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Bakterielle Infektionen und Pathogeninaktivierung
Prof. Harald Klüter Institut für Transfusionsmedizin und Immunologie
• Amplifikation in einer hoch konservierten Genomregion
• Universell bei Mikroorganismen
• z. B. 16s DNA
• Nachweisgrenze 16 - 500 Bakterien pro ml
• Zeitdauer bis zum Nachweis: ca. 2-3 Stunden
Schnell-Methode
PEI: negative Testung – TK-Haltbarkeit Tag 5
• Durchflussbasierte Nachweismethode
• Prinzip: Ein nicht fluoreszenzierendes Fluorochrom gelangt durch die intakte Zellmembran in die lebendende Zellen. Der Farbstoff wird durch die zellinterne Esteraseaktivität umgewandelt und fluoresziert.
• Nachweis gram - positiver und - negativer Bakterien
• PEI: negative Testung – TK-Haltbarkeit Tag 5
Bacti Flow
Schnell-Methode
Bakterien-Screening-Methoden
• Zeitaufwändig bevor das Ergebnis vorliegt
• Hohe Sensitivität (1 cfu/ml)
• Vermehrung der Bakterien in-vitro
• geringere Bakterienlast ausreichend
• PROBENNAHMEFEHLER
Inkubationsmethode
Schnellmethode • Ergebnis liegt schnell vor
• niedrigere Sensitivität
• keine Bakterienvermehrung in-vitro
• hohe Bakterienlast notwendig
• PROTHRAHIERTE PROBENNAHME
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Pathogeninaktivierung
• Effektive Inhibierung von Pathogenen (Viren, Bakterien und Parasiten)
• Erhalt der biologischen Funktion der Blutkomponente (Erythrozyten, Thrombozyen, Plasmaproteine) über den Lagerungszeitraum
Seghatchian et al. Transfus Med Hemother 2011;38:55-64
Hellstern et al. Transfus Med Hemother 2011;38:65-70
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Pathogeninaktivierungsverfahren
80er – Jahre
• Entwicklung neuer Verfahren
• Erhalt der biologischen Funktion auch
von zellhaltigen Blutkomponenten
(Erythrozyten, Thrombozyten)
Pathogeninaktivierungsmethoden
• Viren, Bakterien, Protozoen und Leukozyten benötigen DNA bzw. RNS für die Proteinbiosynthese bzw. zur Replikation.
• Eine Nukleinsäurefunktion ist nicht erforderlich für die biologische Funktion von Erythrozyten, Thrombozyten und Plasmaproteinen.
Prinzip
Zugabe photoaktiver Substanzen und Lichtbestrahlung - direkte Schädigung des Pathogens - Schädigung des Genoms (DNA / RNA)
Eine Zellvermehrung ist nicht mehr möglich
Pathogeninaktivierungsmethoden
• Mirasol
Riboflavin (Vitamin B2) + Licht (265-370 nm)
à Plasma
à Thrombozytenkonzentrate
à Erythrozytenkonzentrate
• Psoralen S-59 (Amotosalen-HCL)
+ UV-A Licht (320-400 nm)
à Thrombozytenkonzentrate
à Plasma
• Psoralen S-303 (FRALE) à Erythrozytenkonzentrate
• UV-C Licht (245 nm) à Thrombozytenkonzentrate
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Pathogeninaktivierungsmethoden
• Mirasol
Riboflavin (Vitamin B2) + Licht (265-370 nm)
à Plasma
à Thrombozytenkonzentrate
à Erythrozytenkonzentrate
• Psoralen S-59 (Amotosalen-HCL)
+ UV-A Licht (320-400 nm)
à Thrombozytenkonzentrate
à Plasma
• Psoralen S-303 (FRALE) à Erythrozytenkonzentrate
• UV-C Licht (245 nm) à Thrombozytenkonzentrate
N
N
N
N CH 3
CH 3
O
H
O
CH 2
CHOH
CHOH
CHOH
CH 2 OH
Riboflavin (Vitamin B2) + Licht (265-370 nm)
Essentieller Nahrungsbestandteil - täglich empfohlene Menge ist 1,7 mg
Prinzip: Mirasol - Riboflavin und Licht (265-370 nm)
Ito et. al. J Biol Chem 1993; 268: 13221
Pathogen Riboflavin
Elektronenübertragung von der chemisch wirksamen Substanz auf das Pathogen - direkte Zellschädigung
- Genombrüche aufgrund der Interaktion mit der photoaktiven Substanz Energieübertragung von der chemisch wirksamen Substanz auf Sauerstoffmoleküle. Die dabei entstehende aktivierte Form (Singuletzustand) ist reaktiv und kann Lipide, Proteine und DNA/RNA-Basen oxidieren
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Herstellungsprozess
Zugabe der Riboflavinlösung
Bestrahlung ca. 6-10 Min
Thrombozytenkonzentrat
Transfusion
Riboflavin
• Geeignet für die Pathogeninaktivierung von Thrombozyten- und Erythrozytenkonzentraten sowie Plasma
• Überschuss an Riboflavin wird nicht aus dem Präparat entfernt, da sowohl das Vitamin als auch die Photoprodukte (Lumichrome) als unbedenklich angesehen werden
Pathogeninaktivierungsmethoden
• Mirasol
Riboflavin (Vitamin B2) + Licht (265-370 nm)
à Plasma
à Thrombozytenkonzentrate
à Erythrozytenkonzentrate
• Psoralen S-59 (Amotosalen-HCL)
+ UV-A Licht (320-400 nm)
à Thrombozytenkonzentrate
à Plasma
• Psoralen S-303 (FRALE) à Erythrozytenkonzentrate
• UV-C Licht (245 nm) à Thrombozytenkonzentrate
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Amotosalen-HCl - Wirkmechanismus
Amotosalen- HCl
UV-A Bestrahlung
Kreuzvernetzungen mit DNA/RNA Wollowitz S. Semin Hematol 2001;38(S11):4-11
Herstellungsprozess CAD - Abreicherung der
Photoprodukte 4-16 Std.
.
7.
Thrombozytenkonzentrat
Pathogeninaktivierungsmethoden
• Mirasol
Riboflavin (Vitamin B2) + Licht (265-370 nm)
à Plasma
à Thrombozytenkonzentrate
à Erythrozytenkonzentrate
• Psoralen S-59 (Amotosalen-HCL)
+ UV-A Licht (320-400 nm)
à Thrombozytenkonzentrate
à Plasma
• Psoralen S-303 (FRALE) à Erythrozytenkonzentrate
• UV-C Licht (245 nm) à Thrombozytenkonzentrate
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Psoralen S-303 - Wirkmechanismus
• niedriger pH – S 303 • Zugabe zum Erythrozytenkonzentrat - pH Veränderung – Aktivierung von S-303 • Anchor bindet an das Genom • Kreuzvernetzung des Effektorteils mit dem Genom • Abspaltung von Anchor und Linker • Anchor - Linker stellen ein nicht reaktives Produkt dar
Herstellungsprozess
Step 1: Zugabe von GSH (Gluthation) und S -303 zum Erythrozytenkonzentrat
Step 2: Das Erythrozytenkonzentrat wird in ein Zwischenlagerungsbeutel überführt – Inkubation bis zu 20 Std. bei 20–25°C. Step 3: Überstand wird nach Zentrifugation abgepresst
Step 4: Das Erythrozytenkonzentrat wird in den Endlagerungsbeutel überführt
Degeneration von S-303 in S-300
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Pathogeninaktivierungsmethoden
• Mirasol
Riboflavin (Vitamin B2) + Licht (265-370 nm)
à Plasma
à Thrombozytenkonzentrate
à Erythrozytenkonzentrate
• Psoralen S-59 (Amotosalen-HCL)
+ UV-A Licht (320-400 nm)
à Thrombozytenkonzentrate
à Plasma
• Psoralen S-303 (FRALE) à Erythrozytenkonzentrate
• UV-C Licht (245 nm) à Thrombozytenkonzentrate
• Thrombozytenkonzentraten Phase III Studien in Planung
• Plasma
erste Versuche
UV-C Licht (254 nm)
Amotosalen Riboflavin UV-C
Thrombozyten-konzentrat
Amotosalen HCl (S-59) + UVA
PEI: Zulassungen vorhanden
Europa: Phase III
Deutschland: In-Vitro
In Planung:
Phase III
Plasma Amotosalen HCl (S-59) + UVA
PEI: Zulassungen beantragt
Prä-klinisch
Erste Versuche
Erythrozyten-konzentrat
FRALE (S-303)
Klinische Studien Phase III geplant
Prä-klinisch
Vollblut Erste Ergebnisse Klinische Studien sind geplant
Ausblick
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• Erhöhung der Sicherheit der Bluttransfusion
• Behandlung unabhängig von Spenderuntersuchung
• Einführung zusätzlicher Untersuchungstest nicht nötig
• Abbau überflüssiger Testverfahren
• zusätzliche Kosten der Blutversorgung
• Nebenwirkung der verwendeten Systeme?
• Qualitätssicherung-System noch zu etablieren
Pathogeninaktivierung von Blutpräparaten - Ausblick -
Robert Koch Institut – Arbeitskreis Blut
Votum 16 (V16): Mindestanforderungen zur Sterilitätstestung von Blutprodukten
Probenumfang: 0.4 x n
Flüssigmedien:
Nachweis aeroben / anaerober Bakterien und Pilzen in mind. 2 Medien (Thioglycolat-Nährmedien, Fa. Biomerieux, BactAlert)
Inokulum-Volumen: 5 - 10 ml pro Flasche, 7 Tage, 30-37°C (Automaten)
Bei positivem Befund: Ausstrich auf festem Nährmedium – Bebrütung mind. 48 Stunden
Bei positivem Befund: Keimdifferenzierung Wiederholungsansatz
Robert Koch Institut – Arbeitskreis Blut
Votum 16 (V16): Mindestanforderungen zur Sterilitätstestung von Blutprodukten
Ergebnisinterpretation:
Ist der erste Ansatz einer Sterilkontrolle positiv, sind Wiederholungsansätze ratsam. Bleiben bei der Wiederholungsuntersuchung alle Ansätze steril, wird die Sterilkontrolle als negative bewertet. Bei erneutem Nachweis desselben Keims ist das Ergebnis der Sterilkontrolle positiv.
Wird in der Wiederholungsuntersuchung ein anderer Keim als im ersten Ansatz nachgewiesen, sollte die Sterilkontrollmethode kritisch überprüft werden, da der Verdacht auf Sekundärkontamination besteht.
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Ergebnis der Sterilitätskontrollen Baden-Württemberg – Hessen 2010