UNIVERSIDADE CEUMA - UNICEUMA PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO PROGRAMA DE MESTRADO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA ARUANÃ JOAQUIM MATHEUS COSTA RODRIGUES PINHEIRO INVESTIGAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTI-INFLAMATÓRIA DA FRAÇÃO ACETATO DE ETILA DE FOLHAS DA ESPÉCIE Punica granatum L. SÃO LUIS 2015
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ARUANÃ JOAQUIM MATHEUS COSTA RODRIGUES … Joaquim... · As professoras Iracelle Abreu, Selma do Nascimento, Elizabeth Fernandes, Natilene, ... DEXA Dexametasona E100 Fração acetato
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UNIVERSIDADE CEUMA - UNICEUMA
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
PROGRAMA DE MESTRADO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
ARUANÃ JOAQUIM MATHEUS COSTA RODRIGUES PINHEIRO
INVESTIGAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTI-INFLAMATÓRIA DA
FRAÇÃO ACETATO DE ETILA DE FOLHAS DA ESPÉCIE Punica granatum L.
SÃO LUIS
2015
ARUANÃ JOAQUIM MATHEUS COSTA RODRIGUES PINHEIRO
INVESTIGAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTI-INFLAMATÓRIA DA
FRAÇÃO ACETATO DE ETILA DE FOLHAS DA ESPÉCIE Punica granatum L.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia Parasitária da
Universidade CEUMA, como requisito parcial
para a obtenção do título de Mestre em
Biologia Parasitária.
Orientador: Prof. Dr. Lídio Gonçalves Lima
Neto
Co-orientador: Prof. Dr. Eduardo Martins de
Sousa
SÃO LUIS
2015
ARUANÃ JOAQUIM MATHEUS COSTA RODRIGUES PINHEIRO
INVESTIGAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTI-INFLAMATÓRIA DA
FRAÇÃO ACETATO DE ETILA DE FOLHAS DA ESPECIA Punica granatum L.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia Parasitária da
Universidade CEUMA, como requisito parcial
para a obtenção do título de Mestre em
Biologia Parasitária.
A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em
Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia ___/___/___,
(E30); AcOEt 100mg/kg+LPS (E100); e Dexametasona 5mg/kg+LPS (DEXA). * p<0,05
quando comparados com o grupo controle negativo; # p<0,05 quando comparados com o
grupo LPS.
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5 DISCUSSÃO
A Punica granatum L. (Romã), assim como muitas outras plantas usadas
com fins medicinais, possui várias classes de metabólitos químicos secundários em
diversas estruturas, como folha, fruto, semente, flores, casca, entre outros; com
diferentes atividades biológicas (SYED et al., 2013).
Os resultados encontrados na análise fitoquímica do extrato hidroalcoólico
da romã mostraram a presença de fenóis; taninos hidrolisáveis; flavonóides,
flavonas, flavononóis e xantonas; esteroides; saponinas; e chauconas e auronas.
Em um estudo realizado por PHATTHALUNG; CHUSRI; VORAVUTHIKUNCHAI
(2012) na Tailândia, foi estudado a ação de vários extratos frente à Acinetobacter
baummannii e, na análise fitoquímica do pericarpo da Punica granatum L.,
concluíram que a presença de taninos hidrolisáveis e flavonóides, tais compostos
também achados em nosso estudo, foram alguns dos metabólitos secundários
responsáveis por tal ação. MENA et al. (2012) realizaram um estudo onde
objetivaram identificar os compostos presentes no suco da romã por métodos
cromatográficos e detectaram quantidades significativas de flavonóides, taninos,
compostos fenólicos, resultados também semelhantes aos achados em nosso
estudo e comprova por uma metodologia mais sensível que há a presença desses
compostos. Além desses, NAYAK et al. (2013) avaliaram a ação cicatrizante do
extrato da casca do fruto da romã em modelo de indução de ferida em murinos e
viram na análise fitoquímica a presença de saponinas, taninos e flavonóides,
resultados também encontrados na nossa pesquisa, só que nas folhas da espécie, o
que mostra que os metabólitos coincidem em partes diferentes, mas dentro da
mesma espécie. Outro trabalho que também corrobora com os nossos resultados foi
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realizado por PANICHAYUPAKARANANTA et al. (2010), no qual testou-se o extrato
da casca do fruto da romã obtido por extração metanólica e logo após fracionado
com acetato de etila para avaliar o seu efeito antioxidante. Por métodos
cromatográficos, foram detectadas grandes quantidades de flavonóides, mesmo
resultado encontrado em nossa fração acetato de etila utilizado em todos os nossos
testes e que pode justificar as ações terapêuticas encontradas. A classe de
metabólitos secundários dos flavonóides tem grande afinidade com o Acetato de
Etila, o que fez com que toda a carga desse composto presente no extrato
hidroalcoólico da romã fosse transferido para a fração AcOEt quando foi realizado o
fracionamento com tal solvente. Da mesma forma, SENGUTTUVAN; PAULSAMY;
KARTHIKA (2014) realizaram o fracionamento do extrato alcoólico das raízes da
espécie Hypochaeris radicata L. e na análise fitoquímica, viram que a fração Acetato
de Etila tinha uma forte presença de flavonóides. Diante do descrito, pode-se
observar que o perfil de metabólitos secundários é semelhante em diversas partes
da Punica granatum L., e mesmo havendo poucos estudos acerca das folhas da
espécie, se torna pertinente a sua utilização, devido ao fato da disponibilidade dos
frutos, casca e sementes ser sazonal, diferente das folhas.
No que diz respeito aos resultados obtidos na avaliação da ação
antimicrobiana da Punica granatum L. (Romã), são poucos os artigos que relatam
sobre o assunto. Os resultados encontrados foram positivos para a inibição de S.
aureus e P. aeruginosa, onde a fração Acetato de Etila da romã foi capaz de inibir o
crescimento dessas espécies, além de apresentar uma boa CIM e CBM para ambas.
Este é um dos primeiros trabalhos a relatar a atividade antibacteriana das folhas da
romã, por outro lado, existem estudos com outras partes da espécie. Em um estudo
realizado por MCCARRELL et al. (2008), eles avaliaram a atividade antimicrobiana
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do extrato das cascas da romã e mostraram uma atividade sobre S. aureus e P.
aeruginosa em 12 e 24h de incubação, corroborando com os nossos dados. Outro
estudo com o mesmo resultado foi o realizado por DUMAN et al. (2009), onde eles
também viram que dentre várias bactérias e fungos, a romã foi capaz de inibir o
crescimento de S. aureus e P. aeruginosa nos ensaios de ágar difusão e
concentração inibitória mínima. Além da cepa sensível de S. aureus, a AcOEt teve
ação inibitória também sobre a cepa resistente da espécie (MRSA), algo que foi
descrito por VORAVUTHIKUNCHAI; KITPIPIT (2005), mas com o extrato etanólico
da romã. Segundo LEE, J. K. et al. (2015) Acinetobacter baumannii é uma das
bactérias que mais causam internações em UTI’s em quadro de pneumonia. O que
agrava mais esse quadro é o fato de que essa cepa vem desenvolvendo fortes
genes relacionados à resistência bacteriana, como mostra o estudo de HOU; YANG
(2015). A cepa de A. baumannii testada em nosso estudo foi sensível ao extrato da
Punica granatum L., o que prova mais uma vez o poder antibacteriano da espécie.
Interessantemente, esse é o primeiro trabalho que descreve a ação antimicrobiana
da Romã frente a S. pyogenes, que segundo COTS et al. (2015) é a maior
causadora de faringite bacteriana em adultos. De acordo com um trabalho realizado
por SIRIWONG et al. (2015), a quercetina e a luteolina, compostos que pertencem a
família dos flavonóides, possui forte atividade antibacteriana frente a essa bactéria.
Outras cepas relacionadas à infecções do trato respiratório são Streptococcus
pneumoniae, que seguida por Klebsiella pneumoniae que são as maiores
causadoras da pneumonia adquirida na comunidade, segundo IROEZINDU et al.
(2014). O extrato testado teve uma ótima ação antibacteriana contra S. pneumoniae,
inibindo o crescimento em todas as concentrações testadas, além de ter tido o
melhor resultado de Concentração Inibitória Mínima (CIM) dentre todas as cepas
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testadas (0,5mg/ml). Da mesma forma, HAYOUNI et al. (2011) testaram a ação
bactericida e fungicida do extrato metanólico da casca da romã e obtiveram
resultados positivos para a inibição de S. pneumoniae, entre outras bactérias e
fungos.
Por outro lado, nosso extrato não apresentou atividade antimicrobiana
contra K. pneumoniae e H. influenzae, da mesma forma que DURAIPANDIYAN;
AYYANAR; IGNACIMUTHU (2006) testaram a atividade antimicrobiana de 18
extratos de plantas medicinais e viram que a Punica granatum L. não apresentou
inibição frente a K. pneumoniae. Já no estudo de QABAHA (2013) onde foi avaliada
a ação de cinco plantas indígenas da Palestina contra bactérias no combate de
radicais livres, o autor concluiu que K. pneumoniae foi sensível ao extrato da casca
da romã. Não foi encontrada nenhuma referência sobre o teste da Punica granatum
L. ou dos compostos encontrados por nosso trabalho frente à cepa H. influenzae.
Os testes que avaliaram a atividade anti-inflamatória da romã em modelo
de dano pulmonar agudo em camundongos, os resultados da contagem total de
leucócitos no sangue mostraram que o grupo de animais com dano pulmonar agudo
e sem tratamento tiveram alterações significativas. Isso sugere que o tempo de seis
horas de indução da inflamação não foi é suficiente para estimular a liberação de
células para o sangue periférico provenientes da medula óssea. Em um trabalho
realizado por AULAKH; SURI; SINGH (2014) onde eles avaliaram o poder de
inibição do dano pulmonar agudo da angiostatina, foi realizado a instilação de LPS e
após 9 horas o sangue periférico foi coletado e eles observaram que não houve
diferença estatística entre os grupos controles positivo, negativo e de tratamento.
Para a contagem diferencial dos leucócitos séricos, não houve diferença nos grupos
em relação às células mononucleares, já que os linfócitos, principais e mais
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numerosos representantes, estão relacionados a uma resposta imune adaptativa,
estando mais presente na fase tardia da inflamação, quando o organismo inicia uma
resposta imune específica ao invasor (DINGENOUTS; GOUMANS; BAKKER, 2015).
Já os polimorfonucleares, mostraram uma grande diferenciação no grupo C.P. em
relação ao grupo C.N., evidenciando a ativação da imunidade inata. Os grupos de
animais que receberam tratamento também tiveram uma modulação, mas reduzindo
a diferenciação celular sérica, porém essa diferença não foi estatisticamente
significativa.
Na contagem de leucócitos totais do lavado broncoalveolar pode se
observar um aumento significante no número de leucócitos nos animais do grupo
que recebeu a instilação de LPS sem tratamento (LPS) em relação ao controle
negativo (C.N.). De fato, essa endotoxina tem a capacidade de induzir a resposta
imunológica rápida a nível local ativando fatores de transcrição de vários genes
necessários à síntese de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias, o que
desencadeia uma migração celular para o local do dano iniciando assim, a resposta
imunológica inflamatória aguda (LU, Y. C.; YEH; OHASHI, 2008). Os animais dos
grupos onde foi induzida o dano pulmonar agudo e tratados tiveram uma redução na
contagem dos leucócitos na cavidade alveolar, porém o grupo que recebeu a dose
de 30mg/kg do extrato não foi o suficiente para obter uma redução significativa,
diferente do grupo que recebeu uma dose de 100mg/kg que foi o necessário para
reduzir significativamente a migração celular para o local do dano. Esse é o primeiro
trabalho a relatar a atividade anti-inflamatória das folhas da romã em modelo de
inflamação respiratória aguda induzida por LPS, porém um trabalho prévio realizado
por DE OLIVEIRA et al. (2013), onde foram trataram camundongos asmáticos com o
extrato das folhas da romã, foi observada a redução da migração celular no lavado
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broncoalveolar coletado após 24 horas da indução inflamatória com ovalbumina.
Além dos grupos tratados com a AcOEt, utilizamos a dexametasona como anti-
inflamatório convencional, para validar a técnica de tratamento por via oral dos
animais. Os animais pertencentes a tal grupo foram os que apresentaram a maior
redução da migração celular local, reduzindo para menos da metade quando
comparado ao grupo LPS. LI et al. (2015) testaram o efeito imunomodulador de um
flavonóide em modelo de dano pulmonar agudo e também usaram a dexametasona
como controle de tratamento; e após seis horas da instilação com LPS, coletaram o
lavado broncoalveolar dos animais para realizar a contagem total de leucócitos e
viram que o grupo tratado com o anti-inflamatório convencional teve uma redução de
mais de 50% na migração comparado ao grupo LPS; resultados que corroboram
com os obtidos em nosso teste. Vale lembrar que a classe de metabólitos
secundários flavonóides foi a que apresentou maior presença no extrato utilizado
neste estudo.
Na contagem diferencial do lavado broncoalveolar, foi observado
basicamente dois tipos celulares: macrófagos, que são monócitos teciduais, e
neutrófilos, que são polimorfonucleares. O grupo controle negativo, onde não foi
induzida nenhuma inflamação, apresentou baixa celularidade e essas poucas
células observadas, em média 99% eram macrófagos teciduais sem apresentar
quantidades representativas de polimorfonucleares. Já no grupo LPS, onde os
animais foram induzidos a inflamação pulmonar e não tiveram quaisquer
tratamentos, observou-se uma grande migração de neutrófilos para os pulmões. Em
um trabalho realizado por XU, M. et al. (2015), também houve uma migração
significativa de neutrófilos no lavado broncoalveolar dos animais do grupo LPS
depois de sete horas da administração de LPS quando comparado ao grupo controle
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negativo. No modelo de tratamento com a AcOEt utilizado neste trabalho pode-se
observar a redução da migração neutrofílica, sendo significativo no grupo que foi
administrado a concentração de 100mg/kg do extrato (E100). PENG et al. (2015)
estudaram a ação anti-inflamatória da punicalagina isolada do fruto da Punica
granatum L. na síndrome da insuficiência respiratória aguda induzida pela instilação
intranasal de LPS em camundongos e observaram a redução da migração de
neutrófilos e macrófagos no lavado broncoalveolar e histologicamente no tecido
pulmonar, caracterizando a redução de infiltração pulmonar.
HUANG; ZHONG; WU (2015) utilizaram o mesmo protocolo animal usado
em nosso trabalho, administrando uma dose única de quercitina via oral uma hora
antes da instilação com LPS e a coleta do lavado broncoalveolar foi realizado 6
horas após a indução; e viram que o grupo tratado foi capaz de reduzir
significativamente a migração de neutrófilos para os pulmões. É importante
relembrar que a quercitina é uma substância pertencente à família dos flavonóides,
metabólito secundário mais presente no extrato testado do nosso trabalho.
Na quantificação proteica de citocinas no lavado broncoalveolar, pode-se
observar que houve um aumento significativo na produção de TNF-α no grupo onde
foi administrado LPS e sem tratamento quando comparado ao grupo controle
negativo, o que de fato acontece, já que essa endotoxina é capaz de ativar genes
que transcrevem citocinas pró-inflamatórias como é o caso do TNF-α (LIU et al.,
2015), podendo estar relacionado com a migração celular de polimorfonucleares
observada no mesmo grupo. Em um estudo realizado por HECKER et al. (2015), foi
realizada uma instilação de LPS em camundongos e após oito horas foi observado
um aumento significativo na dosagem de TNF-α, corroborando com os nossos
dados. Os dois grupos tratados com o AcOEt, causaram uma redução na
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quantificação dessa mesma citocina, porém este efeito não foi significativo quando
comparado ao grupo LPS, isso pode ser justificado pelo tempo de tratamento com
os extratos que pode ter sido insuficiente para ocorrer uma maior redução dessa
citocinas. Já o anti-inflamatório, dexametasona, utilizado como controle de
tratamento do trabalho, apresentou uma redução significativa de TNF-α, justificando
o fato de esse grupo ter sido o que mais reduziu a migração celular para os
pulmões. LEE, H. S. et al. (2015) induziram o dano pulmonar agudo com instilação
de LPS e utilizaram a dexametasona como controle de tratamento e; após quatro
horas, observaram que o anti-inflamatório foi o que mais inibiu a dosagem de TNF-α
no lavado broncoalveolar.
Em relação à dosagem de IL-10, o único grupo de apresentou diferença
estatística foi o LPS, que teve uma redução na dosagem proteica quando
comparado ao grupo controle negativo. Podemos observar que o mesmo grupo foi o
que maior expressou TNF-α no lavado broncoalveolar, deixando evidente a
modulação que a interleucina 10 tem na produção de citocinas pró-inflamatórias
(AGBANOMA et al., 2012). Nenhum dos grupos tratados (E30, E100 e DEXA)
tiveram os níveis de IL-10 alterados comparando com os controles. HACKSTEIN et
al. (2015) induziram uma pneumonia em camundongos e trataram com células
tronco mesenquimais e viram que em até 48 horas da indução, o nível proteico de
IL-10 no lavado broncoalveolar não diferenciou em nenhum dos grupos (controle
negativo, LPS e tratamento).
A dosagem de albumina no sobrenadante do lavado broncoalveolar
mostrou que a instilação intranasal por LPS foi responsável pelo extravasamento de
proteínas séricas para a cavidade alveolar, uma vez que o mesmo não foi observado
no grupo controle negativo, onde não houve a indução da inflamação. O mesmo foi
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observado no trabalho de LU, H. et al. (2015), onde a dosagem de proteínas totais e
albumina no lavado broncoalveolar foram maiores no grupo onde foi administrado
LPS quando comparado ao controle negativo. Por outro lado, todos os grupos de
tratamento do nosso estudo foram capazes de reduzir o extravasamento proteico, e
os grupos E100 e DEXA foram estatisticamente menores que o LPS. DE OLIVEIRA
et al. (2013) observaram que micropartículas contendo o extrato das folhas da
Punica granatum L. encapsulado foi capaz de reduzir o extravasamento proteico
para o lavado broncoalveolar de camundongos asmáticos induzido por ovalbumina.
Podemos afirmar que o extrato testado, assim como a dexametasona foram capazes
de reduzir a formação do edema pulmonar, uma vez que é conhecido que o
extravasamento de proteínas para os alvéolos pulmonares é fundamental para a
formação do edema no processo inflamatório, evidenciando mais uma vez a
atividade anti-inflamatória.
Apesar do extrato estudado não ter reduzido a dosagem da citocina pró-
inflamatória, a diminuição do extravasamento plasmático, avaliado indiretamente
pela dosagem de albumina pode justificar a redução da migração de neutrófilos e
consequentemente a migração de leucócitos totais. Em outro estudo, (HUSARI et
al., 2014) induziram um dano pulmonar agudo em camundongos por hiperóxia
durante cinco dias e observaram que o tratamento com o suco da romã reduziu no
lavado broncoalveolar a migração leucocitária, principalmente de neutrófilos
justificado pela redução na dosagem de albumina e de citocinas pró-inflamatórias,
como o TNF-α.
Estudos complementares são necessários para avaliar a ação do extrato
estudado na virulência de algumas cepas bacterianas e também para determinar o
perfil de sensibilidade ao extrato de cepas obtidas de amostras clínicas, além de
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outras cepas multirresistentes. Porém, este estudo é de grande impacto por mostrar
pela primeira vez, a ação antimicrobiana das folhas da romã frente a bactérias
causadoras de infecções respiratórias agudas e infecções hospitalares. Além disso,
para reforçar a ação anti-inflamatória das folhas da romã são necessários outros
estudos com protocolo de tratamento mais prolongado, como por exemplo, de 24
horas e até mesmo tratamentos múltiplos com o extrato para a avaliação da síntese
proteica e da migração celular a nível sistêmico diferente deste estudo onde o
modelo utilizado foi de tratamento único e tempo de indução de seis horas. Por outro
lado, este estudo é de grande impacto por mostrar a importância do uso de outras
partes da Punica granatum L. diferentes dos trabalhos disponíveis na literatura, além
de evidenciar a atividade do extrato na migração de neutrófilos, provavelmente
justificada pela diminuição do extravasamento plasmático.
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6 CONCLUSÃO
O presente estudo foi capaz de comprovar as ações antimicrobiana e anti-
inflamatória da Romã de acordo com a sua utilização na medicina popular.
Com os resultados obtidos, podemos concluir que a AcOEt de folhas da
espécie Punica granatum L. pode ser um potencial agente antimicrobiano frente a
bactérias associadas à infecções respiratórias agudas infecções hospitalares.
Ainda, a AcOEt pode ser utilizada para tratar doenças inflamatórias
considerando que o extrato afetou a quimiotaxia de neutrófilos e o extravasamento
plasmático.
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