APLICACIÓN DEL MODELO CINÉTICO DE GOMPERTZ

7/22/2019 APLICACIN DEL MODELO CINTICO DE GOMPERTZ

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M.Sc. Blgo. Edgar Zrate Sarapura

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APLICACIN DEL MODELO CINTICO DEGOMPERTZ

A LA INTERACCIN DEL EFECTO

DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTODE LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. LACTISEN LECHE


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INTRODUCCIN

Lactococcus lactis subsp. lactis es una bacteria cido-lctica utilizada comocultivo iniciador en productos lcteos fermentados.

Se debe aprovechar el uso de bacterias probiticas como Lactococcus lactis subsp. lactisque generan metabolitos (nisina) en los sustratos donde se reproducen quecontrolan el crecimiento de bacterias alterantes y patgenos especficos. Sin

embargo su uso est determinado por el cabal conocimiento de sus parmetros decrecimiento en circunstancias ambientales controladas para su mximoaprovechamiento.

Por ello se hace necesario conocer la cintica de su crecimiento a diferentes

temperaturas para lograr determinar el ptimo resultado mediante el uso de lamicrobiologa predictiva implementada con modelos matemticos primarios ysecundarios.


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INTRODUCCIN

El modelado matemtico es una herramienta de gran utilidaden tecnologa de alimentos, ya que permite analizar enforma cuantitativa el comportamiento microbiano en undeterminado ambiente o sistema particular.

La propiedad ms importante de un modelo primario es que describa de forma

adecuada el crecimiento de los microorganismos y permita obtener estimacionesprecisas de los parmetros que caracterizan dicho crecimiento. La variabilidadde las estimaciones depende de la tcnica usada para monitorear elcrecimiento y del modelo usado.

Para los modelos secundarios se han propuesto diferentes ecuaciones para

expresar el crecimiento microbiano en funcin de la temperatura (Zwieteringet al. 1991). Los modelos ms utilizados son el de Arrhenius y el de la razcuadrada. El modelo de la raz cuadrada o modelo Ratkowzky et al. (1982) es unaecuacin que describe la dependencia del crecimiento microbiano respecto ala temperatura, en condiciones por arriba de la temperatura ptima para elcrecimiento microbiano.


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INTRODUCCIN

De todas los sustancias antimicrobianas producidas por las bacterias lcticas,las bacteriocinas aparecen como las ms adecuadas desde un punto de vistatecnolgico para ser utilizadas como conservantes de grado alimentario (de Vuysty Vandame, 1994). En la actualidad la nisina es la nica bacteriocinalegalmente autorizada como conservante en aproximadamente 50 pases(Delves-Broughton et al., 1996).

La importancia del estudio radica en obtenerrespuestas como la tasa de crecimiento (m), fase deadaptacin (), densidad poblacional mxima,tiempo para la formacin de algn metabolitoespecfico.

Desde esta base cientfica se podr desarrollar planes de explotacin industrial deesta bacteria en diversas explotaciones biotecnolgicas, desarrollo de proyectos deinversin en microbiologa industrial, etc; quienes no tendrn necesidad derealizar la etapa exploratoria de evaluacin del crecimiento ya que losresultados de ste estudio les entregan dicha informacin.


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OBJETIVO

El estudio tuvo como objetivo principal aplicar el modelo cintico deGompertz que se eligi para obtener el mejor ajuste a los valorespoblacionales obtenidos experimentalmente para describir las curvas decrecimiento de Lactococcus lactis Subsp. Lactis, a cuatro temperaturas en estudio,dentro del rango de 10 a 40C y a partir de las ecuaciones desarrolladas

calcular los principales parmetros que describen el crecimiento microbiano(tiempo de adaptacin, tasa mxima de crecimiento exponencial y tiempo degeneracin) a nivel del modelo primario y lograr finalmente, describir elcomportamiento de estos parmetros, en funcin a la temperatura dentro delrango estudiado mediante el empleo de modelos secundarios


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MATERIAL Y MTODO

Del medio y condiciones del cultivo.

Se utiliz como medio de cultivo la leche en polvo descremada,libre de inhibidores, reconstituida al 10% en agua. El medio de

cultivo, convenientemente homogenizada, se esteriliz enautoclave a 121 C durante 20 minutos y a 15 lb de presin.


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MATERIAL Y MTODO

De la obtencin de las curvas y parmetros del crecimiento

Se utilizaron 180 tubos de vidrio con tapa rosca,estriles y con capacidad para 25 mL, en los cualesse dispensaron 10 mL de leche reconstituida estril.

El total de tubos fueron divididos en 4 grupos experimentales de 45 tuboscada uno y cada grupo se incub, en forma correspondiente, a lastemperaturas 10, 20, 30 y 40 C con una variacin de 0,1C, lo cualse consigui utilizando un bao de circulacin termorregulado con

refrigeracin, marca Mettler Modelo 3422A cada uno de los tubos se les inocul con 0.1 mL de cultivologartmico de Lactococcus lactis Subsp. Lactis, proveniente de unasuspensin de clulas en suero fisiolgico, con un nivel 0.5 de la escalade MacFarland.


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MATERIAL Y MTODO

De la obtencin de las curvas y parmetros del crecimiento

Para cada temperatura se incubaron 45 tubos en las condicionesdescritas y dependiendo de la relacin tiempo-temperatura enestudio, fueron retirados del bao 3 tubos, tomndose de

inmediato alcuotas de 1.0 mL de cada uno de ellos para medirpor duplicado las UFC/mL del L. lactis, utilizando el mtodo de siembrapor incorporacin en Agar M-17 con glicerofosfato y lactosa al 10%,

en forma tal de obtener una representacin de toda lacurva de crecimiento, fase de adaptacin, de

crecimiento exponencial y comienzo de la faseestacionaria, durante un periodo de 24, 48 y 24 horas,para 10 C, 20 C, 30 C y 40 C, respectivamente yen los cuales se obtuvieron las iteraciones aintervalos convenientes para cada caso.


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MATERIAL Y MTODO

Del anlisis del modelo primario

Los datos del crecimiento (UFC/mL) para cada temperatura fueronincorporados como variable dependiente en el modelo de crecimiento deGompertz de cuatro parmetros, mientras que el tiempo de incubacin (t)

se incorpor como variable independiente.

Luego se introdujo la ecuacin correspondiente al modelo descrito y susvariables al computador utilizando el Programa Curve expert 1.0 y seefectu el proceso analtico hasta encontrar el punto de convergencia, en

el cual los parmetros de regresin (A, C, b y M) consiguen una magnitudapropiada, ajustando de la mejor forma posible la relacin entre lasvariables.


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MATERIAL Y MTODO

Modelo de Gompertz:

log N=A+C.exp[-exp (-b(Tiempo - M))]

Donde:logN: es el logaritmo comn de poblaciones bacterianas (UFC/mL).Tiempo: Es el periodo de incubacin, es la variable independiente (horas).A, C, b y M: son los parmetros de ajuste del modelo y representana la curva de crecimiento por todo el ciclo computacional iterativo:Aes el logaritmo comn de la poblacin inicial en UFC/ml (inculo),C es el logaritmo comn de la diferencia entre la poblacin inicial y finalen la fase estacionaria;b representa la pendiente de la curva y describe la tasa de crecimiento; yM es el tiempo en el cual la tasa de crecimiento es de mayor magnitud.



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MATERIAL Y MTODO

Utilizando los parmetros de ajuste del modelo de Gompertz, se calcularonla fase de adaptacin (), la tasa mxima de crecimiento exponencial(mx) y el tiempo de generacin (Tg), como descriptoresmicrobiolgicos a ser utilizados para efectos de prediccin de la

poblacin en un tiempo dado y en cada temperatura incluida en el rango deestudio (10-40 C), a tal efecto, se utilizaron las siguientes expresionesmatemticas:

Fase de latencia o adaptacin ():()= M1/ B+ ((log NA)/((b C)/exp(1)))

Tasa especfica de crecimiento (m):[log (UFC/mL)/h] = b C/exp (1)

Tiempo de generacin (Tg):[h] = exp(1) log (2)/b C



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MATERIAL Y MTODO

La fase de adaptacin (), tasa mxima de crecimiento exponencial (m) ytiempo de generacin (Tg) fueron incorporados a los modelos secundariosque mejor ajustaron sus valores en todo el rango trmico estudiado yen los cuales se integraron los datos provenientes de todas lastemperaturas en estudio.

Se utiliz el modelo hiperblico para modelar la fase de adaptacin, elcual modela el logaritmo neperiano de la fase de adaptacin

() = p / (Temperaturaq))

dondep yq representan los parmetros de ajuste de la ecuacin.

Del anlisis con el modelo secundario


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MATERIAL Y MTODO

Para modelar el efecto de la temperatura sobre la tasa especfica decrecimiento (m) se utiliz el modelo de la raz cuadrada, modificada porRatkowsky para su uso incluso ms all de la temperatura ptima decrecimiento.

La ecuacin de regresin no lineal utilizada en el proceso iterativo hastalograr la menor suma de residuales, fue la siguiente:

m= (bx(Temp.- Tmin)) x (1-exp(c*Temp. - Tmax))

donde b yc son los parmetros de regresin del modelo; yTmin y Tmaxcorresponden a las temperaturas mnima y mximas a las cuales puedecrecer la cepa de L. lactis estudiada, siendo ajustados tambin por elmodelo.



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MATERIAL Y MTODO

El tiempo de generacin o tiempo de doblaje, fue descrito por un modelohiperblico, cuya ecuacin describe la interaccin de la curva decrecimiento con la temperatura y fue similar a la utilizada para la fase deadaptacin;

Tg = p / (Temperaturaq)

dondep representa la disminucin del tiempo de generacin en la medidaen que se aumenta la temperatura yq representa la temperatura a la cual eltiempo de generacin es infinito.

Obtenidos todos los puntos experimentales, se efectu el anlisis deregresin no lineal correspondiente a todos los modelos secundariosdescritos hasta obtener el mejor ajuste, con lo cual se obtuvo losdescriptores de crecimiento definitivos que resultan vlidos a cualquiertemperatura dentro del rango entre los 10 y 40 C.



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MATERIAL Y MTODO

Tcnicas estadsticas

Los ajustes de las curvas de crecimiento al modelo de Gompertz y razcuadrada se utilizaron mecanismos de regresin lineal en SPSS 12.0.

Una vez ajustada la recta de regresin a los datos observadoslog (UFC/mL), se dispuso de una medida que valore la bondad de ajuste

realizado y que permita decidir si el ajuste lineal es suficiente o se debenbuscar modelos alternativos, por lo que se determin el Coeficiente decorrelacin que mide la proporcin de variabilidad total de la variabledependiente, respecto a su media que es explicado por el modelo deregresin.

Las diferencias significativas entre los parmetros de crecimientoobtenidas a diferentes temperaturas se obtuvieron a travs del anlisis devarianza [ F(n=3; =0.05)].

Las comparaciones entre datos de origen y estimados por lo modelos sediferenciaron a travs del diseo estadstico t-Student (p0.05).


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RESULTADOS

La leche reconstituida al 12% permiti el crecimiento favorable a temperaturas de10, 20, 30 y 40 C. La temperatura ptima de crecimiento se estim a 30 Cen donde se establecen 29.77 duplicaciones (n) y una tasa relativa (r) de 2.48.Existe diferencia estadsticamente significativa entre las respuestas delcrecimiento a las temperaturas empleadas, siendo este factor la causa delaceleramiento o retardo del crecimiento. (p=1,6014E-15). Ver cuadro 1.


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RESULTADOS

Utilizando el modelo primario de Gompertz se obtuvieron los parmetros deajuste A, C, b y M, agrupados por temperaturas de 10, 20, 30 y 40 C. Se observaque en la medida que se incrementa la temperatura los parmetros b y C seincrementan, en tanto que M disminuye, excepto cuando el cultivo se expone a latemperatura de 40 C que hace que el parmetro b y C disminuya y M aumente.Existe efecto estadsticamente significativo de las temperaturas sobre los

parmetros de crecimiento. (p= 8,94E-09). Ver cuadro 2.


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RESULTADOS

Existe una elevada correlacin (r ) indicando la bondad del modelo primariode Gompertz que ajusta los datos experimentales para describir elcomportamiento del crecimiento de Lactococcus lactis Subsp. Lactisy que la relacinde la sumatoria de los Residuales y el nmero de iteraciones indica que el error esbastante aceptable. Ver cuadro 3.


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RESULTADOS

La fase de latencia () y el tiempo de generacin (Tg) se hacen mnimos en lamedida que la temperatura se incrementa. Excepto, cuando la temperatura alcanzael valor de 40 C, mientras que la tasa mxima de crecimiento exponencial (max)muestra un comportamiento inverso. Ver cuadro 4.


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RESULTADO

Se determinaron los estimadores p y q de los modelos secundarios para lafase de adaptacin () y tiempo de generacin (Tg), los cuales fueronincorporados al modelo correspondiente para la prediccin de los parmetrosmicrobiolgicos en funcin de la temperatura.

Se establecieron las siguientes ecuaciones de prediccin:()= 31.55 /(Temperatura-4.02) y

Tg= 14.19/(Temperatura-7.42)

Aplicando los modelos secundarios se estimaron los tiempos de la fase deadaptacin y generacin. El coeficiente de correlacin obtenido para el tiempo deadaptacin es de r = 0.94, y para el tiempo de generacin (r ) = 0.91.


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RESULTADOS

Los valores de los residuales indican un error muy bajo y por lo tanto un buenajuste de los datos. No se encontr diferencia significativa (p>0.05) entre el valorde origen y el estimado, para ambos parmetros de crecimiento. Ver cuadro 5.


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RESULTADOS

La tasa de crecimiento se model utilizando la ecuacin de la raz cuadradade Ratkowsky, que para su ejecucin se estimaron previamente los valores para loscuatro parmetros o estimadores: b= 0.042, c= 4.39, Tmin= 0.05 y Tmax = 56.5.

max = (0.042*(T- 4.00))* (1

exp (0.05* (T

53.01)))

Los resultados estimados para la tasa especfica de crecimiento segn el modelosecundario no se diferencian estadsticamente del estimado por el modeloprimario de Gompertz.


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RESULTADOS

Se puede inferir que el uso del modelo secundario de la raz cuadrada predice latasa de crecimiento mximo de Lactococcus lactis Subs. Lactisen leche reconstituida al12%, a temperaturas diferentes a las experimentadas, en forma directa. Ver cuadro6.


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DISCUSIN

Se utiliz leche descremada al 12% como sustrato natural para elcrecimiento de Lactococcus lactis Subs. Lactis obteniendo ptimosresultados an a temperatura de 10 C. El aporte del 12% de slidos totalesen la leche permite el crecimiento, del mismo modo que encontr Fara(2002) que determin que el adicionamiento de 12 a 15% de slidos totalesde la leche, permite cultivos con densidades poblacionales de 106 a 109,producidos en un periodo de tiempo de 48 horas y expuestos atemperaturas de 35 C.


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DISCUSIN

La fase de latencia a 10 C es muy extensa culminando a las 17,43 horas.Durante el tiempo de adaptacin muchas clulas bacterianas contenidas enel inculo pueden morir y slo las que sobrevivieron establecieron lacurva de crecimiento cuya tasa de crecimiento total fue de

0.08 logUFC/mL/h; mientras que las temperaturas de 20, 30 Cestablecieron mayores tasas de crecimiento. Cabe mencionar que a latemperatura de 40 C se produce una disminucin de la tasa de crecimientoen relacin a la de 20 y 30 C, debido probablemente a que muchasactividades metablicas de la bacteria no se ejecutan eficientemente y labacteria entra en un proceso de declive o muerte celular. Chacon (1992)

encontr resultados similares estableciendo que los mejores aislamientosdel gnero Lactococcus se efecta a los 30 C y la tasa de crecimientogeneral de 0,24 Log UFC/mL/h. (Cuadro 1).


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DISCUSIN

El modelo de Gompertz ajust las curvas de crecimiento en formaeficiente, utilizando la mayor cantidad de iteraciones estimando uncrecimiento idealizado basado en los datos experimentales. El estudioreporta que la temperatura ptima es de 30 C, en donde el crecimiento

logartmico es de 0,51 Log UFC/mL/h y el tiempo para alcanzar elmximo crecimiento fue de 2,98 horas. Adems se puede apreciar como losvalores del r2 son elevados, lo cual indica la bondad del modelo para elajuste de los datos analizados, ms an cuando el anlisis de losresiduales es muy pequeo indicando que el error experimental esmnimo. Las otras temperaturas ofrecieron menores valores debido a que

afectan de alguna forma la cintica de crecimiento. Estos valores sonaproximados a los reportados por Valbuena y col. (2005) que para elparmetro b es 0.32 y 4.21 para M. (Cuadro 2).


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DISCUSIN

Observando los grficos de las curvas de crecimiento se establece que lafase de adaptacin, considerando que es la proyeccin de una lnearecta tangencial a la lnea de crecimiento exponencial, hasta el eje de lasordenadas (tiempo), reflejan que en todos los casos la cantidad del inculoo poblacin inicial fue apropiada y que dependiendo del incremento de latemperatura el tiempo de adaptacin disminuye, excepto para 40 C, en elcual se incrementa. Respuestas parecidas tienen los parmetros tasaespecfica del crecimiento (max) y el tiempo generacional (tg).

Se destaca que la mejor expresin del crecimiento es a los 30 C en loscuales se registra un tiempo de adaptacin de 1,608 horas, tasa decrecimiento logartmico de 1,09 Log UFC/mL/h y que el tiempo querequiere para duplicarse es de 0,27 horas.


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DISCUSIN

Todos los valores de los parmetros cinticos del crecimiento halladosmediante las ecuaciones propuestas se corroboran grficamente quecorresponden a la realidad. Las figuras 1, 2, 3 y 4 permiten apreciar lomencionado anteriormente. Comparativamente encontramos que Lade(2006) reporta valores de 1,89 h, 1,16 Log UFC/mL/h y 0,22 h,respectivamente. Asimismo, Cayr (2007) hall para los mismosparmetros y en forma respectiva los siguientes valores, 1,78 h, 1.35 LogUFC/mL/h y 0,19 h.

Estos datos permite afirmar que los ensayos realizados ofrecenrespuestas fisiolgicas bastantes homogneas de Lactococcus lactis Subs.. Lactis

dentro su temperatura ptima de crecimiento.


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CONCLUSIN

Se obtuvo un crecimiento ptimo a la temperatura de 30 C con lossiguientes parmetros: A=3.13, b = 0.51, C = 5.82 y M = 2.98. Losparmetros cinticos ptimos correspondientes a 30 C son: = 1.608 h,max = 1.092 log UFC/mL/h y Tg = 0.274 horas.

Los resultados obtenidos con el modelo primario permitieron hallarlas constantes para utilizar el modelo secundario de Ratkowzky el cualsimplifican la prediccin del crecimiento utilizando slo la variacin detemperatura, siendo su expresin:

max= (0.042*(T-4.00))* (1exp (0.05* (T53.01))).

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