Universidad de Zaragoza Centro Politécnico Superior Proyecto Fin de Carrera Ingeniero Químico BIOSÍNTESIS DE LA COCAÍNA: ESTUDIO DE LA FORMACIÓN DE UN PAR COCAÍNA-ÁCIDO CLOROGÉNICO EN ERYTHROXYLUM COCA Autor: JOSÉ CARLOS PARDO TORRE Zaragoza, Junio 2011 Ponente: PROF. JOAQUÍN CORONAS CERESUELA Director: DR. JOHN D’AURIA Instituto Max Planck para la Ecología Química. Departamento de Bioquímica Departamento de Ingeniería Química y Tecnología del Medio Ambiente
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B E ÁCIDO CLOROGÉNICO EN ERYTHROXYLUM COCA · alkaloid biosynthesis” en el Instituto Max Planck para la Ecología Química (Jena, Alemania), estudia la forma de almacenamiento
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Universidad de Zaragoza Centro Politécnico Superior
Proyecto Fin de Carrera
Ingeniero Químico
BIOSÍNTESIS DE LA COCAÍNA: ESTUDIO DE LA FORMACIÓN DE UN
PAR COCAÍNA-ÁCIDO CLOROGÉNICO EN ERYTHROXYLUM COCA
Autor: JOSÉ CARLOS PARDO TORRE
Zaragoza, Junio 2011
Ponente: PROF. JOAQUÍN CORONAS CERESUELA Director: DR. JOHN D’AURIA
Instituto Max Planck para la
Ecología Química.
Departamento de Bioquímica
Departamento de Ingeniería
Química y Tecnología del
Medio Ambiente
A todos los que me han
ayudado a llegar hasta aquí,
en especial, a mis abuelas,
Marina y Maribel.
BIOSÍNTESIS DE LA COCAÍNA: ESTUDIO DE LA FORMACIÓN DE UN
PAR COCAÍNA-ÁCIDO CLOROGÉNICO EN ERYTHROXYLUM COCA
RESUMEN:
Las plantas de la especie Erythroxylum coca producen cantidades de cocaína en torno al 1% en
peso (seco). La importancia socioeconómica que ésta ha tenido a lo largo de la historia del ser
humano y la posibilidad de uso en aplicaciones medicinales hacen de su biosíntesis un tema de gran
interés para la investigación. Además, su carácter tóxico hacia otros seres vivos y su abundancia en
la planta convierten su almacenamiento en objeto de estudio.
Este PFC, llevado a cabo en el grupo de investigación “Biochemistry and evolution of tropane
alkaloid biosynthesis” en el Instituto Max Planck para la Ecología Química (Jena, Alemania), estudia
la forma de almacenamiento de la cocaína en plantas de la especie Erythroxylum coca, partiendo de
la hipótesis de que existe una interacción con el ácido clorogénico que forma la base de este
almacenamiento. Para ello se siguieron tres principales líneas de trabajo.
La primera fue expresar el gen que codifica la enzima –aciltransferasa– responsable de la síntesis
del ácido clorogénico en diferentes sistemas –bacteria y dos tipos de levadura– para después realizar
su caracterización bioquímica. Para ello se utilizaron técnicas de clonación y recombinación de ADN,
cultivo de células y purificación de proteína por cromatografía de afinidad.
La segunda, estudiar la interacción entre el ácido clorogénico y la cocaína, llevando a cabo
medidas de espectrofotometría UV-Visible y de resonancia magnética nuclear.
La tercera, conocer más sobre el lugar de almacenamiento de la cocaína: partes de la planta, fase
de desarrollo de las hojas, capa de tejido celular, etc. para lo cual se utilizaron técnicas histológicas y
de extracción y análisis por cromatografía líquida.
En conjunto, los resultados han permitido conocer más sobre la forma de almacenamiento de la
cocaína, que parece concentrarse en las capas intermedias de las hojas adultas. Igualmente, el
estudio de la interacción con el ácido clorogénico ha permitido determinar la fuerza de la misma en
forma de su constante de equilibrio, y se ha podido conocer que esta interacción se centra en la
parte aromática de ambas moléculas. Además, se caracterizó la enzima EcHQT que cataliza la
formación de ácido clorogénico, obteniendo resultados similares a los de otras enzimas HQT.
Índice de contenidos
i
Índice de contenidos
Agradecimientos ............................................................................................................. iv
Abreviaturas .................................................................................................................... v
fenilalanina, glicina, triptófano, glicina– (D'Auria et al., 2007).
En el caso de E.coca en el grupo de trabajo donde se llevó a cabo este PFC, una biblioteca de
ADNc fue construida a partir de ARNm. En dicha biblioteca se identificaron ocho posibles
aciltransferasas con características comunes a las de la familia BAHD, llamadas EcBAHD por venir de
la especie E.coca. Los marcos abiertos de lectura5 de las ocho EcBAHD fueron clonados en vectores
de expresión en E.coli y posteriormente expresados (Figura 6).
5 Marco abierto de lectura (ORF): Cualquier secuencia de ADN situada entre un codón de inicio y un codón de
terminación. En el texto, cada uno de los ocho ORF a los que se hace referencia es una secuencia de ADN que se espera que sea el gen que codifica una enzima aciltransferasa.
1. Introducción
5
Figura 5: Síntesis del ACG.
Entre las ocho enzimas expresadas, EcBAHD7 y EcBAHD8 mostraron actividad cocaína-sintasa
(Figura 3), y EcBAHD4 mostró actividad hidroxicinamil-CoA quinato: hidroxicinamil transferasa,
abreviada EcHQT para E.coca (Figura 5). Sin embargo, el alto porcentaje de semejanza entre las
secuencias de aminoácidos de las enzimas EcBAHD sugiere llevar a cabo un nuevo análisis para
confirmar que sólo EcBAHD4 tiene actividad HQT.
Figura 6: Expresión de proteína (EcBAHD) en E.coli a partir de ADNc.
1. Introducción
6
1.4 Motivación e interés del PFC
Para poder usar compuestos naturales vegetales en aplicaciones médicas, y para poder después
modificar plantas con fines beneficiosos para el ser humano, es importante conocer cuál es su ruta
de biosíntesis.
Precisamente en el caso de la cocaína, a pesar de la importancia social y económica que
representa, y a pesar de la influencia que E.coca ha tenido en la historia del ser humano, hasta la
fecha muy poco se sabe sobre la ruta de biosíntesis a nivel molecular, genético o enzimático.
El inconveniente del uso de muchos compuestos naturales en aplicaciones medicinales son los
efectos secundarios que presentan, por lo que a menudo la investigación trata de dar con
compuestos similares que no presenten estos inconvenientes.
Diferentes feniltropanos poseen diferentes niveles de toxicidad, diferente duración de los efectos
estimulantes, diferente poder adictivo… Así, análogos de drogas conocidas con menor efecto tóxico
se administran como parte de terapias contra la drogadicción (Figura 7) (Kimmel et al., 2001). Otro
ejemplo de aplicación proviene de la sensación de saciedad que producen muchos feniltropanos,
efecto que podría desarrollarse para producir fármacos que ayuden en tratamientos contra la
obesidad.
Figura 7: Dos compuestos análogos de la cocaína. 2β-carbofenoxi-3β-(4-clorofenil)tropano fue propuesto como posible substituto de la cocaína en terapias de drogadicción.
Precisamente el estudio y caracterización de las enzimas involucradas en la ruta de biosíntesis es
lo que en un futuro puede permitir a la ingeniería genética diseñar enzimas con características
deseadas, siendo capaces de modificar la ruta síntesis, y produciendo de forma eficiente compuestos
beneficiosos para el ser humano.
Además, el hecho de que pocas plantas produzcan metabolitos secundarios en cantidades tan
altas, convierte el almacenamiento de la cocaína en un tema de interés. Por otro lado, si bien se ha
demostrado su carácter insecticida (Nathanson et al., 1993), hasta la fecha se desconoce el papel
biológico que juega en la planta, y siendo un compuesto de tal toxicidad, no parece probable que
aparezca disuelto en el citosol –zona no confinada de la célula vegetal– sino en algún
compartimento específico.
1. Introducción
7
1.5 Estructura del PFC
Este PFC está estructurado como sigue:
En el capítulo 2 “Hipótesis y objetivos” se presentan muy brevemente las hipótesis del
autor sobre lo que se espera obtener al final del PFC basado en extenso estudio
bibliográfico así como en el trabajo previo del grupo de investigación donde se realiza el
PFC. Además, se vuelven a redactar los objetivos de la propuesta.
En el capítulo 3 “Procedimiento Experimental” se explican en orden los sucesivos
experimentos llevados a cabo. Para hacer la lectura más ligera, los protocolos enteros
(cantidades exactas, métodos detallados, materiales, equipos, proveedores…), así como
cualquier citación de tecnologías patentadas y algunas secuencias de ADN con las que se
trabaja aparecerán como anexos.
En el capítulo 4 “Resultados y discusión” se muestran los resultados de los
correspondientes experimentos descritos en el capítulo 3, siguiendo en la medida de lo
posible el orden en que están redactados en ese capítulo. En el mismo capítulo se
discuten los resultados obtenidos.
En el capítulo 5 “Conclusiones” están las conclusiones sacadas por el autor tras la
realización del PFC, valorando los resultados obtenidos. Se ofrece, además, un pequeño
resumen de las perspectivas de continuación, así como una pequeña sección con algunas
incidencias y una valoración personal del conjunto del PFC.
El anexo I “En detalle” contiene información que puede ser de interés al lector para
entender y conocer más sobre ciertos conceptos que hayan aparecido a lo largo del PFC6.
El anexo II “Protocolos” contiene los protocolos de laboratorio redactados paso por paso,
métodos, equipos, material, proveedores, secuencias de ADN y desarrollos de
ecuaciones.
El anexo III “Resultados complementarios” presenta resultados que por espacio y por
hacer la lectura más cómoda no se han incluido en el capítulo 4.
El anexo IV “Glosario” contiene un glosario de términos que se consideró preciso aclarar
por su especificidad, cuyas definiciones se adaptan al uso dado en este PFC.
6 El autor de este PFC recomienda especialmente consultar el Anexo I para aclaraciones relacionadas con
temas de ingeniería genética que pueden resultar de ayuda al lector a la hora de entender muchos de los experimentos incluidos en el procedimiento experimental. En particular, se recomienda consultar el Anexo I.3 “Tecnología de recombinación y clonación de ADN y purificación de proteínas”.
2. Hipótesis y objetivos
8
2. Hipótesis y objetivos
La base de este PFC es el almacenamiento y la compartimentación de cocaína en plantas de la
especie Erythroxylum coca variedad coca.
Como punto de partida de este estudio, con base en publicaciones relacionadas con el
almacenamiento de alcaloides –en su mayoría de cafeína– y en el trabajo previo de investigación en
E.coca, las hipótesis que se plantean son:
El almacenamiento de cocaína en plantas de E.coca ocurre de forma compartimentada.
El almacenamiento está ligado a la interacción de la cocaína con el ácido clorogénico u
otros compuestos fenólicos de estructura química similar como el ácido cumarilquínico.
Estos compuestos fenólicos resultan de reacciones de acilación entre el ácido quínico y los
respectivos ácidos hidroxicinámicos en forma de tioéster con la coenzima A. Estas
reacciones de acilación están catalizadas por enzimas EcHQT.
Los objetivos de este PFC son:
Comprobar cuál(es) de las ocho enzimas EcBAHD encontradas en E.coca tiene actividad
HQT.
Realizar la caracterización bioquímica de aquellas enzimas que hayan mostrado actividad
HQT.
Determinar si la cocaína y el ácido clorogénico interaccionan formando un par y tratar de
conocer la fuerza y estructura de dicho par.
Estudiar si dicho par se forma también in vivo.
Conocer más sobre el lugar de acumulación de la cocaína: partes de la planta, tejidos,
estructuras intracelulares…
3. Procedimiento Expemerimental
9
3. Procedimiento Experimental
3.1 Extractos de Erythroxylum coca: el punto de partida
Para argumentar la hipótesis de que la cocaína interacciona con ACGs, es interesante conocer los
niveles de estos compuestos en E.coca, ya que para almacenar un alto contenido de alcaloides
tropánicos se requeriría también un alto contenido en ACGs.
Para ello, el contenido de tres réplicas de hojas de E.coca en diferentes fases de desarrollo –
brote, hoja enrollada, hoja joven, hoja adulta– así como del tallo, se extrajo en un 1 mL de tampón
de extracción y se analizó mediante LC-MS-IT y HPLC-UV, el primero para identificar cada compuesto
y el segundo para análisis cuantitativo.
3.2 EcBAHD aciltransferasas: ¿Qué enzima cataliza la síntesis de ácido clorogénico
(ACG)?
Puesto que el ácido clorogénico y el ácido cumarilquínico están relacionados a través de la familia
de enzimas Citocromo P450, como se ha comentado anteriormente, se decidió buscar actividad HQT
en base únicamente a la síntesis de ácido cumarilquínico (Figura 8).
Figura 8: Síntesis de ácido cumarilquínico.
Para determinar cuál de las ocho enzimas EcBAHD tenía actividad HQT, se llevaron a cabo ocho
ensayos enzimáticos7 usando ácido quínico y p-cumaril-CoA en tampón de adsorción8 bis-tris pH =
7,5, y añadiendo a cada reacción 20 μL de extracto crudo de enzima9 EcBAHD 1 a 8,
respectivamente, interrumpiendo el ensayo tras 12 h con HCl –pH final = 1. Como control negativo
se prepararon las mismas reacciones incubando previamente la enzima durante 10 min a 90 °C para
desnaturalizarla. El producto se analizó mediante LC-MS-IT10.
7
Para estos ocho primeros ensayos enzimáticos se usó proteína expresada en bacteria E.coli antes de este PFC. Más adelante se explica el proceso de expresión de proteína en diferentes microorganismos tal y como lo realizó el autor de este PFC para su posterior uso. 8
Tampón de adsorción: Es el primero de los tampones usado durante la purificación de una proteína por cromatografía de afinidad, siendo el otro el tampón de elución. La lisis celular y posterior colección de proteína se realizan comúnmente en tampón de adsorción. 9
Extracto crudo: Proteína no purificada obtenida tras la lisis celular. 10
Como se mostrará en los resultados, la única enzima con actividad HQT fue EcBAHD4, por lo que en los próximos capítulos se tratará únicamente con EcBAHD4 –llamada EcHQT– y no con las otras siete.
3. Procedimiento Expemerimental
10
3.3 Optimización de la producción de proteína11: clonación, expresión,
purificación12
Partiendo de un vector pDONR207 con el gen EcHQT (clon de entrada), para elegir el sistema de
expresión de proteína óptimo –E.coli (bacteria), S.cerevisiae (levadura) o P.pastoris (levadura)– se
expresó el gen en los tres para poder comparar la cantidad producida, la actividad de la enzima, la
eficacia de la posterior purificación, etc. Para los sistemas mencionados, se usaron los vectores de
destino pH9GW, pYesDest52 y pEP-Strep, respectivamente (Figura 9).
Figura 9: Clon de entrada (izquierda) junto a los vectores de destino usados para la expresión de EcHQT en E.coli, S.cerevisiae y P.pastoris, respectivamente de izquierda a derecha.
Para cada uno de los tres vectores mencionados, en primer lugar se llevó a cabo la recombinación
LR entre el clon de entrada y el vector de destino (Invitrogen™, 2010). El producto de la
recombinación se transformó13 en bacteria E.coli TOP10 y las células transformadas se incubaron en
platos con medio de cultivo y antibiótico (kanamicina, ampicilina o zeocina, según el vector).
De las colonias que crecieron se seleccionaron cuatro para análisis. En primer lugar se realizó una
PCR de colonias, y el ADN amplificado se analizó por electroforesis de gel de agarosa para identificar
los clones positivos.
De uno de los clones positivos se preparó cultivo de 5 mL que se incubó durante la noche. Tras la
incubación se centrifugó y se extrajo el ADN del sedimento de células obtenido. El ADN extraído se
secuenció para confirmar que el vector contenía el gen de interés sin errores.
Una vez confirmada la secuencia se transformó el vector en su correspondiente organismo de
expresión –pH9GW en E.coli BL21(DE3), pYesDest52 en S.cerevisiae y pEP-Strep en P.pastoris KM71–
y se incubaron las células en platos con los respectivos medios de cultivo para cada sistema.
A partir de una colonia aislada del cultivo en plato se prepararon 50 mL de cultivo líquido de cada
uno de los sistemas, se dejó crecer hasta la DO600 apropiada y se indujo la producción de proteína.
Transcurrido el tiempo adecuado de expresión de proteína, se centrifugó el cultivo y se congeló el
sedimento de células hasta el momento de su lisis.
11
Siendo las enzimas proteínas que catalizan reacciones químicas, durante este PFC se hablará de “proteína” en el contexto del proceso de expresión (producción a partir del gen), y se hablará de “enzima” en el contexto de catálisis de una reacción química. 12
El Anexo I.3 presenta una explicación de la tecnología de recombinación adaptada a este PFC. 13
Transformación: Introducción de ADN externo en una bacteria. Aunque comúnmente usado también para levaduras, el término riguroso para las últimas es “transducción”.
3. Procedimiento Expemerimental
11
El sedimento se resuspendió en tampón de adsorción y se llevó a cabo su lisis por sonificación,
agitación con esferas de cristal u homogeneización de alta presión. La suspensión resultante se
centrifugó y se tomó el sobrenadante como extracto crudo de proteína.
El crudo se filtró a través de una membrana de 0,22 μm de tamaño de poro y se purificó por
cromatografía de afinidad (FPLC). Las fracciones obtenidas se analizaron por electroforesis de gel de
poliacrilamida en dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) para conocer la pureza de la fracción
purificada. Además, se prepararon ensayos enzimáticos de actividad HQT que se analizaron por LC-
MS-IT.
3.4 Caracterización bioquímica de EcBAHD4
Una vez elegido el sistema de expresión a usar se volvió a expresar y purificar proteína en mayor
cantidad. Ésta se reconcentró y desalinizó parcialmente en una columna de centrifugación con una
membrana de 10 kDa de corte de paso, reduciendo el volumen a la mitad (≈ 2,5 mL). Posteriormente
se midió la concentración de la proteína mediante un ensayo Bradford usando BSA para la recta de
calibrado.
Conocida la concentración de la proteína, se determinó el tampón y el pH óptimo de trabajo
preparando ensayos enzimáticos de actividad HQT en tampón bis-tris propano en el rango de pH =
6,7-9,5, además de tampón K2HPO4/KH2PO4 en el rango 5,7-8,3 y tampón tris en el rango 7,3-9,1. El
análisis se realizó por LC-MS-TripleQuad, usando ACG como estándar y asumiendo la cuantificación
del ácido cumarilquínico igual a la del ACG14.
Igualmente, se llevaron a cabo ensayos enzimáticos añadiendo diferentes iones metálicos a la
reacción en forma de cloruros para estudiar el incremento de actividad o inhibición de la enzima en
su presencia.
La estabilidad de la enzima en función de la temperatura se determinó preincubando la misma
durante media hora a 4, 10, 25, 35, 45 y 55 °C.
Finalmente, se estudió la cinética de la reacción aplicando el modelo de Michaelis-Menten –
usando una concentración de substrato mucho mayor que de enzima y manteniendo el estado
estacionario. Primero se prepararon ensayos enzimáticos con cantidades crecientes de uno de los
substratos –ácido quínico– manteniendo la concentración del otro –cumaril-CoA– en exceso, y
posteriormente se realizó el mismo proceso cambiando la relación de concentraciones de los
substratos.
14
El ácido cumarilquínico no se encuentra disponible comercialmente.
3. Procedimiento Expemerimental
12
Fórmula 1: Velocidad de formación de producto: según el modelo de Michaelis-Menten para un solo substrato y sin inhibición (izquierda); con inhibición por substrato –acompetitiva– (derecha)
15.
3.5 Estudio de la interacción ACG-cocaína en disolución
3.5.1 ¿Interaccionan la cocaína y el ácido clorogénico formando un par?
Atendiendo al fenómeno del efecto batocrómico, el espectro de absorción del ácido clorogénico
se vería desplazado hacia longitudes de onda mayores si formase un complejo con la cocaína en
presencia de la misma (Kappeler et al., 1987).
El espectro de absorción del ACG se midió en disolución acuosa 0,2 mM en el rango 350-380 nm,
y se repitió el proceso añadiendo exceso de hidrocloruro de cocaína (4 mM).
3.5.2 Caracterización del par ACG-cocaína por espectrofotometría UV-Visible
Para conocer más sobre la localización de la interacción entre ambos compuestos se repitieron
las medidas espectrofotométricas usando por separado los compuestos que conforman las dos
mitades de la cocaína: tropina16 4 mM y ácido benzoico 4 mM.
Además, con base en el equilibrio de formación del complejo y en la ley de Beer-Lambert, es
posible derivar una ecuación que permita calcular la constante de formación KC, cuantificando así la
fuerza con que interaccionan ambos compuestos.
ACG = Ácido clorogénico; TA = Tropano-alcaloide (cocaína); C = Complejo
Fórmula 2: Equilibrio de formación del complejo ACG-Cocaína.
Fórmula 3: Derivación de la ley de Beer-Lambert aplicada a la formación del complejo ACG-Cocaína.
Conocidos [TA]0, [ACG]0 y A(λ), se puede representar una recta εC vs 1/KC usando valores
aleatorios de εC. Si se utilizan diferentes concentraciones iniciales de cocaína se obtendrá un
15
En el Anexo II.4 se muestran los desarrollos de las ecuaciones mostradas en la memoria. 16
La estructura de la tropina es muy similar a la de la metilecgonina la cual, por reacción con el ácido benzoico, da lugar a la cocaína (Figura 3). La metilecgonina no está disponible comercialmente.
3. Procedimiento Expemerimental
13
conjunto de rectas que se corten en un punto de cuyas coordenadas se hallará KC y εC a una longitud
de onda determinada.
El espectro de absorción del ACG 0,2 mM en presencia de diferentes concentraciones de cocaína
se midió en el rango 350-380 nm a temperatura ambiente.
3.5.3 Caracterización del par ACG-Cocaína por RMN
Para confirmar los resultados obtenidos por espectrofotometría UV-Visible se analizaron
soluciones de ACG y cocaína mediante resonancia nuclear magnética (RMN). En particular, se
llevaron a cabo medidas de espectroscopía monodimensional de 1H y de espectroscopía de
correlación homonuclear bidimensional (COSY).
Para ello se utilizaron disoluciones ACG:Cocaína 0,2:50 mM y 50:0,2 mM en tampón de fosfato
deuterado pD = 7,5 en D2O, así como disoluciones de ACG y cocaína por separado para estudiar el
desplazamiento del espectro debido a la interacción entre ambos y determinar en qué partes de
ambas moléculas se centra dicha interacción. TMSP-d4 se usó como patrón externo.
3.6 Estudio de la interacción ACG-cocaína en plantas de la especie E.coca17
Una vez estudiada la interacción ACG-cocaína en disolución, el siguiente paso fue tratar de
detectar esta interacción in vivo. Para ello, se pusieron discos de Ø = 1 cm perforados de hojas de
E.coca en un volumen de agua abundante, se aplicó vacío y se tomaron muestras durante 4 días que
se analizaron por LC-MS-TripleQuad. Posteriormente se extrajo el contenido restante del disco para
cuantificar los ACGs y cocaína de la misma forma que en el apartado 3.1.
Puesto que la hipótesis inicial sugiere que la cocaína se almacena en algún compartimento
específico donde la interacción con el ACG impediría su liberación, se esperaba que la cocaína fuera
liberada con el tiempo hasta un límite donde toda la cocaína libre habría pasado al medio acuoso
mientras que la cocaína en forma de complejo habría quedado atrapada dentro del disco. Conocida
la cantidad total de cocaína y de ACG en un disco, y conocida la KC de formación del complejo, se
podría comparar la cantidad teórica de cocaína en forma libre con la cantidad real lavada del disco.
3.7 Inmunohistoquímica: localización de la cocaína dentro de la hoja
Para conocer el tipo de tejido y la capa del tejido donde se almacena la cocaína dentro de la
planta se llevaron a cabo experimentos de inmunohistoquímica (IHQ)18.
En primer lugar se tomaron hojas adultas de E.coca, se fijaron y se embebieron en bloques de
cera. De estos bloques se prepararon cortes de 10 μm de grosor en un micrótomo que se usaron
para la IHQ.
El primer experimento de IHQ se realizó usando anticuerpos policlonales anti-cocaína y
anticuerpos secundarios acoplados a una peroxidasa (HRP) y detección con DAB19. Las muestras se
analizaron por microscopía óptica.
17
Los datos obtenidos del análisis de estos experimentos resultaron irrelevantes, no mostrando patrón alguno de lavado de ninguno de los compuestos analizados entre diferentes réplicas. Por esa razón no se presentan en la siguiente sección “Resultados y discusión”. 18
Procedimiento basado en el uso de un anticuerpo para la detección de una especie (antígeno) en un tejido biológico. En este caso el antígeno es la cocaína.
3. Procedimiento Expemerimental
14
Posteriormente se repitió el mismo experimento usando detección con tiramida (detección
fluorescente). Las muestras se analizaron por microscopía confocal.
Por último, se repitió el experimento con detección fluorescente, usando anticuerpos
monoclonales en lugar de policlonales, buscando así una mayor especificidad de la señal obtenida.
Dos tipos de control negativo se usaron en estos experimentos. Para el primero se realizó la IHQ
sin incubación de anticuerpos, y para el segundo se usaron hojas de A.thaliana en lugar de E.coca20.
19
DAB es oxidado por las enzimas peroxidasas tiñendo el tejido de un color marrón. 20
A.thaliana es una planta que no produce cocaína u otros alcaloides tropánicos, por lo que se puede utiliza como control negativo.
4. Resultados
15
4. Resultados y discusión
4.1 Altos niveles de cocaína, cinamilcocaína y ACGs en Erythroxylum coca
Los extractos de E.coca mostraron niveles altos de ambos, alcaloides tropánicos y ACGs (Figura
10). Además, al igual que otros autores han documentado la variación acompasada de los niveles de
alcaloide y ACG entre variedades de plantas del mismo género (Waldhauser y Baumann, 1996), en
E.coca los niveles de ambos también varían de forma conjunta de un tejido o fase de desarrollo a
otro, a pesar de no existir una relación molar entre ambos compuestos.
Por otro lado, se comprobó que con el tiempo las hojas acumulan cocaína, siendo así las hojas
adultas donde más cocaína se almacena.
Figura 10: Niveles de alcaloides tropánicos y ACGs en E.coca (valores por gramo de materia seca).
4.2 EcBAHD4 es la única enzima EcHQT
El análisis de las ocho aciltransferasas encontradas en E.coca muestra que únicamente EcBAHD4
posee actividad HQT, es decir, es la única enzima que cataliza la síntesis de ácido cumarilquínico
(Figura 11).
Además, se observa que no hay un único producto, sino varios isómeros del ácido cumarilquínico
(338 g/mol)21, a pesar de que uno de ellos es muy mayoritario. Es probable que uno de estos
isómeros se deba al pequeño porcentaje de p-cumaril-CoA que se encuentra en forma de isómero
cis22.
Por último, en el análisis de los ocho ensayos se aprecia la aparición de un pico en t ≈ 17,5 min,
correspondiente al ácido cumárico (164 g/mol), que desaparece cuando el crudo es desnaturalizado.
Este pico también desaparece prácticamente tras la purificación de EcHQT, lo cual hace razonable
pensar en la existencia de tioesterasas en el extracto crudo de bacteria E.coli que catalicen la rotura
del enlace entre el grupo cumaril y la coenzima A (Cho y Cronan, 1993).
21
Nótese que se muestra el cromatograma en modo de ionización negativo, por lo que la masa molecular mostrada es una unidad menor a la del compuesto en estado neutro debido a la pérdida de un protón. 22
El substrato p-cumaril-CoA no existe comercialmente y fue sintetizado por otro miembro del grupo de trabajo.
4. Resultados
16
Figura 11: Cromatograma Total de Iones (modo negativo) de los ensayos de actividad HQT de EcBAHD4 y 5. Los otros seis ensayos analizados resultaron en cromatogramas prácticamente idénticos al de EcBAHD5, por lo que no se muestran.
4.3 Pichia pastoris como sistema de expresión de EcHQT
La secuencia de aminoácidos de EcHQT obtenida previo a la transformación de los vectores de
destino en los respectivos sistemas de expresión revela las características de dicha enzima comunes
a todas las enzimas de la familia BAHD, con una longitud de 433 aminoácidos, una masa de 48,5 kDa
(aprox. 51,4 kDa teniendo en cuenta el his- o strep-tag) y conservando los dos motivos “DFGWG” y
“HXXXDG”. La figura 12 muestra esta secuencia alineada frente a otras tres enzimas HQT aisladas de
plantas de café (Coffea canephora), tabaco (Nicotiana tabacum) y tomate (Solanum lycopersicum)
mediante un análisis “blastp” (Lepelley et al., 2007). La similitud de EcHQT con las otras HQT
mostradas varía entre el 57% y el 61%.
Una vez expresada EcHQT en E.coli, S.cerevisiae y P.pastoris, el análisis por SDS-PAGE prueba una
clara purificación por cromatografía de afinidad con el uso de las etiquetas his-tag (en bacteria) y
strep-tag (en levadura). Una banda mayoritaria aparece entre 50 y 60 kDa en las fracciones
purificadas, correspondiente a EcHQT (Figura 13). Otra banda aparece aproximadamente a la altura
de 25 kDa. Puesto que aparece en la fracción purificada en los tres sistemas, resulta lógico pensar
que es una fracción de la proteína original que se degradó durante la purificación, siendo la mitad
que contenía el tag, la que se purificó.
Se debe tener en cuenta la dificultad de comparar cuantitativamente los sistemas de expresión
en un gel SDS-PAGE, ya que las condiciones de cada purificación no son exactamente iguales, ni las
fracciones purificadas se recogen en el mismo volumen, por lo que tienen diferentes diluciones, que
a su vez afecta a la tinción del gel. Por otro lado, la detección con nitrato de plata requiere
volúmenes de proteína inyectados muy pequeños, llegando a 0,25-0,35 μL para el crudo y el
flowthrough, lo que da lugar a una mayor variabilidad del resultado. Por esta razón, se estimó que
usando cantidades similares de proteína, el resultado del SDS-PAGE para S.cerevisiae y para
P.pastoris sería muy similar.
4. Resultados
17
Figura 12: Alineamiento de EcHQT con otras tres enzimas HQT, aisladas de plantas de café (CcHQT), tabaco (NtHQT) y tomate (SlHQT). En azul, aminoácidos del mismo tipo en las cuatro secuencias. En amarillo, aminoácidos del mismo tipo en más de una secuencia. Los dos motivos conservados se encuentran recuadrados en rojo. Números de acceso: CcHQT, G-10889 (PlantCyc); NtHQT, AJ582651 (GenBank); SlHQT, G-12431 (PlantCyc).
Por otro lado, y a pesar de tener en cuenta la diferencia de dilución, la figura 14 muestra que la
expresión en levadura da lugar a proteína más activa, como se esperaba, puesto que las células
eucariotas normalmente realizan el plegamiento de proteínas con múltiples dominios –como
EcHQT– de manera más eficaz que las procariotas (D'Auria, 2006; Jacob et al., 2007).
Se decidió, por tanto, trabajar con levadura, en particular con P.pastoris, teniendo en cuenta el
tiempo de expresión, menor en P.pastoris que en S.cerevisiae, y el uso de antibiótico –zeocina– en el
cultivo en P.pastoris, lo que hace más difícil el desarrollo de bacteria u otro tipo de contaminación
que pueda echar a perder el cultivo.
4. Resultados
18
Figura 13: Análisis SDS-PAGE de EcHQT expresada en tres sistemas (detección con nitrato de plata). El contraste de la imagen se aumentó para poder mostrar la banda común a los tres sistemas a la altura de 25 kDa. M: Marcador; C: Crudo; F: Flowthrough (proteína no retenida); P: Purificado
Figura 14: Cromatograma Extraído de Iones (337 g/mol; modo negativo). Comparación de la actividad de EcHQT en los tres sistemas de expresión.
4.4 Caracterización bioquímica de EcHQT
EcHQT se mostró relativamente estable en torno a pHs neutros, con máxima actividad a pH = 7,5,
que se redujo a la mitad a pH = 5,5 ó pH = 9,5. Se observó además que el uso de tampón de fosfato
maximiza la actividad frente a otros tampones (Figura 15). El uso de tris, por ejemplo, reduce la
actividad en más del 50% en referencia a la máxima actividad encontrada para el fosfato. Estos datos
van en concordancia con los de otras enzimas HQT caracterizadas previamente (Ulbrich y Zenk,
1979; Lotfy et al., 1992)23.
Igualmente se encontró que tanto la adición de Cu2+ como de Fe2+ inhibe casi completamente la
acción de la enzima. Además, el bloqueo de los iones metálicos por formación de quelatos con EDTA
mejoró la actividad en hasta un 25% (Figura 16).
23
La actividad mostrada en las figuras se calculó en μkat (μmol producto/s).
4. Resultados
19
El estudio de la estabilidad térmica reveló la labilidad de EcHQT, cuya actividad se redujo en un
20% tras 30 min de preincubación a 4 °C. Tras incubarla a 45 °C, EcHQT quedó prácticamente
inactiva (Figura 17).
Figura 15: Actividad de EcHQT a diferentes pHs, tomando el mayor valor obtenido como 100%.
Figura 16: Actividad de EcHQT en presencia de diferentes cofactores metálicos. El 100% se ha asignado a un ensayo de referencia sin iones añadidos.
4. Resultados
20
Figura 17: Actividad de EcHQT tras preincubación (30 min). El 100% se ha asignado a un ensayo de referencia sin preincubación.
Los valores de la constante de Michaelis-Menten (KM) y la velocidad máxima (vmax) se calcularon
por regresión hiperbólica de los datos obtenidos (Figura 18 y Figura 20). Además se calcularon la
constante catalítica (kcat), el ratio kcat/KM y la constante de inhibición para el p-cumaril-CoA.
Calculados los parámetros cinéticos, se representó la curva Lineweaver-Burk que muestra
claramente los dos modelos usados, sin inhibición y con inhibición por substrato (Figura 19 y Figura
21).
KM [μM] vmax *μmol/L·s+ kcat [1/s] kcat/KM [1/M·s] KSI *μM+
Figura 22: Espectrofotometría UV-Visible. Cálculo de la constante de formación del par ACG-Cocaína a 25 °C.
El valor de KC obtenido para el par ACG-cocaína es unas 5 veces menor al publicado para ACG-
cafeína –y menor también que el de otros alcaloides purínicos publicados conjuntamente–, cuya
interacción ha sido bien caracterizada en estudios de RMN o cristalografía de rayos X (Kappeler et
al., 1987).
4. Resultados
24
Figura 23: Espectrofotometría UV-Visble. Espectro del ACG (0,2 mM) junto al de la cocaína (4 mM) (A), la tropina (4 mM) (B) y el ácido benzoico (4 mM) (C), por separado y juntos en disolución. Nótese que la curva roja con la leyenda separada por “:” corresponde a los compuestos juntos en disolución, mientras que la curva morada con la leyenda separada por “+” corresponde a la suma matemática de las curvas por separado como prueba de que el desplazamiento de la curva no se debe a la simplemente a la suma de las absorbancias de éstos. Como blanco se usó H2O. La gráfica (D) corresponde al efecto batocrómico producido en el espectro del ACG (0,2 mM) por la cocaína a diferentes concentraciones. Como blanco se usó ACG (0,2 mM). La línea de puntos marca la longitud de onda escogida para el cálculo de KC (364 nm).
4. Resultados
25
4.5.2 Resonancia Nuclear Magnética: la interacción ACG-cocaína se centra en la parte aromática
El espectro de protón 1H de diferentes muestras ACG-cocaína permitió asignar individualmente a
cada protón el desplazamiento de su correspondiente pico debido a la interacción entre ambos
compuestos (Figura 25)24.
La figura 24 muestra claramente mayores desplazamientos en los protones cercanos a la parte
aromática de ambas moléculas, probando una vez más que es ahí donde se centra la interacción
entre ambas. Se observa además que el máximo desplazamiento ocurre en los carbonos 2 (80,4 Hz) y
3 (85,3 Hz) del anillo de tropano, y es de esperar que ocurriera de forma similar en el carbono 4 de
haber sido posible su cuantificación. Esto hace pensar en un cambio conformacional en el anillo de
tropano que pudiera así facilitar un posible posicionamiento en paralelo de las mitades más
próximas a la zona aromática de ambas moléculas, de forma similar a como se ha publicado para el
caso de la cafeína (Martin et al., 1986; D’Amelio et al., 2009).
Figura 24: Resonancia Nuclear Magnética. Asignación del desplazamiento del espectro 1H a los protones –unidos a
carbono– de las moléculas de ACG (izquierda) y cocaína (derecha). Los desplazamientos se representan con símbolos “Δ” y vienen dados en hertzios. Aquellos marcados con “n.d.” no están disponibles puesto que la zona alifática de ambas moléculas resuena en la misma región del espectro, lo que hizo imposible la asignación exacta de la posición del protón en el espectro.
Por otro lado, como se muestra en el ejemplo de la figura 25, todos los desplazamientos medidos
son desplazamientos hacia ‘campo alto’, es decir, hacia valores más bajos del desplazamiento
químico (ppm), lo que implica un mayor apantallamiento nuclear por parte de los electrones, que se
traduce en una mayor energía de resonancia. Es posible que el aumento de carga electrónica en la
zona aromática del ACG y de la cocaína se deba al solapamiento de los orbitales pi entre ambas
moléculas.
24
Otras zonas del espectro 1H del ACG y de la cocaína, así como los espectros COSY se muestran en el
Apéndice III “Resultados complementarios”.
4. Resultados
26
Figura 25: Resonancia Magnética Nuclear. Comparación del espectro 1H del ACG por separado y en presencia de cocaína. La zona del espectro mostrada corresponde a valores altos del
desplazamiento químico (ppm), es decir, a la parte aromática de la molécula.
4. Resultados
27
4.6 ¿Dónde se almacena la cocaína?
Los experimentos de inmunohistoquímica, tanto con detección por DAB, como con detección
fluorescente, muestran que el almacenamiento de la cocaína no tiene lugar de forma dispersa entre
todas las células sino que se centra en ciertas capas del tejido de la hoja, es decir, está
compartimentada (Figura 26, Figura 27 y Figura 28)25.
Si en el apartado 4.1 se ha mostrado que la cocaína se almacena con el tiempo en la hoja, siendo
las hojas ya desarrolladas –adultas– las que realmente realizan la función de almacenamiento, en la
figura 26 se aprecia cómo las células en el mesófilo26 son las que principalmente contienen cocaína.
En particular, la cocaína parece situarse en las células del mesófilo esponjoso, ya que la
fluorescencia que aparece en el mesófilo en empalizada se presenta siempre de forma más difusa, y
podría ser ruido debido a que todas las plantas presentan autofluorescencia –que a menudo resulta
complicada de eliminar. Por esta misma razón se detectaría igualmente señal en el control negativo
y en hojas de A.thaliana, aunque de manera más tenue (Figura 26 A).
Figura 26: Inmunohistoquímica. Detección –con fluorescencia– de cocaína realizada en una hoja adulta de E.coca. Imagen tomada en el extremo de la sección trasversal de la hoja con un aumento 40x. (A) Control negativo (sin anticuerpos); (B) Protocolo completo (con anticuerpos). Izquierda, imagen fluorescente; centro, campo claro (luz normal); derecha, imágenes superpuestas.
25
Otras imágenes de detección con DAB o de hojas de A.thaliana se aparecen el Anexo III “Resultados complementarios”. 26
El apartado 1 del Anexo I “En detalle” muestra la estructura por capas de una hoja de E.coca.
4. Resultados
28
Figura 28: Inmunohistoquímica. Detección –con fluorescencia– de cocaína realizada en una hoja adulta de E.coca. Imagen tomada hacia la mitad de la sección trasversal de la hoja con un aumento 10x. Izquierda, imagen fluorescente; centro, campo claro (luz normal); derecha, imágenes superpuestas.
Figura 27: Inmunohistoquímica. Detección –con fluorescencia– de cocaína realizada en una hoja adulta de E.coca. Imagen tomada entre la vena central y el extremo de la sección trasversal de la hoja con un aumento 40x. Izquierda, imagen fluorescente; centro, campo claro (luz normal); derecha, imágenes superpuestas.
5. Conclusiones
29
5. Conclusiones
5.1 Compleción de los objetivos
A lo largo de este PFC se ha estudiado la forma de almacenamiento de la cocaína en plantas de la
especie Erythroxylum coca variedad coca.
Analizando los objetivos iniciales del proyecto, el trabajo realizado ha permitido satisfacer casi la
totalidad de los mismos.
En primer lugar, es posible afirmar que de las ocho aciltransferasas identificadas en E.coca
pertenecientes a la familia de enzimas BAHD, solamente una posee actividad hidroxicinamil-CoA
quinato: hidroxicinamiltransferasa, es decir, es capaz de sintetizar ácido cumarilquínico.
Esta enzima, llamada EcHQT, se caracterizó bioquímicamente, encontrando las condiciones
óptimas de pH, temperatura y cofactores metálicos, y se estudió su cinética de reacción, obteniendo
resultados dentro del rango de valores publicados para otras enzimas del mismo tipo.
Además, se encontró que el ácido clorogénico y la cocaína interaccionan en disolución formando
un par, y que dicha interacción se centra en la parte aromática de ambas moléculas, de manera
similar a como se ha investigado en algunos alcaloides purínicos.
Por último, se obtuvo información sobre el lugar de almacenamiento de la cocaína. Se demostró
que las hojas adultas son las que acumulan la mayor parte de este alcaloide, y que las hojas más
jóvenes, al igual que las raíces, no poseen prácticamente cocaína. Experimentos de
inmunohistoquímica permitieron incluso conocer más sobre la relación entre las distintas capas de
tejido celular y la cocaína, sugiriendo que las células del mesófilo esponjoso acaparan la función de
almacenamiento. La presencia de puntos definidos y no una señal difusa, apoya la hipótesis de que
la cocaína aparece de forma compartimentada.
Si bien se necesita continuar investigando en este campo, el hecho de que la cocaína se acumule
sobre todo en las hojas adultas –mucho más abundantes que las hojas en desarrollo–, y de que se
almacene de forma compartimentada, ayuda a pensar en la función ecológica que juega dicho
alcaloide, función que hasta la fecha es desconocida. Se podría argumentar su papel dentro del
mecanismo de defensa de la planta, puesto que estando compartimentada no sería tóxica para la
célula vegetal, siendo liberada en caso de destrucción de la misma –por el ataque de un organismo
herbívoro– y realizando su función insecticida, parecido a como se ha propuesto en otras
publicaciones (Stephen et al., 1998).
5.2 Posibilidad de continuación
A pesar de haber satisfecho la mayoría de los objetivos de este proyecto, todavía quedan
incógnitas por resolver. El principal objetivo será aclarar si la interacción estudiada entre la cocaína y
el ácido clorogénico ocurre de hecho in vivo. Para ello, se tratarán de optimizar los experimentos de
lavado de cocaína descritos en el apartado 3.6, y posiblemente se lleven a cabo intentos de
aislamiento de vacuola que, por la dificultad y el tiempo que entrañan, no se consideraron dentro de
este PFC. Otros experimentos de histoquímica se han propuesto, no sólo para corroborar los ya
5. Conclusiones
30
realizados, sino también para la localización de ácidos clorogénicos, tinción de vacuolas y otras
pruebas que ayuden a la caracterización histológica de la cocaína.
Además, en estos momentos se sigue trabajando con los datos obtenidos de las pruebas de RMN
realizadas, para intentar modelar una estructura tridimensional del par ACG-cocaína. De la misma
manera, se han comenzado intentos de cristalización de este complejo para su posterior análisis por
cristalografía de rayos X.
Por otro lado, más allá del tema base de este PFC, la investigación de la biosíntesis de alcaloides
tropánicos se encuentra todavía en sus primeros pasos, y nuevos proyectos que abordar ya se
discuten, como por ejemplo la formación del doble anillo –anillo de tropano– que dará lugar a la
metilecgonona (Figura 3).
Por último, puesto que los resultados obtenidos son no sólo bastante positivos, sino además
novedosos, se espera publicarlos junto con los que resulten del trabajo en curso en los próximos
meses.
5.3 Incidencias y valoración personal
Este PFC se realizó en un laboratorio de biología molecular dentro del departamento de
bioquímica, en el Instituto Max Planck para la Ecología Química en Jena (Turingia, Alemania).
Empecé el trabajo en este laboratorio hacia mediados de octubre 2011, y pasé satisfactoriamente
un periodo de entrenamiento y evaluación de dos meses, puesto que era la primera que me
adentraba en el mundo de la biotecnología. Esto significó, no sólo aprender a trabajar en un
laboratorio biológico, sino además un estudio concienzudo de toda la teoría que ello requiere, desde
las bases de la biología, la bioquímica o la genética hasta los conceptos detrás de la biotecnología
más vanguardista aplicada.
Este periodo de prueba me dejó entre 5 y 6 meses de trabajo hasta la entrega en junio de 2011,
que se tradujo en unas 1200 horas de trabajo.
Pensando en los experimentos llevados a cabo, es difícil encontrar uno más difícil que otro, pues
la mayoría resultaron mucho más largos y complicados de lo esperado. Los experimentos más
químicos entrañaron más dificultad de puesta a punto, puesto que trabajar con cocaína de pureza
>99% implica requisitos legales y económicos que no permiten margen de error. A menudo se llevó a
cabo el experimento en primer lugar con cafeína, escopolamina o atropina, y una vez optimizado se
procedió con cocaína. Además, el análisis de resultados requirió mayor tiempo que los experimentos
bioquímicos.
Por otro lado, la parte bioquímica de los experimentos conlleva un tiempo de espera (por
ejemplo por frecuentes incubaciones de 24-72 h), y una variabilidad que ralentizan
considerablemente el siguiente paso y, por consiguiente, la obtención de resultados.
Bibliografía
31
Bibliografía
Asano, N., K. Yokoyama, M. Sakurai, K. Ikeda, H. Kizu, A. Kato, M. Arisawa, D. Höke, B. Dräger, A. A. Watson y R. J. Nash (2001). "Dihydroxynortropane alkaloids from calystegine-producing plants." Phytochemistry 57(5): 721-726.
BBC-GCSE. (2011). "Cross-section through a leaf cell." Consultado el 26-Abril-2011, en http://www.bbc.co.uk/schools/gcsebitesize/science/add_aqa/plants/plants1.shtml.
Bieri, S., A. Brachet, J.-L. Veuthey y P. Christen (2006). "Cocaine distribution in wild Erythroxylum species." Journal of Ethnopharmacology 103(3): 439-447.
Broadman, L. M., W. Ceruzzi, P. S. Patane, R. S. Hannallah, U. Ruttimann y D. Friendly (1990). "Metoclopramide reduces the incidence of vomiting following strabismus surgery in children." Anesthesiology 72(2): 245-248.
Chabannes, M., K. Ruel, A. Yoshinaga, B. Chabbert, A. Jauneau, J.-P. Joseleau y A.-M. Boudet (2001). "In situ analysis of lignins in transgenic tobacco reveals a differential impact of individual transformations on the spatial patterns of lignin deposition at the cellular and subcellular levels." The Plant Journal 28(3): 271-282.
Cho, H. y J. E. Cronan (1993). "Escherichia coli thioesterase I, molecular cloning and sequencing of the structural gene and identification as a periplasmic enzyme." Journal of Biological Chemistry 268(13): 9238-9245.
D'Auria, J. y T. Docimo. (2011). "Max Planck Institute or Chemical Ecology: Biochemistry and evolution of tropane alkaloid biosynthesis." Consultado el 06-Mayo-2011, en http://www.ice.mpg.de/ext/ger-research.html?&L=0#header_logo.
D'Auria, J. C. (2006). "Acyltransferases in plants: a good time to be BAHD." Current Opinion in Plant Biology 9(3): 331-340.
D'Auria, J. C., E. Pichersky, A. Schaub, A. Hansel y J. Gershenzon (2007). "Characterization of a BAHD acyltransferase responsible for producing the green leaf volatile (Z)-3-hexen-1-yl acetate in Arabidopsis thaliana." The Plant Journal 49(2): 194-207.
D’Amelio, N., L. Fontanive, F. Uggeri, F. Suggi-Liverani y L. Navarini (2009). "NMR reinvestigation of the caffeine-chlorogenate complex in aqueous solution and in coffee brews." Food Biophysics 4(4): 321-330.
Facchini, P. J. y B. St-Pierre (2005). "Synthesis and trafficking of alkaloid biosynthetic enzymes." Current Opinion in Plant Biology 8(6): 657-666.
Invitrogen™ (2010). "Gateway® Technology Manual. A universal technology to clone DNA sequences for functional analysis and expression in multiple systems." Invitrogen. Cat. núm. 12535-019 y 12535-027
Jacob, E., A. Horovitz y R. Unger (2007). "Different mechanistic requirements for prokaryotic and eukaryotic chaperonins: a lattice study." Bioinformatics 23(13): i240-i248.
Kappeler, A. W., T. W. Baumann y H. Greutert (1987). "Complexation of purine alkaloids in the coffee plant." 12e Colloque Scientifique International sur le Café, Montreux (Suiza).
Kimmel, H. L., F. Ivy Carroll y M. J. Kuhar (2001). "Locomotor stimulant effects of novel phenyltropanes in the mouse." Drug and Alcohol Dependence 65(1): 25-36.
Lepelley, M., G. Cheminade, N. Tremillon, A. Simkin, V. Caillet y J. McCarthy (2007). "Chlorogenic acid synthesis in coffee: An analysis of CGA content and real-time RT-PCR expression of HCT, HQT, C3H1, and CCoAOMT1 genes during grain development in C. canephora." Plant Science 172(5): 978-996.
Lotfy, S., A. Fleuriet y J.-J. Macheix (1992). "Partial purification and characterization of hydroxycinnamoyl CoA: Transferases from apple and date fruits." Phytochemistry 31(3): 767-772.
Martin, R., T. H. Lilley, C. P. Falshaw, E. Haslam, M. J. Begley y D. Magnolato (1986). "The caffeine-potassium chlorogenate molecular complex." Phytochemistry 26(1): 273-279.
Meltzer, P. C., A. Y. Liang y B. K. Madras (1994). "The discovery of an unusually selective and novel cocaine analog: difluoropine. Synthesis and inhibition of binding at cocaine recognition sites." Journal of Medicinal Chemistry 37(13): 2001-2010.
Mondolot, L., P. La Fisca, B. Buatois, E. Talansier, A. De Kochko y C. Campa (2006). "Evolution in caffeoylquinic acid content and histolocalization during coffea canephora leaf development." Annals of Botany 98(1): 33-40.
Nathanson, J. A., E. J. Hunnicutt, L. Kantham y C. Scavone (1993). "Cocaine as a naturally occurring insecticide." Proceedings of the National Academy of Sciences 90(20): 9645-9648.
Niggeweg, R., A. J. Michael y C. Martin (2004). "Engineering plants with increased levels of the antioxidant chlorogenic acid." Nat Biotech 22(6): 746-754.
Ordoñez, H. y J. H. Ordoñez (2006). "Requiem for ouabain? No!" Rev. Colomb. Cardiol. 12(6): 404-408.
Plowman, T. (1981). "Amazonian coca." Journal of Ethnopharmacology 3(2-3): 195-225.
Plowman, T. y N. Hensold (2004). "Names, types, and distribution of neotropical species of Erythroxylum (Erythroxylaceae)." Brittonia 56(1): 1-53.
Rhodes, M. J. C. (1994). "Physiological roles for secondary metabolites in plants: some progress, many outstanding problems." Plant Molecular Biology 24(1): 1-20.
Rhodes, M. J. C. y L. S. C. Wooltorton (1976). "The enzymic conversion of hydroxycinnamic acids to p-coumarylquinic and chlorogenic acids in tomato fruits." Phytochemistry 15(6): 947-951.
Riboulet, C., S. Guillaumie, V. Méchin, M. Bosio, M. Pichon, D. Goffner, C. Lapierre, B. Pollet, B. Lefevre, J. P. Martinant y Y. Barrière (2009). "Kinetics of phenylpropanoid gene expression in maize growing internodes: relationships with cell wall deposition." Crop Sci. 49(1): 211-223.
Roberts, M. F. y M. Wink (1998). "Introduction" Alkaloids. Biochemistry, Ecology and Medicinal Applications. M. F. Roberts y M. Wink. New York, Plenum Publishing Corporation: 1-7.
Simpson, A. J. y S. A. Brown (2005). "Purge NMR: Effective and easy solvent suppression." Journal of Magnetic Resonance 175(2): 340-346.
Bibliografía
33
Stephen, O. D., C. V. Kevin y F. S. F. Jorge (1998). "Histochemical and Immunocytochemical Localization of Tropane Alkaloids in Erythroxylum coca var. coca and E. novogranatense var. novogranatense." International Journal of Plant Science 159(3): 492-503.
Theodoridis, G., A. Kantifes, P. Manesiotis, N. Raikos y H. Tsoukali-Papadopoulou (2003). "Preparation of a molecularly imprinted polymer for the solid-phase extraction of scopolamine with hyoscyamine as a dummy template molecule." Journal of Chromatography A 987(1-2): 103-109.
Ulbrich, B. y M. H. Zenk (1979). "Partial purification and properties of hydroxycinnamoyl-CoA: quinate hydroxycinnamoyl transferase from higher plants." Phytochemistry 18(6): 929-933.
Waldhauser, S. S. M. y T. W. Baumann (1996). "Compartmentation of caffeine and related purine alkaloids depends exclusively on the physical chemistry of their vacuolar complex formation with chlorogenic acids." Phytochemistry 42(4): 985-996.
Whetten, R. y R. Sederoff (1995). "Lignin biosynthesis." Plant Cell 7(7): 1001-1013.
Whetten, R. W., J. J. MacKay y R. R. Sederoff (1998). "Recent advances in understanding lignin biosynthesis." Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 49(1): 585-609.
Wikipedia. (2011). "Célula vegetal." Consultado el 26-Abril-2011, en http://es.wikipedia.org/wiki/Célula_vegetal.
Wink, M. (1998). "A short history of alkaloids" Alkaloids. Biochemistry, Ecology and Medicinal Applications. M. F. Roberts y M. Wink. New York, Plenum Publishing Corporation: 30-31.
Yu, X.-H. y C.-J. Liu (2006). "Development of an analytical method for genome-wide functional identification of plant acyl-coenzyme A-dependent acyltransferases." 358(1): 3.
Figura 29: Estructura de la célula vegetal. Imagen tomada de (Wikipedia, 2011).
Figura 30: Corte transversal de una hoja (esquema y vista real en E.coca). (Izquierda: imagen adaptada a partir de (BBC-GCSE, 2011); derecha: imagen tomada con microscopio “Zeiss Confocal LSM510”, aumento 20x).
Anexo I: En detalle
36
I.2 Ruta de la lignina
Como se observa en la figura 31, la lignina es un biopolímero sin estructura definida, formado por
unión de unidades simples derivadas de tres monolignoles que a su vez se derivan del aminoácido
fenilalanina: alcohol coniferílico, sinapílico y p-cumarílico. Éstos se originan de los correspondientes
ácidos y se incorporan al polímero como fenilpropanoides: guaiacilo (G), siringilo (S) y p-hidroxifenilo
(H), respectivamente. Reacciones de hidroxilación y metilación relacionan los tres ácidos al principio
de la ruta.
La lignina es uno de los polímeros naturales más abundantes del mundo junto a la celulosa y la
quitina. Al ser una matriz de polisacáridos, la lignina confiere rigidez y fuerza de compresión a las
paredes celulares. Por otro lado, su carácter hidrófobo hace posible el transporte de agua a lo largo
de la planta (Whetten y Sederoff, 1995; Whetten et al., 1998).
Anexo I: En detalle
37
Figura 31: Ruta de la lignina. Imagen adaptada a partir de (Riboulet et al., 2009).
Anexo I: En detalle
38
I.3 Tecnología de recombinación y clonación de ADN y purificación de proteínas
El primer paso para la expresión de proteína es la elección del sistema donde se va a expresar,
que determinará el tipo de clonación, cultivo y lisis, además de la cantidad específica producida, la
eficacia de la posterior purificación y, lo más importante, la actividad de la enzima.
Los tres sistemas en los que se expresó proteína en este PFC son: bacteria Escherichia coli,
levadura Saccharomyces cerevisiae y levadura Pichia pastoris.
Para poder seleccionar una bacteria o levadura donde se ha introducido el ADN deseado (clon
positivo) de entre un grupo de bacterias o levaduras sin ese ADN (clon negativo), es necesario dar
alguna ventaja al clon positivo. Si, por ejemplo, éste recibe resistencia a un antibiótico que otro clon
negativo no recibe, se podrá usar ese antibiótico para matar selectivamente todos los clones
negativos.
Por otro lado, una vez que la proteína haya sido expresada, y para poder caracterizar la enzima
deseada, se necesita purificar esa proteína de entre el enorme conjunto de proteínas que se
obtienen tras producir la lisis celular. Para ello, con base en el dogma central de la biología molecular
que explica cómo el ADN se transcribe a ARN, que se traduce después a proteína, se puede añadir
una secuencia corta de ADN –etiqueta o tag– antes del gen de interés que, una vez traducida a
proteína, haga de “ancla” para su purificación por cromatografía de afinidad. Dos ejemplos de esto
muy conocidos son las etiquetas His-tag y Strep-tag.
Estas dos y otras características pueden introducirse en los clones positivos si antes de insertar el
ADN deseado en el microorganismo se clona en un vector ADN diseñado con esas características. En
este PFC, este proceso, llamado recombinación genética, se realizó mediante la tecnología Gateway®
de Invitrogen™.
La base de esta tecnología son las reacciones de recombinación BP y recombinación LR. Una
recombinación LR tiene lugar entre un vector con sitios de unión attL y otro con sitios attR, y el
producto son dos vectores con sitios attB y attP respectivamente, donde las secuencias de ADN
entre sitios attL y attR han sido intercambiadas (Figura 32). Lo opuesto ocurre con la recombinación
BP (Invitrogen™, 2010).
Figura 32: Recombinación LR donde el gen deseado –EcHQT– se clona en un vector pH9GW portador de un His-tag.
Anexo I: En detalle
39
En la Figura 32, si esta reacción transcurre y posteriormente el producto se transforma27 en
bacteria, poniéndola en medio de cultivo con antibiótico kanamicina, el resultado es el siguiente:
Las bacterias donde el vector pH9GW no se haya introducido morirán por no tener
resistencia a la kanamicina (primer y cuarto vector).
Las bacterias que reciban el vector pH9GW pero sin reaccionar (segundo vector), morirán
por el efecto del gen ccdB, que inhibe la acción de las enzimas ADN girasas necesarias
para replicación y transcripción de ADN.
Por tanto, únicamente sobrevivirán y formarán colonias las bacterias con el vector
pH9GW y el gen EcHQT –gen deseado.
Una vez cultivada la bacteria se puede inducir la producción de proteína, donde EcHQT se
traducirá según su secuencia de ADN pero con un tag añadido de nueve histidinas. Así, después de
producir la lisis celular y recolectar la proteína, se podrá purificar por cromatografía de afinidad en
una columna diseñada para retener histidina.
En el caso de la levadura S.cerevisiae, el proceso de selección de la levadura deseada, en lugar de
usar antibiótico, se llevó a cabo mediante el uso de SC-U. SC-U es un medio de cultivo para
S.cerevisiae que no contiene uracilo, necesario para la transcripción de ADN, y por tanto para la
supervivencia. El vector pYesDest52 contiene sin embargo el gen de autoproducción de uracilo
(Figura 33).
Figura 33: Recombinación LR donde el gen deseado –EcHQT– se clona en un vector pYesDest52 portador de un Strep-tag.
De nuevo, únicamente las levaduras que hayan recibido el vector pYesDest52 con el gen EcHQT
incluido podrán sobrevivir, ya que serán las únicas que puedan producir uracilo y no llevan el gen
ccdB.
Además del vector pH9GW (para transformación en bacteria E.coli) y el vector pYesDest52 (para
transformación en levadura S.cerevisiae), el tercer vector usado en este PFC es el vector pEP-Strep,
utilizado para transformación en levadura P.pastoris. La reacción de recombinación LR
correspondiente a este vector es la mostrada en la Figura 34. En este caso, el antibiótico usado para
seleccionar los clones de interés será la zeocina.
27
Transformación: Introducción de ADN externo en una bacteria. Aunque comúnmente usado también para levaduras, el término riguroso para las últimas es “transducción”.
Anexo I: En detalle
40
Figura 34: Recombinación LR donde el gen deseado –EcHQT– se clona en un vector pEP-Strep portador de un Strep-tag.
Ambos vectores usados para levadura (pYesDest52 en S.cerevisiae o pEP-Strep en P.pastoris)
conllevan la adición de un Strep-tag a la proteína, cuya especificidad implica en la mayoría de los
casos una purificación más eficiente que con el uso del his-tag.
Anexo II: Protocolos
41
Anexo II: Protocolos
Todas las disoluciones se prepararon con agua doblemente destilada y de calidad Milli-Q.
Todos los materiales usados eran de la máxima pureza disponible y fueron provistos por Sigma-
Aldrich Chemie GmbH, Fluka (Sigma-Aldrich) y Carl Roth GmbH. En caso de excepción, se
especificará.
Para las esterilizaciones por filtración se usaron filtros de tamaños 0,22 μm ó 0,4 μm. Para las
esterilizaciones por autoclave los ciclos usados fueron de 20 min a 120 °C.
II.1 Materiales, disoluciones y medios
AAmix sin uracilo 5x 500 mg adenina, arginina, cisteína, leucina, lisina, treonina y
potential), -35 V; EP (entrance potential), -4 V; CEP (cell entrance potencial), -36 V; CE (collision
energy), -22 V; CXP (cell exit potential), -4 V; tiempo de adquisión, 100 ms; y el modo de escaneo fue
MRM con valores de m/z para iones iniciales y fraccionados de 353,13 190,88 (ácido clorogénico)
y 337,13 190,88 (ácido quínico).
La separación duró 8 min a 20 °C con un flujo de 800 μL/min usando ácido fórmico 0,05% en agua
(A) y acetonitrilo (B) fase móvil, con el siguiente perfil de elución:
Tiempo (min) 0,00 0,50 4,00 4,10 5,00 5,10 8,00
% A 95 95 40 0 0 95 95
% B 5 5 60 100 100 5 5
Tabla 4: Gradiente de disolventes A / B usado como fase móvil en LC-MS-TripleQuad.
II.2.21 Detección y análisis del par ACG-cocaína por espectrofotometría UV-Visible
Inicialmente, para detectar interacción entre ambos compuestos, se midió el espectro entre 350-
380 nm de disoluciones acuosas de hidrocloruro de cocaína 4 mM y ACG 0,2 mM por separado y
juntos en una sola disolución, usando cubetas de cuarzo “QS 104.002B-QS” de Hellma Analytics y
agua como blanco en un equipo “UV-2501PC” de Shimadzu Corp. Se usó una abertura de 0,1 nm,
con medidas de espectro cada 0,5 nm en modo de lectura muy lento.
Para estudiar más a fondo la localización de la interacción se usaron disoluciones de tropina 4
mM en ACG 0,2 mM y de ácido benzoico 4 mM en ACG 0,2 mM y agua como blanco.
Para medir la KC, se usaron disoluciones de ACG 0,2 mM y cantidades crecientes de hidrocloruro
de cocaína (25, 100, 150, 200, 250 y 300 mM), usando ACG 0,2 mM como blanco.
II.2.22 Análisis del par ACG-cocaína por RMN (Resonancia Nuclear Magnética)
Se llevaron a cabo medidas de espectro 1H monodimensional y de espectro de correlación
bidimensional (COSY-90), de manera que se asignó cada pico del espectro a su correspondiente
protón en la molécula de ACG o cocaína. Las medidas se realizaron principalmente en un equipo
“DRX500” de Bruker BioSpin. Las muestras se prepararon en tampón fosfato deuterado 10 mM, pD =
7,5, a una temperatura de 300 K. La supresión de la señal del H2O se realizó según el método PURGE
(Simpson y Brown, 2005).
Anexo II: Protocolos
49
El desplazamiento del espectro 1H de una muestra de ACG 0,2 mM se midió en presencia de 50
mM usando TMSP-d4 3% en D2O como patrón externo ajustado a 0,0ppm, en tubos de Ø = 5 mm. De
la misma manera, el espectro una muestra de cocaína 0,2 mM se midió en presencia de ACG 50 mM.
II.2.23 Lavado de cocaína de discos de E.coca
Brotes de E.coca y discos de Ø = 1 cm perforados de hojas adulta y joven y se pusieron en
diferentes vasos de precipitados con 25 mL agua y 0,005% triton x-100, puestos a su vez en un
desecador al que se aplicó vacío durante 96 h y se tomaron muestras empezando cada 30 min y
posteriormente más espaciadas. Las muestras se analizaron mediante LC-MS-TripleQuad.
El contenido de cocaína no lavada, así como el contenido de ACG, se extrajeron (ver “II.2.1
Extracción del contenido de hojas de E.coca”) y cuantificaron mediante LC-MS-TripleQuad diluído
1:1000.
II.2.24 Inmunohistoquímica (preparación del tejido)
Fijación: Hojas de E.coca y hojas de Arabidopsis thaliana se cortaron en trozos de ≈ 1 cm de
longitud que se sometieron a vacío inmersos en una solución EtOH 63%, ácido acético 5%,
formaldehido 2%, ácido tánico 1 g/100 mL durante 2 h (Stephen et al., 1998). Posteriormente se
dejó el tejido en la solución durante 12 h sin aplicar vacío.
Lavado y encerado: El tejido se lavó dos veces con PBS durante 10 min. Posteriormente 1 h en
cada disolución de EtOH (10%, 30%, 50%, 70%, 95%), seguido de 1 h en cada disolución EtOH:Roti®-
Histol, 3:1, 1:1, 1:3, Roti®-Histol 100%. Tras el último lavado puso el tejido en viales con unos 7 mL
de Roti®-Histol y se mantuvo en un horno a 60 °C.
Embebido: Gota a gota se añadió Paraplast® precalentado a 60 °C hasta doblar el volumen y se
incubó durante 24 h. Esta operación se repitió 3 veces. Finalmente se embebió el tejido en pequeños
bloques de Paraplast® dejando enfriar a temperatura ambiente.
Seccionado: Del bloque de Paraplast® se cortaron secciones de 10 μm de grosor en un micrótomo
“Microm HM355 S”, se pusieron en láminas de cristal con polilisina y se incubaron a 42 °C durante 12
h. Posteriormente se almacenaron a 4 °C hasta su uso.
II.2.25 Inmunohistoquímica (procedimiento)
Desencerado: Las láminas de cristal con el tejido a analizar se lavaron en Roticlear® 2 veces, 10
min cada una. Seguido, Roticlear®:EtOH 1:1, 5 min.
Rehidratación: Se lavó el tejido 2 min en cada disolución de EtOH (95%, 70%, 50%, 30%, 10%), y
dos veces en H2O.
Bloqueo de peroxidasas endógenas: El tejido se lavó en H2O2 0,3% en MeOH durante 30 min.
Incubación de anticuerpos primarios: Dos lavados con PBS durante 5 min se llevaron a cabo,
seguidos de otro con BSA 1% en PBS durante 1 h. Siguieron dos lavados de 5 min con PBT y
finalmente se añadió el anticuerpo primario anti-cocaína en diferentes diluciones en BSA 1% en PBS
(100 μL/muestra). Las muestras se cubrieron con una lámina de cristal y se incubaron durante 12 h a
4 °C.
Anexo II: Protocolos
50
Los anticuerpos primarios policlonales fueron cosechados en oveja, provistos por RayBiotech,
Inc., mientras que los monoclonales fueron cosechados en ratón, provistos por GeneTex, Inc.
Incubación de anticuerpos secundarios: Se lavaron las muestras en PBT dos veces, 5 min cada
una, y se añadió el anticuerpo secundario ligado a peroxidasa –HRP– (anti-oveja o anti-ratón, según
el anticuerpo primerio usado) en diferentes diluciones en PBS con BSA 1% (100 μL/muestra). Las
muestras se cubrieron con una lámina de cristal y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h.
Los anticuerpos secundarios anti-oveja fueron cosechados en vaca, provistos por Santa Cruz
Biotechnology Inc., mientras que los anticuerpos anti-ratón fueron cosechados en cabra, provistos
por Sigma-Aldrich, Inc.
(A) Detección con DAB: A cada muestra se añadieron 100 μL de DAB (10 μL DAB 10x en 90 μL de
Substrato Peróxido Estable 1x) y se incubó a temperatura ambiente durante 8 min. Seguidamente se
lavaron las muestras en PBT para parar la reacción.
Las láminas se analizaron bajo un microscopio óptico “Zeiss Axiovert 200” con cámara
acoplada “Zeiss Axiocam MRc5”.
(B) Detección con tiramida: A cada muestra se añadieron 100 μL de solución de tiramida a
partir del kit “Tyramide Signal Amplification Alexa Fluor® 546”.
Las láminas se analizaron bajo un microscopio confocal “Zeiss Confocal LSM510”.
II.3 Secuencias de ADN
Vectores
El vector pH9GW usado para expresión en E.coli es una modificación del vector pET-T7 (28a) de
Merck KGaA (Novagen), con un tag de polihistidina (9xHis), la secuencia attR Gateway, y resistencia
a la kanamicina (Yu y Liu, 2006).
El vector Gateway® pYesDest52 usado para expresión en S.cerevisiae y con resistencia a la
ampicilina es un vector de Invitrogen GmbH modificado con un strep-tag y la secuencia attR
Gateway.
El vector pEP-Strep usado para expresión en P.pastoris y con resistencia a la zeocina es una
modificación del vector pICHOLI de MoBiTec GmbH con un strep-tag y la secuencia attR Gateway.
Primers
Para PCR y secuenciación de EcBAHD4 en el vector pH9GW se usaron los primers T7 promoter y
T7 terminator; para el vector pYesDest52, T7 promotor y V5 reverse; y para el vector pEP-Strep,
5’AOX y 3’AOX.
Primer Secuencia (5’3’)
T7 Promoter TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG
T7 Terminator CCC AAG GGG TTA TGC TAG TT
V5 Reverse ACC GAG GAG AGG GTT AGG GAT
5‘AOX GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC
3‘AOX GCA AAT GGC ATT CTG ACA TCC
Anexo II: Protocolos
51
II.4 Desarrollos de ecuaciones
II.4.1 Modelo de Michaelis-Menten
A) Un solo substrato, sin inhibición
E = Enzima; S = Substrato; P = Producto
K’M = Constante de Michaelis-Menten; ki = constante cinética
Suponiendo una reacción irreversible:
La velocidad de reacción es, tomando la conversión a producto como etapa limitante, k-1>>kcat:
La concentración de enzima libre es la total (inicial) menos la adsorbida , por
tanto:
Sustituyendo en la ecuación (3):
B) Un solo substrato. Inhibición por substrato (acompetitiva)
En este caso, la ecuación (1) quedaría:
donde
Anexo II: Protocolos
52
Y asumiendo equilibrio rápido, la velocidad de formación de producto queda:
II.4.2 Derivación de la ley de Beer-Lambert aplicada al complejo ACG-cocaína
ACG = ácido clorogénico; C = complejo; TA = Tropano alcaloide (cocaína)
A(λ) = Absorbancia a la longitud de onda considerada; ε = Absortividad molar; KC = constante de
formación del complejo
Asumiendo un complejo ACG:TA en relación 1:1:
La concentración de TA y ACG es la inicial menos la que está en forma de complejo,
,
Teniendo en cuenta que la absorbancia total es la suma de las absorbancias de las tres especies
[ACG], [TA], [C], la ley de Beer-Lambert para una cubeta de 1 cm de longitud (l), queda:
Sustituyendo (8) en (4), y si se elige la longitud de onda y el blanco tal que la absorbancia de la
cocaína y del ACG se hacen prácticamente cero, la ecuación queda:
Anexo III: Resultados complementarios
53
Anexo III: Resultados complementarios
En las páginas siguientes se muestran gráficas e imágenes en relación con los experimentos de
RMN e IHQ que por espacio no se han incluido en la memoria del PFC.
Anexo III: Resultados complementarios
54
Figura 35: Resonancia Magnética Nuclear. Comparación del espectro 1H completo del ACG por separado y en presencia de cocaína.
Anexo III: Resultados complementarios
55
Figura 36: Resonancia Magnética Nuclear. Comparación del espectro 1H de la cocaína por separado y en presencia de ACG. La zona del espectro mostrada corresponde a valores altos del
desplazamiento químico (ppm), es decir, a la parte aromática de la molécula.
Anexo III: Resultados complementarios
56
Figura 37: Resonancia Magnética Nuclear. Comparación del espectro 1H completo de la cocaína por separado y en presencia de ACG.
Anexo III: Resultados complementarios
57
Figura 38: Resonancia Magnética Nuclear. Espectro de correlación homonuclear bidimensional (COSY) del ACG en presencia de cocaína. El espectro COSY ayuda a determinar la posición exacta de ciertos picos no detectables por espectroscopía
1H como el mostrado en rojo, cuya señal en el espectro
1H es incierta debido la señal de la cocaína.
Anexo III: Resultados complementarios
58
Figura 39: Magnética Nuclear. Espectro de correlación homonuclear bidimensional (COSY) de la cocaína en presencia de ACG. El espectro COSY ayuda a determinar la posición exacta de ciertos picos no detectables por espectroscopía
1H como el mostrado en rojo, cuya señal en el espectro
1H es incierta debido la señal del ACG.
Anexo III: Resultados complementarios
59
Figura 40: Inmunohistoquímica. Detección –con DAB– de cocaína realizada en una hoja adulta de E.coca. Ambas imágenes tomadas entre la vena central y el extremo de la sección trasversal de la hoja con un aumento 10x. (A) Control negativo, sin anticuerpos; (B) protocolo completo (con anticuerpos).
Anexo III: Resultados complementarios
60
Figura 41: Inmunohistoquímica. Detección de cocaína realizada en una hoja de A.thaliana. Imagen (A) tomada en el extremo de la sección trasversal de la hoja con un aumento 20x; imagen (B) tomada hacia la mitad de la sección con un aumento 10x. Izquierda, imagen fluorescente; centro, campo claro (luz normal); derecha, imágenes superpuestas.
Anexo IV: Glosario
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Anexo IV: Glosario
Aminoácido (proteína): Molécula orgánica que contiene un grupo amino y otro carboxilo.
Cada uno de los bloques que componen una proteína.
Analgésico: Medicamento que calma o elimina el dolor.
Anticolinérgico: Compuesto que reduce los efectos del neurotransmisor acetilcolina en
el sistema nervioso central y el sistema nervioso periférico.
Anticuerpo: Proteína en forma de “Y” usada por el sistema inmune para identificar
o neutralizar cuerpos extraños.
- Monoclonales: Anticuerpos con afinidad por el mismo antígeno
que son idénticos entre sí por proceder de células también
idénticas clones de la misma célula madre.
- Policlonales: Anticuerpos que provienen de diferentes células
madre.
Antígeno: Sustancia que, cuando se introduce en un cuerpo, provoca una
respuesta inmune por parte del mismo, generando anticuerpos que
reconocen y neutralizan dicha sustancia.
Tampón de adsorción: Es el primero de los tampones usados durante la purificación de una
proteína por cromatografía de afinidad, siendo el otro el tampón de
elución. La lisis celular así como la posterior colección de proteína y
otros análisis de la misma se realizan comúnmente en tampón de
adsorción.
Tampón de elución: (Ver “Tampón de adsorción”).
Citoplasma: Emulsión coloidal fina de aspecto granuloso que reside dentro de la
membrana celular y cuya función es albergar los orgánulos de la
célula, excepto el núcleo. Está compuesto por el citosol y los
orgánulos.
Citosol: Parte líquida del citoplasma.
Codón: Cada triplete de nucleótidos (A, C, G, T) que codifica un aminoácido.
P.ej. ATG (codón de inicio) se transcribe a AUG, que se traduce al
aminoácido metionina.
Coenzima: Es un tipo de cofactor orgánico; un compuesto químico no proteico
que se adhiere a una proteína –normalmente enzimas– y que es
requerido para la actividad biológica de la misma.
Anexo IV: Glosario
62
Control negativo: Control que descarta la posibilidad de que un resultado se deba a un
efecto no relacionado con el experimento en cuestión, es decir, es un
experimento de no debería funcionar.
Control positivo: Control que confirma la veracidad de un resultado, es decir, es un
experimento que debería funcionar.
Electroforesis de gel Técnica usada comúnmente para analizar fragmentos de ADN. Puesto
que de agarosa (ADN): el ADN está cargado negativamente, la aplicación de corriente
eléctrica entre los extremos del gel de agarosa donde se inyecta el ADN,
permite su separación en función del tamaño.
Ensayo Bradford de Ensayo colorimétrico para determinar la concentración de una
proteína, proteínas: basado en la interacción de la proteína con el azul de Coomassie G-
250. Mayor concentración de proteína implica mayor interacción y por
tanto mayor estabilización de la forma azul del colorante, lo cual se puede
cuantificar por espectrofotometría preparando una recta de calibrado
con un patrón externo como la albúmina de suero bovino.
Enzima: Proteína que cataliza una reacción química.
Expresión (proteína): Proceso mediante el cual la información codificada en un gen (ADN) se
usa para la síntesis de una proteína mediante la transcripción y
traducción.
Extracto crudo de proteína: Proteína no purificada, obtenida tras la lisis celular.
Flowthrough: En purificaciones por cromatografía de líquidos, p.ej. FPLC, es la
primera fracción en abandonar la columna tras la inyección,
correspondiente al analito no retenido. Luego de la misma le suceden
el lavado y las fracciones purificadas.
Gen: Secuencia lineal de nucleótidos en una molécula de ADN con la
información necesaria para la síntesis de una macromolécula con