•15/03/2010 •1 KLONOVÁNÍ a GENOVÉ KLONOVÁNÍ a GENOVÉ INŽENÝRSTVÍ INŽENÝRSTVÍ KLONOVÁNÍ a GENOVÉ KLONOVÁNÍ a GENOVÉ INŽENÝRSTVÍ INŽENÝRSTVÍ 1) úvodní přednáška 2) PCR techniky 2) PCR techniky 3) mutageneze in vitro 4) cDNA a genomové knihovny 5) sekvencování genomů 6) transgenoze rostlin 7) genové čipy 7) genové čipy 8) transgenoze živočichů 9) genová terapie 10) klonovací strategie a expresní systémy 11) seminář – nástroje molekulární biologie v praxi
25
Embed
KLONOVÁNÍ a GENOVÉ INŽENÝRSTVÍ - ODDĚLENÍ … · 2010-03-15 · • enzym izolovaný z T4 bakteriofága infikujícího E.coli, katalyzuje tvorbu fosfodiesterové vazby mezi
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
•15/03/2010
•1
KLONOVÁNÍ a GENOVÉ KLONOVÁNÍ a GENOVÉ INŽENÝRSTVÍINŽENÝRSTVÍ
KLONOVÁNÍ a GENOVÉ KLONOVÁNÍ a GENOVÉ INŽENÝRSTVÍINŽENÝRSTVÍ
1) úvodní přednáška
2) PCR techniky2) PCR techniky
3) mutageneze in vitro
4) cDNA a genomové knihovny
5) sekvencování genomů
6) transgenoze rostlin
7) genové čipy7) genové čipy
8) transgenoze živočichů
9) genová terapie
10) klonovací strategie a expresní systémy
11) seminář – nástroje molekulární biologie v praxi
•15/03/2010
•2
Získávání bioinformací(dobrovolný seminář)
• NCBI (National Center for Biological Information)
• Introny a Exony• Promotor • Enhancer a Silencer• Počátek transkripce• Transkripční faktory• Transkripční faktory• Signální sekvence
IntronIntronyy aa ExonExonyy: Kodující sekvence (ORF) mnoha eukaryotických genů jepřerušená sekvencí známou jako introny. Introny jsou úseky DNA jejichžtranskripty nejsou přítomný ve zralé mRNA. Exony jsou části sekvencepřítomné ve zralé mRNA a kodují produkt eukaryotického genu.
Místo počátku transkripce: místo kde začíná syntéza mRNA (pozice 0, -30bp od TATA boxu) .Promotor: Oblast genu (5’-konec) upstream od místa počátku transkripcesloužící jako templát pro navázání transkripční jednotky a iniciacitranskripce. Inducibilní promotor – je závislý na přítomnosti induktoru(nízkomolekulární látka). Konstitutivní promotor – nezávislý (provozníh k i “ )„house keeping“ geny).
Enhancer: Část sekvence genu která interaguje s transkripčními faktory atak zvyšuje účinnost transkripce. Je umístěna upstream nebo downstreamod kódující sekvence a může být stovky bází daleko od kódující sekvencekterou kontroluje.Silencer: Opak enhanceru.Transkripční faktory: Proteiny interagující se specifickou sekvenci DNA,p y y g j p ,většinou ovlivňující terciální strukturu DNA a tak regulují transkripčníjednotku. Jsou buď aktivátory nebo represory viz výše.Koaktivátory: Proteiny interagující s transkripčními faktory (ale ne s DNA)regulující transkripci.Signální sekvence: kóduje signální peptid, který předurčuje zacíleníproteinu na buněčné úrovni a následně se odštěpuje.
•15/03/2010
•5
DNA polymerasy
DNA DNA DNADNA
blíže přednáška techniky PCR
DNA DNA RNARNATranskripce (RNA syntéza): přenos informace z DNA do RNA(nestabilní) prostřednictvím enzymu RNA Polymerasy (DNA-dependentníRNA Polymerasa).
Syntéza RNA je komplementární k templátovému DNA duplexu a jeidentická s netemplátovým vláknem duplexu (5´-3´). Netemplátovýřetězec je proto nazýván kódující řetězec a je identický s mRNA svýjimkou záměny U za T.TypyTypy RNARNA::messenger RNA (mRNA, polyA+ RNA). RNA která je přepisována dopolypeptidů ((11--55%%)).ribozomální RNA (rRNA). strukturní složka ribozómů. ((9090%%))transferová RNA (tRNA). přenašeč aminokyselin do místa syntézyproteinu. ((55--1010%%))málá jaderná, jadérková, cytoplazmatická RNA (snRNA/sno/scRNA).sestřih mRNA
přidáván na 5'-konec většiny mRNA. Stabilita mRNA apodílí se na vazbě k ribozomu.
P l d l 100 200 b dl há k• Polyadenylace. 100-200 bp dlouhá sekvencepolyadenozinu je přidávána na 3'-konec většinyeukaryotické pre-mRNA. PolyA konec není kodován vDNA.
• Sestřih intronů a exonů. introny jsou vyštěpeny a exonyspojeny dohromady ve struktuře zvané spliceozom.
RRNA NA proteinprotein• Translace (syntéza proteinů): Translace je proces přeměny informace z RNA
do aminokyselinového řetězce (polypeptidu) probíhající v cytoplasmě. ZralámRNA je transportována do cytoplasmy k ribozomům (mnohdy vázané naendoplasmatickou retikulární síť).
• Ribozóm se skládá ze strukturní rRNA a 80 různých proteinů které tvoříRibozóm se skládá ze strukturní rRNA a 80 různých proteinů, které tvořímalou a velkou podjednotku.
• Iniciace: Zachycení mRNA a nalezení start kodonu AUG, který kodujemethionin.(M je odštěpen během postranslačních úprav nebo společně se signálnímpeptidem)
• Elongace: Přidávání různých AK v aktivované formě vázané na tRNA avytváření peptidové vazby mezi amino a karboxylovou skupinou.
• Terminace: STOP kodón (UAA, UAG nebo UGA)
Posttranslační úpravy:• Fosforylace, glykosylace, organelové cílení a odštěpení signálního peptidu, složení do aktivního stavu (vytvoření terciální a kvartérní struktury).
Reverzní transkripce: Proces vytvoření DNA z RNA templátu zapomocí RNA-dependentní DNA polymerasy – ReverReverznízníttransranskkriptriptasaasa (RT).RT je přítomná pouze v RNA virech avian myeloblastosis virus
RNA RNA DNADNA
RT je přítomná pouze v RNA virech avian myeloblastosis virus(AMVAMV), Moloney murine leukemia virus (MMLVMMLV), nebo humanimmunodeficiency virus (HIV).
ApliAplikacekace::tvorba cDNA (komplementární DNA): přesná DNA kopie mRNAtvorba cDNA (komplementární DNA): přesná DNA kopie mRNA.DNA sekvence proteinu bez přerušení introny.
• cDNA knihovny• RT PCR
•15/03/2010
•8
Hybridizace• Dva řetězce DNA mohou být k sobě komplementární.• mRNA syntetizována z genu je identická k jednomu vláknu svého
genu a komplementární k druhému vláknu.• Komplementární řetězce mohou být odděleny (denaturace) a znovup ý y ( )
spojeny (renaturace – hybridizace) na různém stupni specifity,mohou vznikat hybridní formace DNA-DNA, DNA-RNA, nebo RNA-RNA.
MethodMethodyy využívajícívyužívající těchtotěchto vlastnostivlastnosti::• Southern blot: Hybridizace DNA na DNA (v pevné fázi)• Northern blot: Hybridizace DNA na RNA (v pevné fázi)• RNAse protection assay: Hybridizace RNA na RNA (v roztoku)• RNAse protection assay: Hybridizace RNA na RNA (v roztoku)• In situ hybridizace DNA-DNA nebo DNA-RNA (ve tkání, či v buňce,
např. FISH)• izolace mRNA: vazba polyA konce na polyT sekvenci navázanou na
pevný matrix.
Stringence: podmínky zaručující stupeň specifity (komplementarity)
PG2
Strigence hybridizaceStrigence hybridizace
teplota ▲koncentrace soli ▼
Denaturační činidla (formamid) za snížené teploty udržují vysokou strigenci
PG1
Snímek 15
PG2 RNAse protection assay multi Northern blot ve zkumavce: pripravi se in vitro transcrpipcí proby proti cilové mRNA, necha se probehnout hybridizace, vsechny ssRNA se pak rozstipou, reakce se hodí na gel a sleduje se intenzita (pomocí značení sondy) a velikost získaných bandu.galuszka; 18/02/2008
Snímek 16
PG1 foramid narušuje vodíkové vazby mezi bázemi a tím snižuje melting temperature, muze byt nahrazen mene toxickou močovinougaluszka; 18/02/2008
•15/03/2010
•9
Princip Southern a Northern blotu
Hybridizační sondyHybridizační sondy jsou značené:• chemiluminiscenčně BIOTIN detekce AVIDIN-HRP, DIGOXYGENIN• fluorescenčně FLUORESCEIN, RHODAMIN • radioaktivně dAT32P, 3H
• Příprava sond:• 5´ a 3´koncové značení – nízká citlivost• pomocí RANDOM HEXAMERů a DNA polymerasy (Klenowův fragment)• PCR• nick translace – DNasa I a DNA polymerasa• in vitro transkripce (RNA próby) FISH fluorescent in situ hybridization
PG3 rozdělit typy sond RNA a DNAgaluszka; 18/02/2008
•15/03/2010
•10
Příprava hybridizačních sondPříprava hybridizačních sondznačení pomocí náhodných hexameru značení pomocí nick translation
(posun jednořetězcového zlomu)
PG4PG1
RESTRIKČNÍ ENDONUKLEASY RESTRIKČNÍ ENDONUKLEASY (restrikční enzymy II třídy)(restrikční enzymy II třídy)
• rozpoznávají specifické sekvence dsDNA a štípou jí ve stejném místě
• rozpoznávací místo je 4-8 bp dlouhé
• štípou dlouhé fragmenty dsDNA na• štípou dlouhé fragmenty dsDNA na kratší
• štípou vždy znovu opakovatelným způsobem
• pocházejí především z bakterií
• ochrana před cizorodou DNA především bakteriofágovou
• modifikačně-restrikční enzymový y ýsystém (RE + specifická modifikační metylasa)
• Přes 120 rozpoznávacích míst
• dodnes popsaných více než 800 RE
Snímek 19
PG4 Klenowuv fragment: postráda 5-3 exonukleasovou aktivitu, polymerasa nedegraduje jiz nasedly primer a zastavuje se polymerizace galuszka; 18/02/2008
PG1 Labeling principle The nick translation method (1) is based on the abilityof DNase I to introduce randomly distributed nicks intoDNA at low enzyme concentrations in the presence ofMg2+.E. coli DNA polymerase I synthesizes DNA complementaryto the intact strand in a 5' → 3' direction usingthe 3'-OH termini of the nick as a primer (2). The 5' → 3'exonucleolytic activity of DNA polymerase I simultaneouslyremoves nucleotides in the direction of synthesis(3). The polymerase activity sequentially replacesthe removed nucleotides with isotope-labeled or hapten-labeled deoxyribonucleoside triphosphates (1). Atlow temperature (15°C), the unlabeled DNA in thereaction is thus replaced by newly synthesized labeledDNA.DNA The DNA must be in low-salt concentration solution.Radioactive dNTPfor labeling[α-32P] dCTP is preferentially used due to its greaterstability in comparison to other labeled deoxyribonucleosidetriphosphates.[α-32P] deoxyribonucleoside triphosphates with a specificactivity of 3000 Ci/mmol give better incorporationand higher levels of labeling than those with a specificactivity of 400 Ci/mmol under identical reaction conditions.Specific activity The level of specific labeling and the incorporation rateare dependent on the ratio of substrate DNA to labeledPetr Galuszka; 11/02/2006
•15/03/2010
•11
• RE mohou na DNA vytvářet TUPÉ nebo LEPIVÉ konce
• restrikční sekvence jsou většinou symetrické.
RESTRIKČNÍ MíSTA MAJÍ BOD SYMETRIERESTRIKČNÍ MíSTA MAJÍ BOD SYMETRIE
y
• nukleotidy vytvářejí PALINDROM
• Palindrom: sekvence se čte stejně v obou směrech jak ve5’ → 3’ tak ve směru 5’ → 3’ na komplementárním řetězci.
EcoRI
TUPÉ KONCE – nespecifické spojeníLEPiVÉ KONCE –specifické spojení
EcoRI
Existují RE se stejnou restrikční sekvencí lišící se pouze typem vzniklých konců (5´- či 3´- lepivé) KpnI vs. Asp718 KpnI vs. Asp718 -- izoschizomeryizoschizomery
Lepivé konceLepivé konce::každý DNA fragment (jakéhokoli původu) tvoří štěpením stejnou RE dvě jednovláknové identické
• dvě odlišné DNA mající stejné rozpoznávací místo pro danou RE se mohou vzájemně spojit v rekombinantní DNA molekulu
•• rekrekombinantombinantníní DNA moleDNA molekulakula:: je nová kombinace nukleotidů v DNA která se nevyskytuje volně v přírodě
Počet nukleotidů v restrikčním místě dané RE determinuje průměrnou délku fragmentů DNA získaných naštípaním danou RE
Pravděpodobnost že dané restrikční místo bude nalezeno v genomu:
1) 44 = 256 bp
2) 46 = 4096 bp
3) 48 = 64 000 bp
GTACGTAC
Působení RE je velmi citlivé na
průměrná vzdálenost mezi restrikčními sekvencemi v DNA
= 4n
n = # bází v restrikčním místě
) p
jiontovou sílu roztoku a charakterpřítomných solí.Pokud nejsou zachovány specificképodmínky pro danou RE ta můžemít tzv. star aktivituSTARSTAR AKTIVITAAKTIVITA – nespecifickénáhodné štěpení
•15/03/2010
•13
T4 DNA ligasaT4 DNA ligasa• enzym izolovaný z T4 bakteriofága infikujícího E.coli,
katalyzuje tvorbu fosfodiesterové vazby mezi5´fosfátovou skupinou jednoho a 3´OH skupinousousedního nukleotidu.
• reakce vyžaduje energii jednoho ATP• používá se ke spojování lepivých i tupých konců
dvou restrikčních fragmentů DNA, připojovánírůzných adaptorových sekvencí k DNA a cirkulizaciDNA
• Reakce se provádí většinou za snížené teploty (15-16°C) aby se snížila kinetická energie molekul azabránilo se tak nekomplementárnímu spárovánílepivých konců.lepivých konců.
• zápor: nízká aktivita enzymu – dlouhý reakční čas.
Další enzymy používané v molekulární biologii: Alkalická fosfatasa
Mung Bean nukleasa
KLONOVÁNÍKLONOVÁNÍMolekulární klonováníMolekulární klonování::•• multi-krokový proces který vytvoří kolekci definovaných fragmentů dané DNA pomocí restrikčních endonukleas
j í b ý h DNA f tů ( ětši j d h ) iál í• spojení vybraných DNA fragmentů (většinou jednoho genu) se speciálním nosičem – vektorvektor pomocí T4 DNA ligasy
• přenos vzniklého konstruktu do živých buněk (často baktérie)
• mnohonásobné namnožení vložených DNA fragmentů replikaci v živé buňce –DNA KLONYDNA KLONY
• vytváření geneticky identických buněk (organismů)•• v živé přírodě přirozené: kolonie baktérii
řízkování rostlinjednovaječná dvojčata
umělé umělé ►►
•15/03/2010
•14
KLONOVACÍ VEKTORYKLONOVACÍ VEKTORYA) Bakteriální a kvasinkové – PLASMIDYPLASMIDY- přirozené součástí bakteriálních buněk nesoucí vlastní genetickou informaci ve formě
dsDNA (rezistence k antibiotikům, metabolismus nezvyklých substrátů…) 1-100kb- replikují se nezávisle na baktérii- vlastní plasmidové vektory vznikly úpravou přirozených
„high copy“ plasmidy„high copy“ plasmidy1970 1970 -- pBR (Bolivar a Rodriguez)pBR (Bolivar a Rodriguez)- 4.36 kb menší než je přirozeně se vyskytující v E.coli - oriori vlastní počátek replikace- rezistence k Amp a Tc- unikátní restrikční místa - kapacita pro inzertovou DNA 11--5 kb5 kb
100-1000 kopií v buńce
oriMCSMCS
multiple cloning site(polylinker)
KLONOVACÍ VEKTORYKLONOVACÍ VEKTORYB) Virové - BAKTERIOFÁGYBAKTERIOFÁGY- bakteriální viry s dvouřetězcovou lineární DNA- klonovací kapacita 22--25kb25kb inzertu- mnohonásobné množení v závislosti na hostitelské bakterii
BAKTERIOFÁG lambda 49kbBAKTERIOFÁG lambda 49kb
• Střední část genomu není důležitá pro lytický růst a lze ji nahradit inzertovou DNA
• snadná manipulace díky cos místům (lepivé konce) na koncích λ DNA, které umožňují její cirkulaci
coscos
• Zacirkuluje se pouze bakteriofág, který má vzdálenost mezi cos místy 37-52kb
• tvorba cDNA a genomových knihoven
•15/03/2010
•15
C) bakteriálně-virové - KOSMIDYKOSMIDY• odvozené z plasmidu do kterého byly naklonovány cos místa bakteriofága λ• Inzertová DNA je naklonována do lineárního kosmidu a sbalena in vitro
virovým mechanismem a infikována do bakterie
KLONOVACÍ VEKTORY
• v bakterii je pak cirkulována a replikuje se dál jako plasmid• malá velikost cca 5kb – není potřeba infekčních lytických λ proteinů, pouze
selekční marker k antibiotiku, velikost inzertové DNA se může pohybovat ažk 4747kbkb
D) bakteriálně-virové - FASMIDYFASMIDY (phagemid)(phagemid)• odvozené od bakteriofága M13 s malou ssDNA (6.4kb), který se po infekci do
bakterie replikuje jako kruhovitá dsDNA (plasmid, snadná manipulace, restrikce)• infekční fágové částice však opět obsahují pouze ssDNA (vhodný zdroj pro
izolaci ssDNA např. pro hybridizaci)• do infekčních částic mohou být sbaleny částice až dvakrát větší než je fágová
DNA
PG5
Snímek 29
PG5 KOSMIDY nemají lytické geny, replikují se jako bakteriofág ale nelýzují bakterii, s prazdnýma se manipuluje jako s plasmidy.Replikuji se pomaleji než plasmidyKONKATEMERY - cirkularní kosmid se naštípe jedním lepivým a jedním tupym aby nedochazelo k cirkulacigaluszka; 18/02/2008
•patří mezi kyvadlové vektory (shuttle vector)•v bakterii jako kruhová dsDNA (plasmid)•vedle sekvencí bakteriálního plasmidu obsahují části kvasinkového chromozomu (centromera, počátek ( , preplikace,dvě telomery)•linearizací se chromozom aktivuje (oddělení telomer od sebe) •obrovská klonovací kapacita až 2000kb2000kb•nestabilita a složitá manipulace (protoplasty)
KYVADLOVÉKYVADLOVÉ VEKTORYVEKTORY umožňující existenci a replikaci ve dvou rozdílných organismech:pYES bakterie – kvasinka - počátek replikace z přirozeného kvasinkového vektoru 2μTi-plazmid bakterie – rostlina viz přednáška transgenoze rostlin
klonovací vector + DNA obsahující klonovací vector + DNA obsahující požadovaný gen (izolace)požadovaný gen (izolace)
t ikt ikrestrikcerestrikce
ligaceligace
transformacetransformace
selekce pomocí selekčních markerůselekce pomocí selekčních markerů
reprodukce a syntéza cílového proteinu reprodukce a syntéza cílového proteinu izolaceizolace
Využití molekulárního klonováníVyužití molekulárního klonování•• uchovávání, zmnožení a manipulace s genetickou informací uchovávání, zmnožení a manipulace s genetickou informací (cDNA a genomové knihovny)(cDNA a genomové knihovny)
•• produkce proteinů pro různorodé využitíprodukce proteinů pro různorodé využití•• vnášení nových či pozměněných genů do organismů (GMO, genová terapie)vnášení nových či pozměněných genů do organismů (GMO, genová terapie)
farmaceutikafarmaceutika
zemědělstvízemědělství
medicínamedicínaprůmyslprůmysl
základní výzkumzákladní výzkum
•15/03/2010
•18
SELEKČNÍ MARKERYSELEKČNÍ MARKERYgeny nesené na klonovacím vektoru, exprimované geny nesené na klonovacím vektoru, exprimované
současně s transgenem, na jejichž fenotypovém současně s transgenem, na jejichž fenotypovém projevu lze transformované buňky snadno projevu lze transformované buňky snadno
TETRACYKLIN TETRACYKLIN (zabraňuje vazbě aminoacyl tRNA k ribozomu) gen Tet kóduje membránový protein, který aktivně transportuje TC ven z buňky
HYGROMYCIN B HYGROMYCIN B (interferuje s velkou ribozomální podjednotkou a zabraňuje elongaci syntetizovaného peptidu) gen způsobující rezistenci hgh kóduje fosforylasu inaktivující toto antibiotikum. PůSOBÍ I NA EUKARYOTICKÉ BUŇKY!!! (selekce transgenních rostlin)
•• INHIBITORY TRANSKRIPCE A REPLIKACEINHIBITORY TRANSKRIPCE A REPLIKACE
ACTINOMYCIN D ACTINOMYCIN D (inhibuje transkripci tím, že se váže na specifické úseky DNA)
RIFAMPICIN RIFAMPICIN (inhibuje prokaryotní RNA polymerasu, ale i chloroplastovou a mitochondriální, proto je toxicky i pro člověka)
ZEOCINZEOCIN – glykopeptid izolovaný ze Streptomyces, který štěpí po vstupu do buňky jakoukoliv DNA.Rezistentní gen Sh ble kóduje inhibiční protein (13.6 kDa) tohoto glykopeptidu.
koncentrace účinné pro selekci:Baktérie 25-50 μg/mLKvasinky 50-300 μg/mLSavčí buňky 50-1000 μg/mL ZEOCIN
Princip selekce: pro transformaci daného plasmidu se použijíspecifické kmeny kvasinek deficientní pro daný gen, selekce se pak provádí na minimálním médiu (bez živin).
tzn. že tento kmen je autotrofní na histidin, leucin,tryptofan a uracil a na médiu bez těchto živinneporoste
kyvadlový vektor pro transformaci kvasinek →
SELEKČNÍ MARKERYSELEKČNÍ MARKERY3) blue/white screening testblue/white screening test- pomocný test pro selekci transformovaných bakterií či bakteriofágu- klonovací vektor nese gen lacZ+ který kóduje enzym ββ--galaktosidasu galaktosidasu (štěpí laktosu na
galaktosu a glukosu)- MCS je umístěn uvnitř tohoto genu, a po vložení inzertu se tento gen stává neaktivní