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1INTRODUCCION A LA BIOLOGIA
CELULAR Y MOLECULAR
Replicacin, reparacin y
recombinacin de ADN
Empaquetamiento del ADN
Cada molcula de ADN se empaqueta en un cromosoma
El total de informacin gentica contenida en los cromosomas de un
organismoconstituye su genoma.
El genoma de E. Coli est formado por 4.7 x 106 pares de bases,
en una nicamolcula de ADN de doble hlice (un cromosoma).
El genoma humano est formado por 3 x 109 pares de bases, en 24
cromosomas(22 autosomas y 2 cromosomas sexuales diferentes), es
decir est formado por24 molculas de ADN distintas, cada una de las
cuales contiene entre 50 x 106 y250 x 106 pares de bases.
En los organismos diploides, existen dos copias de cada tipo de
cromosoma, unoheredado de la madre y otro del padre (con la
excepcin de los cromosomassexuales en los machos, en los que el
cromosoma Y procede del padre y el X dela madre). As una clula
humana tpica presenta contiene 46 cromosomas y 6 x109 pares de
bases.
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2Divisin celular
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3Cariotipo humano
Cada molcula de ADN que forma un cromosoma ha de contenerun
centrmero, dos telmeros y varios orgenes de replicacin
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4El ADN de todos los cromosomas se encuentra empaquetado en una
estructuramuy compacta con la ayuda de protenas especficas.
Las protenas de los eucariotas que se unen al ADN se clasifican
en dos grupos:las histonas y las protenas cromosmicas
no-histonas.
El complejo formado por el ADN cromosmico y las dos clases de
protenas sedenomina cromatina.
Las histonas son protenas relativamente pequeas, con una
proporcin muyelevada de aminocidos cargados positivamente (Lisina y
Arginina). La cargapositiva ayuda a las histonas a unirse
firmemente al ADN, el cual est cargadonegativamente,
independientemente de su secuencia de nucletidos. Es probableque
las histonas no se disocien del ADN; influiran sobre cualquier
reaccin queocurriese en los cromosomas.
Los cinco tipos de histonas de las clulas eucariotas se
clasifican en dos gruposprincipales: las histonas nucleosmicas y
las histonas H1. Las histonasnucleosmicas (H2A, H2B, H3 y H4) son
pequeas protenas (102-135 aa)responsables del plegado del ADN en
los nucleosomas. Las histonas H1 son demayor tamao (220 aa) y han
sido menos conservadas evolutivamente que lashistonas
nucleosmicas.
La asociacin de las histonas con el ADN conduce a laformacin de
los nucleosomas, las partculas unitariasde la cromatina
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5Cada nucleosoma est compuesto 8 histonas nucleosmicas
(eloctmero de histonas). La partcula tiene una forma de disco, con
undimetro de alrededor de 11 nm y contiene dos copias de cada una
delas cuatro histonas nucleosmicas (H2A, H2B, H3 y H4). Este
octmerode histonas forma un ncleo proteico alrededor del cual la
hlice de ADNde doble cadena da dos vueltas.
El nucleosoma est formado por dos vueltascompletas de ADN (83 pb
por vuelta)alrededor de un ncleo octamrico dehistonas ms el ADN
separador adyacente.La parte del nucleosoma que se denominacuenta
contiene alrededor de 146 pb(alrededor de 1.8 vueltas) luego de
serdigerido por una DNAasa.
Existen zonas del ADN que se encuentranlibres de nucleosomas por
accin deprotenas de regulacin gnica.
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6Generalmente los nucleosomasse empaquetan con la histonaH1
formando estructurasregulares de orden superior
Las molculas de histona H1 son responsables del empaquetamiento
de losnucleosomas formando la estructura de la fibra de 30 nm. En
la molcula de lahistona H1 se puede diferenciar una regin globular
central, muy conservadaevolutivamente, unida a los brazos amino y
carboxilo terminales, menosconservados.
Cada molcula de H1 se une a travs de su regin globular a un
lugar nico delnucleosoma, mientras que los brazos entran en
contacto con otros lugares de lashistonas del ncleo o de los
nucleosomas adyacentes, permitiendo que seempaqueten de forma
repetida regularmente.
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7Desde el eje del cromosoma seextienden grandes bucles
decromatina descondensada.
Los cromosomas plumuladosson un buen ejemplo de unacaracterstica
recurrente de lacromatina: cuando lacromatina se
transcribeactivamente se encuentra enuna estructura
extendida,cuando est condensada esinactiva.
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8Algunos experimentos indican que la cromatina activa es
bioqumicamentediferente:
1- La histona H1 se une con menor fuerza a la cromatina
activa.
2- Las histonas de la cromatina activa presentan mayor grado de
acetilacin
3- La histona H2B parece estar menos fosforilada en la cromatina
inactiva
4- La cromatina activa se encuentra enriquecida en una forma
variante menor dela histona H2A
5- Los nucleosomas de la cromatina activa se unen selectivamente
a dospequeas protenas cromosmicas similares, denominadas HMG 14 y
HMG 17.
Heterocromatina: altamentecondensada, 10% del genomase encuentra
empaquetado bajoesta forma
Cromatina
Eucromatina:
Eucromatina activa:10% del genoma, es laforma de cromatinamenos
condensada
Eucromatina inactiva:80% del genoma, seencuentra mscondensada
que laeucromatina activapero menos que laheterocromatina
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9Los cromosomas mitticos estnformados por cromatina en suforma
ms condensada
Video
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El conjunto de los 46 cromosomas humanos enmitosis se denomina
cariotipo. Tincin deGiemsa para bandas G (A-T).
cidos nucleicos
Una cadena de ADN es un largopolmero no ramificado,
compuestonicamente por cuatro tipos desubunidades. Estas
subunidades sonlos desoxirribonucletidos quecontienen las bases
adenina (A),citosina (C), guanina (G) y timina (T).
Los nucletidos est unidos porenlaces covalentes fosfodister
entre elcarbono 5 de un grupo desoxirribosay el carbono 3 del
siguiente.
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La molcula de ADN es un polmero helicoidalformado por dos
hebras.
Todas las bases nitrogenadas de la molcula deADN se hallan en el
interior de la doble hlice,mientras que la regin azucar fosfato se
disponeen el exterior de la misma.
Las bases nitrogenadas se aparean entre A y T porun lado y entre
C y G por otro.
Cada nucletiido, A, T, C, o G, puede serconsiderado como una
letra de un alfabetosencillo de cuatro letras que es utilizadopara
escribir los mensajes biolgicos enforma lineal. Los organismos se
diferencianentre s porque sus respectivas molculasde ADN poseen
diferentes secuencias denucletidos, y por consiguiente,
diferentesmensajes biolgicos.
Como consecuencia directa delmecanismo de apreamiento de
bases,resulta evidente que el ADN contieneinformacin gracias a la
secuencia linealde sus nucletidos.
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El nmero de posibles secuenciasdiferentes en una cadena de DNA
de nnucletidos es de 4n. La variedad biolgicaque se puede generar
utilizando unamodesta longitud de ADN es enorme. Unaclula animal
tpica contiene un metro deADN (3 x 109 nucletidos).
La informacin gentica existente en unaclula humana permitira
llenar un libro dems de 500.000 pginas.
La enzima DNA polimerasa cataliza laadicin de un
desoxirribonucletido alextremo 3 de una cadena de ADN.
Cadanucletido aadido a la cadena es, enrealidad, un
desoxirribonuclesidotrifosfato, la liberacin del pirofosfato deeste
nucletido activado y su hidrlisisposterior proporcionan la energa
para lareaccin de replicacin del ADN,convirtindola de forma
efectiva en unareaccin irreversible.
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La replicacin semiconservativa delADN. En cada ciclo de
replicacin, cada unade las dos hebras de ADN son utilizadascomo
patrn para la formacin de una hebracomplementaria de ADN. Por lo
tanto, lashebras originales permanecen inalteradas a lolargo de
muchas generaciones celulares.
Mecanismos de replicacin del ADN
La replicacin del ADN supone unasvelocidades de polimerizacin
deaproximadamente 500 nucletidos porsegundo en las bacterias y de
unos 50nucletidos por segundo en los mamferos.Las enzimas de
replicacin son exactas yrpidas para cumplir con este proceso.
La rapidez y la exactitud se consiguenmediante un complejo
multienzimtico devarias protenas que dirige el proceso yconstituye
una complicada mquina dereplicacin.
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En la horquilla de replicacin se sintetiza el ADN de las dos
hliceshijas mediante un complejo multienzimtico que contiene la
DNApolimerasa.
Nunca se ha encontrado una DNA polimerasa que acteen direccin 3a
5.
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Las horquillas de replicacin se inician en el origen dela
replicacin. En las bacterias, levaduras y en variostipos de virus,
las burbujas de replicacin se generanen secuencias especiales del
ADN que reciben elnombre de orgenes de replicacin. Estos
puedentener una longitud de 300 nucletidos.
Una horquilla de replicacin tiene una estructura asimtrica.La
cadena hija de ADN que se sintetiza de manera continua recibe
elnombre de cadena conductora y se sintetiza antes que la
cadenahija que se sintetiza en forma discontinua y recibe el nombre
decadena retrasada.
La sntesis de la cadena retrasada es ms lenta debido a que
debeesperar a que la cadena conductora exponga la cadena patrn
sobrela que se sintetizar cada uno de los fragmentos de
Okazaki.
La sntesis de la cadena conductora mediante un
mecanismodiscontinuo de punto hacia atrs significa que para la
replicacindel ADN nicamente se necesite la DNA polimerasa.
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En la horquilla retrasada la DNA primasautiliza ribonuclesidos
trifosfato para sintetizarcebadores de aproximadamente 10nucletidos
de longitud en eucariotes.
La sntesis de cada fragmento de Okasakiacaba cuando la DNA
polimerasa se encuentracon el RNA cebador unido al extremo 5
delfragmento anterior de DNA.
Un sistema especial de reparacin del ADNacta para eliminar el
ARN cebador y losubstituye por ADN. Posteriormente la ligasaune el
extremo 3 de cada fragmento de ADNcon el extremo 5 del fragmento
anterior.
Reaccin catalizada por la DNA ligasa. Esta enzima suelda un
enlacefosfodister roto. La DNA ligasa utiliza una molcula de ATP
para activar elextremo 5 de la muesca (paso 1) antes de formar el
nuevo enlace (paso 2). Deesta forma, la reaccin energticamente
desfavorable de soldadura de lamuesca est desplazada por el proceso
energticamente favorable de lahidrlisis de ATP.
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Mltiples copias de unasprotenas iniciadoras se unen alugares
especficos del origen dereplicacin enrollando el ADN asu alrededor
y formando un grancomplejo ADN-protena. Luego,este complejo une la
DNAhelicasa y la coloca sobre unazona de ADN de una sola cadenaen
una regin adyacente a lahlice.
Para la replicacin de E. Coli , laprotena de iniciacin es
laprotena dnaA y el primosomaest compuesto por lasprotenas dnaB
(DNA helicasa) ydnaG (RNA primasa)
Para abrir la doble hlice y poner al descubierto lacadena patrn
del ADN que ser copiada por laDNA polimerasa, son necesarias
protenasadicionales. Dos tipos de protenas de replicacincontribuyen
con este proceso: las DNA helicasas ylas protenas de unin al DNA
monocatenario(SSB).
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Las protena SSB se unen a cadenas abiertas, sin recubrir las
basesde la cadena. Colaboran con las helicasas estabilizando
laconformacin desenrollada de las cadenas sencillas.
Su unin cooperativa recubre completamente las regiones de ADN
decadena sencilla de la cadena retrasada previniendo as la
formacinde cortas hlices en forma de horquilla que impediran la
funcin dela DNA polimerasa.
La molcula de DNA polimerasa se mantiene unida al DNA medianteun
anillo deslizante. Esta protena forma una amplio anillo alrededorde
la hlice de ADN. Un lado del anillo se une a la DNA polimerasa, yel
anilllo completo se desliza libremente a medida que la polimerasase
desplaza a lo largo de la cadena de ADN. El ensamblaje de
laabrazadera alrededor del ADN requiere hidrlisis de ATP por
protenasaccesorias que se unen a la abrazadera y al ADN.
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Protenas de la horquilla de replicacin
La molculas de primasa se une directamente a la DNA
helicasa,formando una unidad denominada primosoma.
Las protenas de replicacin se mantienen unidas entre s formando
unagran unidad (masa total > 106 daltons) que se desplaza
rpidamente a lolargo del ADN, permitiendo la sntesis de ADN en las
dos direcciones de lahorquilla de una forma coordinada y
eficiente.
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Las DNA topoisomerasa evitan que el ADN se enrede durante la
replicacin
Cada 10 pares de bases replicadas en lahorquilla corresponden a
una vuelta completadel ADN que se replica alrededor del eje de
ladoble hlice. Por consiguiente, para que lahorquilla de replicacin
pueda desplazarse, todoel cromosoma que se halla por delante de
lahorquilla tendra que girar rpidamente.
Durante la replicacin del ADN se utiliza unaestrategia
alternativa que utiliza unas protenasconocidas como DNA
topoisomerasas queforman un eslabn giratorio en la hlice de
ADN.
La DNA topoisomerasa es una especie de nucleasareversible que se
une covalentemente a un fosfatodel ADN rompiendo un enlace
fosfodister de unacadena de ADN.
La topoisomera 1 genera una rotura en una solacadena (nick) que
permite a las dos secciones de lahlice del ADN a cada lado de la
muesca girarlibremente una respecto a otra utilizando como lugarde
giro el enlace fosfodister de la cadena opuesta ala que se ha
producido la muesca.
Cualquier tensin que se genere en la hlice de ADNdirigir la
rotacin en la direccin en la que estatensin se disipe.
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La topoisomerasa II forma una unin covalentecon ambas cadenas de
la hlice de ADN al mismotiempo, generando transitoriamente una
rotura enlas cadenas de ADN.
Estas enzimas se activan por determinadas zonasdel cromosoma en
la que dos hlices se cruzanentre s.
La reaccin de la Topo II evita que se generen losgraves
problemas de embrollamiento, que de otraforma, apareceran durante
la replicacin delADN.
El fsico Erwin Schroedinger seal en 1945 que, fuese cual fuesela
naturaleza qumica del material hereditario (desconocida enaquel
momento), un gen tena que ser extremadamente pequeo yestar formado
de pocos tomos. En caso contrario, el elevadonmero de genes
necesarios para generar un organismo no cabraen el ncleo celular.
Por otro lado, y debido a su reducido tamao,caba esperar que un gen
sufriera importantes cambios comoconsecuencia de reacciones
espontneas inducidas por colisionestrmicas aleatorias con molculas
del disolvente.
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Mecanismos de reparacin del ADN
El ADN sufre importantes cambios debido a fluctuaciones trmicas.
Cadada se pierden unas 5000 bases pricas (adenina y guanina) debido
a ladestruccin trmica de enlaces N-glucosdicos entre estas bases y
ladesoxirribosa (despurinacin). Anlogamente, se estima que
ladesaminacin de citosina a uracilo en el ADN se produce a una
velocidadde 100 cambios por genoma/da.
Desaminacin de nucletidos deADN. En el ADN de vertebrados
unescaso porcentaje de losnucletidos C estn metilados, locual
contribuye al control de laexpresin gnica. Cuando estos 5-metil
nucletidos C se desaminanaccidentalmente, forman T. Esta Tse
aparear con una G de lacadena opuesta, formando un parde bases
equivocado.
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Resumen de las alteraciones espontneas que requierenreparacin
del ADN. Se indican los lugares de cadanucletido que se sabe se
modifican por oxidacinespontnea (flechas rojas), ataque hidroltico
(flechasazules), o metilacin descontrolada por el dador degrupos
metilo S-adenosil metionina (flechas verdes), lafrecuencia de cada
proceso se indica por el grosor de cadaflecha.
Detalle de la estructura de un dmero de timina, untipo de
alteracin generado por la exposicin a laradiacin ultravioleta (como
la luz solar). Se puedeformar un dmero similar entre dos bases
depirimidina vecinas cualesquiera (residuos C o T) delADN.
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MELANINA
Sntesis de melanina
240 400 nm
290 320
UV-AUV-BUV-C
Estructura de la melanina
Melanina
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Radiacin UV-B (290-320 nm)
Noviembre Diciembre Enero
La exposicin de ratas a la radiacin UV-B genera la aparicin de
tumores slidosAngel H Roffo 1934.
Cancer et. Soleil. Carcinomes et sarcomes provoqu par lction du
soleil in toto Bull Assoc Fra tude Cancer
Angel H. Roffo
El primer trabajo que puso el acento sobre la correlacin entre
la exposicin solar y la mortalidad a causa de melanoma fue
publicado por Lancaster et al. en 1956.
Some geographical aspects of the mortality from melanoma in
Europeans. Med J Aust
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ADN y UV
Reparacin del ADN
Uno de cada mil cambios accidentales de las basesdel ADN
provocan una mutacin. Para conservar estefenmeno, existe una amplia
variedad demecanismos de reparacin del ADN, cada uno deellos
catalizados por un conjunto de enzimasdiferentes.
El proceso bsico consta de tres etapas:
1-La porcin alterada de la cadena es reconocida yeliminada por
nucleasas de reparacin del ADN, quehidrolizan los enlaces
fosfodister alterados. Estoproduce un hueco en la regin de la hlice
de ADN.
2-La DNA polimerasa se une al extremo 3-OH de lacadena cortada
de ADN y coloca nucletidosutilizando la informacin correcta de la
cadenapatrn.
3- La DNA ligasa suelda la cadena completando elproceso.
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Las alteraciones del ADN son eliminadas por ms de una va
Las enzimas involucradas en el proceso de reparacin del ADN
dependen del tipo dealteracin que se trate.
-La despurinacin, la lesin ms frecuente de las que tienen lugar
en el DNA, produceuna azucar desoxirribosa que ha perdido su base.
Este azcar es rpidamentereconocido por la enzima AP endonucleasa,
la cual corta el enlace fosfodister dellado 5del lugar alterado.
Luego de la escisin de una residuo azcar-fosfato por unaenzima
fosfodiesterasa, se recupera la secuencia de DNA inalterada
mediante la accinde una DNA polimerasa y una DNA ligasa.
-Una ruta de reparacin relacionada, denominada reparacin por
eliminacin de bases,implica la actuacin de una batera de enzimas
diferentes llamadas DNA glucosilasas.Cada DNA glucosilasa reconoce
a un tipo de base de ADN alterada y cataliza laeliminacin
hidroltica de la base. Posteriormente el sistema AP reconoce el
azucar-fosfato y lo elimina por el sistema antes mencionado.
Existen como mnimo seis tipos de estas enzimas, entre las que se
encuentran las queeliminan C desaminadas, A desaminadas, diferentes
tipo de bases alquiladas u oxidadas,bases con anillos abiertos, y
bases en las que un enlace doble carbono-carbono se haconvertido un
enlace simple carbono-carbono
La DNA polimerasa acta como una enzima autocorrectora que
elimina sus propios errores de polimerizacin a medida que avanza
por el ADN.
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El elevado grado de fidelidad del mecanismo de replicacin delADN
requiere la existencia de un mecanismo de correccin degaleradas o
verificacin de lectura.
A diferencia de las RNA polimerasas, las DNA polimerasas no
inicianuna nueva cadena de nucletidos uniendo entre s dos
nucletidostrifosfato: necesitan de forma absoluta la presencia de
un extremo3-OH de una cadena cebadora sobre la que aadir los
nucletidossiguientes.
Las molculas de ADN que presentan errores de apareamiento (ocon
la falta de algn apareamiento), de nucletidos en el extremo3-OH de
la cadena cebadora no son efectivas como cadenapatrn.
Las molculas de DNA polimerasa son capaces de trabajar
concadenas de ADN defectuosas de este tipo mediante la utilizacin
deuna subunidad o dominio cataltico que corta cualquier
residuodesapareado del final de la cadena cebadora.
El proceso de corte mediante esta actividad
correctoraexonucleasa 3a 5 contina hasta que se ha eliminado
elnmero de nucletidos necesarios del extremo 3 como pararegenerar
un extremo con bases apareadas que pueda cebar lasntesis de
ADN.
Comparacin entre los dos principales sistemas de reparacin del
ADN
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Recombinacin gentica
Una propiedad importante del ADN en las clulas,es su capacidad
de experimentar reordenacionesque pueden hacer variar tanto las
combinacionesparticulares de genes que se hallan presentes enel
genoma de cualquier individuo como elprograma y el nivel de
expresin de estos genes.Estas reordenaciones de ADN estn
generadasmediante la recombinacin gentica.
Se conocen dos grandes tipos de procesos derecombinacin gentica:
la recombinacin generaly la recombinacin especfica.
En la recombinacin general, el intercambiognico se produce entre
secuencias homlogasdel ADN, generalmente localizadas sobre
doscopias del mismo cromosoma.
Unin heteroduplex. Esta estructura junta dosmolculas de ADN en
el lugar donde se hanentrecruzado. Este tipo de unin
presentageneralmente varios cientos de nucletidos delongitud.
En el lugar de intercambio no se altera lasecuencia de
nucletidos, el proceso de roturay unin ocurre de una forma tan
precisa, queni se pierde ni se gana un solo nucletido.
A pesar de esta precisin, la recombinacingeneral crea molculas
de ADN cuyasecuencia es nueva. El mecanismo derecombinacin general
asegura que slo seproduzcan intercambios entre dos regiones dedoble
hlice de ADN que presenten secuenciasnotablemente homlogas.
El proceso de reconocimiento ocurre medianteinteracciones
directas de apareamiento debases.
A pesar de la precisin del proceso, se generanporciones de ADN
cuya secuencia es nueva: launin heterodplex puede contener unpequeo
nmero de errores en elapareamiento de bases, y lo que es
msimportante, habitualmente los dos DNA que seentrecruzan no son
exactamente el mismo acada lado de la unin.
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La recombinacin especfica de lugar no se produce nicamente entre
ADNhomlogo. Por el contrario, el intercambio se produce entre
cortassecuencias de nucletidos (sobre una o ambas molculas de ADN
queparticipan) reconocidas especficamente por una enzima de
recombinacinespecfica de lugar. La recombinacin especfica de lugar
altera las posicionesrelativas de las secuencias de nucletidos en
los genomas.
En la recombinacin conservativa especfica de lugar, enzimas
derecombinacin especfica de lugar ponen y quitan del
genomasecuencias especiales de ADN
-La recombinacin gentica especfica delugar est guiada por una
enzima derecombinacin que reconoce secuenciasespecficas de
nucletidos presentes en unao en ambas molculas de ADN que
serecombinan.
-Separando y volviendo a unir molculas deADN de doble hebra en
lugaresdeterminados, este tipo de recombinacinpermite que varios
tipos de secuencias deADN se desplacen dentro y entrecromosomas. Se
forma una pequea reginheteroduplex de 6-7 pares de bases.
-El mismo sistema enzimtico que une dosmolculas de ADN tambin
puede separarlasde nuevo, recuperando de forma precisa lasecuencia
de ambas molculas originales deADN. No se modifica la
secuencianucleotdica.
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Recombinacin transposicional especfica de lugar. La
recombinacintransposicional pude insertar un elemento gentico mvil
en cualquiersecuencia de ADN
Muchas secuenciasmviles de ADN,incluyendo virus
yelementostransponibles, codificanintegrasas que insertansu ADN en
uncromosoma a travs deun mecanismodiferente del que utilizael
bacterifago lambda.
Estas integrasas no requieren secuencias especficas en el ADN y
no forman ninguna uninheteroduplex.
Introducen cortes en ambos extremos de la secuencia lineal del
ADN del elemento genticomvil y catalizan un ataque directo de estos
extremos de ADN sobre la molcula de ADNdiana, rompiendo dos enlaces
fosfodister cercanos de la molcula diana.
Debido a la forma de estos cortes quedan huecos a ambos lados
que son rellenados por laDNA polimerasa generndose una corta
duplicacin de la secuencia del ADN diana adyacente
Representatividad en el genoma humano de los distintos elementos
gnicos
Tipos de transposones
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