ðẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI VIỆN VI SINH VẬT VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ========000======== BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN ðỀ TÀI KHCN ðẶC BIỆT CẤP ðẠI HỌC QUỐC GIA Tên ñề tài: ðiều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh vật và kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn Mã số: QG. 09. 48 Chủ trì ñề tài: TS. Nguyễn Huỳnh Minh Quyên Cơ quan: Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh học Hà Nội, năm 2011
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
ðẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
VIỆN VI SINH VẬT VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
========000========
BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN
ðỀ TÀI KHCN ðẶC BIỆT CẤP ðẠI HỌC QUỐC GIA
Tên ñề tài: ðiều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh vật
và kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn
Mã số: QG. 09. 48
Chủ trì ñề tài: TS. Nguyễn Huỳnh Minh Quyên
Cơ quan: Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh học
Hà Nội, năm 2011
1
MỤC LỤC
PHẦN I. BÁO CÁO TÓM T ẮT 3
Bằng tiếng Việt 3
Bằng tiếng Anh 8
PHẦN II. BÁO CÁO T ỔNG KẾT 12
Giải thích chữ viết tắt 13
Danh sách những người tham gia thực hiện ñề tài 13
Danh mục các bảng và hình 14
MỞ ðẦU 15
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LI ỆU 16
1.1 Kháng sinh 16
1.1.1. Khái niệm chung 16 1.1.2. Lịch sử phát triển kháng sinh 16
1.1.3. Phân loại kháng sinh 18
1.1.4. Kháng sinh kháng khối u 21
1.1.5. Nhu cầu phát triển kháng sinh mới 21
1.2 Xạ khuẩn 22
1.2.1. Các ñặc ñiểm chung 22
1.2.2. Xạ khuẩn và các chất thứ sinh 23
1.3 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn ở Việt Nam 23
1.4 Nội dung và mục ñích của nghiên cứu 24
CHƯƠNG II - NGUYÊN VẬT LI ỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.1. Nguyên vật li ệu 25
2.1.1. ðối tượng nghiên cứu 25
2.1.2. Hóa chất 25
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 25
2.2. Phương pháp nghiên cứu 25
2.2.1. Phương pháp phân lập xạ khuẩn 25
2.2.2. Các vi sinh vật kiểm ñịnh 26
2.2.3. Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh 27
2.2.4. Chiết bằng ethyl-acetate 28
2.2.5. Sắc ký các chất chiết thu ñược 28
2.2.6. Sàng lọc chủng xạ khuẩn sinh anthracycline 29
2.2.7. Phép thử ñộc tế bào 30
2
2.2.8. Các phương pháp phân loại xạ khuẩn 30
CHƯƠNG III. K ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
3.1. ða dạng sinh học các chủng xạ khuẩn thu thập ñược ở
Vườn Quốc gia Cát Bà 32
3.2. Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh 33
3.3. Hiệu quả tách chiết dịch nuôi cấy các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược 35
3.4. Phân tích sắc ký dịch nuôi các chủng xạ khuẩn chiết trong ethyl acetate 36
3.4.1. Sắc ký bản mỏng (TLC) 36
3.4.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 38
3.5. ðặc ñiểm nhận dạng của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược 42
3.5.1. ðặc ñiểm hình thái của các chủng thuộc Streptomyces 42
3.5.2. Giải trình tự rDNA 16S ñối với các chủng xạ khuẩn thuộc chi Nonomuraea 44
3.6. Sàng lọc khả năng sinh anthracyline của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược 45
3.7. Các nghiên cứu liên quan ñến các chủng có hoạt tính ñộc tế bào 46
3.7.1. Hoạt tính gây ñộc tế bào 46
3.7.2. Phân tích HPLC dịch nuôi chiết trong ethyl acetate
của các chủng có hoạt tính ñộc tế bào 47
KẾT LUẬN VÀ KI ẾN NGHỊ 53
TÀI LI ỆU THAM KH ẢO 55
PHỤ LỤC 62
3
PHẦN I. BÁO CÁO TÓM T ẮT
1. Tên ñề tài: ðiều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh
vật và kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn 2. Mã số: QG.09.48
cột: 30 'C; bước sóng: UV/VIS 190 - 600 nm (khoảng cách 2 nm). Các mẫu chất chiết
ñược hòa tan trong DMSO. Phần nghiên cứu này ñược thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi
sinh vật phân tử, Trung tâm Công nghệ sinh học quốc tế (International Centre of
Biotechnology-ICBiotech), ðại học Tổng hợp Osaka, Nhật Bản.
2.2.6 Sàng lọc chủng xạ khuẩn sinh anthracycline
Khả năng sinh anthracycline của các chủng xạ khuẩn ñược sàng lọc bằng phép thử
màu. Bản chất của phép thử như sau: Do có mặt của vòng anthraquinone trong cấu tạo
hóa học, các anthracycline thay ñổi màu sắc tùy theo pH của môi trường, cụ thể là có màu
da cam ở pH acid và màu tím khi ở pH base. ðặc tính này ñược dùng ñể sơ bộ sàng lọc
30
các chủng sinh anthracycline trong số các chủng xạ khuẩn phân lập ñược (Trease G. E.,
Evans W. C., 1996).
Cách tiến hành như sau: ñục 2 giếng nhỏ trên ñĩa thạch trước ñó ñã ñược nuôi xạ
khuẩn (khoảng 4 – 5 ngày tuổi). Nhỏ vào mỗi giếng 25 µl HCl (1N) hoặc NaOH (2N).
Quan sát màu quanh giếng sau 10 – 20 phút.
2.2.7. Phép thử ñộc tế bào
Khả năng gây ñộc tế bào của các chất chiết ñược từ dịch nuôi xạ khuẩn ñược xác
ñịnh theo phương pháp của Skehan và cộng sự (1990) và Likhiwitayawuid và cộng sự
(1993) hiện ñang ñược áp dụng tại Vi ện Nghiên cứu ung thư quốc gia (Hoa Kỳ) và trường
Dược, ðại học Illinois, Chicago (Hoa Kỳ). Phép thử ñược thực hiện tại Phòng Sinh học
thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam. Cụ thể là:
Ba dòng tế bào ung thư của người gồm ung thư gan (hepatocellular carcinoma, Hep-
G2), ung thư phổi (lung cancer, Lu) và ung thư cơ vân tim (rhabdosarcoma, RD) ñược
dùng ñể sàng lọc hoạt tính gây ñộc tế bào bằng phép thử Sulforhodamine B (SRB assay).
Các dòng tế bào này ñược cho vào ñĩa 96 giếng (mỗi giếng chứa 2x103 tế bào) rồi
cho chất cần thử (ở ñây là chất chiết từ dịch nuôi xạ khuẩn như ñã mô tả ở 2.2.4. với các
nồng ñộ pha theo thang 10) hòa tan trong DMSO. Sau ñó các ñĩa ñược nuôi trong tủ CO2
ở 37 ºC trong 7 ngày. Vào ngày thứ 3 môi trường nuôi ñược thay mới. Tỷ lệ phần trăm
sống sót của tế bào ñược hiện thị màu bằng SRB (sulforhodamine B) và ñược ñọc bằng
máy ñọc ELISA (ELISA reader) ở bước sóng 495 nm.
Hoạt tính gây ñộc tế bào ñược tính bằng phần trăm ức chế khi so sánh mật ñộ quang
học của giếng ñược xử lý với mẫu nghiên cứu và chứng âm (DMSO). Nồng ñộ ức chế
50% (IC50) ñược suy ra từ ñường cong phát triển tế bào và nồng ñộ chất thử (phần trăm
sống sót so với nồng ñộ chất thử).
2.2.8. Các phương pháp phân loại xạ khuẩn
a. Qua ñặc ñiểm hình thái
Các ñặc ñiểm hình thái của xạ khuẩn ñược quan sát sau hai tuần nuôi ở các ñiều
kiện như ñã mô tả. Các ñặc ñiểm hiển vi như hệ sợi cơ chất, hình thái sợi khí sinh, cấu
trúc chuỗi bào tử ñược quan sát dưới kính hiển vi phản pha (Carl-Zeiss) có nối máy ảnh
và phần mềm chụp ảnh. Atlas hình thái xạ khuẩn (Gernot, 1997) và Sổ tay nhận dạng xạ
khuẩn (Identification Manual of Actinomycetes) (Miyadoh et al, 2001) ñược dùng ñể
31
tham khảo về ñặc ñiểm phân loại.
b. Bằng sinh học phân tử
Tách chiết DNA
DNA genome của các chủng xạ khuẩn ñược tách chiết theo phương pháp ñã ñược
Marmur (1961) và Saito (1963) mô tả với một số cải tiến. Cụ thể là, nuôi xạ khuẩn trong
môi trường YS lỏng trong 3 ngày ở 30°C và thu tế bào bằng ly tâm ở 3000 vòng/phút
trong 5 phút. Tế bào sau khi ñã ñồng nhất (bằng que nhựa vô trùng, rửa bằng 2 ml ñệm
1�TE 2 – 3 lần và hòa tan lại trong 0.5 ml EDTA 5 mM, pH 8) bị phá vỡ bằng xử lý với
lysozyme (50 µl có nồng ñộ 40 mg.ml−1) ở 37°C qua ñêm, rồi ñược xử lý với SDS (50 µl
có nồng ñộ 20%) và proteinase K (50 µl có nồng ñộ 4 mg.ml−1) ở 55°C trong 1 giờ. DNA
ñược chiết bằng bổ sung một thể tích tương ñương hỗn hợp phenol:chloroform:isoamine
alcohol = 25:24:1 (PCI), trộn và ly tâm ở 15000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C. Bước
chiết này ñược lặp lại 3 lần. DNA nhiễm sắc thể ñược kết tủa bằng 2 thể tích 2-propanol
lạnh, rồi làm khô bằng ethanol 70% ở nhiệt ñộ phòng và hòa tan trong 100 µl nước cất.
Phản ứng PCR, giải trình tự và phân tích cây chủng loại phát sinh
Gene rDNA 16S ñược khuếch ñại bằng cặp primer:
27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)
1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT)
Hỗn hợp phản ứng (50 µl) gồm 5 µl ñệm (0.2 M Tris-HCl pH 8.3, 0.25 M KCl, 20
mM MgCl2), 20 nM mỗi loại deoxynucleotide, 50 pM mỗi loại primer, 2.5 U Taq DNA
polymerase, và 1 µl DNA khuôn (nồng ñộ khoảng 10-20 ng). Chu trình PCR gồm 5 phút
sốc nhiệt ở 95°C, tiếp ñến là 30 chu kỳ gồm 95°C trong 30 giây, 52°C trong 30 giây, và
72°C trong 1 phút, cuối cùng là 72°C trong 7 phút. Sản phẩm PCR ñược ñiện di trên gel
agarose, cắt và tinh sạch băng DNA bằng kit QIAquick gel extraction (Qiagen), và ñọc
trình tự bằng máy tự ñộng ABI 3110 Avant Appied Biosystems sequencer.
Trình tự gen sau ñó ñược phân tích so sánh với trình tự 16S rDNA của các loài có
liên quan hiện ñã công bố trên Database DDBJ/EMBL/GenBank sử dụng phần mềm
BLAST Search. So sánh tương ñồng với các trình tự liên quan ñược thực hiện bằng phần
mềm CLUSTAL_X, phiên bản 1.8 (Thompson et. al., 1997). Cây phân loại ñược dựng
theo phương pháp neighbour-joining (Saitou, Nei, 1987), trong ñó ñịnh dạng cây ñược
tiến hành dựa trên 1000 phép so sánh ña chiều (Felsenstein, 1985).
32
CHƯƠNG III. K ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ða dạng sinh học các chủng xạ khuẩn thu thập ñược ở Vườn Quốc gia Cát Bà
Việt Nam với hơn 1.700 km bờ biển trải từ bắc xuống nam với rất nhiều ñảo có
mức ña dạng sinh học cao. Một số ñảo của Việt Nam ñã ñược công nhận là vườn quốc gia
ñể bảo tồn và phát triển bền vững nguồn gene sinh học. Trong khi hệ thực vật và ñộng vật
ở các vườn quốc gia của Việt Nam ñã ñược quan tâm nghiên cứu về mức ñộ ña dạng rất
nhiều thì vi sinh vật chưa ñược quan tâm ñúng mức cho dù vi sinh vật ñóng vai trò chủ
ñạo trong sự phát triển của công nghệ sinh học. Hiện vẫn còn ít các nghiên cứu liên quan
ñến sự ña dạng cũng như khả năng ứng dụng của hệ vi sinh vật ở các vườn quốc gia này.
Trong số các ñảo của Việt Nam, Cát Bà là ñảo lớn nhất của Vịnh Hạ Long, di sản
thiên nhiên thế giới. ðảo hiện có 620 loài thực vật bậc cao, 32 loài ñộng vật có vú, 69 loài
chim và 20 loài bò sát. Cũng tương tự như hầu hết các khu bảo tồn ở Việt Nam, Vườn
quốc gia Cát Bà chưa ñược nghiên cứu về mức ñộ ña dạng và tiềm năng sử dụng của vi
sinh vật.
Nhằm góp phần nghiên cứu về nhóm xạ khuẩn có ở ñảo Cát Bà, ñề tài ñã tiến hành
phân lập xạ khuẩn theo hai phương pháp khác nhau như ñã mô ở chương II. Qua ñó ñã
phân lập ñược 424 chủng xạ khuẩn từ các mẫu ñất và lá cây mục thu tại Cát Bà. Trong số
424 chủng ñó, 353 chủng (83.25%) phân lập ñược từ ñất và 71 chủng (16.75%) từ mẫu lá
cây mục.
Tiếp theo, các chủng xạ khuẩn phân lập ñược ñã ñược phân loại theo hình thái ñể
phân thành 2 nhóm Streptomyces và non-Streptomyces (xạ khuẩn hiếm) (Bảng 3.1). ðể
ñịnh loại chính xác hơn nhóm xạ khuẩn hiếm phương pháp ñọc trình tự một phần rDNA
16S (khoảng 900 bp) ñã ñược thực hiện và so sánh với các trình tự ñã có trên cơ sở dự
liệu bằng công cụ Blast Search.
Qua bảng 3.1 chúng tôi nhận thấy 296 chủng phân lập ñược là Streptomyces (chiếm
khoảng 69,81%) và 128 chủng thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm (non-Streptomyces) (chiếm
khoảng 30,19%). Các nghiên cứu trước ñây cho thấy Streptomyces là một trong những
nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong ñất và phân bổ rộng rãi trên thế giới (Hopwood A. D.,
2007). Do vậy tỷ lệ cao của Streptomyces trong bộ sưu tập xạ khuẩn ở Cát Bà khẳng ñịnh
kết luận này.
Nhìn chung, hầu hết các chủng Streptomyces phân lập ñược mọc nhanh và khỏe,
xuất hiện trước tiên trong các ñĩa phân lập và dễ phân lập. Ngược lại, các chủng xạ khuẩn
hiếm (non-Streptomyces) mọc chậm, khuẩn lạc nhỏ, khó phân lập và nuôi cấy. Số lượng
33
xạ khuẩn hiếm thu ñược từ phương pháp ly tâm-hoàn ẩm nhiều hơn bằng phương pháp
sấy khô truyền thống.
Bảng 3.1 Sơ bộ phân loại các chủng xạ khuẩn phân lập ñược
Các nhóm xạ khuẩn Số lượng chủng %
Streptomyces 296 69.81
Xạ khuẩn hiếm (non-Streptomyces)
Micromonospora 27 6.36
Nonomuraea 17 4.00
Nocardia 12 2.83
Kineosporia 8 1.90
Microbispora 7 1.65
Actinomadura 7 1.65
Pseudonocardia 6 1.42
Nocardiopsis 6 1.42
Micrococcus 5 1.18
Streptosporangium 5 1.18
Khác (mỗi loại ít hơn 1%) 28 6.60
Tổng cộng 424 100.00
Xét về mức ñộ ña dạng, chúng tôi nhận thấy các chi Micromonospora, Nonomureae
và Nocardia là các chi chiếm ưu thế trong các chi xạ khuẩn hiếm (non-Streptomyces) thu
thập tại Cát Bà (Bảng 3.1). Các loài thuộc ba chi này cũng thường ñược phân lập ở các
ñịa ñiểm khác ở Việt Nam (Duong V.H., Ando K., 2010).
Các chủng phân lập ñược hiện ñược lưu giữ tại Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật
(Vietnam Type Culture Collection, VTCC), Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học trong
glycerol 20% ở −80 °C.
3.2 Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh
ðể sàng lọc các chủng sinh kháng sinh, 4 chủng vi sinh vật ñại diện cho vi khuẩn
Gram âm và dương; nấm và nấm men ñã ñược lựa chọn làm vi sinh vật kiểm ñịnh.
Bước sàng lọc ñầu tiên ñược thực hiện bằng phương pháp mảnh thạch như ñã mô tả
ở chương II. Qua ñó cho thấy trong 424 chủng xạ khuẩn nghiên cứu chỉ có 115 chủng
34
(chiếm khoảng 27,12%) cho hoạt tính ñáng kể kháng ít nhất một trong bốn vi sinh vật
kiểm ñịnh.
Tiếp theo 115 chủng này ñược dùng làm ñích cho bước sàng lọc thứ hai sử dụng
phương pháp khuếch tán dịch nuôi cấy. Một số hình ảnh ñại diện cho bước phân tích này
ñược trình bày ở hình 3.1. Từ bước sàng lọc này 17 chủng thể hiện hoạt tính tương ñối
cao với ít nhất hai trong bốn vi sinh vật kiểm ñịnh ñã ñược lựa chọn. Hoạt tính tương ñối
của các chủng này ñược trình bày ở bảng 3.2.
Hình 3.1. ðánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn
Một số hình ảnh tiêu biểu minh họa cho phương pháp khuếch tán dịch nuôi cấy.
Trong số 17 chủng chọn lọc ñược, 14 chủng có hoạt tính kìm hãm vi khuẩn Gram
âm (E. coli), 14 chủng kìm hãm vi khuẩn Gram dương (M. luteus) và 11 chủng có hoạt
tính kháng cả hai nhóm vi khuẩn. Với các tế bào nhân thật, gồm nấm (F. oxysporium) và
nấm men (C. albicans), 12 chủng có hoạt tính kháng nấm và chỉ 6 chủng có hoạt tính
kháng nấm men (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật của 17 chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược
Hiệu quả ức chế vi sinh vật ki ểm ñịnh (ñường kính vòng kìm hãm, mm)
Chủng
E. coli M. luteus F. oxysporium C. albicans
A45 10 0 6 0
A149 8 6 0 0
A154 8 8 0 0
A160 0 6 0 10
A232 6 7 0 12
A390 10 10 18 0
A396 8 12 0 0
A410 24 0 10 0
A427 16 0 12 0
E. coli F. oxysporium M.luteus C. albicans
35
A444 0 7 8 0
A1018 0 40 10 16
A1022 16 30 10 0
A1041 22 28 6 0
A1043 8 32 6 0
A1073 21 30 10 10
A1393 14 18 14 6
A1470 15 26 12 0
Kết quả còn cho thấy 9 trong số 17 chủng chọn lọc ñược có hoạt tính mạnh với cả vi
khuẩn và nấm (ñường kính vòng kìm hãm > 10 mm). ðặc biệt là hai chủng A1073 và
A1393 kìm hãm cả bốn chủng vi sinh vật kiểm ñịnh (bảng 3.2, các dòng ñược bôi ñậm).
3.3. Hiệu quả tách chiết dịch nuôi cấy các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược
17 chủng chọn lọc ñược ñã ñược tiến hành nuôi cấy lỏng và sơ bộ tách chiết dịch
ngoại bào ñể tiến hành các phân tích tiếp theo. Hiện nay có nhiều công bố liên quan ñến
việc tách chiết các chất có hoạt tính sinh học nguồn gốc từ vi sinh vật. Qua tham khảo tài
liệu chúng tôi nhận thấy ethyl acetate thường ñược sử dụng trong bước ñầu tiên khi tách
chiết hợp chất có hoạt tính kháng sinh từ vi sinh vật. Ethyl acetate ñược coi là một trong
những dung môi hữu cơ tương ñối ít ñộc hại, dễ loại bỏ do có ñộ bay hơi cao và là dung
môi ñược dùng phổ biến trong tách chiết nhiều chất hóa học. Ethyl acetate hiện ñược sử
dụng trong nhiều ngành công nghiệp trong ñó có cả công nghiệp thực phẩm (làm bánh
kẹo). Vì vậy sử dụng dung môi này sẽ an toàn cho người thực hiện (Dutia, Pankaj, 2004).
Do ñó chúng tôi ñã lựa chọn ethyl acetate làm dung môi ñể chiết các chất tan trong dịch
nuôi thu ñược từ các chủng chọn lọc ñược. Quy trình tách chiết ñã ñược mô tả chi tiết ở
chương II. Hiệu quả tách chiết các chất tan trong ethyl acetate ñược trình bày ở bảng 3.3.
Qua ñó cho thấy từ 01 lít dịch nuôi cấy (sau khi ñã loại bỏ tế bào) thu ñược từ vài chục
miligram ñến vài gram chất tan trong ethyl acetate. So với chất khô thì lượng chất tan này
chiếm từ 0,5% ñến gần 15% tùy theo từng chủng xạ khuẩn. Trong ñó dịch nuôi của chủng
A396 có tỷ lệ chất tan này cao nhất (14,89%), còn thấp nhất là chủng A154 (chỉ chiếm
0,51%).
Bảng 3.3. Hiệu quả tách chiết dịch nuôi các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược
(từ 1 lít dịch nuôi ñã loại tế bào)
TT Chủng Chất khô (gam) Chất tan trong
ethyl acetate (mg)
Phần trăm so với chất khô (%)
36
1 A45 5,040 504,76 10,02
2 A149 33,445 103,20 3,09
3 A154 5,883 30,15 0,51
4 A160 14,114 72,96 0,52
5 A232 16,556 158,76 0,96
6 A390 13,076 361,40 2,76
7 A396 6,209 924,64 14,89
8 A410 9,699 113,60 1,17
9 A427 18,238 101,92 0,56
10 A444 18,413 2152,36 11,69
11 A1018 28,650 544,96 1,90
12 A1022 30,076 257,04 0,85
13 A1041 25,825 268,64 1,04
14 A1043 23,413 310,40 1,33
15 A1073 30,333 388,72 1,28
16 A1393 28,911 309,04 1,07
17 A1470 20,348 726,80 3,57
3.4. Phân tích sắc ký dịch nuôi các chủng xạ khuẩn chiết trong ethyl acetate
3.4.1. Sắc ký bản mỏng (TLC)
Chất chiết ñược từ dịch ngoại bào của 17 chủng xạ khuẩn sau khi hòa tan lại trong
chloroform ñã ñược cho chạy TLC cùng với các ñối chứng là chloramphenicol,
kitasamycin, erythromycin và chất chiết dịch ngoại bào chủng A16 ñược coi là ñối chứng
cho anthracycline. Kết quả ñược trình bày trên hình 3.2.
Kết quả thu ñược cho thấy phổ các băng TLC của 17 chủng rất khác nhau. Số băng
thu ñược dao ñộng từ 1 ñến 4 băng. Có 8 chủng (A149, A154, A160, A232, A410, A427,
A1073, A1393) chỉ cho 1 băng, 3 chủng (A396, A444, A1018) cho phổ có 2 băng, 4
chủng (A45, A1041, A1043, A1470) cho phổ 3 băng và 2 chủng (A390, A1022) cho phổ
4 băng.
37
Hình 3.2. Phổ TLC chất chiết từ dịch ngoại bào của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược. A, B và C – phổ TLC dưới ánh sáng UV. D – phổ minh họa các băng ñược hiển thị. Viết tắt: CAP-Chloramphenicol; Kita-Kitasamycin; Ery-Erythromycin; các số biểu diễn số của tên chủng. Mũi tên chỉ hướng pha ñộng.
So sánh với từng ñối chứng chúng tôi nhận thấy:
- Chloramphenicol cho phổ TLC chỉ gồm 01 băng. Trong 17 mẫu nghiên cứu chỉ có
mẫu A396 (có hai băng) là có băng có cùng ñộ di ñộng tương ñối với kháng sinh
này.
- Kitasamycin cho một phổ hai băng. Không có mẫu nào trong 17 mẫu nghiên cứu có
phổ TLC cũng như băng sắc ký trùng với phổ hay băng của kháng sinh này.
- Erythromycin cũng có phổ gồm hai băng nhưng có ñộ di ñộng tương ñối nhỏ hơn
so với hai băng của kitasamycin. Có hai mẫu có băng tương tự với băng nhận ñược
từ erythromycin. ðó là băng có ñộ di ñộng tương ñối thấp nhất (tức băng chậm
D
38
nhất) của A45 (cùng ñộ di ñộng với băng chậm của kháng sinh này) và băng duy
nhất của A410 trùng với băng nhanh của kháng sinh này.
- Chất chiết từ chủng A16 cho phổ TLC gồm 5 băng. Trong số 5 băng này có 2 băng
(băng thứ hai và băng thứ năm tính từ phía xuất phát) là không tìm thấy ở bất kỳ
phổ TLC nào của 17 mẫu nghiên cứu. Ba băng còn lại có thể quan sát thấy ở mẫu
A1043 (băng thứ nhất); A232, A390, A1018 và A1022 (băng thứ ba); A45, A427,
A1018, A1022 và A1470 (băng thứ tư). Như vậy trong 17 mẫu nghiên cứu có hai
mẫu (A1018 và A1022) có 2 băng TLC trùng với 2 băng của mẫu ñối chứng này.
Như vậy qua phân tích TLC dường như các hợp chất chiết ñược không hoàn toàn tương
ñồng với một trong các kháng sinh ñược dùng làm chuẩn trong nghiên cứu này. Tuy nhiên
ñể trả lời chính xác liệu các hợp chất ñó có phải là các chất ñã biết hay là các hợp chất
mới cần phải có các phân tích sâu hơn.
3.4.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Tiếp theo nhằm tìm hiểu sâu hơn các hợp chất tách chiết ñược từ xạ khuẩn, chúng
tôi ñã tiến hành chạy HPLC của các mẫu với cùng ñiều kiện sắc ký của các chất chuẩn (là
các kháng sinh như ñã ñề cập ở phần phân tích TLC).
Với các ñiều kiện chạy HPLC như ñã mô tả ở phần phương pháp, kết quả phân tích
ñược tổng kết ở bảng 3.4, sắc ký ñồ ñược ñính kèm ở phần phụ lục của báo cáo.
Bảng 3.4. Tổng kết kết quả phân tích HPLC chất chiết từ các chủng xạ khuẩn chọn
lọc ñược
TT
Chất chuẩn/chủng
Số lượng ñỉnh thu ñược
Thời ñiểm
thôi của các ñỉnh
chính (phút)
Tỷ lệ so với tổng số thu ñược
Ghi chú
I Kitasamycin 7 3.714
4.427
17,77 %
62,82 %
1 A232 3 7.062
7.291
7.662
10,65 %
54,83 %
34,03 %
các ñỉnh không tách rõ rệt
2 A390 2 7.276
7.672
7.276 %
7.672 %
các ñỉnh không tách rõ rệt
39
3 A1018 5 5.723
6.174
64,09 %
28,67 %
4 A1041 6 6.456
6.648
7.266
7.622
5,28 %
6,92 %
50,77 %
36,10 %
5 A1073 5 7.266
7.619
8.180
55,60 %
40,53 %
3,2 %
6 A1393 5 7.293
7.641
60,43 %
38,50 %
các ñỉnh ko tách rõ rệt
7 A1470 4 3.396
3.898
5.877
5,61 %
22,47 %
71,46 %
không tách tốt
8 Các chủng còn lại (10 chủng và chủng ñối chứng A16)
không tách rõ rệt
II Erythromycin 6 3.117
3.357
53%
24,7%
1 A149 11 8.661
9.166
50%
40%
nhưng không tách biệt hoàn toàn
2 A154 5 9.107 96% nhưng không tách tốt
3 A160 8 8.789 94% nhưng không tách tốt
4 A232 9 3.925
4.054
21.19%
71.16%
5 A390 11 4.024 88,53%
6 A396 8 phân ñoạn từ 6 – 12 phút không tách
7 A427 12 3.363
4.775
8.607
8,98%
6,70%
70%
nhưng không tách
8 A444 8 3.044 1,2 %
40
3.339
9.107
1,1 %
93%
nhưng không tách
9 A1018 10 3,999
4.063
5.892
26,34 %
56,95 %
6,68 %
10 A1022 13 3.977
4.567
5.755
62,58 %
11,49 %
14,49 %
11 A1041 10 3.985 81,25%
12 A1043 8 3.333
8.585
2%
86%
nhưng không tách tốt
13 A1073 11 4.011 84,89 %
14 A1393 12 4.007 81,85%
15 A1470 8 3.038
3.343
9.467
1%
2,38%
93,62%
nhưng không tách tốt
16 A16: chủng ñối chứng dương
8 9.539 95% nhưng không tách tốt
17 Các chủng còn lại: 2 chủng không tách tốt
III Chloramphenicol 1 5.498 100%
1 A232 10 1.186
4.192
5.153
5,16 %
62,27 %
15,60 %
2 A390 7 1.195
4.190
29,61 %
66,82 %
3 A396 8 3.609
3.876
4.464
5.407
6.185
10.852
6,15 %
18,64 %
17,96 %
4,33 %
11,04 %
40,22 %
4 A1018 8 1.184 8,65 %
41
4.210
5.905
8.212
60,80 %
16,31 %
11,08 %
5 A1022 12 1.195
4.189
5.876
8.174
4,55 %
36,76 %
28,13 %
25,72 %
6 A1041 9 1.182
4.111
10,23 %
71,33 %
7 A1073 7 1.201
4.193
16,14 %
66,39 %
8 A1393 7 1.201
4.193
17,59 %
80,14 %
9 Các chủng còn lại: 9 chủng và chủng ñối chứng dương A16
không tách tốt
Qua phân tích kết quả thu ñược từ HPLC, chúng tôi nhận thấy các hợp chất thu ñược
từ các chủng xạ khuẩn nghiên cứu chưa thể khẳng ñịnh thuộc vào nhóm nào trong số các
chất chuẩn ñã sử dụng, trừ mẫu A396 có một ñỉnh (thôi ở 5.476 phút) tương ứng với
chloramphenicol (Hình 3.3). Kết quả này cũng ñược khẳng ñịnh từ phân tích TLC (Hình
3.2).
Hình 3.3. Phổ HPLC của chloramphenicol (A) và chất chiết từ dịch nuôi chủng A396 (B)
Abs
270
A B
Thời gian (phút)
42
3.5. ðặc ñiểm nhận dạng của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược
ðối với nghiên cứu về vi sinh vật, việc ñịnh loại là hết sức quan trọng. Như ñã trình
bày ở phần 3.1 (ða dạng sinh học của các chủng xạ khuẩn phân lập ở Cát bà), trong 424
chủng phân lập ñược có khoảng 70% thuộc Streptomyces còn lại là xạ khuẩn hiếm (non-
Streptomyces). Sau ñây là các thông tin cụ thể hơn về 17 chủng chọn lọc ñược trong bộ
sưu tập nói trên. 17 chủng chọn lọc ñược chỉ thuộc 2 chi là Streptomyces (10 chủng) và
chi Nonomuraea (7 chủng).
3.5.1 ðặc ñiểm hình thái của các chủng thuộc Streptomyces
Như ñã trình bày, các chủng xạ khuẩn phổ biến (Streptomyces) có ñặc ñiểm hình
thái ñiển hình có thể dùng ñể nhận dạng [11], [29]. Từ các ñặc ñiểm ñó 10 chủng (gồm
A390, A410, A427, A1018, A1022, A1041, A1043, A1073, A1393 và A1470) trong số
17 chủng chọn lọc ñược thuộc về chi Streptomyces.
Các khuẩn lạc của các chủng này rất khác biệt về mặt kích thước (trong hoặc bầu
dục), bề mặt khuẩn lạc (mềm, cứng, nhăn nheo, cấu trúc hạt), và ñộ dày (phồng hay dẹt).
Các khuẩn lạc tạo thành hệ sợi cơ chất và sợi khí sinh với các loại màu khác nhau như
trắng, vàng, ñỏ hoặc nâu. Các khuẩn lạc này ñược phủ kín bởi một lớp sợi khí sinh hoặc
ñường ñồng tâm. Kích thước khuẩn lạc phụ thuộc vào các chủng và ñộ tuổi nhưng dao
ñộng từ vài mm ñến 1 cm (hình 3.4).
Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc một số chủng Streptomyces
Liên quan ñến việc tạo thành hệ sợi khí sinh và chuỗi bảo tử, 10 chủng Streptomyces
này tạo thành hệ sợi khí sinh với các chuỗi bào tử dài trên môi trường thạch YS. ðặc ñiểm
bào tử và chuỗi bào tử ñược quan sát dưới kính hiển vi phản pha (hình 3.5).
A1018
A1073
(A) A1018
(B) A390
A1043 A390 A1073 A1018
43
Hình 3.5. Hệ sợi mang bào tử của một số chủng Streptomyces A, B – Dạng thẳng; C, D – Dạng hình xoắn của sợi mang bào tử
Dựa trên quan sát dưới kính hiển vi, chuỗi bào tử của các chủng Streptomyces có thể
chia thành hai loại:
- Dạng thẳng (Hình 3.5.A và B) có chuỗi bào tử thẳng hoặc ngoằn ngoèo, hệ sợi khí
sinh phân nhánh màu trắng. Các chủng thuộc nhóm này gồm A390, A427, A1018, A1022,
A1393 và A1470.
- Dạng xoắn (hình 3.6. D và D) có hệ sợi khí sinh tạo thành sợi mang bào tử phân
nhánh có hình móc, vòng mở, các xoắn dài, rộng hay vuốt dài (hình 3.5.C) hoặc các xoắn
với 3 -5 vòng (hình 3.5.D). Các chủng thuộc loại này gồm A410, A1041, A1043 và
A1073.
Các bào tử có hình bầu dục hoặc hình xoắn, sắp xếp thành chuỗi dài. Không quan
sát thấy các cấu trúc ñặc biệt khác như túi bào tử hay các cơ quan dự trữ.
Thông tin chi tiết về ñặc ñiểm nhận dạng của các chủng thuộc chi Streptomyces
ñược tổng hợp ở Bảng 3.5.
44
Bảng 3.5. Các ñặc ñiểm nhận dạng của 10 chủng thuộc chi Streptomyces
TT Chủng ðặc ñiểm khuẩn lạc ðặc ñiểm chuỗi bào tử
1 A390 ñường kính 0,5cm, màu tím nhạt, có sợi khí sinh, bề mặt khuẩn cao
Dạng thẳng
2 A410 ñường kính 0,2 cm, bề mặt phẳng, sợi khí sinh tâm màu xám, vòng ngoài màu trắng, các khuẩn lạc già tạo những giọt dịch thể màu nâu ở tâm khuẩn lạc
Dạng xoắn
3 A427 ñường kính 0,2 cm - 0,3 cm, bề mặt lồi, xung quanh có màu trắng, sợi cơ chất màu trắng
Dạng thẳng
4 A1018 ñường kính 0,1 cm, khí sinh màu trắng xám, cơ chất màu be
Dạng thẳng
5 A1022 ñường kính 0,2 cm, sợi khí sinh màu trắng sau chuyển sang vàng, tâm khuẩn lạc già tạo giọt nước, cơ chất màu vàng nâu
Dạng thẳng
6 A1041 ñường kính 0,3 cm - 0,5cm, sợi khí sinh màu xám, bề mặt hơi dẹt
Dạng xoắn
7 A1043 ñường kính 0,1 cm - 0,2cm, sợi khí sinh màu nâu, bề mặt hơi dẹt
10 A1470 ñường kính 0,3cm, bề mặt lồi, sợi khí sinh xung quanh màu xám, tâm màu trắng
Dạng thẳng
3.5.2 Giải trình t ự 16S rDNA ñối với các chủng xạ khuẩn thuộc chi Nonomuraea
Như ñã trình bày ở phần 3.1. phương pháp sinh học phân tử (giải trình tự và so sánh
16S rDNA ñã ñược dùng ñể phân biệt các chủng thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm. ðiều thú vị
là cả 7 chủng thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm chọn lọc ñược lại cùng thuộc chi Nonomuraea.
Quan hệ di truyền giữa các chủng này ñược trình bày ở hình 3.6. và qua ñó cho thấy 7
chủng này có thể chia thành 5 nhóm.
Tóm lại, mặc dù bộ sưu tập xạ khuẩn từ Cát Bà có mức ñộ ña dạng về phân loại
nhưng các chủng có hoạt tính kháng vi sinh vật cao chỉ thuộc về hai chi Streptomyces và
Nonomuraea.
45
Hình 3.6. Cây chủng loại phát sinh trình tự rDNA 16S cho thấy vị trí của 7 chủng xạ khuẩn hiếm trong chi Nonomuraea
Giá trị tại các ñiểm phân nhánh lớn hơn 500 ñược biểu diễn trên cây. Thước ño là 5% khác biệt trong trình tự DNA. Microbispora parva ñược chọn làm gốc phân nhánh
3.6. Sàng lọc khả năng sinh anthracycline của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược
Một trong những nhóm kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn hiện ñang ñược sử
dụng ñể ñiều trị nhiều loại ung thư là anthracycline. ðể bước ñầu tìm hiểu xem liệu 17
chủng chọn lọc ñược có chủng nào sinh anthracycline không chúng tôi ñã tiến hành phép
thử ñặc hiệu với nhóm hợp chất này – thử nghiệm biến ñổi màu phụ thuộc vào pH.
Nguyên tắc của phép thử này là ở chỗ do có mặt của vòng anthraquinone trong cấu tạo
hóa học, các anthracycline thay ñổi màu sắc theo pH của môi trường, cụ thể là có màu da
cam ở pH acid và màu tím khi ở pH base.
Trên cùng ñĩa nuôi, hai pH khác nhau ñược tạo thành bằng cách nhỏ dung dịch acid
và base vào hai giếng ñược ñục ở chỗ khuẩn lạc mọc tốt. Sau khoảng 20 phút quan sát
màu sắc quanh các giếng ñể có kết luận bước ñầu về kháng sinh mà chủng xạ khuẩn ñó
sinh ra. Kết quả cho thấy, trong 17 chủng nghiên cứu chỉ có 2 chủng (A1018 và A1073) là
thể hiện phản ứng này tức chuyển màu da cam khi có pH acid và màu tím khi có pH base
46
(hình 3.7). Như vậy, rất có thể hợp chất do hai chủng xạ khuẩn này sinh ra thuộc nhóm
kháng sinh anthracycline.
Hình 3.7. Sự thay ñổi màu sắc theo pH môi trường của các chủng A1018 và A1073. A: giếng có pH acid; B: giếng có pH base. A16 – chủng ñối chứng sinh anthracyclin.
3.7. Các nghiên cứu liên quan ñến các chủng có hoạt tính gây ñộc tế bào
3.7.1. Hoạt tính gây ñộc tế bào
Như vậy, qua các nghiên cứu ở trên có ba chủng xạ khuẩn ñược thấy là có tiềm
năng sinh chất kháng sinh kháng ung thư là A1018, A1022 và A1073. Trong ñó A1022 có
phổ TLC gần với chủng ñối chứng sinh anthracycline A16 (xem mục 3.4.1); A1018 vừa
có phổ TLC tương tự ñối chứng lại vừa ñược chọn từ phép thử thay ñổi màu do thay ñổi
pH (xem các mục 3.4.1 và 3.6); còn A1073 thì ñược lựa chọn từ phép thử pH (xem mục
3.6).
Các chất chiết từ dịch nuôi của ba chủng này và của chủng ñối chứng sinh
anthracycline (A16) ñược gửi thử nghiệm hoạt tính gây ñộc tế bào tại Phòng Sinh học
thực nghiệm, Viện Hóa các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Quy trình thử nghiệm, các dòng tế bào dùng trong thử nghiệm ñã ñược trình bày ở
phân phương pháp của báo cáo này. Kết quả nhận ñược cho thấy cả 4 chất chiết từ dịch
nuôi các chủng ñều có kết quả dương tính với cả 3 dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2),
ung thư phổi (Lu) và ung thư cơ vân tim (RD) của người (bảng 3.6).
Hoạt tính gây ñộc tế bào ung thư ñược thể hiện thông qua phần trăm tế bào sống
sót và IC50 (trong trường hợp này ñược hiểu là nồng ñộ chất làm chết 50% tế bào). Trong
ñó chủng A1073 cho hoạt tính cao nhất và cao một cách có nghĩa so với hai chủng còn lại
mà chúng tôi lựa chọn thử nghiệm. Hoạt tính của A1073 tương ñương với chủng ñối
47
chứng A16. Cả ba chủng ñều có hiệu quả gây ñộc cao với dòng RD – ung thư cơ vân tim.
ðiều thú vị là khi sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh ba chủng này cũng là các
chủng thể hiện hoạt kháng vi sinh vật nhân thật (tức F. oxysporium và C. albicans) khá
cao. Vậy phải chăng có mối liên hệ giữa hoạt tính kháng vi sinh vật và hoạt tính kháng tế
bào ung thư? Cho ñến nay chưa có tài liệu nào ñề cập ñến mối liên hệ này.
Bảng 3.6. Kết quả xác ñịnh hoạt tính gây ñộc tế bào
Dòng tế bào TT Mẫu
Hep-G2 Lu RD
Kết luận
Phần trăm sống sót (%) 1 Chứng âm (DMSO) 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 Âm tính 2 Chứng dương 1,8 ± 0,5 1,2 ± 0,1 0,5 ± 0,0 Dương tính 3 Chất chiết từ dịch
nuôi chủng A1018 12,3 ± 0,6 7,6 ± 0,1 0,0 ± 0,0 Dương tính với cả
3 dòng 4 Chất chiết từ dịch
nuôi chủng A1022 50,1 ± 0,2 25,1 ± 0,7 0,0 ± 0,0 Dương tính với cả
3 dòng 5 Chất chiết từ dịch
nuôi chủng A1073 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 Dương tính với cả
3 dòng 6 Chất chiết từ dịch
nuôi chủng A16 0,6 ± 0,4 3,9 ± 0,0 0,0 ± 0,0 Dương tính với cả
3 dòng Giá trị IC50 (µg/ml) 1 Chứng dương 0,310 0,420 0,220 Dương tính 2 Chất chiết từ dịch
nuôi chủng A1018 4,170 1,440 2,700 Dương tính với cả
3 dòng 3 Chất chiết từ dịch
nuôi chủng A1022 20,000 5,250 0,446 Dương tính với cả
3 dòng 4 Chất chiết từ dịch
nuôi chủng A1073 0,510 0,450 0,550 Dương tính với cả
3 dòng 5 Chất chiết từ dịch
nuôi chủng A16 0.585 0.545 0.469
Dương tính với cả 3 dòng
Chứng dương: là một trong những chất có khả năng diệt tế bào (ellipithine, vinblastine hoặc taxol) pha trong DMSO. Hep-G2: dòng tế bào ung thư gan, Lu: dòng tế bào ung thư phổi, RD: dòng tế bào ung thư cơ vân tim. IC50: nồng ñộ chất làm chết 50% tế bào ung thư.
3.7.2. Phân tích HPLC các hợp chất chiết từ dịch nuôi của các chủng có hoạt tính
kháng tế bào ung thư
Sau khi ñã nhận ñược kết quả khả quan khẳng ñịnh khả năng gây ñộc tế bào ung thư,
các chủng A1018, A1022 và A1073 ñược tiếp tục nuôi với thể tích lớn nhằm thu ñược
nhiều hơn chất tan trong ethyl acetate. Các chất tan này sau ñó ñược tiến hành sắc ký trên
48
HPLC ñể so sánh với cơ sở dữ liệu hiện có tại ðại học Tổng hợp Osaka nhằm tìm hiểu
bản chất của các chất này. Các ñiều kiện sắc ký ñã ñược trình bày chi tiết ở phần phương
pháp (2.2.5.2.b). Kết quả sắc ký ñược tổng kết trong bảng 3.7, sắc ký ñồ ñược trình bày
trong hình 3.8; 3.9 và 3.10.
Bảng 3.7. Tổng kết kết quả phân tích HPLC chất chiết từ dịch nuôi của 3 chủng có