Page 1
1
Autoreferat
1. Imię i nazwisko:
Damian Kamil Gaweł
2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe:
Doktor nauk biologicznych, specjalność biochemia, Instytut Biochemii i Biofizyki Polskiej
Akademii Nauk, 2003.
Tytuł rozprawy doktorskiej: „Spontaneous frameshift mutagenesis and UV-induced mutagenesis
occurring during replication of leading and lagging DNA strands in Escherichia coli cells”.
Promotor: prof. dr hab. Iwona Fijałkowska
Magister inżynier, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, 1997.
Praca magisterska pt. „Konstrukcja systemu do badania wierności replikacji na nici prowadzącej
i opóźnionej w Escherichia coli” wykonana w Pracowni Mutagenezy i Reperacji DNA, w
Instytucie Biochemii i Biofiyzki PAN pod kierunkiem prof. dr hab. Iwony Fijałkowskiej i prof. dr
hab. Piotra Jonczyka.
Promotor: dr Jerzy Rogoziński
3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych.
2012 – obecnie Adiunkt, Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, Centrum Medyczne
Kształcenia Podyplomowego, Warszawa.
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. Barbara Czarnocka
2011 – 2012 Adiunkt, Katedra i Zakład Biochemii, I Wydział Lekarski z Oddziałem
Stomatologicznym, Warszawski Uniwersytet Medyczny, Warszawa.
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. Anna Barańczyk-Kuźma
2008 – 2011 Pracownik naukowy (Research Scientist), Department of Pediatrics, Infection
Diseases, Duke Medical Center, Duke University, USA.
Kierownik zespołu: Patrick Seed, MD. PhD.
2003 – 2008 Staż naukowy (Postdoctoral Fellow), Laboratory of Molecular Genetics,
National Institute of Environmental and Health Sciences, USA.
Kierownik zespołu: Roel Schaaper, PhD.
2003 – 2003 Biolog, Pracownia Mutagenezy i Reperacji DNA, Instytut Biochemii i Biofizyki
PAN w Warszawie.
Kierownik zespołu: prof. dr hab. Iwona Fijałkowska
Page 2
2
1997 – 2003 Studia doktoranckie, Szkoła Biologii Molekularnej, Instytut Biochemii i
Biofizyki PAN w Warszawie.
Promotor: prof. dr hab. Iwona Fijałkowska
4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach
naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze
zm.):
a) tytuł osiągnięcia naukowego
Analiza czynników genetycznych oraz mechanizmów kontrolujących stabilność genomu
b) (autor/autorzy, tytuł/tytuły publikacji, rok wydania, nazwa wydawnictwa)
[1]. Gawel D., Fijalkowska I.J., Jonczyk P., Schaaper R.M.
Effect of dNTP pool alterations on fidelity of leading and lagging strand DNA replication in E. coli
2014, Mutation Research, Jan;759:22-8
IF = 4.44; MNiSW = 35 pkt
[2]. Gawel D., Fijalkowska I.J., Jonczyk P. and Schaaper R.M.
The dnaX36 mutator of Escherichia coli: effects of the DNA Polymerase III holoenzyme τ subunit
on chromosomal DNA replication fidelity
2011, Journal of Bacteriology, Jan;193(1):296-300
IF = 3.825; MNiSW = 35 pkt
[3]. Gawel D., Hamilton M.D., Schaaper R.M.
A novel mutator of E. coli carrying a defect in the dgt gene encoding a dGTP triphosphohydrolase
2008, Journal of Bacteriology, Nov;190(21):6931-9
IF = 3.636; MNiSW = 32 pkt
[4]. Gawel D., Pham P.T., Fijalkowska I.J., Jonczyk P., Schaaper R.M.
Role of Accessory DNA Polymerases in the Escherichia coli dnaX36 Mutator Mutant
2008, Journal of Bacteriology, Mar;190(5):1730-42
IF = 3.636; MNiSW = 32 pkt
[5]. Kuban W., Jonczyk P., Gawel D., Malanowska K., Schaaper R.M., Fijalkowska I.J.
Role of Escherichia coli DNA polymerase IV in in vivo replication fidelity,
2004, Journal of Bacteriology, Jul;186(14):4802-7
IF = 4.146; MNiSW = 16 pkt.
Łączny wskażnik „impact fator” (IF) dla prac wchodzących w skład „osiągnięcia naukowego”
wynosi 19.683 (150 pkt MNiSW).
Page 3
3
c) omówienie celu naukowego/artystycznego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników
wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania.
Jedną z podstawowych funkcji żywej komórki jest zdolność do podziału. Proces ten
poprzedza zduplikowanie genomu. Synteza nowej cząsteczki DNA zachodzi z wysoką
wiernością oraz prędkością. Przy syntezie ~1000 nukleotydów na sekundę błąd w zapisie
nowej sekwencji DNA pojawia się średnio raz na 1010 syntetyzowanych par zasad. Mimo, że
proces replikacji cechuje tak wysoka wierność, powstające błędy stanowią istotne źródło
mutacji spontanicznych. Przyjmuje się, że oprócz mutacji powstających w trakcie procesu
rekombinacji, generowanych podczas procesów naprawy DNA, czy indukowanych przez
czynniki endo- i egzogenne, to właśnie błędy generowane podczas procesu replikacji DNA
odgrywają znaczącą rolę w procesie mutagenezy.
Niestabilność genetyczna jest jednym z głównych czynników związanych z genezą wielu
chorób, w tym nowotworowych, czy autoimmunologicznych. Opisanych jest wiele genów, w
których określone zmiany (mutacje), powstałe w zapisie sekwencji nukleotydowej są typowe dla
określonego wariantu chorobowego. Geny te określane są jako markerowe, a indukowane w
nich mutacje, opisywane jako mutacje predykcyjne. Do tego typu markerów należą np. geny
związane z naprawą DNA tj. BRCA1 i BRCA2 , czynnik transkrypcyjny p53, czy protoonkogeny
związane ze ścieżką regulacyjną MAPkinaz. Dlatego poznanie czynników molekularnych oraz
mechanizmów odpowiedzialnych za kontrolę procesu wierności syntezy DNA ma istotne
znaczenie dla zrozumienia źródeł zmienności w przyrodzie, procesu ewolucji, jak również
patogenezy chorób, w których czynniki genetyczne odgrywają istotną rolę.
Prowadzone przeze mnie badania miały na celu : (i) poznanie molekularnych czynników
odpowiedzialnych za wierność procesu syntezy DNA, (ii) zbadanie ich wpływu na częstość i
specyficzność mutacji generowanych podczas syntezy DNA in vivo na nici prowadzącej i
opóźnionej DNA oraz (iii) poznanie mechanizmów kontroli stabilności genomu. Ponieważ wiele
zjawisk w żywej komórce przebiega w podobny lub niemal identyczny sposób zarówno u
organizmów prokariotycznych, jak i eukariotycznych, w swojej pracy doświadczalnej
posłużyłem się klasycznym organizmem modelowym – bakterią Escherichia coli. Model ten
pozwala na badanie uniwersalnych procesów komórkowych oraz ich mechanizmów, w tym
replikacji chromosomalnego DNA oraz procesu mutagenezy.
Synteza DNA
Replikacja obu nici DNA zarówno u organizmów pro- jak i eukariotycznych przebiega w
obrębie tych samych widełek replikacyjnych, a enzymem syntetyzującym dwie nowe nici DNA
jest polimeraza DNA. W przypadku E. coli główną replikazą jest polimeraza III DNA, która wraz
Page 4
4
z towarzyszącymi jej białkami o różnych funkcjach tworzy funkcjonalny kompleks nazywany
holoenzymem polimerazy III DNA (Hol Pol III DNA). Synteza potomnego DNA zachodzi tylko w
kierunku 5’→3’. Ponieważ dwie nici DNA mają przeciwną orientację, to w trakcie równoczesnej
syntezy jedna z nici jest syntetyzowana zgodnie z ruchem widełek replikacyjnych, w sposób
ciągły (nić prowadząca), druga zaś w postaci (<2000 par zasad) fragmentów Okazaki (nić
opóźniona). Przy stałym kierunku replikacji, budowa widełek replikacyjnych oraz asymetryczna
budowa holoenzymu polimerazy III umożliwiają jednoczesną syntezę nici prowadzącej i
opóźnionej. Mechanizm syntezy nici jest różny. Synteza nici opóźnionej wymaga ciągłych
dysocjacji i reasocjacji polimerazy od/do DNA, co zmniejsza procesywność replikacji. Przyjęto,
że różny mechanizm replikacji nici DNA może być powodem różnic wierności tego procesu
pomiędzy nicią prowadzącą, a opóźnioną. Wykazano istnienie kilkakrotnej różnicy w częstości
mutagenezy dla mutacji typu podstawienia par zasad i zmiany ramki odczytu dla nici
prowadzącej i opóźnionej, zarówno w komórce bakteryjnej, jak i eukariotycznej (Fijalkowska et
a.l, 1998; Gawel et a.l, 2002; Pavlov et al., 2002).
Pomimo, że replikacja jest procesem charakteryzującym się wyjątkowo wysoką
wiernością (1 błąd popełniany jest na 109- 1011 syntetyzowanych par zasad) to błędy są
generowane.
Wysoka wierność jest wynikiem współdziałania czterech czynników:
1. Syntezy komplementarnych par zasad przez polimerazę.
2. Aktywności korektorskiej 3'→5' egzonukleazy.
3. Działania poreplikacyjnego systemu naprawy błędnie sparowanych zasad.
4. Odpowiednio zbilansowanej, wolnej od zmodyfikowanych form mieszaniny
dideoksynukleotydów (dNTP).
Defekt w funkcjonowaniu każdego z tych czterech elementów powoduje znaczny wzrost
poziomu mutacji (Schaaper, 1993; Ahluwalia and Schaaper, 2013).
Polimerazy DNA
Polimerazy są wyspecjalizowanymi białkami zdolnymi do syntezy kwasów nukleinowych.
W komórce E. coli zidentyfikowanych zostało pięć polimeraz DNA, natomiast komórka ludzka
dysponuje aż 16 enzymami zdolnymi do syntezy genomu. Polimeraza III DNA (Pol III) jest
głównym enzymem katalizującym syntezę DNA w komórce E. coli. Charakteryzuje się wysoką
procesywnością i wiernością syntezy wynoszącą ~10-5. Pol III posiada dodatkowo aktywność
enzymatyczną 3'→5' egzonukleazy, umożliwiającą usunięcie pojedynczych, źle sparowanych
nukleotydów. Ta aktywność zwiększa wierność syntezy matrycy 100-krotnie, do wartości ~10-7.
Ilość cząsteczek białka Pol III w komórce E. coli szacuje sie na <30. Polimerazą o podobnej
aktywności i wierności syntezy jest polimeraza II DNA (Pol II). Badania wskazują , że pełni ona
istotną rolę w replikacji DNA, jako polimeraza „pomocnicza/zapasowa” (ang. back-up
Page 5
5
polymerase) dla polimerazy III DNA. Brak jej aktywności nie wpływa znacząco na przeżywalność
komórki w warunkach fizjologicznych. Dodatkowo Pol II odgrywa ważną rolę w procesach
naprawczych. Liczba cząsteczek polimerazy II w komórce wynosi ok. 50 i zwiększa się do ~300
w warunkach stresu. Trzecią z polimeraz charakteryzującą się wysoką wiernością syntezy DNA
jest polimeraza I (Pol I). Posiada trzy aktywności enzymatyczne: polimerazy,
egzonukleazy 3'→5' oraz egzonukleazy 5'→3'. Pol I wyspecjalizowana jest w wycinaniu
starterów RNA i syntezie DNA. Cechuje się wysoką wiernością, ale niską procesywnością.
Występuje w liczbie ok. 400 cząsteczek na jedną komórkę. Podobnie do polimerazy III DNA jest
białkiem niezbędnym dla przeżywalności komórki (Fijalkowska et al., 2012).
W organizmie E. coli aktywne są jeszcze dwie polimerazy: polimeraza IV (DinB, Pol IV)
oraz polimeraza V DNA (UmuD2’C, Pol V). Obie należą do polimeraz rodziny Y i cechują się niską
wiernością oraz procesywnością (z ang. „error-prone”polymerases). Mają zdolność do syntezy
DNA przez uszkodzenia oraz źle sparowane zasady, kosztem obniżonej wierności. Liczba
molekuł DinB w komórce wynosi około 250 i zwiększa się w warunkach stresu, do ok. 2500.
Polimeraza V należy do białek systemu SOS i jest indukowana w komórce w odpowiedzi na stres
i osiąga liczbę ~200 cząsteczek.
Dostęp do końca 3’ DNA jest limitowany poprzez wysoką procesywność polimerazy III
oraz nieznany mechanizm regulacji. Dane wskazują, że mechanizm kontroli dostępu polimeraz
do matrycy DNA nie zależy bezpośrednio od ilości wolnych cząsteczek polimeraz i ich
współzawodnictwa o wolny koniec nici 3’, a raczej decyduje o tym typ uszkodzenia, które
sprowokowało oddysocjowanie Pol III DNA od DNA. Różnice w mechanizmie replikacji nici
opóźnionej i prowadzącej (w związku z tym częsta dysocjacja Pol III na nici opóźnionej - synteza
fragmentów Okazaki) powodują, że szansa na udział pozostałych polimeraz w replikacji nici
opóźnionej jest bardziej prawdopodobna, czego konsekwencją może być różny poziom
wierności syntezy obu nici.
Czynnikiem, który ostatecznie podnosi wierność syntezy DNA o dwa rzędy wielkości do
wartości ok. 10-10 jest poreplikacyjny system naprawy błędnie sparowanych zasad (z ang.
mismatch repair – MMR). System ten skutecznie rozpoznaje, a następnie usuwa błędy
replikacyjne pozostawione przez polimerazy i nieusunięte poprzez 3'→5' egzonukleazę.
Nieaktywny, powoduje wzrost mutagenezy.
Budowa holoenzymu polimerazy III DNA. Białko .
Holoenzym polimerazy III DNA, jest złożonym kompleksem białkowym
odpowiedzialnym za syntezę genomu w komórce E. coli. Zbudowany jest z 17 podjednostek:
()22('), które można pogrupować w funkcjonalne kompleksy. Hol Pol III DNA jest
zbudowany z dwóch rdzeni polimerazy (), które umieszone są na dwóch przeciwstawnie
syntetyzowanych niciach DNA i składa się z polimerazy (), 3'→5'egzonukleazy () oraz
Page 6
6
podjednostki , stabilizującej rdzeń. Pierścienie każdy tworzy dimer) asystują rdzeniowi
polimerazy utrzymując go przy matrycy, zwiększając procesywność syntezy DNA, co jest istotne
zwłaszcza dla syntezy nici prowadzącej. Kompleks (') jest odpowiedzialny za
umieszczanie i usuwanie pierścienia na/z nici DNA, podczas syntezy nici opóźnionej, na
której polimeraza musi być cyklicznie usuwana po zakończeniu syntezy fragmentu Okazaki i
dostarczana w miejsce syntetyzowanego przez primazę startera RNA.
Białko odgrywa niezwykle istotną rolę w holoenzymie pełniąc funkcję centrum
koordynacyjnego dla wszystkich elementów kompleksu. Położone centralnie pełni rolę
rusztowania dla całej cząsteczki Hol Pol III DNA, ale również reguluje proces replikacji. Białko
jako jedyne wchodzi w bezpośrednią lub pośrednią interakcję ze wszystkimi białkami widełek
replikacyjnych, włączając helikazę i primazę. Reguluje prędkość syntezy DNA poprzez kontakt z
DnaB helikazą oraz inicjuje usunięcie polimerazy z nici opóźnionej na końcu fragmentu Okazaki
poprzez bezpośrednią interakcję z podjednostką rdzenia polimerazy.
Białko zbudowane jest z 643 aminokwasów i kodowane przez gen dnaX . Jest ono
jednym z dwóch peptydów syntetyzowanych przez ten gen. Drugim z nich, krótszym, jest białko
, które wchodzi w skład kompleksu odpowiedzialnego za umieszczanie i usuwanie pierścienia
na/z DNA. Białka i są identyczne pod względem budowy na odcinku 430 pierwszych
aminokwasów (domeny I-III), a ich stosunek stechiometryczny w komórce wynosi 1:1.
Identyczny skład aminokwasowy obejmujący domeny I-III obu produktów genu dnaX powoduje,
że białko posiada aktywność białka , a co za tym idzie ma m.in. zdolność do umieszczania i
usuwania pierścienia na/z DNA. Białko posiada dodatkowo dwie domeny (IV i V) na końcu
C-terminalnym, które są kluczowe dla szybkiej, procesywnej i jak wykazaliśmy wiernej syntezy
DNA. Domena IV pośredniczy w interakcji -helikaza, a domena V jest odpowiedzialna za
interakcję z podjednostką polimerazy III DNA. Ponieważ białko w komórce występuje jako
dimer (2), może skutecznie wiązać dwa rdzenie polimerazy i koordynować ich aktywność w
obrębie tych samych widełek replikacyjnych. pełni niezwykle ważną rolę w kontrolowaniu
wierności procesu replikacji, głównie poprzez regulację dostępu poszczególnych polimeraz do
matrycy DNA (McHenry, 2011, Gawel et al. 2008).
Pula dNTP i „efekt kolejnego nukleotydu”
W ostatnich latach w badaniach nad wiernością syntezy DNA coraz więcej uwagi poświęca
się puli dNTP. Jest to czwarty czynnik, który w znaczący sposób może wpływać na poziom
mutacji generowanych w czasie replikacji DNA (poza klasycznymi, omówionymi powyżej:
aktywnością polimerazy, aktywnością korektorską 3’→5’ egzonukleazy oraz aktywnością
postreplikacyjnego systemu MMR). Jak pokazały doświadczenia stosunkowo niewielka zmiana
Page 7
7
w proporcjach stężenia poszczególnych dNTP również prowadzi do dramatycznego (>1000x)
wzrostu ilości mutacji w komórce (Ahluwalia and Schaaper, 2013).
W kontroli puli dNTP w komórce bierze udzial szereg genów. W E. coli do kluczowych
należą geny kodujące enzymy wchodzące w skład cyklu syntezy dezoksyrybonukleotydów tj.
nrdAB (reduktaza nukleotydowa- kluczowy enzym syntezy dNTP), ndk (kinaza NDP, która
również odgrywa istotną rolę w kontroli stężenia NTP w komórce), czy dcd (deaminaza dCTP,
enzym głównego szlaku syntezy dUMP). Mutacje w obrębie ww. genów powodują zmianę
proporcji puli poszczególnych dNTP w komórce, czego konsekwencją jest wzrost mutagenezy. W
trakcie syntezy DNA o miejsce w centrum aktywnym polimerazy współzawodniczy jeden
poprawny dNTP z pozostałymi trzema (nie licząc możliwej kontaminacji puli zmodyfikowanymi
formami DTP). Mimo, że polimeraza bardzo precyzyjnie wybiera poprawną cząsteczkę dNTP
(popełnia błąd raz na 105 syntetyzowanych par zasad) to zmiana stężenia dNTP w puli znacząco
zmienia (obniża) tę wysoką selektywność i zwiększa prawdopodobieństwo popełnienia błędu
przez polimerazę. Również samo zatrzymanie syntezy DNA spowodowane wstawieniem
nieprawidłowego nukleotydu może promować oddysocjowanie polimerazy III DNA od matrycy.
Przerwanie ciągłości procesu syntezy DNA może powodować rozplecenie 3’ końca DNA i
powstanie niesparowanych fragmentów DNA, które są narażone na częste rearanżacje i
dyslokacje nukleotydów. Dodatkowo, o powstały koniec 3’-OH rywalizują wszystkie polimerazy,
w tym Pol IV, czy Pol V, charakteryzujące się obniżoną wiernością syntezy DNA.
Mechanizmem, na drodze którego zmiana puli nukleotydowej może wpływać również na
wierność replikacji jest opisane przez Bloom et al., 1997 zjawisko określane „efektem
następnego nukleotydu”. Stwierdzono, że po wstawieniu nieprawidłowego nukleotydu podczas
syntezy DNA kontynuowanie tego procesu jest łatwiejsze, gdy kolejnym wstawianym
nukleotydem jest nukleotyd występujący w komórce w nadmiarze – co skutkuje „wymuszonym”
przechodzeniem polimerazy przez wstawioną nieprawidłowo zasadę.
Inną klasą białek wpływających na stabilność puli nukleotydowej i w konsekwencji
wierność syntezy DNA są enzymy usuwające zmodyfikowane dNTP z puli. Klasycznym
przykładem takiego białka jest białko MutT (MTH1 to jego ludzki homolog), pirofosfataza
katalizująca hydrolizę 8-oxodGTP do monofosfonukleozydu (Fowler and Schaaper, 1997).
Polimeraza III DNA wydajnie wstawia 8–oxoG naprzeciw adeniny, co w konsekwencji prowadzi
do znacznego wzrostu transwersji typu AT→CG. Delecja genu mutT powoduje silny wzrost
poziomu 8-oxodGTP w komórce, co świadczy o niezwykle ważnej roli białka MutT w kontroli
poziomu mutagenezy. 8-oxodGTP jest tylko jedną z wielu pochodnych form prawidłowych
dNTP o potencjale mutagennym. W związku z tym zakłada się istnienie innych białek o podobnej
aktywności do MutT. Jednym z takich peptydów jest Dgt. Kodowane przez gen dgt białko
charakteryzuje się nietypową aktywnością dGTPazy i zdolnością do odłączania trzech grup
Page 8
8
fosforanowych od deoxyguanozyny (dGTP→dG + PPPi). Dodatkowo białko to ma zdolność do
wiązania się do pojedynczej nici DNA. dgt jest genem mutatorowym. Delecja dgt powoduje
wzrost poziomu mutagenezy, specyficznie podnosząc częstość mutacji typu GC→CG i AT→GC.
Obserwacje te sugerują, że Dgt może pełnić istotną rolę w kontroli prawidłowej puli dGTP lub
podobnie jak MutT usuwać zmodyfikowane pochodne dNTP z komórki, ograniczając w ten
sposób szanse na zsyntetyzowanie przez polimarazę błędnej pary nukleotydów.
Omówienie prac
Prowadzone badania miały na celu analizę czynników genetycznych oraz mechanizmów
kontrolujących stabilność genomu oraz dokonanie pomiaru częstości mutagenezy spontanicznej
generowanej podczas syntezy DNA. Używając metod biologii molekularnej modyfikowaliśmy i
analizowaliśmy geny oraz mechanizmy zaangażowane bezpośrednio lub związane z kontrolą
wierności procesu replikacji. Posłużyliśmy się systemami eksperymentalnymi umożliwiającymi
pomiar mutagenezy podczas procesu syntezy DNA in vivo na nici prowadzącej i opóźnionej DNA.
Pozwoliło nam to na:
(i) opisanie roli Pol III, Pol II i Pol IV w procesie syntezy DNA;
(ii) określenie częstości i specyficzności mutagenezy generowanej przez
poszczególne polimerazy podczas syntezy DNA in vivo (w tym na nici
prowadzącej i opóźnionej DNA);
(iii) opisanie roli białka w kontrolowaniu wierności replikacji oraz w regulacji
dostępu polimeraz do matrycy DNA;
(iv) odkrycie i charakterystykę nowego genu mutatorowego dgt;
(v) analizę zależności wierności procesu syntezy DNA , w tym nici prowadzącej i
opóźnionej, od stężenia poszczególnych dNTP w puli nukleotydowej.
[1]. Kuban W., Jonczyk P., Gawel D., Malanowska K., Schaaper R.M., Fijalkowska I.J. Role of
Escherichia coli DNA polymerase IV in in vivo replication fidelity, 2004, Journal of Bacteriology,
Jul;186(14):4802-7.
W pracy opisaliśmy badania nad rolą polimerazy IV DNA (Pol IV, produktu genu dinB) w
replikacji chromosomalnego i episomalnego DNA w komórce Escherichia coli. Zbadaliśmy, czy
obecność stosunkowo wielu cząsteczek tej polimerazy w komórce (>200) może odpowiadać za
obserwowany poziom mutacji spontanicznie generowanych w trakcie procesu syntezy DNA.
Założyliśmy, że jeśli Pol IV bierze udział w normalnej replikacji DNA, to delecja genu dinB będzie
powodowała spadek poziomu mutagenezy (efekt antymutatorowy), przy założeniu, że
polimeraza IV, podobnie jak to obserwowano w warunkach in vitro, również in vivo cechuje się
obniżoną wiernością syntezy DNA. Porównując częstości mutacji w szczepach z nieaktywnym
poreplikacyjnym systemem naprawy błędnie sparowanych par zasad (co pozwalało nam
Page 9
9
monitorować faktyczną częstość mutacji powstałych w trakcie syntezy DNA) wykazaliśmy, że
dla badanych typów mutacji i markerów brak aktywnej polimerazy IV nie wpływa na zmianę
poziomu mutacji chromosomalnego DNA w komórce. Również dokonując pomiaru mutagenezy
na nici prowadzącej i opóźnionej nie zaobserwowaliśmy wpływu braku Pol IV na ilość
powstających mutacji chromosomalnych. Z kolei wyraźny fenotyp dla delecji dinB
zaobserwowaliśmy w szczepach, w których gen markerowy (allel lac) znajdował się na episomie
(F’ lac-pro). Każda cząsteczka F’ występuje w komórce E. coli w ~3 kopiach i oprócz genu
markerowego posiada sekwencje genu dinB. Poziom podstawowy mutacji spontanicznych jest
wyższy, niż ten obserwowany w szczepach, w których gen markerowy oraz dinB wystepują w
pojedynczej kopii i lokalizują sie wyłącznie na chromosomie. Po usunięciu wszystkich kopii
dinB, poziom mutacji dla markera lac znajdującego się na czynniku F’ spadł ok. 5-krotnie, co
świadczy, że Pol IV bierze aktywny udział w replikacji episomalnego DNA. Otrzymane wyniki
pokazały, że udział Pol IV DNA w replikacji chromosomalnego DNA w komórce E. coli jest
ograniczony, natomiast wierność syntezy DNA episomalnego w znacznym stopniu zależy od
aktywności polimerazy IV DNA.
[2]. Gawel D., Pham P.T., Fijalkowska I.J., Jonczyk P., Schaaper R.M. Role of Accessory DNA
Polymerases in the Escherichia coli dnaX36 Mutator Mutant, 2008, Journal of Bacteriology,
Mar;190(5):1730-42.
W pracy omawiamy wyniki dalszych badań nad mechanizmami mutagenezy,
koncentrując się na roli białka oraz analizie udziału poszczególnych polimeraz DNA w
syntezie DNA i kontrolowaniu wierności procesu replikacji w komórce E. coli . Gen dnaX koduje
podjednostkę polimerazy III holoenzymu. W badaniach posłużyliśmy się mutantem
(DnaX36) i systemem doświadczalnym, w którym gen markerowy (określony allel lac)
znajdował się na episomie (F’ lac-pro). Mutacja w allelu dnaX36 lokalizuje się w C-końcowym
fragmencie peptydu, domenie V, odpowiadającej za oddziaływanie z podjednostką
(polimerazą) rdzenia holoenzymu. jest mutatorem i jak wskazują otrzymane wyniki wzrost
częstości mutacji spowodowany jest nieprawidłowym procesowaniem błędów popełnionych
przez Pol III podczas syntezy DNA. Zaproponowaliśmy, że źródłem obserwowanej mutagenezy
jest zmieniona interakcja -. Pokazaliśmy również, że wzrost poziomu mutacji w dnaX36 był
ściśle zależny od aktywności polimerazy IV DNA i polimerazy II DNA. Wysoka częstość mutacji
w szczepach dnax36 była wprost proporcjonalna do liczby cząsteczek Pol IV w komórce, dlatego
(jak to obserwowaliśmy w poprzednich badaniach) delecja genu dinB prowadziła do znacznego
spadku poziomu mutacji. Niezwykle interesującą interakcję zaobserwowaliśmy pomiędzy Pol II
a . Wyniki wskazują, że Pol II pełni funkcję korektorską dla błędnie syntetyzowanych par
zasad przez Pol III podczas procesu replikacji . Podsumowując, otrzymane wyniki pokazują
Page 10
10
zależność pomiędzy aktywnością polimeraz DNA a podjednostką która ma na celu
zapewnienie optymalnej, wysokiej wierności replikacji. Nieprawidłowa interakcja
destabilizuje rdzeń, czego przejawem jest wzrost częstości mutacji typu podstawienia par zasad
oraz zmiany ramki odczytu. Jest to jedna z pierwszych prac przedstawiająca kompleksową
analizę udziału poszczególnych polimeraz w widełkach replikacyjnych i charakteryzująca rolę
białka spoza rdzenia polimerazy, w kontroli wierności replikacji.
[3]. Gawel D., Fijalkowska I.J., Jonczyk P. and Schaaper R.M. The dnaX36 mutator of Escherichia
coli: effects of the DNA Polymerase III holoenzyme τ subunit on chromosomal DNA replication
fidelity, 2011, Journal of Bacteriology, Jan;193(1):296-300.
Praca stanowi kontynuację badań nad rolą białka holoenzymu polimerazy III w
procesie replikacji DNA. Celem projektu była analiza roli podjednostki w kontrolowaniu
wierności syntezy DNA Escherichia coli, z wykorzystaniem systemu genetycznego
umożliwiającego monitorowanie częstości oraz specyficzności generowanych mutacji na nici
prowadzącej i opóźnionej. Mutant dnaX36 wykazuje działanie modyfikujące interakcje , co
znajduje odzwierciedlenie w zaburzeniach procesowania błędów przez polimerazę III, a co za
tym idzie obniżeniu wierności syntezy DNA. Wykazano, że: (i) kontroluje wierność replikacji
zarówno nici prowadzącej, jak i opóźnionej, (ii) powstające mutacje są niezależne od aktywności
Pol IV, oraz (iii) efekt mutatorowy jest niwelowany przez Pol II. Zaproponowaliśmy, że rolą
jest kontrolowanie mechanizmów odpowiedzialnych za procesowanie błędów popełnionych
przez Pol III α podczas syntezy DNA. Przyjęliśmy, że podczas prawidłowej replikacji większość
błędnie sparowanych zasad przez polimerazę α jest usuwana przez podjednostkę ɛ rdzenia
polimerazy (3’→5’ egzonukleazę). Ta wysoce wydajna korekta błędów replikacyjnych zależy od
białka τ, które promuje wymaganą zmianę konformacji umieszczając w miejscu błędu
egzonukleazę. Otrzymane wyniki wskazują, że τ może również promować oddysocjowanie
rdzenia Pol III od błędnie sparowanej zasady, umożliwiając w ten sposób dostęp do wolnego
końca 3’-OH polimerazie II DNA. Nasze dane wskazują, że główną polimerazą edytującą błędy
generowane przez polimerazę III w szczepie dnaX36 jest polimeraza II. W rzeczywistości, ponad
90% potencjalnych mutacji jest wydajnie edytowanych poprzez replikazę II.
Zaproponowaliśmy, że Pol II odgrywa niezwykle istotną antymutatorową funkcję podczas
procesu replikacji, pełniąc rolę polimerazy zapasowej/pomocniczej dla głównej replikazy Pol III
DNA.
[4]. Gawel D., Hamilton M.D., Schaaper R.M. A novel mutator of E. coli carrying a defect in the dgt
gene encoding a dGTP triphosphohydrolase, 2008, Journal of Bacteriology, Nov;190(21):6931-9.
W poszukiwaiu nowych czynników wpływających na mutagenezę przeprowadziliśmy
Page 11
11
również badania nad nowo odkrytym allelem o potencjale mutatorowym – genem dgt,
kodującym białko Dgt. Białko to należy do nadrodziny enzymów HD, metalozależnych
fosfohydrolaz i występuje w komórkach bakterii, jak i eukariontów. Cechuje je aktywność
dNTPazy i niezwykła specyficzność: dNTP są hydrolizowane do odpowiedniego nukleozydu i
tripolifosforanu (dNTP→dN + PPPi) oraz brak aktywności w stosunku do NTP. Wśród puli dNTP,
jak dotąd dGTP zostało zidentyfikowane jako substrat o najwyższym powinowactwie do Dgt.
Białko to również wykazuje aktywność względem kwasu dezoksyrybonukleinowego (ma silne
powinowactwo do pojedynczych łańcuchów DNA). Naszym celem było poszukiwanie
mechanizmu, który pozwala Dgt regulować stabilność DNA w komórce E. coli.
Zaobserwowaliśmy, że inaktywacja genu bakteryjnego dgt prowadzi do silnego ≤100-krotnego
wzrostu określonych podstawień par zasad i mutacji typu przesunięcia ramki odczytu.
Aktywność mutatorowa dgt charakteryzuje się unikalną specyficznością, niespotykaną dotąd w
innych szczepach mutatorowych. Wśród sześciu możliwych mutacji typu podstawienia par
zasad, mutacje typu GC→CG i CG→AT były znacznie podwyższone w szczepie dgt. Sugeruje to,
że Dgt może być zaangażowane w nieznaną dotąd ścieżkę kontrolującą mutagenezę. Co ciekawe,
zaobserwowaliśmy również dwu- lub trzykrotne zmniejszenie częstości mutacji (efekt
antymutatorowy) dla transwersji GC→TA. Analiza tych efektów, w połączeniu z sekwencją
nukleotydową DNA, w której mutacje występowały sugeruje, że zmiana puli dGTP (zwiększenie
jej stężenia w szczepie dgt), może przynajmniej częściowo wyjaśniać obserwowane fenotypy.
Druga z hipotez zakłada, że Dgt może reprezentować nowy typ białka o funkcji podobnej do
MutT i usuwać z puli nukleotydowej zmodyfikowane pochodne, bądź ich prekursory. Hipoteza
ta zakłada, że dGTP nie jest fizjologicznym substratem dla Dgt, i że istnieje dotąd
niezidentyfikowany (inny niż np. 8-oxodGTP) substrat/pochodna dNTP, który nieusunięty z
komórki może znacząco wpływać na wierność procesu replikacji DNA in vivo.
[5]. Gawel D., Fijalkowska I.J., Jonczyk P., Schaaper R.M. Effect of dNTP pool alterations on fidelity
of leading and lagging strand DNA replication in E. coli. 2014, Mutation Research, Jan;759:22-8.
Celem pracy było zbadanie wpływu zaburzonej puli nukleotydowej na poziom mutacji
generowanych na nici prowadzącej i opóźnionej DNA i wykorzystanie tego efektu do
zdefiniowania nici, na której błędy replikacyjne powstają ze zwiększoną częstością. W
poprzednich badaniach wykazaliśmy, że wierność procesu syntezy nici prowadzącej i
opóźnionej DNA nie jest jednakowa. Wykorzystaliśmy w tych badaniach wcześniej
skonstruowany system genetyczny, w którym gen markerowy był wklonowany w dwóch
orientacjach względem miejsca startu replikacji. W tym systemie zdefiniowane błędy powstają
raz na nici prowadzącej, a raz na opóźnionej DNA chromosomalnego. Do badania wpływu
zaburzonej puli nukleotydowej na częstość powstawania mutacji użyliśmy alleli pełniących
Page 12
12
istotną rolę w kontroli stężenia puli dNTP w komórce: dcd i ndk, kodujących enzymy wchodzące
w skład cyklu syntezy dezoksyrybonukleotydów . Produktem genu ndk jest kinaza NDP, która
odgrywa kluczową rolę w kontroli stężenia wszystkich dNTP w komórce. Mutant ndk-
charakteryzuje się zachwianiem równowagi w stężeniu dNTP w komórce. W szczepie ndk-
obserwuje się wzrost stężenia dCTP i spadek stężenia dATP, podczas gdy stężenie dTTP i dGTP
nie ulega istotnym zmianom. Natomiast produktem genu dcd jest deaminaza dCTP, enzym
głównego szlaku syntezy dUMP. 80% dUMP w komórce E. coli jest syntetyzowane tą drogą.
dUMP jest prekursorem syntezy tymidyny (dTTP). Mutacja dcd- prowadzi do zaburzenia puli
dNTP w komórce i przejawia się wzrostem stężenia dCTP, przy jednoczesnej redukcji stężenia
dTTP. Obie mutacje powodują fenotyp mutatorowy spowodowany zakłóceniem puli
nukleotydowej w komórce. W wyniku przeprowadzonych doświadczeń wykazaliśmy, że zmiany
w puli nukleotydowej znacznie zwiększają częstość powstawania mutacji na nici prowadzącej,
jak i opóźnionej DNA chromosomalnego E. coli, i że efekt ten jest podobny dla obu nici. Zarówno
zmieniona ilość danego nukleotydu w puli w połączeniu z tzw. „efektem następnego
nukleotydu” (zwłaszcza kiedy dany dNTP jest w nadmiarze w komórce) odpowiadają za
zwiększoną częstość powstawania błędnych par. Dodatkowo szczegółowa analiza sekwencji i
obserwowane efekty mutatorowe alleli dcd i ndk oraz analiza preferencji syntezy błędnie
sparowanych par zasad in vitro przez polimerazę III DNA pozwoliły nam zaproponować, która z
nici jest bardziej mutagenna. Połączone wyniki sugerują, że nicią chromosomalnego DNA
charakteryzującą się większą wiernością syntezy jest nić opóźniona.
Piśmiennictwo:
1. Fijalkowska IJ, Jonczyk P, Tkaczyk MM, Bialoskorska M, Schaaper RM., Unequal fidelity of
leading strand and lagging strand DNA replication on the Escherichia coli chromosome. 1998,
Proc Natl Acad Sci U S A. Aug 18;95(17):10020-5.
2. Gawel D., Jonczyk P, Bialoskorska M, Schaaper RM, and Fijalkowska IJ, Asymmetry of
frameshift mutagenesis during leading and lagging-strand replication in Escherichia coli. 2002,
Mutation Research, 501(1-2):129-36
3. Pavlov YI, Newlon CS, Kunkel TA. Yeast origins establish a strand bias for replicational
mutagenesis. Mol Cell. 2002 Jul;10(1):207-13.
4. Schaaper RM. Base selection, proofreading, and mismatch repair during DNA replication in
Escherichia coli. 1993, J Biol Chem. Nov 15;268(32):23762-5.
5. Fijalkowska IJ, Schaaper RM, Jonczyk P. DNA replication fidelity in Escherichia coli: a multi-
DNA polymerase affair. 2012, FEMS Microbiol Rev. Nov;36(6):1105-21.
6. McHenry CS, Bacterial replicases and related polymerases. 2011, Curr Opin Chem Biol.
Oct;15(5):587-94.
7. Gawel D., Pham P.T., Fijalkowska I.J., Jonczyk P., Schaaper R.M. Role of Accessory DNA
Polymerases in the Escherichia coli dnaX36 Mutator Mutant. 2008, Journal of Bacteriology,
Mar;190(5):1730-42
8. Ahluwalia D, Schaaper RM. Hypermutability and error catastrophe due to defects in
ribonucleotide reductase. 2013, Proc Natl Acad Sci U S A. Nov 12;110(46):18596-601.
Page 13
13
9. Gawel D., Fijalkowska I.J., Jonczyk P., Schaaper R.M. Effect of dNTP pool alterations on fidelity
of leading and lagging strand DNA replication in E. coli. 2014, Mutation Research, Jan;759:22-8
10. Bloom LB, Chen X, Fygenson DK, Turner J, O'Donnell M, Goodman MF. Fidelity of Escherichia
coli DNA polymerase III holoenzyme. The effects of beta, gamma complex processivity proteins
and epsilon proofreading exonuclease on nucleotide misincorporation efficiencies. 1997, J Biol
Chem. Oct 31;272(44):27919-30.
11. Fowler RG, Schaaper RM. The role of the mutT gene of Escherichia coli in maintaining
replication fidelity. 1997, FEMS Microbiol Rev. Aug;21(1):43-54.
5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo – badawczych
a) Lista publikacji nie wchodzących w skład osiągnięcia (w rozumieniu art. 16 ust. 2 ustawy z dnia
14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie
sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.):
[1]. Singh D, Gawel D., Itsko M., Hochkoeppler A.,. Krahn JM., London RE., and Schaaper RM.
Structure of Escherichia coli dGTP Triphosphohydrolase: A Hexameric Enzyme With DNA
Effector Molecules.
2015, J. Biol. Chem. doi:10.1074/jbc.M115.636936
IF = 4.6 (2013/2014), MNiSW = 35 pkt.
[2]. Gawel M., Kostera-Pruszczyk A., Lusakowska A., Jedrzejowska M., Ryniewicz B., Lipowska
M., Gawel D., Kaminska A.
Motor unit loss estimation by the multipoint incremental MUNE method in children with spinal
muscular atrophy – a preliminary study.
2014, Neuromuscular Disorders, doi: 10.1016/j.nmd.2014.11.012.
IF = 3.134, MNiSW = 35 pkt.
[3]. Rudzinska M., Gawel D., Sikorska J., Karpinska K.M. Czarnocka B.
The role of the transmembrane glycoprotein PDPN in the biology of differentiated thyroid
cancers.
2014, PLOS ONE, May 5;9(5):e96541
IF = 3.534 (2013), MNiSW = 35 pkt.
[4]. Gawel M., Jamrozik Z., Szmidt-Salkowska E., Slawek J., Gawel D., Rowińska-Marcińska K.,
Kaminska A.
Electrophysiological features of lower motor neuron involvement in progressive supranuclear
palsy.
2013, J Neurol Sci., Jan 15;324(1-2):136-9.
IF = 2.262, MNiSW = 35 pkt.
Page 14
14
[5]. Gawel D. and P. Seed
Urinary tract infection drives genome instability in uropathogenic Escherichia coli and
necessitates translesion synthesis polymerase IV for virulence.
2011, Virulence, May 1;2(3)
IF = 2.264, MNiSW = 35 pkt
Lista publikacji uzyskanych przed otrzymaniem tytułu doktora nauk biologicznych:
[6]. Gawel D., Maliszewska-Tkaczyk M., Jonczyk P, Schaaper RM., and Fijalkowska IJ.
Lack of strand bias in UV-induced mutagenesis in Escherichia coli.
2002, Journal of Bacteriology, 184(16):4449-54.
IF = 3.959, MNiSW = 35 pkt.
[7]. Gawel D., Jonczyk P., Bialoskorska M., Schaaper RM., and Fijalkowska IJ.
Asymmetry of frameshift mutagenesis during leading and lagging-strand replication in
Escherichia coli.
2002, Mutation Research, 501(1-2):129-36
IF = 3.158, MNiSW = 35 pkt.
b) Analiza bibliometryczna dorobku. Sumaryczna wartość wskaźnika Impact Factor (IF) , łączna
liczba cytowań wszystkich dotychczasowych oraz wartość inedksu Hirsha
Sumaryczny IF publikacji oryginalnych: 43,152 (308 MNiSW)
Łączna liczba cytowań: 119 (Web of Sciences); (125, Scopus)
Indeks-h: 6 (Web of Sciences); 7 (Scopus)
Doniesienia konferencyjne: 20
c) Ukończone kursy i szkolenia
2007- Kurs z Izolacji i Hodowli Komórek Macierzystych, prowadzony przez Foundation for
Advance Education in the Sciences, National Institute of Health, USA
2006- Szkolenie z Real Time PCR (Bio-Rad), Duke University, USA
2000- Półroczny Staż Naukowy, National Institute of Health, USA
2000- Międzynarodowa Szkoła Biologii Molekularnej, Spetsai, Greece
Page 15
15
d) Dorobek dydaktyczny
2012 – obecnie prowadzenie zajęć dydaktycznych oraz kursów praktycznych/doszkalających
z zakresu biologii molekularnej i biochemii, w tym jako kierownik naukowy.
Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego
2013 – 2014 Promotor 11 prac dyplomowych, Wydział Nauk o Zdrowiu, Wyższa Szkoła
Infrastruktury i Zarządzania, Warszawa
2013 – 2014 Recenzent prac dyplomowych, Wydział Nauk o Zdrowiu, Wyższa Szkoła
Infrastruktury i Zarządzania, Warszawa
2012 – 2014 Zajęcia dydaktyczne z zakresu mikrobiologii i immunologii, Wydział Nauk o
Zdrowiu , Wyższa Szkoła Infrastruktury i Zarządzania, Warszawa
2011 – 2012 Zajęcia dydaktyczne z biochemii (seminaria i zajęcia praktyczne), Katedra
Biochemii, I Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Warszawski
Uniwersytet Medyczny
2004 – 2007 Szkolenie i opieka nad studentami w ramach programu „NIH
Summer Internship Program in Biomedical Research” prowadzonymi w
National Institute of Environmental and Health Sciences
2001 – 2002 Szkolenie i opieka nad studentem przygotowującym pracę magisterską,
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Warszawa
e) Stypendia i nagrody
2013 I nagroda za prezentacje ustną “The role of homeobox transcription factor Prox1 in the
biology of differentiated thyroid cancer”; 1st Central European Symposium of Young
Endocrinologist; Wrocław.
2013 Nagroda Rektora Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego za publikację
“Electrophysiological features of lower motor neuron involvement in progressive
supranuclear palsy”, J Neurol Sci. 2013
2007 Nagroda - „Research Excellence in Biomedical Sciences“ przyznana przez National
Institute of Environmental and Health Sciences, USA
2006 Nagroda - „Research Excellence in Biomedical Sciences“ przyznana przez National
Institute of Environmental and Health Sciences, USA
2000 Stypendium - The Kosciuszko Foundation
2000 Stypendium - Federation of European Biochemical Societies (FEBS)
2000 Stypendium - Federation of European Biochemical Societies (FEBS)
Page 16
16
1997 List gratulacyjny, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie