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VIROLOGIA - Micro (Aula 1)
Iremos ver: estrutura, classificao e replicao viral; mecanismo
de patogenia viral: as armas que os vrus usam para causar leso de
clulas e diagnstico laboratorial nas doenas virais (exames
complementares para confirmar uma infeco viral) Observamos
diferentes estruturas dos vrus (envelopados e no envelopados, com
ou sem capsdeos), diferentes mtodos de replicao e o conhecimento
desses dois facilita o diagnostico laboratorial, o tratamento
(novos antivirais podem ser aplicados e aprovados, de acordo com o
modo de replicao ou da estrutura do vrus); e a preveno (conhecer
como esse vrus infecta, por exemplo) Mtodos de controle:
-conhecimento de reservatrios: conhecer de cada vrus, como o da
dengue, febre amarela, permite fazer o controle dessa doena -modo
de transmisso: como esse vrus se transmite, como fecal-oral;
-mtodos para inativar vrus de interesse: destruir a causa para
fazer vacinas (pode fazer vacina por meio de vrus mortos ou uma
vacina atenuada); -vacinas -drogas anti-virais: importante, pois os
vrus podem desenvolver resistncia aos anti-virais, como ocorre em
coquetel de HIV (como tambm h nas bactrias) Consequncia das
infeces: -sofrimento seguido de recuperao: doena aguda e resoluo
dessa sem deixar problemas, como na influenza -doena persistente:
como hepatite B, apresentando uma cronicidade -doena fatal: quando
chega no rgo alvo (alguns vrus so considerados benignos, mas isso
tambm depende do estado do paciente, sade, idade, sistema imune e
outras doenas associadas), como no vrus da raiva, que ao chegar no
SNC fatal (internao , pode entrar em coma e levar a morte) -doena
congnita: como na rubola no adulto benigno, mas no primeiro
trimestre pode gerar sequelas irreversveis (transmisso vertical)
-fator contribuinte no cncer: muitos vrus so oncognicos capazes de
induzir transformao e imortalizao da clula e desenvolve o tumor,
como no vrus da hepatite B -fator contribuinte em outras doenas: se
o individuo j possui outra doena associada e adquire outro
determinado vrus, isso aumenta o grau de complicao Os vrus podem
ser uteis no desenvolvimento de vacinas. H uma protena, por
exemplo, muito importante para a proteo contra a doena de chagas, s
que eu no consigo fazer uma imunizao com essa protena, ento eu
posso pegar o gene dessa protena e transfectar em um vrus atenuado
(mas vivo), levar o gene a produzir grande quantidade de protena e
induzir uma resposta imune contra essa protena do T. cruzi;
(carreador de qualquer gene para produzir um antgeno que no possua
relao com o vrus) Terapia genica: quando o individuo nasce com
algum defeito no gene, ento eu posso carrear genes com a utilizao
do vrus como um vetor (pego um gene de uma pessoa normal, fao
transfeco para um vrus, infecto o individuo com esse vrus vai ser
uma infeco que no causa doenas, pois vrus atenuado, mas vai repor
esse erro gentico hereditrio, por produo de protenas ou vai
corrigir um gene defeituoso) Ferramentas para investigar clulas
hospedeiras: auxilia no conhecimento sobre fisiologia da clula
hospedeira, que usada como fabrica na replicao.
Transcrio de Brbara Almeida,
Karen Figueiredo e Thas Gonalves
MEDUERJ 2016
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Vrus possuem genoma de acido nucleico DNA ou RNA protegido por
uma cobertura proteica chamada de capsdeo , que protege do
ambiente, mas tambm importante porque possui ligantes para
receptores especficos nas clulas alvo protenas para proteo e
entrada (VAP PROTEINA DE ADESO OU FIXAO VIRAL), pois possuem
algumas terminaes que so ligante nos receptores das clulas
permissveis que oferecem todo o maquinrio necessrio para replicao.
O primeiro encontro do vrus com a clula-alvo feita por essa
protenas virais que possuem receptores especficos, ex: EBV que
possui receptor somente nas clulas B humanas, mas h outros tipos de
vrus que tambm podem infectar animais, insetos etc. Envelopes
lipdicos: Alguns vrus so chamados de vrus envelopados, possuindo o
genoma dentro de capsdeo proteico e em torno desse h um envelope
lipdico com algumas protenas e glicoprotenas (esse envelope
adquirido da clula hospedeira). Sendo de natureza lipdica, ele
menos resistente. Quando o vrus perde a sua proteo proteica, ele
fica incapaz de infectar qualquer clula. O vrus de maior resistncia
ambiental o no-envelopado (?). O tamanho dos vrus pode variar de
18-380 nm. So parasitas intracelulares obrigatrios, sendo a
resposta imune eficaz a celular, a melhor que destruiria seria a
CD8/CTL. Slide mostrando comparao com a bactria Escherichia coli e
vrus RNA,DNA, vrus da varola (grandes) -pico (pequeno com RNA)
Propriedades dos vrus: -agentes filtrveis: existem filtros , em que
se pega liquido como um soro, urina, passa no filtro e esteriliza
bactrias retidas e como os vrus so muito pequenos, eles passam,
sendo agentes filtrveis; -parasitas intracelulares obrigatrios
-incapazes de produzir energia ou protenas independentemente da
clula hospedeira: vrus no faz nada, ele leva no seu genoma o que
precisa, mas toda a sua protena, sntese porteira, duplicao do
genoma, tudo a clula hospedeira que fornece. Se a clula alvo
permissa no possui determinada enzima que o vrus precisa para
fabricar componentes estruturais ou no estruturais, ele precisa
levar no genoma o gene para codificar o restante para a clula
produzir o que ele precisa utilizar (ao contrario desaparece). A
mquina do vrus a clula alvo. -os genomas virais consistem em RNA ou
DNA, mas no ambos; -vrus apresentam morfologia com capsdeo desnudo
ou com envoltrio -componentes virais so organizados e no sofrem
replicao por diviso (eles replicam dentro das clulas, montam as
suas partculas, e saem das clulas por lise celular ou por
brotamento, sendo essa ultima de melhor vantagem, pois a clula
permanece viva e fechada e a maquinaria celular continua; se h lise
celular, ele destri a fabrica dele). H vrus que mantm no mximo a
clula vrus para aumentar a carga viral (ocorrem muitas replicaes);
Consequncias das propriedades dos vrus: -os vrus no so vivos -os
vrus devem ser infecciosos para sobreviver na natureza, infectando
planta, inseto, humano; -os vrus devem ser capazes de utilizar os
processos das clulas hospedeiras para produzir seus componentes
(RNAm, protenas e copias idnticas dos genomas virais); -os vrus
devem codificar quaisquer processos necessrios no oferecidos pelas
clulas hospedeiras (como uma enzima ou protena importante para a
sua replicao viral, ele ento deve levar essas protenas de forma
inativa, sendo ativadas dentro das clulas, pois a clula no tem essa
enzima);
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-necessrio a ocorrncia de auto-organizao dos componentes virais
: montagem dos vrus para deixar as clulas por lise ou brotamento
COMPARAO ENTRE BACTERIAS E VIRUS (SLIDE) Fatores que afetam a faixa
de hospedeiro: -receptores da superfcie celular: hospedeiro ideal
aquele que possui clulas que possui receptores que reconhecem as
VAP virais, ao contrario no ocorre infeco. As clulas hepticas, por
exemplo, possuem receptores ideais ao vrus da hepatite.
-disponibilidade da maquinaria de replicao: ela deve oferecer toda
a maquinaria -habilidade de sair das clulas e disseminar-se: por
lise, ou outra forma de morte celula ou brotamento; -resposta
anti-viral do hospedeiro: importante, pois principalmente os vrus
com efeitos citopticos causam leses; mas a grande maioria das
doenas virais, a leso, inflamao leva a hemorragia , como febre
amarela, no o vrus que causa, mas sim a resposta imune
(imunepatognica). Ento a imunologia uma faca de 2 gumes, pois se o
individuo muito comprometido, ele tem virose grave ou mesmo
benigna. O sistema imune tanto na fase inata quando na adquirida
importante por bloquear ou terminar infeco viral, mas muitas das
leses so causadas pelas respostas imunes, principalmente nos vrus
que no fazem efeito citopatico. Dependendo da resposta imune do
hospedeiro, ele tem menos ou mais sucesso. Estrutura viral: -a
partcula viral : virion -protena que recobre o genoma: capsdeo.
Esses so usualmente simtricos, mas pode ser helicoidal ou
icosadrico. -capsideo + genoma = nucleocapsideo (? Ver no slide)
-pode haver ou no o envelope -simetria icosadrica (20 faces, 12
vrtices , 5 pentmeros) ou helicoidal (comprimento controlado pelo
genoma viral e a hlice pode ser firme ou flexvel ; como no vrus do
Tobaco, que possui um capsdeo com um genoma em hlice circular)
-pentons com 5 lados e hexons com 6 lados - o envelope uma membrana
com bicamada lipdica da clula hospedeira, so que protena na
superfcie do envelope so protenas virais. Essas glicoprotenas
externas so as VAP , atravs dessas h reconhecimento de receptores
nas clulas-alvo. Ex: na influenza h uma hemaglutinina que liga a
hemcia ou outra clula que contenha esse receptor. importante, pois
uma protena de ligao com as clulas permissvel (ao contrario no h
adeso ou infeco eficaz) Envelope: adquire o envelope por brotamento
a partir da membrana celular. Ento quando h uma infeco, j estando
dentro das clulas, j possui componentes prontos, protenas prontas,
o vrus insere essas protenas virais na superfcie da membrana da
clula hospedeira e naquele local ele sai por brotamento. Assim, ele
no mata a clula, sai por brotamento, a clula recupera a membrana.
Ento o brotamento possibilita a liberao do vrus sem causar morte
clula. O envelope possui protenas virais e no da clula hospedeira
(codificadas pelo vrus). A perda do envelope resulta na perda da
infectividade (somente nos vrus envelopados), pois perde o ligante
para a clula hospedeira. A mesma coisa ocorre com o vrus no
envelopado e o capsdeo. Se h perda desse ultimo, ele no infecta
mais nenhuma clula, pois no pode reconhecer clula-alvo (no possui
VAP). O envelope tambm pode ser adquirido por lise celular. O mais
comum por brotamento, mas quando a fabrica esta muito cheia, ento
ocorre por lise (por alterao da membrana, fazendo com que ocorra
lise). Muitos vrus prolongam a vida das clulas para usar e abusar
da fabrica , enquanto outros imortalizam as clulas, sendo
denominados de vrus oncognicos. No no envelopado, s ocorre por
lise.
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Revisando.... -icosadrico -icosadrico envelopado -helicoidal
-helicoidal envelopado -morfologia complexa Agentes no
convencionais -so mais simples que os vrus, chamados de virides;
-composto somente por RNA, no codifica para protena (no possui nada
para codificar protenas, o RNA chega na clula e transcrito) e ate o
momento, os virides conhecidos possuem interesse na botnica; -virus
humano da hepatite D : agente delta > esta entre um viride e um
vrus (no nenhum dos dois completo), sendo o mais simples que mais
infecta o homem. um vrus parasita de outro vrus vrus da hepatite D
somente cresce na presena do vrus da hepatite B ( o tipo D oferece
ferramentas para o tipo B) Classificao dos vrus: Pode ser por:
tamanho, morfologia, tipo do acido nucleico, caractersticas
bioqumicas, doena (vrus da encefalite, da hepatite) , modo de
transmisso (como os arbovrus que so vrus transmitidos por
artrpodes), clula hospedeira, tecido/rgo trpico. Classificao do
acido nucleico: -RNA ou DNA -segmentado (genoma continuo) ou no
segmentado -linear ou circular -filamento nico ou filamento duplo
Se o filamento nico, pode ser + ou - . Se genoma RNAm sentido (+)
significa que possui o mesmo sentido do RNAm e o que o torna mais
fcil de codificar suas protenas (replicao mais rpida. Se (-), se
compara com filme negativo ( esse negativo tem que virar RNAm para
comear a sntese proteica(?) SLIDE : DIFERENA DE RESISTNCIA ENTRE
VRUS ENVELOPADO E NO ENVELOPADO Enquanto que em consequncia disso
podem ser facilmente disseminados (em fomites, das
mos para as mos, na poeira, em pequenas gotculas). Podem secar e
manter a infectividade.
Podem sobreviver s condies adversas do intestino. Quais so as
condies adversas do
intestino? O estmago produz o que? cido, acidez gstrica. O fgado
produz o que? Bile, que
um detergente. O vrus no envelopado resiste aos cidos graxos e
ao da bile. Podem ser
resistentes a detergentes e ao tratamento inadequado do esgoto.
Os anticorpos podem ser
suficientes para imunoproteo, ou seja, um anticorpo formado
contra a protena de adeso
viral vai ligar a ela e impedir a infeco pelo vrus, impedindo a
interao dele com a clula-
alvo. A ao dos anticorpos importante para evitar a infeco.
Depois da infeco j
instalada, sendo o vrus intracelular, os anticorpos so pouco
eficazes.
Agora os vrus com envoltrio, com envelope. Componentes: membrana
com bicamada
lipdica, lipdios, protenas e glicoprotenas virais. Propriedades:
lbil, sofre ruptura nas
seguintes condies ambientais: no resiste ao meio cido,
detergentes, ressecamento, calor.
Ento o vrus influenza, da gripe tem que estar num ambiente mido,
seno ele no resiste.
liberado por brotamento ou lise celular. Consequncias: deve
permanecer mido; no pode
sobreviver no trato gastrointestinal, ento vrus de transmisso
fecal-oral, como o da
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poliomielite tem que ser NO ENVELOPADO, para que sobreviva no
trato gastrointestinal, caso
contrrio o envelope ser degradado pelo cidos graxos, pela bile
(como o capsdeo proteico,
consegue resistir s aes dos cidos graxos e da bile, estando o
stio de ligao no capsdeo,
este ficar intacto, entretanto, se o stio de ligao estiver no
envelope e este for degradado, o
vrus perde a infectividade; por isso, os vrus no envelopados
podem ser de transmisso fecal-
oral e os envelopados no podem); dissemina-se atravs de grandes
gotculas, secreo,
transplante de rgos e transfuses sanguneas; no precisa matar a
clula para sofrer
disseminao; pode necessitar de resposta imune mediada por
anticorpos e clulas para
proteo e controle, mas como ele se reproduz por brotamento da
clula, a resposta celular
muito importante para destruir a clula infectada; provoca
hipersensibilidade (geralmente
tardia, mas tambm pode ser tipo III ou II) e inflamao (causa
leso, mas se no tivesse
inflamao seria bem pior, porque a infeco se disseminaria
livremente) para causar
imunopatognese.
Existe alguma vantagem do vrus ter envelope? Ele no destri a
clula hospedeira, ele sai por
brotamento. Aquele vrus que se multiplica muito rpido, mata a
clula.
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Ento vamos ver rapidamente as etapas da replicao viral. 1 passo
o reconhecimento da
clula-alvo, atravs de adeso especfica, o vrus vai ento encontrar
a clula com a
maquinaria que ele precisa. Fixao superfcie da clula. Penetrao:
alguns vrus penetram
diretamente, os que dependem do pH precisam entrar no fagossomo.
Desnudamento, que a
liberao da membrana, envelope e capsdeo. Sntese macromolecular,
que a sntese de
protenas no-estruturais, protenas que participam da replicao,
mas no compem a
estrutura do vrus: sntese inicial de mRNA e protenas no
estruturais: genes para enzimas e
protenas de ligao do cido nuclico; replicao do genoma; sntese
tardia de mRNA e
protenas estruturais (j tem genoma, ento vai formar agora as
protenas do capsdeo) (alguns
vrus formam o capsdeo separado do genoma e depois inserem o
genoma no capsdeo, j
outros formam o capsdeo em torno do genoma); modificao ps-traduo
da protena
(algumas protenas virais so glicosiladas, fosfatadas). Organizao
do vrus. Brotamento dos
vrus com envoltrio. E liberao dos vrus. Normalmente, uma clula
produz cerca de 100 mil
vrus. Destes, 10 a 20% so infectantes, os outros sofreram muitas
mutaes e no so mais
infectantes.
Os vrus envelopados tm outra vantagem: escapam da resposta
humoral; uma clula
infectada pode se ligar a uma vizinha no infectada e transferir
os vrus para esta. Para destruir
essas clulas, s a ao dos CTL. Ns vamos ver que muitos vrus
escapam da ao dos CTL por
impedir a sntese de MHC I, que um mecanismo importante, porque a
ao dos CTL a
principal defesa contra vrus. As clulas sem MHC I dependem da ao
das clulas NK para
serem mortas.
Aqui um desenho mostrando a temperatura independente da adsoro,
requer protenas de
ligao viral (VAP) e receptores celulares.
A penetrao dos vrus envelopados se d atravs de fuso com a
membrana plasmtica ou via
endossomas, atravs de fuso com a membrana do endossoma cido.
A captao de vrus via endossomas pode se dar por viropexia,
endocitose ou pinocitose.
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Os vrus no envelopados entram diretamente atravs da membrana
plasmtica.
O desnudamento necessrio para a produo de novos genomas. Aps o
desnudamento,
tem incio a fase de eclipse, na qual o vrus est sem o capsdeo e
sem o envelope, estando
apenas o genoma. Nesse momento o vrus no infeccioso. A fase de
eclipse termina quando
as primeiras novas partculas virais so formadas.
Sntese de cido nucleico e protenas virais: muitas estratgias
(cada vrus tem seus meios de
sintetizar seu genoma e suas protenas); o cido nucleico pode ser
produzido no ncleo ou no
citoplasma (regra geral: a multiplicao dos vrus de DNA se d
intranuclear e a dos vrus de
RNA se d no citoplasma, mas h excees, como o HIV, que um
retrovrus, de RNA, mas a
multiplicao se d intranuclear, o vrus da varola de DNA, mas a
replicao
intracitoplasmtica); a sntese proteica sempre no citoplasma.
Organizao e maturao: no ncleo, no citoplasma, na membrana.
Liberao: por lise, mais comum nos vrus no envelopados;
brotamento atravs da membrana
plasmtica que o mais comum nos vrus envelopados; nem todo vrion
liberado infeccioso
(foi o que eu falei para vocs, so liberados cerca de 100 mil,
mas apenas 10 a 20 mil so
infectantes).
Protenas virais: protenas estruturais (todas as protenas em um
vrion maduro); protenas no
estruturais (protenas codificadas pelo vrus, mas no
acondicionadas no vrion).
Efeitos no hospedeiro: pode inibir a sntese de DNA, RNA ou
protena do hospedeiro (os vrus
penetram a fbrica, a clula-alvo e utilizam todas as estruturas
para sua prpria replicao).
Efeito citoptico justamente causado por aqueles vrus que causam
leso na clula, podendo
causar morte celular. Uma grande importncia do efeito citoptico
no diagnstico
histopatolgico. Tem vrus que causam efeitos citopticos
caractersticos, podendo ser
identificados pelo patologista. Ento, o efeito citoptico
qualquer alterao detectvel na
clula hospedeira: alteraes morfolgicas, morte, apoptose,
crescimento indefinido. A
apoptose interessante para o vrus? No. Ento, ns vamos ver que
alguns vrus bloqueiam a
apoptose.
Bom, como cultivar vrus? Vrus so cultivados normalmente em
monocamadas, utilizando-se
clulas contnuas. Pode-se utilizar no s para diagnstico, como
tambm para quantificar a
carga viral (na urina, no lquor, na saliva).
Aqui h clulas em monocamada e podemos observar como elas mudam a
sua morfologia
quando infectadas (slide 51). importante mandar o material para
ser avaliado pelo
laboratrio junto histria do paciente: sintomas, viagens
recentes, dados de exames. Isso
facilita o diagnstico histopatolgico.
Isso aqui o que eu falei, a unidade formadora de placa. Voc pode
produzir para saber a
carga viral. Ento, eu tenho a minha monocamada de clulas. A eu
adiciono uma espcie de
lquido (lquor, urina), um material. Uma partcula viral penetrou
a clula e vai comear a
replicar. Novas partculas nas clulas. H contaminao de clulas
vizinhas. Eu ento diluo para
poder quantificar. Aqui, por exemplo, eu posso contar 5 na
diluio de 1000. Ento, h 5 para
cada 1000ml da amostra.
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Patognese da infeco viral: fase de penetrao pele (tem que haver
uma soluo de
continuidade, uma leso um corte, no penetram a pele ntegra),
aparelho respiratrio,
aparelho digestivo, aparelho gnito-urinrio, conjuntiva (as
mucosas ele penetra diretamente,
no precisam estar lesadas); fase de disseminao sangue, linfa,
clula nervosa viremia;
perodo de incubao (pode variar muito, at chegar ao rgo-alvo o
vrus vai causar dor de
cabea, mal-estar, os chamados sintomas gripais que muitos vrus
provocam, at que atingem
o rgo-alvo e causam a doena especfica); fase de manifestao dos
sintomas (a a infeco
j est estabelecida). Infeco aguda: sistmica (sarampo),
localizada (influenza = gripe).
Infeco persistente: crnica (hepatite B, C a infeco persiste, sem
sintomas e continua
liberando vrus), latente (herpes, catapora por exemplo, o
indivduo tem catapora na infncia
e de repente os sintomas desaparecem, mas o vrus fica ali, ainda
que no se replique,
podendo recidivar; no caso do vrus da catapora pode causar
herpes zoster), lenta (HTLV
retrovrus em geral, podem ficar at 30/40 anos sem apresentar a
doena).
Aqui est todo o mecanismo
de infeco viral:
1. O microorganismo
penetra o corpo seguinte para
a corrente sangunea
denominado Viremia Primria
(que baixa);
2. Segue para outros
rgos, onde sua replicao
maior sendo denominado
Viremia Secundria (que
bem alta);
3. Seguem para rgo
alvo, onde tero diferentes
representaes clnicas:
- Na pele: Varicela, Varola.
- Nas glndulas salivares: CMV
(citomegalovrus), caxumba e
EBV (Vrus Epstein-Barr causa
comum de mononucleose).
- Nos rins: Vrus lassa (causa
febre lassa), Hantavrus e CMV
- No crebro: Polio e Sarampo.
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Relao entre stio inicial da infeco viral e produo da doena
Local da infeco Infeco Local Infeco Sistmica
OROFARNGE Citomegalovrus (CMV) Epstein-Barr (EBV) Herpes Simples
1
TRATO RESPIRATRIO Vrus influenza Vrus sincicial respiratrio
Rinovrus
Sarampo Caxumba Rubola Varicela Vrus Lassa
TRATO INTESTINAL Norwalk Rotavrus
Hepatite A Polio
TRATO GENITAL Papilomavrus Hepatite B Hepatite C HIV
Transmisso Viral
Modo de transmisso Exemplo Comentrio
Disseminao respiratria ou salivar
Vrus influenza EBV Sarampo Cachumba
Transmisso de difcil controle
Disseminao fecal-oral Polio Rotavrus Hepatite A
Controle atravs de medidas pblicas de sade
Disseminao Venrea HSV HIV HPV
Controle por precaues apropriadas
Zoonoses Inseto-Humano Animal-Humano
Dengue Raiva Lassa Hantavrus
Infeco humana pode ser contolada atravs do controle de
vetores(insetos) e/ou controlando a infeco de animais. No h ou raro
a infeco entre humanos.
Animal-Inseto-Humano Febre amarela
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Padres de infeco viral
II. Infeco Viral Aguda seguida por perodo de
latncia e reativao viral Padro caracterstico de
Herpes Vrus, Varicela, Herpes Simples 1, Herpes
simples
III. Infeco aguda seguida por diminuio da carga
viral. Paciente pode estar assintomtico, contudo,
continua capaz de transmitir vrus pois ainda est
infectado.
Padro caracterstico de Hepatite B e Hepatite C.
Padro de resposta durante uma
infeco primria aguda
I. Na resposta imune inata, os
interferons so importantes inibidores da
replicao viral. Algumas citocinas e as clulas
NK tambm so importantes neste tipo de
resposta imune.
II. Alguns vrus so capazes de
vencer a barreira formada pela imunidade inata.
Neste perodo, ocorre uma resposta mediada
por clulas T.
Clulas Th1-Cd4+, clulas Th2-Cd8+ e CTLs.
III. As citocinas produzidas pelas
clulas T sero extremamente importantes para
a ativao de clulas B.
IV. As clulas B uma vez ativadas
produzem anticorpos especficos contra os
patgenos.
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- Os corpsculos de incluso so facilitadores do
diagnstico direto.
- Todas essas estruturas so facilitadoras do
diagnstico laboratorial. Principalmente a
histopatologia.
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Diagnstico laboratorial das infeces virais
- Espcime clnico: natureza, coleta, transporte,manuteno. A
coleta pode, dependendo da virose, ser o lquor, o sangue, fezes,
urina. O importante o transporte. Se for um vrus envelopado, o
transporte deve ser o mais rpido possvel, j que uma coleta
contaminada com bactrias e fungos pode determinar a morte do vrus.
Esse transporte dever ser feito em temperatura ideal, nem
congelado, nem com temperatura elevada. Normalmente o transporte
feito em reservatrio com gelo (provoca a morte de bactrias e
fungos). - Processos laboratoriais: Exame citopatolgico ECP Pode
determinar imediatamente o diagnstico atravs da histopatologia.
Microscopia eletrnica e imunoeletrnica Restrita a determinadas
instituies. Utiliza anticorpo especfico para determinado vrus. Este
anticorpo facilita a agregao viral e posterior identificao. Logo, a
imunoeletrnica um facilitador para a deteco rpida de um vrus.
Isolamento e crescimento viral em animal, ovo embrionado, cultura
de tecido primrio e imortalizado A maioria dos vrus cresce em
tecido imortalizado. Efeitos citopatolgicos: a. Morte celular:
arredondamento da clula, degenerao, agregao, perda da fixao ao
substrato b. Alteraes histolgicas: corpsculos de incluso no ncleo
ou citoplasma, marginao da cromatina c. Sinccios: clulas gigantes
multinucleadas (fuso celular) d. Alteraes da superfcie celular:
expresso de Ag viral, hemadsoro (expresso de hemaglutinina) Em
cultivo, o vrus infecta a clula, que passa a expressar em sua
superfcie a hemaglutinina. Se forem adicionadas hemcias este
cultivo, estas aglutinaro.
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Interao Vrus-Clulas: Corpsculos de incluso
Diagnstico laboratorial das infeces virais Pode ser feito atravs
de trs mtodos diferentes: Deteco de protenas virais a. Perfis
proticos (eletroforese) Certos vrus possuem perfis eletroforticos
diferenciados, permitindo o diagnstico de imediato. b. Atividades
enzimticas (transcriptase reversa) c. Hemaglutinao e hemadsoro d.
Deteco do Ag (fluorescncia indireta, ELISA, Western blot) Deteco de
material gentico viral a. Perfis de clivagem da endonuclease de
restrio especfica b. Mobilidades eletroforticas do RNA para vrus de
RNA segmentado (eletroforese) c. Hibridao do genoma de DNA in situ
(citoqumica) d. Southern blot (1 tcnica para detectar DNA) e
Northern blot e. Reao da polimerase em cadeia PCR (DNA) Importante
para detectar carga viral em pacientes com HIV. f. Reao da
polimerase em cadeia com transcriptase reversa RT-PCR (RNA)
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Sorologia (converso sorolgica) Converso sorolgica importante na
confirmao de infeces recentes. Sendo o tlulo normal para
determinada infeco 1:32, um paciente que possui titulao 1:120 est
infectado. Contudo, no possvel afirmar se essa infeco recente ou
prvia. Por isso, pede-se ao paciente que retorne 3 semanas depois
para que outro teste seja feito. Para que a infeco seja determinada
recente necessrio que o novo ttulo esteja 4 vezes maior que o ttulo
inicial. Ex: Mulher grvida com titulao positiva para rubola. Testes
sorolgicos: neutralizao, inibio da hemaglutinao, hemaglutinao
passiva, aglutinao ltex, Imunofluorescncia direta e indireta,
ELISA, RIA, Western blot. Neutralizao: Teste baseado na
especificidade entre partculas virais ou antgenos e anticorpos
monoclonais especficos. Quando ocorre a neutralizao, h confirmao
diagnstica para a infeco pesquisada. Hemaglutinao passiva: Pega-se
o soro do paciente que suspeita-se possuir o anticorpo contra
determinado antgeno viral. Caso haja aglutinao das hemcias, a
suspeita confirmada. Se no existem anticorpos no meio as hemcias vo
sedimentar naturalmente no fundo da placa, caracterizando o aspecto
negativo de teste em boto. Pode ser utilizada tanto para a pesquisa
de antgenos quanto de anticorpos. Aglutinao do ltex: As partculas
do ltex so sensibilizados com anticorpo ou antgeno viral. Fazem o
mesmo papel da hemcia na Hemiaglutinao passiva, a diferena que o
ltex um material inerte. Imunofluorescncia: definida como uma
tcnica que possibilita a visualizao de antgenos nos tecidos ou em
suspenses celulares, por meio da utilizao de anticorpos especficos,
marcados com fluorocromo, capazes de absorverem a luz ultra-violeta
(UV), emitindo-a num determinado comprimento de onda, permitindo
sua observao ao microscpio de fluorescncia (com luz UV).
Dentre os fluorocromos mais comumente utilizados esto:
Flurescena (FITC); Rodamina (TRICT).
Aps os fluorforos serem excitados por um determinado comprimento
de onda, emitem ftons de luz fluorescentes a um comprimento de onda
superior.
Imunofluorescncia Direta
Utiliza-se esta tcnica, tambm conhecida como tcnica de camada
simples, para deteco de antgenos em amostras clnicas utilizando-se
anticorpos marcados com fluorocromos.
As etapas deste procedimento compreendem:
Fixao do esfregao da lmina; Tratamento com anticorpo marcado;
Incubao; Lavagem para remover excesso de anticorpos marcados no
ligados; Visualizao no microscpio fluorescente.
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As indicaes desta tcnica so: deteco de vrus, parasitas, antgenos
de tumor de amostras ou monocamadas de clulas do paciente.
utilizado tambm na identificao da distribuio de um antgeno no
interior de um tecido ou compartimento de uma clula.
Imunofluorescncia Indireta
Utiliza-se este tipo de imunofluorescncia, tambm conhecida como
tcnica de dupla camada, na deteco de anticorpos no soro do paciente
por meio de antgenos fixados em uma lmina, na qual se aplica
primeiramente um anticorpo especfico no fluorescente. Por fim,
coloca-se um anticorpo fluorescente com especificidade marcada
contra determinados antgenos do primeiro anticorpo usado para
reagir com o antgeno.
Esta tcnica tem como vantagem possibilitar uma fluorescncia mais
evidente, uma vez que os anticorpos fluorescentes associam-se
somente aos anticorpos primrios, alm de permite trabalhar com
diversos anticorpos primrios especficos para distintos tipos de
antgenos, sendo capaz de identificar qual a classe a qual o
anticorpo pertence.
Habitualmente, a imunofluorescncia indireta utilizada na deteco
de auto-anticorpos, e tambm, na deteco de anticorpos anti-nucleares
encontrados no soro de pacientes com lpus eritematoso sistmico.
ELISA: Mesma tcnica utilizada na imunofluorescncia. Possui tambm
2 tipos: ELISA indireto (deteco de anticorpos) e ELISA sanduche
(deteco de antgenos). A diferena bsica consiste no fato de a
imunofluorescncia usar fluorforos e o ELISA usar cromgenos.
Western-Blot: O teste de Western Blot o teste que confere maior
segurana. O Western Blot conjuga a ligao do anticorpo especfico, em
stios tambm especficos, uma vez que o anticorpo vai se ligar a
protenas que so separadas por diferentes pesos moleculares . Em um
laboratrio de pesquisa faz-se um gel que capaz de separar protenas.
Coloca-se um pente que vai fazer os poinhos para o gel. No primeiro
poinho que eu escolher, eu vou pipetar um marcador de peso
molecular, que um conjunto de protenas ou fragmento proteicos com
pesos moleculares conhecidos. Esse marcador de peso molecular serve
para eu saber qual a posio da protena a hora da corrida. A eu
aplico uma corrente eltrica que vai fazer as protenas migrarem,
separando-se no gel pelo peso molecular (e eu vou saber o peso
molecular por causa do marcador). At a no vi nada.Nesta etapa,
transfere-se o gel para uma membrana e aplicada nova corrente
eltrica, que vai fazer com que essas protenas migrem do gel para
membrana. Todas as protenas esto imobilizadas na membrana. nessa
membrana aonde eu vou colocar a amostra para ver se eu tenho alguma
reao positiva. Se esse anticorpo conseguir se ligar ao antgeno que
est imobilizado, ele vai ficar fixo ali. A eu lavo, coloco um
segundo anticorpo, que pode ser conjugado a uma enzima que produz
alterao de cor ou que produz luminescncia. Esse segundo anticorpo s
vai se ligar se tiver anticorpo em amostra e a vai imprimir naquela
posio do antgeno, no peso molecular que eu quero, vai se precipitar
o substrato. A eu lavo de novo, coloco a membrana dentro de um
cassete de filme, coloco um filme de raio-X e exponho. A eu tenho
uma banda que corresponde ao tamanho da banda que eu espero, porque
aqui do lado eu tenho um marcador e na hora que eu junto com o
filme, eu vejo qual o tamanho da banda.