INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA SEGUNDO EXAMEN PARCIAL DE TECNOLOGÍA DE LA RECOMBINACIÓN GENÉTICA FECHA Y HORA DE APLICACIÓN: 26 ABRIL 2011, 10.00 FECHA Y HORA DE ENTREGA : 28 ABRIL 2011, 8.30 PROF. JESÚS AGUSTIN BADILLO CORONA NOMBRE: INSTRUCCIONES: Seguir la indicaciones y proporcionar la información solicitada de manera concisa y clara. El examen deberá ser devuelto impreso y únicamente con la información solicitada. 1. Proponer un gen que codifique para una proteína de interés biotecnológico o farmacéutico o ambiental. (valor 4 puntos) a. Indicar que base de datos utilizó NCBI b. Indicar el numero de acceso del gen NM_002273.3 c. Indicar el nombre del gen así como de la proteína para la cual codifica. /gene="KRT8" /gene_synonym="CARD2; CK8; CYK8; K2C8; K8; KO" /note="cytokeratin 8; CK-8; keratin-8; cytokeratin-8; type-II keratin Kb8" /codon_start=1 /product="keratin, type II cytoskeletal 8" /protein_id="NP_002264.1 ” d. Indicar a que organismo pertenece este gen ORGANISM Homo sapiens e. Comentar sobre la importancia biotecnológica o farmacéutica o ambiental de este gen. Este gen es miembro del tipo II de la familia queratina agrupado en el brazo largo del cromosoma 12. Las queratinas Tipo I y Tipo II se heteropolimerizan para formar filamentos de tamaño intermedio en el citoplasma de células epiteliales. El producto de este gen típicamente dimeriza con queratina 18 para formar filamentos intermediarios en simples células epiteliales de una sola capa. Esta proteína juega un papel in mantener la integridad de la estructura celular y también funciona en la transducción de señales además de la diferenciación celular. La mutacion en este gen causa cirrosis criptogénica. La cirrosis criptogénica constituye del 3-30% de todos los casos de cirrosis. Típicamente se diagnostica después de una evaluación
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Bioinformatica-Tecnologías de Recombinacion Genética.
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALUNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍASEGUNDO EXAMEN PARCIAL DE TECNOLOGÍA DE LA RECOMBINACIÓN GENÉTICAFECHA Y HORA DE APLICACIÓN: 26 ABRIL 2011, 10.00FECHA Y HORA DE ENTREGA : 28 ABRIL 2011, 8.30PROF. JESÚS AGUSTIN BADILLO CORONANOMBRE:INSTRUCCIONES: Seguir la indicaciones y proporcionar la información solicitada de manera concisa y clara. El examen deberá ser devuelto impreso y únicamente con la información solicitada.
1. Proponer un gen que codifique para una proteína de interés biotecnológico o farmacéutico o ambiental. (valor 4 puntos)
a. Indicar que base de datos utilizóNCBI
b. Indicar el numero de acceso del gen NM_002273.3
c. Indicar el nombre del gen así como de la proteína para la cual codifica. /gene="KRT8" /gene_synonym="CARD2; CK8; CYK8; K2C8; K8; KO" /note="cytokeratin 8; CK-8; keratin-8; cytokeratin-8; type-II keratin Kb8" /codon_start=1 /product="keratin, type II cytoskeletal 8" /protein_id="NP_002264.1”
d. Indicar a que organismo pertenece este genORGANISM Homo sapiens
e. Comentar sobre la importancia biotecnológica o farmacéutica o ambiental de este gen.
Este gen es miembro del tipo II de la familia queratina agrupado en el brazo largo del cromosoma 12. Las queratinas Tipo I y Tipo II se heteropolimerizan para formar filamentos de tamaño intermedio en el citoplasma de células epiteliales. El producto de este gen típicamente dimeriza con queratina 18 para formar filamentos intermediarios en simples células epiteliales de una sola capa. Esta proteína juega un papel in mantener la integridad de la estructura celular y también funciona en la transducción de señales además de la diferenciación celular. La mutacion en este gen causa cirrosis criptogénica. La cirrosis criptogénica constituye del 3-30% de todos los casos de cirrosis. Típicamente se diagnostica después de una evaluación exhaustiva que incluye diagnóstico serológico, para eliminar etiologías identificables y usualmente después de una biopsia hepática. Los principales factores de riesgo para cirrosis criptogénica son: esteatohepatitis no alcohólica (NASH), obesidad, diabetes e hiperlipidemia. Hay factores genéticos que podrían explicar la progresión de esteatosis a cirrosis. Los polimorfismos en genes que codifican citocinas, leptina, queratinas y proteínas del metabolismo de hierro, pueden explicar la susceptibilidad a desarrollar cirrosis.
Mostrar la secuencia del gen seleccionado en formato FASTA dejando la información que aparece después del símbolo > (en caso de que la secuencia sea muy larga, utilizar tamaño de
letra 5).
>gi|196162709|ref|NM_002273.3| Homo sapiens keratin 8 (KRT8), mRNAAAAAGGCCATTCCTGAGAGCTCTCCTCACCAAGAAGCAGCTTCTCCGCTCCTTCTAGGATCTCCGCCTGGTTCGGCCCGCCTGCCTCCACTCCTGCCTCTACCATGTCCATCAGGGTGACCCAGAAGTCCTACAAGGTGTCCACCTCTGGCCCCCGGGCCTTCAGCAGCCGCTCCTACACGAGTGGGCCCGGTTCCCGCATCAGCTCCTC
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALUNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍASEGUNDO EXAMEN PARCIAL DE TECNOLOGÍA DE LA RECOMBINACIÓN GENÉTICAFECHA Y HORA DE APLICACIÓN: 26 ABRIL 2011, 10.00FECHA Y HORA DE ENTREGA : 28 ABRIL 2011, 8.30PROF. JESÚS AGUSTIN BADILLO CORONAGAGCTTCTCCCGAGTGGGCAGCAGCAACTTTCGCGGTGGCCTGGGCGGCGGCTATGGTGGGGCCAGCGGCATGGGAGGCATCACCGCAGTTACGGTCAACCAGAGCCTGCTGAGCCCCCTTGTCCTGGAGGTGGACCCCAACATCCAGGCCGTGCGCACCCAGGAGAAGGAGCAGATCAAGACCCTCAACAACAAGTTTGCCTCCTTCATAGACAAGGTACGGTTCCTGGAGCAGCAGAACAAGATGCTGGAGACCAAGTGGAGCCTCCTGCAGCAGCAGAAGACGGCTCGAAGCAACATGGACAACATGTTCGAGAGCTACATCAACAACCTTAGGCGGCAGCTGGAGACTCTGGGCCAGGAGAAGCTGAAGCTGGAGGCGGAGCTTGGCAACATGCAGGGGCTGGTGGAGGACTTCAAGAACAAGTATGAGGATGAGATCAATAAGCGTACAGAGATGGAGAACGAATTTGTCCTCATCAAGAAGGATGTGGATGAAGCTTACATGAACAAGGTAGAGCTGGAGTCTCGCCTGGAAGGGCTGACCGACGAGATCAACTTCCTCAGGCAGCTATATGAAGAGGAGATCCGGGAGCTGCAGTCCCAGATCTCGGACACATCTGTGGTGCTGTCCATGGACAACAGCCGCTCCCTGGACATGGACAGCATCATTGCTGAGGTCAAGGCACAGTACGAGGATATTGCCAACCGCAGCCGGGCTGAGGCTGAGAGCATGTACCAGATCAAGTATGAGGAGCTGCAGAGCCTGGCTGGGAAGCACGGGGATGACCTGCGGCGCACAAAGACTGAGATCTCTGAGATGAACCGGAACATCAGCCGGCTCCAGGCTGAGATTGAGGGCCTCAAAGGCCAGAGGGCTTCCCTGGAGGCCGCCATTGCAGATGCCGAGCAGCGTGGAGAGCTGGCCATTAAGGATGCCAACGCCAAGTTGTCCGAGCTGGAGGCCGCCCTGCAGCGGGCCAAGCAGGACATGGCGCGGCAGCTGCGTGAGTACCAGGAGCTGATGAACGTCAAGCTGGCCCTGGACATCGAGATCGCCACCTACAGGAAGCTGCTGGAGGGCGAGGAGAGCCGGCTGGAGTCTGGGATGCAGAACATGAGTATTCATACGAAGACCACCAGCGGCTATGCAGGTGGTCTGAGCTCGGCCTATGGGGGCCTCACAAGCCCCGGCCTCAGCTACAGCCTGGGCTCCAGCTTTGGCTCTGGCGCGGGCTCCAGCTCCTTCAGCCGCACCAGCTCCTCCAGGGCCGTGGTTGTGAAGAAGATCGAGACACGTGATGGGAAGCTGGTGTCTGAGTCCTCTGACGTCCTGCCCAAGTGAACAGCTGCGGCAGCCCCTCCCAGCCTACCCCTCCTGCGCTGCCCCAGAGCCTGGGAAGGAGGCCGCTATGCAGGGTAGCACTGGGAACAGGAGACCCACCTGAGGCTCAGCCCTAGCCCTCAGCCCACCTGGGGAGTTTACTACCTGGGGACCCCCCTTGCCCATGCCTCCAGCTACAAAACAATTCAATTGCTTTTTTTTTTTGGTCCAAAATAAAACCTCAGCTAGCTCTGCCAATGTCAAAAAA
f. En caso de que el gen seleccionado tenga intrones, removerlos y mostrar la secuencia ya sin intrones (en caso de que la secuencia sea muy larga, utilizar tamaño de letra 5).
mol_type="mRNA"
g. Mostrar la secuencia de la proteína
>gi|4504919|ref|NP_002264.1| keratin, type II cytoskeletal 8 [Homo sapiens]MSIRVTQKSYKVSTSGPRAFSSRSYTSGPGSRISSSSFSRVGSSNFRGGLGGGYGGASGMGGITAVTVNQSLLSPLVLEVDPNIQAVRTQEKEQIKTLNNKFASFIDKVRFLEQQNKMLETKWSLLQQQKTARSNMDNMFESYINNLRRQLETLGQEKLKLEAELGNMQGLVEDFKNKYEDEINKRTEMENEFVLIKKDVDEAYMNKVELESRLEGLTDEINFLRQLYEEEIRELQSQISDTSVVLSMDNSRSLDMDSIIAEVKAQYEDIANRSRAEAESMYQIKYEELQSLAGKHGDDLRRTKTEISEMNRNISRLQAEIEGLKGQRASLEAAIADAEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQDMARQLREYQELMNVKLALDIEIATYRKLLEGEESRLESGMQNMSIHTKTTSGYA
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2. Utilizando el vector pET28a (ver mapa anexo) resolver y responder a los siguientes puntos tomando en cuenta el gen seleccionado en el punto 1. (valor 4 puntos)
a. Proponer un par de sitios de restricción en el polilinker para insertar el gen seleccionado en el punto 1. Proporcionar el nombre y la secuencia de los sitios de restricción.
BamHI y EagIb. ¿Dónde son cortados los sitios seleccionados en 2a y que tipo de extremos se
generan?
BamHI5’… G G A T C C … 3’3’… C C T A G G … 5’
“Sticky Ends”
EagI
5'...C G G C C G... 3'3'...G C C G G C... 5'
“Sticky Ends”
c. Verificar que estos sitios de restricción no estén presentes en el gen seleccionado en el punto 1. Mostrar los resultados obtenidos al digerir el gen en el digestor de la página de New England Biolabs (http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php) de que estas enzimas no cortan. En caso de que corten, volver al punto 2a y proponer otros sitios de corte.
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110 TsoI TARCCA(N)9 NN
111 TspGWI ACGGA(N)9 NN
112 TsuI GCGAC
113 Tth111I GACN N NGTC
114 UbaF14I CCA(N)5TCG
115 UbaF9I TAC(N)5RTGT
116 UbaPI CGAACG
117 XbaI T CTAG A
118 XmnI GAANN NNTTC
d. Diseñar un PAR de iniciadores (primers) para amplificar por PCR el gen seleccionado en 1. Mostrar solo el PAR de iniciadores seleccionados.
e. ¿Qué condiciones de temperatura y tiempos se necesitan para amplificar un producto de PCR con los primers diseñados?
Temperatura de entre 60.05 y 59.38 °C.Tiempo 1.802 minutos
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f. Mostrar la secuencia del producto de PCR amplificado.
g. ¿Cómo cambiarían estos iniciadores si se quisiera introducir los sitios de restricción seleccionados en 2a?
BamHIG GATC C Forward primer GCAGCAACTTTCGCGGTGGC +
G GATC C Reverse primer GGAGGGGTAGGCTGGGAGGG
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EagI C GGCC G Forward primer GCAGCAACTTTCGCGGTGGC +
C GGCC G Reverse primer GGAGGGGTAGGCTGGGAGGG
h. ¿sobre que antibiótico se deberán crecer las células a las que se les introduce el vector pET28a?
Kanamicina.
i. ¿cuál es el origen del promotor T7? ¿cómo es que este promotor es funcional en bacteria? ¿la polimerasa de origen bacteriano reconoce este promotor? Si no es así, que polimerasa lo reconoce?
El Origen del Promotor T7 es VIRAL. El promotor del fago T7 necesita la ARN polimerasa específica del mismo fago, por lo que si queremos expresar genes bajo ese promotor, hay que clonar simultáneamente el gen de la polimerasa de T7. Normalmente este gen de la polimerasa se inserta en el cromosoma de E. coli o en el profago (la versión insertada del cromosoma del en las células lisogénicas) y bajo el control del promotor de lac. Entonces se procede a transformar las células con la construcción genética dotada del gen de interés aguas abajo del promotor del T7. Cuando añadimos el inductor IPTG, se induce el gen de la polimerasa de T7, proteína que transcribe a gran nivel el gen que hemos clonado.
3. Utilizando la siguiente secuencia (valor 2 puntos):Seq1. ATGTTCCATTTGACAAGCAGAGATGGGGAACCAAGAATGATAGTGGGAAAGAATGAGAGAGGTAAGTCACTTCTGTTTAAAACTGCAAGTGGAATTAATATGTGCACACTGATTGCAATGGATCTAGGGGAGATGTGTGATGATACAGTAACTTACAAGTGTCCTCATATTACAGAGGTTGAACCAGAAGATATAGACTGCTGGTGCAATTTGACCTCAACTTGGGTAACTTATGGCACTTGCAATCAAGCCGGTGAGCATAGAAGGGATAAGCGTAGCGTGGCATTGGCCCCTCATGTCGGCATGGGACTTGACACTCGAACTCAGACTTGGTAA
a. Realizar un Blast en el NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome) e indicar de que gen se trata.
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b. Utilizando la secuencia seq1 y seq2 (proporcionada en este punto), realizar un alineamiento pairwise (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_matcher/nucleotide.html) de las dos secuencias utilizando las herramientas disponibles en Expasy. Mostrar el alineamiento y resaltar las diferencias. ¿Cuál es el porcentaje de identidad?
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