“Aspectos metrológicos asociados con la técnica de PCR ...

“Aspectos metrológicos asociados con la técnica de PCR: Consideraciones para su

aplicación en análisis de muestras clínicas y de alimentos"

Dr. BQ. Esteban Paredes-Osses

Instituto de Salud Pública

Día Mundial de la Metrología 2021“Metrología para la Salud”

Conventional qPCR is made more complicated by a number of factors that can create additional uncertainties and inaccuraciesin the process of quantification. Among the most important is that the results are highly sensitive to small changes inamplification efficiency; for example, over 20 amplification cycles, a 2% difference in amplification efficiency betweenreference materials and test sample results in up to 50% change in the estimated amount of DNA.

PCR digital

PCR digital

• La técnica dPCR se basa en el concepto de dilucioneslimitantes.

• La partición de la muestra: micropocillos, emulsión deaceite y matrices de cámaras miniaturizadas consuperficies de unión de ácido nucleico.

• Distribución de Poisson• Divisiones o particiones se clasifican como positivas

(objetivo detectado) o negativas (no detectado

objetivo).

• Un método absoluto de cuantificación y difiere

significativamente de la qPCR convencional.

where Nλ represents the total number of target copies, N is the number of partitionspresent, and x is the number of positively classified partitions.

PCR digital

dMIQE Group, Huggett JF. The Digital MIQE Guidelines Update: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments for 2020. Clin Chem. 2020 Aug 1;66(8):1012-1029. doi: 10.1093/clinchem/hvaa125. Erratum in: Clin Chem. 2020 Nov 1;66(11):1464. PMID: 32746458.

¿Problemas en PCR?

• Degradación o presencia de impurezas del material genético.

• Mal diseño de experimento con poca eficiencia en la amplificación yespecificidad de partidores.

• Calibración

• Curvas estándar

• Normalización y procesamiento de datos

Controles

• Negativos: Blanco (NTC) y específico.

• Positivos: Cualitativo-Cuantitativo y Control Interno.

Diseño

• Selección del amplicón (menor a 250pb)

• Diseño de sondas y primers

• Evaluación in silico de la especificidad (base de datos).

• Contaminación ADN/ARN

Optimización

• Señal de fluorescencia:

• Temperatura de alineamiento

• Número de ciclos de PCR

• Concentración de primers y sonda

• Resolución (PCR digital)

• Especificidad

Validación PCR

• Precisión

• LOQ

• LOD

• Linealidad

• Veracidad

• Robustez

• qPCR: repetitividad y reproducibilidad

• dPCR: precisión en rango

Trazabilidad y comparabilidad de la medición de la cuantificación de ácidos nucleicos

• Trazabilidad metrológica

• Uso de materiales de referencia

• Calibración instrumentos

Usos PCR

PCR para la Salud

“Aspectos metrológicos asociados con la técnica de PCR: Consideraciones para su

aplicación en análisis de muestras clínicas y de alimentos"

Dr. BQ. Esteban Paredes-Osses

Instituto de Salud Pública

Día Mundial de la Metrología 2021“Metrología para la Salud”

Diagrama Causa y efecto. Contribuciones de incertidumbredel proceso completo para procedimiento de mediciónmediante qPCR.

Diagrama Causa y efecto. Contribuciones de incertidumbrepara un procedimiento de medida mediante dPCR.