17 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret hingga September 2013. Sampling Gracilaria sp., Sargassum sp. dan air laut dilakukan di perairan Santolo dan Sancang, Garut Selatan dan pengukuran parameter lingkungan dilakukan langsung di lokasi. Pengidentifikasian bakteri melalui uji biokimia dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati Institut Teknologi Bandung dan penelitian utama dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran. 3.2 Alat dan Bahan Penelitian 1. Sampling dan pengamatan parameter fisika dan kimiawi lingkungan Alat : Gunting untuk memotong dan mengambil sampel rumput laut. Plastik dan botol sebagai wadah sampel. Alat pengukur pH (pH meter) untuk mengukur derajat keasaman air laut dengan ketelitian 0,1. Kertas label untuk memberi tanda pada sampel. Kontainer pendingin atau cool box untuk menjaga agar sampel tidak membusuk. Termometer skala 0°C-100°C untuk mengukur suhu air laut dengan ketelitian pengukuran 0,1°C. Refraktometer untuk mengukur salinitas air dengan ketelitian pengukuran 0,1. GPS untuk mengetahui posisi sampling. Kamera digital untuk dokumentasi kegiatan. Bahan : Air laut steril Es batu
22
Embed
BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat …media.unpad.ac.id/thesis/230210/2009/230210090015_3_9109.pdfAlkohol 70% Akuades NaCl fisiologis Pewarna gentian violet Lugol Pewarna
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
17
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret hingga September 2013.
Sampling Gracilaria sp., Sargassum sp. dan air laut dilakukan di perairan Santolo
dan Sancang, Garut Selatan dan pengukuran parameter lingkungan dilakukan
langsung di lokasi. Pengidentifikasian bakteri melalui uji biokimia dilakukan di
Laboratorium Mikrobiologi Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati Institut
Teknologi Bandung dan penelitian utama dilakukan di Laboratorium Bioteknologi
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran.
3.2 Alat dan Bahan Penelitian
1. Sampling dan pengamatan parameter fisika dan kimiawi lingkungan
Alat :
Gunting untuk memotong dan mengambil sampel rumput laut.
Plastik dan botol sebagai wadah sampel.
Alat pengukur pH (pH meter) untuk mengukur derajat keasaman air laut
dengan ketelitian 0,1.
Kertas label untuk memberi tanda pada sampel.
Kontainer pendingin atau cool box untuk menjaga agar sampel tidak
membusuk.
Termometer skala 0°C-100°C untuk mengukur suhu air laut dengan
ketelitian pengukuran 0,1°C.
Refraktometer untuk mengukur salinitas air dengan ketelitian
pengukuran 0,1.
GPS untuk mengetahui posisi sampling.
Kamera digital untuk dokumentasi kegiatan.
Bahan :
Air laut steril
Es batu
18
2. Isolasi dan pemurnian bakteri
Alat :
Autoklaf untuk mensterilisasi alat.
Cawan petri untuk tempat pembiakan bakteri.
Erlenmeyer volume 250 ml untuk wadah larutan media.
Plastik tahan panas untuk menjaga agar cairan hasil penguapan tidak
masuk ke dalam alat yang disterilisasi.
Kapas untuk menyumbat erlenmeyer.
Timbangan analitis dengan ketelitian 0,0001 gram untuk menimbang
bahan yang digunakan.
Jarum ose untuk melakukan pemindahan bakteri.
Bunsen untuk mensterilkan jarum ose.
Laminar flow cabinet tempat bekerja proses isolasi bakteri.
Kertas label untuk menamai cawan petri.
Hot plate untuk memanaskan larutan media.
Inkubator untuk menginkubasi bakteri biakan.
Tabung reaksi volume 5 ml sebagai wadah pengenceran dan
menyimpan air laut steril.
Mikropipet untuk mengambil cairan dari sampel yang dihaluskan dalam
jumlah kurang dari 1 ml.
Rak tabung reaksi untuk menyimpan tabung reaksi.
Gelas ukur volume 100 ml untuk mengukur volume larutan.
L Glass untuk meratakan hasil pengenceran pada medium.
Mortar untuk menghaluskan sampel.
Shaker Incubator untuk menghomogenkan dan menginkubasi bakteri
pada kultur cair.
Vortex untuk menghomogenkan larutan.
Plastik wrap untuk menutup cawan petri sehingga dapat meminimalisir
kontaminasi.
Aluminium foil untuk menutup erlenmeyer.
19
Bahan :
Medium bacto agar
Medium pepton bacteriologi
Air laut steril
Akuades steril
KNO3
Alkohol 70%
Sampel rumput laut Gracilaria sp., Sargassum sp. dan air laut
3. Pewarnaan bakteri
Alat :
Objek glass untuk tempat pembuatan preparat.
Pipet untuk meneteskan pewarna.
Mikroskop untuk mengamati preparat.
Bunsen untuk mencegah kontaminasi dan mengeringkan preparat.
Jarum ose untuk mengambil bakteri.
Plastik wrap untuk menutup cawan petri sehingga dapat meminimalisir
kontaminasi.
Bahan :
Alkohol 70%
Akuades
NaCl fisiologis
Pewarna gentian violet
Lugol
Pewarna air fuchsin
4. Pengujian aktivitas agarase
a. Secara Kualitatif
Alat :
Cawan petri untuk wadah medium dan pengujian.
20
Jarum ose untuk memindahkan isolat murni ke cawan petri yang berisi
medium.
Inkubator untuk menginkubasi bakteri.
Bunsen untuk mencegah kontaminasi saat pemindahan bakteri.
Mikropipet untuk meneteskan pereaksi.
Jangka sorong digital untuk mengukur diameter zona bening yang
dihasilkan bakteri.
Plastik wrap untuk menutup cawan petri sehingga dapat meminimalisir
kontaminasi.
Bahan :
Medium POR padat (1.5%)
Pereaksi lugol iodin
b. Secara Kuantitatif
Alat :
Tabung reaksi untuk wadah sampel dan larutan.
Jarum ose untuk memindahkan atau menginokulasi bakteri.
Bunsen untuk mencegah kontaminasi saat pemindahan bakteri.
Shaker incubator untuk tempat menginkubasi bakteri.
Rak tabung reaksi untuk tempat tabung reaksi.
Kuvet wadah larutan dalam pengujian aborbansi menggunakan
spektrofotometer.
Mikropipet untuk meneteskan pereaksi.
Spektrofotometer untuk mengukur aborbansi sampel yang akan diuji.
Laminar flow cabinet tempat bekerja ketika proses isolasi dilakukan.
Bahan :
Medium POR cair (0.1%)
Reagen A : natrium karbonat, natrium kalium tartrat, natrium
bikarbonat, natrium sulfat anhidrat dan air.
Reagen B : tembaga sulfat pentahidrat, air dan asam sulfat pekat.
21
Reagen C : ammonium molibdat, air, asam sulfat pekat, natrium
hidrogen arsenat heptahydrat dan arsenat.
5. Analisis molekuler 16S rRNA
a. Persiapan kultur cair
Alat :
Tabung reaksi wadah kultur cair.
Jarum ose untuk memindahkan bakteri.
Bunsen untuk mencegah kontaminasi saat pemindahan bakteri.
Shaker incubator untuk menginkubasi bakteri.
Laminar flow cabinet tempat bekerja ketika proses isolasi dilakukan.
Bahan :
Medium POR cair (0.1%)
Air laut steril
b. Isolasi DNA
Alat :
Mikro pipet untuk mengambil larutan DNA dan larutan kimia.
Sentrifugasi untuk memisahkan larutan.
Eppendorf untuk menyimpan ekstrak DNA.
Vortex untuk menghomogenkan larutan.
Bahan :
RNAse
TRIS HCl pH 8.5 [200 µM]
NaCl [250 µM]
EDTA [25 µM]
SDS 1%
Na asetat
Etanol absolut
Etanol 70%
TE
22
c. Polymerase Chain Reaction (PCR)
Alat :
Thermal cycler untuk melakukan amplifikasi DNA.
Microtube untuk wadah komponen PCR.
Bahan :
DNA template
Primer forward F (9F) [10mM]
Primer reverse R (1541 dan 1492R) [10mM]
Nuclease free water
PCR master mix (KAPA2G fast ready mix PCR kit)
d. Elektroforesis gel agarosa
Alat :
Gelas ukur volume 100 ml untuk mengukur volume larutan TBE.
Timbangan analitik dengan ketelitian 0,0001 gram untuk menimbang
agarosa.
Cetakan gel agarosa untuk mencetak gel agarosa dan membuat sumur-
sumur.
Microwave untuk memanaskan larutan agarosa.
Alat elektroforesis untuk memisahkan pita DNA dengan bantuan arus
listrik.
Power supply untuk menyalurkan arus listrik.
Ultraviolet transilluminator untuk melihat hasil akhir elektroforesis.
Bahan :
Gel agarosa
Larutan pemberat dan pewarna (loading dye)
Larutan Tris-borat EDTA (TBE) [0.5x]
Ethidium Bromide (EtBr)
DNA ladder 1kb (biolabs)
Akuades
23
3.3 Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode eksploratif untuk
mendapatkan data yang diperlukan.
3.4 Prosedur Penelitian
Alur penelitian yang dilaksanakan adalah sebagai berikut :