Biochémia Biochémia nukleových nukleových kyselín kyselín I I Mechanizmus Mechanizmus transkripcie transkripcie DNA DNA P5 P5 Peter Javorský Peter Javorský email: email: javorsky javorsky@saske saske. sk sk http://www2. http://www2. saske saske. sk sk/ javorsky javorsky Ústav fyziológie hospodárskych zvierat SAV, Košice Ústav fyziológie hospodárskych zvierat SAV, Košice Transkripcia Transkripcia prokaryotickej prokaryotickej DNA DNA V V prokaryotických prokaryotických bunkách je proces transkripcie a bunkách je proces transkripcie a translácie translácie úzko prepojený. úzko prepojený.
12
Embed
Biochémia nukleových kyselín I - home.saske.skhome.saske.sk/~javorsky/pdf/Prednasky/P5-UVL.pdf · RNA-polymeráza katalyzuje prepis všetkých primárnych transkriptov vo forme
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
BiochémiaBiochémia nukleových nukleových kyselínkyselín II
V V prokaryotickýchprokaryotických bunkách je proces transkripcie a bunkách je proces transkripcie a translácietranslácieúzko prepojený. úzko prepojený.
Transkripcia bakteriálneho Transkripcia bakteriálneho genómugenómuprenos genetickej informácie zprenos genetickej informácie z DNA (chromozómovej, DNA (chromozómovej, plazmidovejplazmidovej) do RNA) do RNA
na rozdiel od na rozdiel od DNADNA--primázyprimázy, ktorá , ktorá katalyzujekatalyzuje pri pri replikáciireplikácii syntézu krátkych reťazcov syntézu krátkych reťazcov RNA vRNA v závislosti na závislosti na primozómeprimozóme, , RNARNA--polymerázapolymeráza katalyzujekatalyzuje syntézu dlhých syntézu dlhých
primárnych reťazcov RNA (primárnych primárnych reťazcov RNA (primárnych transkriptovtranskriptov vo forme transkripčných jednotiek) vo forme transkripčných jednotiek) na matrici DNA a viaže sa na promótorna matrici DNA a viaže sa na promótor
mediátorovámediátorová ribonukleová kyselina (ribonukleová kyselina (mRNAmRNA): ): nesienesie prepisprepis štrukturálnychštrukturálnych génovgénov a a slúžislúži akoako matricamatrica prepre syntézu syntézu polypeptidovéhopolypeptidového reťazcareťazca na na ribozómochribozómoch (u baktérií (u baktérií primárnyprimárny transkripttranskript nepodliehanepodlieha posttranskripčnejposttranskripčnej modifikáciimodifikácii))
prekurzorováprekurzorová ribozómováribozómová ribonukleová kyselina (ribonukleová kyselina (prepre--rRNArRNA): ): primárnyprimárny transkripttranskriptgénovgénov prepre rôznerôzne typy typy rRNArRNA
Transkripcia bakteriálneho Transkripcia bakteriálneho genómugenómuprenos genetickej informácie zprenos genetickej informácie z DNA (chromozómovej, DNA (chromozómovej, plazmidovejplazmidovej) do RNA) do RNA
na rozdiel od na rozdiel od DNADNA--primázyprimázy, ktorá , ktorá katalyzujekatalyzuje pri pri replikáciireplikácii syntézu krátkych reťazcov syntézu krátkych reťazcov RNA vRNA v závislosti na závislosti na primozómeprimozóme, , RNARNA--polymerázapolymeráza katalyzujekatalyzuje syntézu dlhých syntézu dlhých
primárnych reťazcov RNA (primárnych primárnych reťazcov RNA (primárnych transkriptovtranskriptov vo forme transkripčných jednotiek) vo forme transkripčných jednotiek) na matrici DNA a viaže sa na promótorna matrici DNA a viaže sa na promótor
mediátorovámediátorová ribonukleová kyselina (ribonukleová kyselina (mRNAmRNA): ): nesienesie prepisprepis štrukturálnychštrukturálnych génovgénov a a slúžislúži akoako matricamatrica prepre syntézu syntézu polypeptidovéhopolypeptidového reťazcareťazca na na ribozómochribozómoch ((u baktérií u baktérií primárnyprimárny transkripttranskript nepodliehanepodlieha posttranskripčnejposttranskripčnej modifikáciimodifikácii))
prekurzorováprekurzorová ribozómováribozómová ribonukleová kyselina (ribonukleová kyselina (prepre--rRNArRNA): ): primárnyprimárny transkripttranskriptgénovgénov prepre rôznerôzne typy typy rRNArRNA
RNARNA--polymerázapolymeráza katalyzujekatalyzuje prepis všetkých primárnych prepis všetkých primárnych transkriptovtranskriptov vo forme transkripčných jednotiek (vo forme transkripčných jednotiek (operónováoperónová, , neoperónováneoperónovátjtj), ktoré sa skladajú z), ktoré sa skladajú z promótora, niekoľkých génov a terminátora. promótora, niekoľkých génov a terminátora. Transkripcia prebieha vTranskripcia prebieha v troch fázach: iniciácia, troch fázach: iniciácia, elongáciaelongácia (pripojovanie (pripojovanie nukleozidnukleozid -- 5´5´--monofosfátov k 3´monofosfátov k 3´--koncu koncu RNARNA--reťazcareťazca), ), termináciaterminácia..
represorrepresor
OperOperáátortor je regulačná je regulačná oblasť DNA, na ktorú sa oblasť DNA, na ktorú sa
viaže proteínviaže proteín-- represorrepresor
Bakteriálny promótorBakteriálny promótor
promótorypromótory jednotlivých jednotlivých transkripčnýchtranskripčných jednotiekjednotiek súsú dosťdosť podobné (afinita k jednej RNApodobné (afinita k jednej RNA--polymerázepolymeráze), sila ), sila promótorapromótora (tým (tým silnejšísilnejší, čím , čím viacviac sasa približujepribližuje ku ku konvenčnýmkonvenčným sekvenciámsekvenciám))
Bakteriálna Bakteriálna RNARNA--polymerázapolymerázaholoenzýmholoenzým sasa skladáskladá::
ss matricovou DNA (matricovou DNA (negatívnynegatívny reťazecreťazec))1 1 σσ podjednotkapodjednotka (m.h. 85 000) (m.h. 85 000) -- sigma faktor sigma faktor -- podmieňujepodmieňuje špecifickúšpecifickú väzbuväzbu RNARNA--
polymerázypolymerázy kk promótoru (promótoru (sekvenciasekvencia --35, 35, --10)10)
sigma faktor sigma faktor σ sasa viaževiaže na na promótorpromótor prostredníctvomprostredníctvom
AMK v AMK v αα helixehelixe((--35/2 AMK, 35/2 AMK, --10/10/treotreo, , argarg))
--35 35 rozpoznávaciarozpoznávacia funkciafunkcia--10 premieňa uzatvorený komplex 10 premieňa uzatvorený komplex na otvorený (uvoľní väzbu medzi na otvorený (uvoľní väzbu medzi
pozitívnym a negatívnym reťazcom pozitívnym a negatívnym reťazcom DNA DNA
Iniciácia transkripcieIniciácia transkripcie
sigma faktor sigma faktor σ sasa viaževiaže na na promótorpromótor prostredníctvomprostredníctvom
AMK v AMK v αα helixehelixe((--35/2 AMK, 35/2 AMK, --10/10/treotreo, , argarg))
--35 35 rozpoznávaciarozpoznávacia funkciafunkcia--10 premieňa uzatvorený komplex 10 premieňa uzatvorený komplex na otvorený (uvoľní väzbu medzi na otvorený (uvoľní väzbu medzi
pozitívnym a negatívnym reťazcom pozitívnym a negatívnym reťazcom DNA DNA
Iniciácia transkripcieIniciácia transkripcie
od štartovacieho od štartovacieho nukleotidunukleotidu začína začína syntéza, vzniká prvý syntéza, vzniká prvý dinukleotiddinukleotid, ,
otvorený úsek (11otvorený úsek (11--17 17 bpbp) ) spôsobuje pnutie vspôsobuje pnutie v mieste mieste --35 a 35 a --1010
Rýchlosť syntézy RNA je asi 40N/s, Rýchlosť syntézy RNA je asi 40N/s, RNARNA--polymerázapolymeráza sa pohybuje vsa pohybuje v smere smere od 3´od 3´-- konca negatívneho reťazca DNA kkonca negatívneho reťazca DNA k jeho 5´jeho 5´-- koncu. Syntéza RNA koncu. Syntéza RNA
prebieha vprebieha v smere 5´smere 5´--3´ a v3´ a v tomto smere sa aj RNA predlžujetomto smere sa aj RNA predlžuje
ElongáciaElongácia RNARNA--reťazcareťazca
Bakteriálne Bakteriálne terminátoryterminátory
terminátory nezávislé na terminátory nezávislé na róró--faktore terminátory závislé na faktore terminátory závislé na róró--faktorefaktore
róró--faktorfaktor je proteín, ktorý na terminátoroch na ňom závislých je proteín, ktorý na terminátoroch na ňom závislých katalyzujekatalyzuje uvoľnenie dokončeného uvoľnenie dokončeného RNARNA--reťazcareťazca zz matricového matricového DNADNA--reťazcareťazca a tak zakončí transkripciua tak zakončí transkripciu
ŠŠtruktúratruktúra terminátoraterminátoranezávislého na nezávislého na róró--faktore faktore a jeho a jeho prepisprepis do do mRNAmRNA
Terminátory závislé na Terminátory závislé na róró--faktore faktore majúmajú namiestonamiestosekvenciesekvencie AAAAAAAA , AAAAAAAA , ktoráktorásasa prepisujeprepisuje do UUUUUUUU a do UUUUUUUU a predstavujepredstavuje signál signál prepreuvoľnenieuvoľnenie RNARNA--polymerázypolymerázy a a mRNAmRNA z z DNADNA--reťazcareťazcasekvenciusekvenciu GTTAGAA, GTTAGAA, ktoráktorá sasaprepisujeprepisuje do do sekvenciesekvencieCAAUCUU a CAAUCUU a pretopreto potrebujúpotrebujúróró--faktorfaktor
bakteriálnabakteriálna transkripčnátranskripčná jednotka jednotka obsahujúcaobsahujúca štrukturálneštrukturálne génygény sasa
odlišuje od odlišuje od ostatnýchostatných transkripčnýchtranskripčných jednotiekjednotiek v v tom, že tom, že medzimedzi
promótorompromótorom a prvým a prvým štrukturálnymštrukturálnym génomgénom za za štartovacímštartovacím
nukleotidomnukleotidom obsahuje tzv. obsahuje tzv. vedúcuvedúcu sekvenciusekvenciu, , ktorejktorej biologický biologický
význam význam spočívaspočíva vv tom, že obsahuje tom, že obsahuje ShineovuShineovu--DalgarnovúDalgarnovú sekvenciusekvenciu, ,
ktoráktorá sasa prepisujeprepisuje zz negatívneho DNA negatívneho DNA -- reťazcareťazca do 5´do 5´-- koncakonca mRNAmRNA
akoako 5´ A G G A 3´, touto 5´ A G G A 3´, touto sekvenciousekvenciou sasa potom potom mRNAmRNA viaževiaže
kk sekvencii 3´U C C U 5´, sekvencii 3´U C C U 5´, ktoráktorá sasa nachádzanachádza na 3´na 3´-- konci 16S konci 16S -- rRNArRNA
ribozómovejribozómovej podjednotkypodjednotky 30S, čím 30S, čím sasa štrukturálnyštrukturálny géngén môžemôže začaťzačať
prepisovaťprepisovať do do primárnejprimárnej štruktúryštruktúry proteínovproteínov ((primárnyprimárny transkripttranskript, ,
ktorýktorý neobsahuje SD neobsahuje SD sekvenciusekvenciu sasa neviaženeviaže na na ribozómribozóm a a neprepisujeneprepisuje
obsahuje na 5´- konci prepis vedúcej sekvencie, ktorá sa neprekladá
za vedúcou sekvenciou obsahuje prepisy štrukturálnych génov, ktoré sa prekladajú do primárnej štruktúry proteínov, pričom je každý vymedzený iniciačným a terminačným kodónom
na 3´- konci obsahuje prepis terminátora končiaceho koncovou sekvenciou UUUUUUUU, ktorá sa neprekladá
je multigénna, obsahuje prepis viacerých génov
bakteriálna mRNA sa posttranskripčne neupravuje !!!!
jej životnosť je len niekoľko minút
z celkovej bunkovej RNA v reálnom čase predstavuje len 3%
Súvislosť transkripcie do Súvislosť transkripcie do mRNAmRNA ss jej jej translácioutransláciou
rýchlosť transkripcie pri 37rýchlosť transkripcie pri 37°°C je 40 N/s C je 40 N/s ≈≈ 13 AMK, u niektorých 13 AMK, u niektorých transkripčných jednotiek pripadá až 15 iniciácií za minútu, pričtranskripčných jednotiek pripadá až 15 iniciácií za minútu, pričom vznikne om vznikne 15 15 mRNAmRNA, z, z ktorých každá je pokrytá 30 ktorých každá je pokrytá 30 ribozómamiribozómami ((polyribozómpolyribozóm), pričom ), pričom vznikne až 30 vznikne až 30 polypeptidovýchpolypeptidových reťazcovreťazcov
min. 32 min. 32 tRNAtRNA
2020--21 AMK21 AMK
Každá skupina génov pre rRNAsa prepisuje ako samostatná
transkripčná jednotka
PolyribozómPolyribozóm
BakteriálnyBakteriálny ribozómribozóm -- sedimentačnýsedimentačný koeficient 70S (50S a 30S). koeficient 70S (50S a 30S). RibozomálnaRibozomálna RNA RNA
je kódovaná je kódovaná viacerýmiviacerými rRNArRNA génmigénmi a a tvorítvorí asi 62% asi 62% celkovejcelkovej hmotnosti hmotnosti ribozómuribozómu. .
PodjednotkaPodjednotka 50S obsahuje 5S 50S obsahuje 5S rRNArRNA, 23S , 23S rRNArRNA a 34 a 34 proteínovproteínov. . PodjednotkaPodjednotka 30S je 30S je
zloženázložená z 16S z 16S rRNArRNA a 21 a 21 proteínovproteínov.. Počet Počet nukleotidovnukleotidov v v génovejgénovej sekvenciisekvencii
16S16S rRNArRNA, , ktoráktorá sasa využívavyužíva pripri fylogenetických fylogenetických štúdiáchštúdiách u baktérií, u baktérií, predstavujepredstavuje
1463 až 1550 1463 až 1550 nukleotidovnukleotidov..
Transkripcia bakteriálnych génov pre Transkripcia bakteriálnych génov pre rRNArRNA a a tRNAtRNA
E. E. colicoli K12K12
55--9 transkripčných jednotiek pre 9 transkripčných jednotiek pre rRNArRNA na chromozómena chromozómepre pre rRNArRNA sa štiepi sa štiepi RNAázouRNAázou IIIIII
Transkripcia bakteriálnych génov pre Transkripcia bakteriálnych génov pre rRNArRNA a a tRNAtRNA
E. E. colicoli K12K12
55--9 transkripčných jednotiek pre 9 transkripčných jednotiek pre rRNArRNA na chromozómena chromozómepre pre rRNArRNA sa štiepi sa štiepi RNAázouRNAázou IIIIII
E.E.colicoli -- PrePre tRNA tRNA -- elongačnýelongačný faktor EFfaktor EF--Tu má Tu má funkciufunkciu mRNAmRNA lebolebo obsahuje obsahuje na 5´na 5´--konci konci ShineovuShineovu--DalgarnovuDalgarnovu sekvenciusekvenciu, , ktorouktorou sasa pripojujepripojuje k k ribozómuribozómu
BakteriálnyBakteriálny a a eukaryotickýeukaryotický géngén
BunkyBunky obsahujúobsahujú 20x 20x viacviac RNA RNA akoako DNA, DNA, čočo v v skutočnostiskutočnosti predstavujepredstavuje asi 5% hmoty asi 5% hmoty bunkybunky. Z . Z
tohoto množstva však skoro 95% tohoto množstva však skoro 95% predstavujepredstavuje rRNArRNA a len 5% a len 5% mRNAmRNA. I . I naprieknapriek tomu, že tomu, že
väčšinuväčšinu RNA RNA bunkybunky predstavujepredstavuje rRNArRNA, , signifikantnesignifikantne viacviac RNA je RNA je prepisovanéprepisované akoako je je skutočneskutočne
preloženépreložené. Toto platí . Toto platí hlavnehlavne prepre eukaryontyeukaryonty, , ktoréktoré musiamusia svojusvoju mRNAmRNA upravovaťupravovať, aby , aby sasa
V V eukaryotickýcheukaryotických bunkách je proces bunkách je proces transtranskkripripciecie aa transltranslácieáciestriktne oddelenýstriktne oddelený
heterogénnaheterogénna jadrovájadrová RNA (RNA (hnRNAhnRNA) ) -- obsahuje obsahuje štruktúrneštruktúrne génygény
prekurzorováprekurzorová transferová RNA (transferová RNA (prepre--tRNA) tRNA) -- obsahuje obsahuje génygény prepre rôznerôznedruhy tRNAdruhy tRNA
prekurzorováprekurzorová ribozómováribozómová RNA (RNA (prepre--rRNArRNA) ) -- obsahuje obsahuje génygény prepre 5,8S5,8S--rRNArRNA, 18S, 18S--rRNArRNA, 28S, 28S--rRNArRNA u u cicavcovcicavcov a 5,8Sa 5,8S--rRNArRNA, 16S, 16S--rRNArRNA a 25Sa 25S--rRNArRNA u vyšších u vyšších rastlínrastlín
5S5S--rRNArRNA
malé RNA malé RNA -- stabilnéstabilné 8080--300 N 300 N dlhédlhé RNA (malé RNA (malé jadrovéjadrové RNA RNA -- snRNAsnRNA, , malé malé jadierkovéjadierkové RNA RNA -- snoRNAsnoRNA, malé , malé cytoplazmatickécytoplazmatické RNA RNA -- scRNAscRNA, , ichich funkciafunkcia je spojená sje spojená s riadením riadením zostrihuzostrihu, , posttraskripčnýmiposttraskripčnýmiúpravami, úpravami, prípadneprípadne neznáma)neznáma)
RNARNA--polymerázapolymeráza I: I: katalyzujekatalyzuje syntézu syntézu prepre--rRNArRNA ((nachádzanachádza sasa len len vv jadierku), jadierku), prepisujeprepisuje génygény I. I. triedytriedy, , nienie je citlivá k je citlivá k αα--amanitínuamanitínu
RNARNA--polymerázapolymeráza II: II: katalyzujekatalyzuje syntézu syntézu hnRNAhnRNA a malých a malých rRNArRNA((nachádzanachádza sasa v v karyoplazmekaryoplazme), ), prepisujeprepisuje génygény II. II. triedytriedy, je citlivá k , je citlivá k αα--amanitínuamanitínu, je , je zloženázložená z 10 z 10 protomérovprotomérov ((αα, , ββ, , ββ´ ´ súsú podobné podobné akoako u u prokaryotickejprokaryotickej RNARNA--polymerázypolymerázy))
RNARNA--polymerázapolymeráza III: III: katalyzujekatalyzuje syntézu syntézu prepre--tRNA, 5StRNA, 5S--rRNArRNA a a niektorýchniektorých malých RNA, (malých RNA, (nachádzanachádza sasa vv karyoplazme), karyoplazme), prepisujeprepisuje génygényIII. III. triedytriedy, , citlivosťcitlivosť k k αα--amanitínuamanitínu je druhovo je druhovo špecifickášpecifická
...každá z...každá z nich vyžaduje špecifický promótor na ktorý sa viaže...nich vyžaduje špecifický promótor na ktorý sa viaže...
konštitutívnakonštitutívna transkripciatranskripcia: umožňuje : umožňuje rôznymrôznym génomgénom rôznurôznurýchlosťrýchlosť transkripcietranskripcie podľapodľa požiadaviekpožiadaviek bunkybunky ((bazálnebazálne a a konštitutívnekonštitutívne TF)TF)
indukovateľnáindukovateľná transkripciatranskripcia: umožňuje : umožňuje reagovaťreagovať pripritranskripciitranskripcii na na vonkajšievonkajšie prostredieprostredie bunkybunky ((indukovateľneindukovateľne TF, TF, uplatňujúuplatňujú sasa pripri diferenciáciidiferenciácii buniekbuniek))
transkripčné faktory sú regulačné proteíny, ktoré sa viažu na retranskripčné faktory sú regulačné proteíny, ktoré sa viažu na regulačnú gulačnú oblasť oblasť promótoróvpromótoróv alebo alebo zosilovačovzosilovačov transkripcie a väčšinou pozitívne transkripcie a väčšinou pozitívne
mtDNAmtDNAobsahuje tri obsahuje tri transkripčnétranskripčné jednotky, jednotky, dvedve prekrývajúceprekrývajúce sasa na H na H reťazcireťazci
((riadenériadené promótormipromótormi P1 a P2) a jednu na P1 a P2) a jednu na reťazcireťazci L (L (riadenáriadenápromótorompromótorom P3), P3), prepisomprepisom vznikajúvznikajú tri molekuly tri molekuly primárnehoprimárneho