AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE UTILIZANDO ANTIOXIDANTE UTILIZANDO SISTEMA SISTEMA β β -CAROTENO/ÁCIDO -CAROTENO/ÁCIDO LINOLÉICO E MÉTODO DE LINOLÉICO E MÉTODO DE SEQÜESTRO DE RADICAIS DPPH SEQÜESTRO DE RADICAIS DPPH Joaquim Maurício DUARTE-ALMEIDA, Ricardo José dos SANTOS, Maria Inês GENOVESE, Franco Maria LAJOLO Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 26(2): 446-452, abr.-jun. 2006
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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE UTILIZANDO SISTEMA β -CAROTENO/ÁCIDO LINOLÉICO E MÉTODO DE SEQÜESTRO DE RADICAIS DPPH Joaquim Maurício DUARTE-ALMEIDA,
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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE UTILIZANDO ANTIOXIDANTE UTILIZANDO
SISTEMA SISTEMA ββ-CAROTENO/ÁCIDO -CAROTENO/ÁCIDO LINOLÉICO E MÉTODO DE LINOLÉICO E MÉTODO DE
SEQÜESTRO DE RADICAIS DPPHSEQÜESTRO DE RADICAIS DPPH
Joaquim Maurício DUARTE-ALMEIDA, Ricardo José dos SANTOS, Maria Inês GENOVESE, Franco Maria LAJOLO
Introdução:Introdução: Radicais de oxigênio e ânion superóxido → papel importante nas reações bioquímicas/fisiológicas do corpo humano;
Produção excessiva
processos patofisiológicos ou fatores ambientais adversos
falta de antioxidantes disponíveis in vivo
podem ocorrer doenças e danos profundos em tecidos
Introdução:Introdução: ANTIOXIDANTES → retardam a velocidade da oxidação, através de um ou mais mecanismos, tais como inibição de radicais livres e complexação de metais;
Compostos fenólicos
potentes antioxidantes
Acerola → ácido ascórbico
Morango, amora e açaí → determinados grupos de flavonóides como antocianinas, flavonóis e flavonas
Introdução:Introdução: MÉTODO DE OXIDAÇÃO DO Β-CAROTENO/ÁCIDO LINOLÉICO
avalia a atividade de inibição de radicais livres gerados durante a peroxidação do ácido linoléico
O método está fundamentado em medidas espectrofotométricas da descoloração (oxidação) do β-caroteno induzida pelos produtos de degradação
oxidativa do ácido linoléico
Objetivo:Objetivo:
A proposta do presente trabalho foi avaliar a atividade antioxidante de compostos puros e extratos de frutas, por
meio de dois métodos, com o objetivo de otimizar a velocidade de aquisição de dados, reduzindo também as
quantidades de reagentes e de amostras.
Materiais e Métodos:Materiais e Métodos:
Frutos in natura
açaí (Euterpe oleracea Martius) acerola (Malpighia glabra L.)
amora (Rubus L.) e morango (Fragaria x ananassa Duch.)
adquiridos na Ceagesp (Companhia de Entrepostos e Armazéns Gerais de São Paulo)
estágio maduro prontos para consumo
Materiais e Métodos:Materiais e Métodos:
Após os frutos serem lavados em água corrente, foram cortados em pedaços, imediatamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados em freezer a -80ºC até o momento das análises, quando foram triturados e homogeneizados em gral com pistilo, sob nitrogênio líquido;
Preparo dos extratos dos frutos:
extração realizada em duplicata; homogeneizou-se 1 g de amostra + 20 mL de metanol 70% em Ultra-Turrax por 1 min em velocidade média, em banho de gelo;filtrado em papel de filtro Whatman nº 6. refiltrado e os extratos obtidos foram reunidos, ajustando-se o volume final para 50 mL com metanol 70%.
Materiais e Métodos:Materiais e Métodos: Determinação da atividade antioxidante utilizando-se sistema β-caroteno/ácido linoléico: Mistura reativa → 20 μL de ácido linoléico + 200 mg de Tween 40 + 25 μL
de solução de β-caroteno a 2 mg/mL em clorofórmio + 500 μL de clorofórmio em erlenmeyer
Completa evaporação do clorofórmio sob N2
adicionou-se 25 mL de água previamente saturada com oxigênio durante 30 min
agitou-se vigorosamente
Materiais e Métodos:Materiais e Métodos: Determinação da atividade antioxidante utilizando-se sistema β-caroteno/ácido linoléico:
Mistura reativa límpida com absorbância entre 0,6 e 0,7 em 470 nm;
Determinação das absorbâncias → microplaca de poliestireno com 96 cavidades (λ entre 340 e 800 nm);
Cada cavidade da microplaca → 250 μL mistura reativa + 10 μL de metanol (controle) ou o mesmo volume para as soluções padrão ou extratos das amostras;
Materiais e Métodos:Materiais e Métodos: Determinação da atividade antioxidante utilizando-se sistema β-caroteno/ácido linoléico:
Placa incubada 45ºC (acelerar as reações de oxidação e iniciar o descoramento do β-caroteno);
Leituras realizadas imediatamente e com intervalos de 15 min, durante 120 min, em espectrofotômetro de microplaca Benchmark Plus;
As curvas foram preparadas com 100, 200, 300, 400, 500 e 600 μmoles de ácido ascórbico, 25, 50, 100, 150 e 200 μmoles de BHA e BHT e 150, 300, 450, 600 e 750 μmoles de quercetina.
Materiais e Métodos:Materiais e Métodos: Determinação da atividade antioxidante utilizando-se sistema β-caroteno/ácido linoléico:
Resultados foram expressos como porcentagem de inibição da oxidação, que foi calculada em relação ao decaimento da absorbância do controle (Ac);
A queda da absorbância das amostras (Aam) foi correlacionada com a queda do controle, obtendo-se a porcentagem da inibição da oxidação (% I) através da equação:
Materiais e Métodos:Materiais e Métodos: Determinação da atividade antioxidante utilizando-se sistema β-caroteno/ácido linoléico:
Eficiência do antioxidante → valores de F1 e F2 (YANISHILIEVA & MARINOVA) calculados a partir da curva de oxidação (abs470 nm x tmin)
Eficiência em bloquear a reação em cadeia (interação com os radicais peróxidos) → mensurada na primeira parte da curva (15 e 45 min)
A relação entre as tangentes das curvas da solução padrão e do controle expressa a eficiência do antioxidante (F1) (Equação 2):
Materiais e Métodos:Materiais e Métodos: Determinação da atividade antioxidante utilizando-se sistema β-caroteno/ácido linoléico:
Possibilidade de o antioxidante participar de outras reações durante o processo oxidativo → medida durante a segunda parte da curva (75 e 90 min) (F2):
Materiais e Métodos:Materiais e Métodos: Determinação da atividade antioxidante através do método de seqüestro de radicais livres (DPPH):
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE → capacidade dos antioxidantes em seqüestrar o radical DPPH
Foi utilizado metanol como CONTROLE e BHA, BHT, ácido ascórbico, ácido clorogênico e quercetina como PADRÕES;
Decaimento da absorbância das amostras (Aam) correlacionado ao decaimento da absorbância do controle (Ac) → porcentagem de seqüestro de radicais livres (% SRL), que pode ser expressa através da equação:
Resultados e discussão:Resultados e discussão: Determinação da atividade antioxidante pelo sistema β-caroteno/ácido linoléico com microplaca de poliestireno e DPPH→ expressiva redução do uso de reagentes e de amostras (95%);
Sistema β-caroteno/ácido linoléico → leituras no leitor de microplaca são automáticas e seqüenciais → maior precisão e não requer a presença do analista durante o ensaio;
Determinação da atividade antioxidante pelo sistema β-caroteno/ácido linoléico:
BHA e BHT → ampla utilização na indústria alimentícia;
QUERCETINA e ÁCIDO ASCÓRBICO → normalmente presentes em frutas e vegetais;
Resultados e discussão:Resultados e discussão:
Resultados e discussão:Resultados e discussão:
Resultados e discussão:Resultados e discussão: ÁCIDO ASCÓRBICO → conhecido por sua atividade antioxidante e por isso é utilizado em cosméticos ou em tratamentos de doenças degenerativas;
Após o Ác. Ascórbico doar
os 2 H redutores, ficou passível de receber elétrons, devido ao radical
ascorbila formado, que é
um agente oxidante
Resultados e discussão:Resultados e discussão: Compostos fenólicos → antioxidantes e capazes de exercer seu papel biológico → [ ] ↓ capazes de impedir, retardar e prevenir a auto-oxidação ou oxidação mediada por radicais livres e que o produto formado após a reação seja estável;
Resultados e discussão:Resultados e discussão:
Maior percentagem de
inibição em menor concentração
Estrutura semelhante a
quercetina, mas com glicosídeo na OH →
Menor atividade
↓ atividade antioxidante →
poucas OH redutoras
Resultados e discussão:Resultados e discussão: Compostos fenólicos → antioxidantes e capazes de exercer seu papel biológico → [ ] ↓ capazes de impedir, retardar e prevenir a auto-oxidação ou oxidação mediada por radicais livres e que o produto formado após a reação seja estável;
Valores de F1 e F2 próximos de 1 → menor atividade antioxidante;
F1 → ação sobre o BLOQUEIO DE PERÓXIDOS;
F2 → ação antioxidante em outras reações durante a oxidação;
Resultados e discussão:Resultados e discussão:
Resultados e discussão:Resultados e discussão:
Resultados e discussão:Resultados e discussão:
Atividade antioxidante através do método de seqüestro de radicais livres (DPPH)
Transferência de elétrons de um composto antioxidante para o DPPH, que ao se reduzir perde sua coloração púrpura;
Avalia apenas o poder redutor do antioxidante → não detecta substâncias pró-oxidantes;
Resultados e discussão:Resultados e discussão:
Radical ascorbila não interfere na reação nesse
sistema → Ação antioxidante
Maior porcentagem de seqüestro de radicais livres em comparação ao BHA e o BHT.
Resultados e discussão:Resultados e discussão:
Menor atividade que acerola e amora nesse
sistema
Maior porcentagem de seqüestro de radicais livres →
ácido ascórbico → ação antioxidante
Menor atividade em ambos os
sistemas
Conclusões:Conclusões: Atividade antioxidante dos extratos das frutas mostrou-se de acordo com a dos padrões analisados;
Sistema β-caroteno/ácido linoléico → extrato de ACEROLA comportou-se como PRÓ-OXIDANTE e o AÇAÍ, a AMORA e o MORANGO comportaram-se como ANTIOXIDANTES;
Seqüestro de radicais livres (DPPH) → extrato de ACEROLA apresentou a maior atividade antioxidante, seguido pelos extratos de AMORA, AÇAÍ e MORANGO;
ÁCIDO ASCÓRBICO → comportamento relacionado nos dois sistemas;
Conclusões:Conclusões: Adaptações dos métodos utilizando microplacas permitiram a realização de múltiplas análises, minimizaram o uso de reagentes e reduziram significativamente a quantidade de amostra necessária;
A automatização das leituras de absorbância simplificou e reduziu o tempo e o trabalho despendido pelo analista, proporcionando também grande precisão nos resultados.