Aula Eletroforese

Tcnicas de EletroforeseRodrigo Rocha Latado

EletroforeseDiversos mtodos para anlise de:

cidos nuclicos (DNA e RNA)

Protenas

Enzimas

ETAPAS

Preparar a amostra (DNA total, Produtos de PCR, Protenas, etc...)

Preparar o gel

Aplicar as amostras no gel

Eletroforese

Colorao do gel, Fixao, Documentao

CLASSIFICAO

Tipos: - agarose- poliacrilamida desnaturanteno desnaturante- amido (para isoenzimas)

Princpios:- carga eltrica e tamanho da molcula (partcula)

- pH (focalizao isoeltrica)

Deteco:brometo de etdeo, SYBR, nitrato de prata, fluorescnciasubstratos especficos (isoenzimas)

Visualizao:

UV, direta, cmera

EletroforeseSharp, Sambrook and Sugden

EletroforeseSyber greenSinger VL, Lawlor TE, Yue S. 1999. Comparison of SYBR Green Inucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat. Res. 439(1):37-47.http://www.probes.com/servlets/product?region=0&item=7563

cidos Nuclicoscido nuclico exposto a campo eltrico migra para eletrodo na velocidade ou mobilidade proporcional a fora do campo e a carga lquida da molculamobilidade: inversamente proporcional ao coeficiente friccionalcoeficiente friccional: funo do tamanho e forma da molcula e viscosidade do meio

EletroforeseMolculas separadas por:tamanhoforma ou conformaomagnitude de cargas

Sob pH fisiolgico -> fosfatos ionizadospolinions correm em direo ao eletrodo positivoEletroforese plo negativo -> plo positivo

Eletroforese

EletroforeseTamanho da Molcula de DNADNA linear migra inversa/ proporcional ao log10 do seu peso molecular

EletroforeseAGAROSE: polissacardeo linear de galactose com unidades de b-D-galactopiranose com ligaes 1,3 e 3,6-anidro-a-L-galactopiranose

PM mdio: 120.000 Da

Agarose

Eletroforese em gel de agarose

- Tampo (TAE ou TBE) e agarose

- Concentrao agarose varia entre 1 e 3%

- Fundir a agarose no tampo e aplicar na frma

- Esperar esfriar, retirar o pente

- Aplicar as amostras no gel

- Iniciar a eletroforese

EletroforeseTampes: gua eletrolisada gerando H+ no anodo e OH- no catodo

terminal catdico (+) -> bsicaterminal andico (-) -> cida

requer tampo para evitar gradientes de pH

Eletroforese

Tampo

Aplicao e comentrios

TAE

Usar quando o DNA vai ser recuperado

Usar para eletroforese de DNA de grande tamanho (> 12 Kb)

Baixa fora inica

Propriedades:

Baixa capacidade tamponante - recirculao pode ser necessria para corridas eletroforticas longas (> 6 horas).

TBE

Usar para eletroforese de DNA pequeno (< 1 Kb)

Melhor resoluo de DNA pequeno (< 1 Kb)

Mobilidade do DNA mais restrita

Alta fora inica

Propriedades:

Diminui a mobilidade do DNA.

Alta capacidade tamponante - no requer recirculao para corridas longas.

EletroforeseTAEpara recuperao de fragmentospreferido molculas maioresmenor campo de foramaior porosidade

TBEpreferido para molculas menores < 1Kbinterage com agarose - poros menores

EletroforeseVoltagemexpressar sempre em V cm-1gradiente de voltagem - distncia entre eletrodos

voltagem excessiva - rastro de bandavoltagem baixa - difuso de bandas pequenas

Eletroforese

Tamanho

Voltagem

Tampo

Recuperao

Anlise

< 1 kb

5 V/cm

TAE

TBE

1 to 12 kb

4-10 V/cm

TAE

TAE/TBE

> 12 kb

1-2 V/cm

TAE

TAE

EletroforeseTempo de corrida

correr gel at banda de interesse ter migrado de 40 a 60% do comprimento do gel

parte inferior do gel - difuso e disperso

EletroforeseTampo de Carregamento:Concentrao 6 a 10xaumentar densidade da amostra - depositar amostra no fundo do pooadicionar cor a amostraadicionar corantes de mobilidade ou migraoazul de bromofenolxileno cianolverde de bromocresol

Eletroforese- Poliacrilamida

GEL DE POLIACRILAMIDA

- Gis de Poliacrilamida so obtidos a partir da formao de ligaes entre o polmero acrilamida e o co-monmero bis-acrilamida.

- Essa reao covalente geralmente catalizada por persulfato de amnio e iniciada por TEMED, uma amina terciria.

- Uma ampla faixa de tamanho de poros pode ser obtida atravs de variaes de: Concentrao de acrilamida e bis-acrilamida Grau de polimerizao

GEL DE POLIACRILAMIDA

- A matriz de poliacrilamida por possuir poros menores do que a matriz de agarose, gis de acrilamida so usados para separar fragmentos de DNA menores que 2 kpb, enquanto que molculas de at 200 kpb podem ser separaradas em gis de agarose.

- De forma geral, um gel de 12 cm, a 1% de agarose separa fragmentos na faixa de 30 a 0,2 Kbp, enquanto que a 7,5% de poliacrilamida separa entre 1 a 0,05 Kpb.

Eletroforese

Acrilamida* (%)

Tamanho de Fragmentos Separados

(pares de base)

Migrao de Corante

Xileno Cianol Azul

de Bromofenol

pb pb

3,5

100 1000

460

100

5,0

80 500

260

65

8,0

60 400

160

45

12,0

40 200

70

20

15,0

25 150

60

15

20,0

6 100

45

12

O corante Azul de Bromofenol (Bromphenol Blue) migra a aproximadamente a 300 pares de base e Xileno Cianol (Xylene Cyanol) a 4 Kpb, independente da concentrao de agarose entre 0,5 e 1,4% em 0,5 x de TBE.

ACRILAMIDA DESNTAURANTE- Acrscimo de Uria no gel para a manuteno do DNA naforma de fita simples

- Amostras de DNA so desnaturadas a 94 -96o C, na presena de Formamida, antes da eletroforese