio dei composti volatili dal campione di organismo insufflando nel vial
Elio ad elevato grado di purezza per 11 minuti e scaldando alla temperatura di 60 °C. I composti
vengono trasferiti in fase gassosa ed intrappolati su una trappola “trifasica” (tenax/sigel/carbosieve), da
dove vengono successivamente desorbiti a 190°C sotto flusso di Elio ed inviati, sempre sotto corrente
di Elio, in testa alla colonna gas-cromatografica .
Il Gas Cromatografo è un Agilent Technologies 6890N accoppiato ad un rivelatore a Spettrometria di
massa 5973.
Lo strumento e le condizioni gas-cromatografiche utilizzate sono state le seguenti:
colonna DB624, lunghezza 30 m, D.I. 0,25 mm, Film Thickness 1.4 µm; gas di trasporto Elio flusso
0.9 ml/min a flusso costante. Iniettore split/splitless in modalità split alla temperatura di 200°C.
Capitolo 6 – Bioaccumulo
ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere 530
Temperatura del forno: isoterma a 35°C per 4 min., quindi rampa di 15°C/min. fino ad arrivare alla
temperatura finale di 150°C a cui resta per 3 minuti.
Il rivelatore è uno Spettrometro di Massa in modalità SIM.
L’identificazione dei composti è stata effettuata mediante confronto dei tempi di ritenzione dei picchi
incogniti con quelli degli standard e mediante confronto delle abbondanze relative degli ioni.
La determinazione quantitativa è stata effettuata per interpolazione da una curva di calibrazione a 5
punti ottenuta da miscele standard a concentrazioni variabili, che hanno subito la stessa procedura dei
campioni.
Il limite di quantificazione del metodo è pari a 0,05 ng/g per ciascun composto.
6.2.5.2 Risultati
L’analisi dei composti organici volatili Cloroformio, Tetracloruro di Carbonio, Tricloroetilene,
Bromodiclorometano, Bromoclorometano, Dibromoclorometano, Tetracloroetilene e Bromoformio, è
stata effettuata su pool di mitili appartenenti alla specie Mytilus galloprovincialis.
Sono state analizzate per ciascuna stazione due repliche, con l’eccezione della stazione TC039, per la
quale è stato possibile analizzare una sola replica.
I risultati delle determinazioni analitiche dei composti organici volatili alogenati prelevati nel corso della
campagna di campionamento sono mostrati in tabella 6.2.5.2.1. I risultati sono espressi in ng/g di peso
umido.
Le determinazioni analitiche hanno fornito valori di concentrazione sempre al di sotto dei limiti di
quantificazione del metodo applicato, pari a 0,05 ng/g, con l’unica eccezione del tetracloroetilene e del
bromodiclorometano nel campione di mitilo prelevato nella stazione TC040 con un valore pari al limite
di quantificazione.
Capitolo 6 – Bioaccumulo
ISPRA (2012) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro – Fase di cantiere 531
Tabella 6.2.5.2.1: Concentrazione di composti organici volatili in Mytilus galloprovincialis – fase di cantiere - Dicembre 2008.
Nelle tabella 6.3.2.1 vengono riportati i risultati delle analisi microbiologiche effettuate in Mytilus
galloprovincialis nella fase di cantiere.
I risultati mostrano valori di concentrazione per i coliformi totali e fecali generalmente bassi o inferiori
al limite di quantificazione. Gli streptococchi fecali sono sempre al di sotto del limite di rilevabilità del
metodo. Non è stata registrata una contaminazione microbiologica da salmonella. Tabella 6.3.2.1: Risultati delle analisi microbiologiche in Mytilus galloprovincialis – fase di cantiere – Dicembre 2008.
Area Terminale – Mytilus galloprovincialis – Cantiere – Dicembre 2008