AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris (12 Juin 2012) Anticorps monoclonaux à usage thérapeutique: optimisation, nouveaux formats et défis technico-économiques Jean-Luc Teillaud (Equipe 14 « Biotechnologie des Anticorps », Centre de Recherche des Cordeliers/INSERM U.872) [email protected]
Anticorps monoclonaux à usage thérapeutique : optimisation, nouveaux formats et défis technico-économiques Jean-Luc Teillaud, Docteur ès Sciences, Directeur de Recherche à l'INSERM Unité Inserm U872, Centre de recherche des Cordeliers Université Piere et Marie Curie - Paris 6 UMRS 872 Université Paris Descartes 15, rue de l'École de Médecine 75270 Paris cedex 06, France
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Anticorps monoclonaux à usage thérapeutique: optimisation, nouveaux formats et défis technico-économiques
Jean-Luc Teillaud (Equipe 14 « Biotechnologie des Anticorps »,
- Blocage de l’activation d’un récepteur (HER2/Neu, EGF-R)
- Blocage de l’interaction cellule-cellule (CD11a, intégrine 4)
- Induction d’apoptose (CD20)
- Ciblage d’une drogue (CD33-ozogamicine*)
* Retiré du marché
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Modes d’action des AcM à usage thérapeutique
- Activation de mécanismes effecteurs via la région Fc (ADCC, CDC, phagocytose, production de cytokines ou/et de chimiokines) (CD20, CD52)
- Induction d’une immunomodulation par blocage de molécules membranaires impliquées dans la co-stimulation ou son contrôle (CD4, CTLA-4)
- Induction d’une réponse immune adaptative cellulaire à long-terme
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
«L’anticorps murin qui voulait être humain»
- L’infusion d’AcM de souris chez l’Homme => anticorps humains anti-Ac de souris (HAMA) => neutralisation et clairance accélérée de l’AcM => chute de l’efficacité,
effets secondaires dus à la formation de complexes immuns et à leur dépôt.
- Les AcM de souris ne stimulent pas les fonctions effectrices de l’immunité de façon optimale chez l’Homme :=> faible activation du complément,
=> mauvais recrutement des récepteurs pour la région Fc des Ig (RFc) et du RFcn (=> diminution de la T1/2).
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Ingénierie cellulaire pour générer des AcM humains
1977 : Transformation par l’EBV de lymphocytes B pour produire des AcM (Steinmitz et al., Nature, 269: 420, 1977)
Ac1Ac2Ac3
Clonage des cellules
AcM
Lignées B(EBV)
Criblage
Lymphocytes B du sang périphérique
Transformation
DonneurImmunisé
EBV
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Ingénierie moléculaire pour générer des anticorps humains
1984 : AcM chimériques souris/homme (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6851, 1984)
1988 : Expression de fragments d’anticorps (fragment Fv simple chaîn, e Fv) dans E. coli (Skerra & Plückthun, Science, 240: 1038 ; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879, 1988 ; Bird et al., Science, 242: 423, 1988)
1989 : AcM humanisés (Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029, 1989)
1989 : Banques combinatoires de phages exprimant des fragments d’Ac humains (Fab’, scFv) («Phage display») (Huse et al., Science, 246, 1275, 1989)
1994 : Production d’AcM humains par des souris transgéniques (Lonberg et al., Nature, 368: 856, 1994; Green et al., Nat Genet, 7: 13, 1994) ou trans-chromosomiques (Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 722, 1994)
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012) 10
De la souris à l’Homme…
Domaine Ig de souris Domaine IgG humaine
AcM de souris AcM chimérique
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Ingénierie moléculaire pour générer des anticorps humains
1984 : AcM chimériques souris/homme (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6851, 1984)
1988 : Expression de fragments d’anticorps (fragment Fv simple chaîn, e Fv) dans E. coli (Skerra & Plückthun, Science, 240: 1038 ; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879, 1988 ; Bird et al., Science, 242: 423, 1988)
1989 : AcM humanisés (Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029, 1989)
1989 : Banques combinatoires de phages exprimant des fragments d’Ac humains (Fab’, scFv) («Phage display») (Huse et al., Science, 246, 1275, 1989)
1994 : Production d’AcM humains par des souris transgéniques (Lonberg et al., Nature, 368: 856, 1994; Green et al., Nat Genet, 7: 13, 1994) ou trans-chromosomiques (Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 722, 1994)
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012) 12
De la souris à l’Homme…
Domaine Ig murin Domaine Ig humain CDRs murin
AcM de souris AcM humanisé
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012) 13
Génération d’un AcM recombinant humanisé huIgG1,
Vecteur avec séquences huC1 et huCLignée cellulaire (CHO, NS1…)
Transfection
AcM, HuIgG1,
Clonage
VL
VH
ARNt/ARNm
Hybridome B de souris
huVL
huVH
1. Séquençage2. Comparaison V humains3. Modélisation 3-D/cristal4. Détermination CDR/FR
contact5. Greffe CDR6. Mutations ponctuelles FR
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Humanisation d’un AcM recombinant
Substitutions d’a.a. des FR humains impliqués dans des contacts avec des a.a. des moCDRs greffés: remplacement des a.a. «humains» par les a.a. trouvés à la même position sur les VH/VL murins de l’Ac de souris («FR back mutations»)
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Ingénierie moléculaire: anticorps humains
1984 : AcM chimériques souris/homme (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6851, 1984)
1988 : Expression de fragments d’anticorps (fragment Fv simple chaîn, e Fv) dans E. coli (Skerra & Plückthun, Science, 240: 1038 ; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879, 1988 ; Bird et al., Science, 242: 423, 1988)
1989 : AcM humanisés (Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029, 1989)
1989 : Banques combinatoires de phages exprimant des fragments d’Ac humains (Fab’, scFv) («Phage display») (Huse et al., Science, 246, 1275, 1989)
1994 : Production d’AcM humains par des souris transgéniques (Lonberg et al., Nature, 368: 856, 1994; Green et al., Nat Genet, 7: 13, 1994) ou trans-chromosomiques (Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 722, 1994)
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Expression bactérienne de fragments d’anticorps: les « single chain Fv (scFv) »
Espaceur
VHa VLaLrbs
Stop
Etiquette(GGGGS)3
P
VHa
VLa
Espaceur
Etiquette
scFv
VH
VL
Fv
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Ingénierie moléculaire: anticorps humains
1984 : AcM chimériques souris/homme (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6851, 1984)
1988 : Expression de fragments d’anticorps (fragment Fv simple chaîn, e Fv) dans E. coli (Skerra & Plückthun, Science, 240: 1038 ; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879, 1988 ; Bird et al., Science, 242: 423, 1988)
1989 : AcM humanisés (Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029, 1989)
1989 : Banques combinatoires de phages exprimant des fragments d’Ac humains (Fab’, scFv) («Phage display») (Huse et al., Science, 246, 1275, 1989)
1994 : Production d’AcM humains par des souris transgéniques (Lonberg et al., Nature, 368: 856, 1994; Green et al., Nat Genet, 7: 13, 1994) ou trans-chromosomiques (Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 722, 1994)
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Banques combinatoires de phages
Phage filamenteux
scFv
pIII
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012) 19
Génération d’AcM humains: sélection de VH/VL humains par criblage de banques de phages filamenteux (« Phage display »)
1. Clonage et expression de régions Fab ou de scFv humains => production d’une banque de phages
2. Sélection de Fab ou de scFv spécifiques exprimés à la surface des phages
3. Isolement des VH/VL spécifiques et «reformatage» sous forme d’IgG entière
4. Transfection et production de l’AcM recombinant dans des cellules eucaryotes (CHO, NS1…)
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Banques combinatoires de phages
ADNc
ARNt/ARNm
Lymphocytes B humains
VLVH
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012) 21
Génération d’AcM humains: sélection de VH/VL humains par criblage de banques de phages filamenteux (« Phage display »)
1. Adsorption 2. Lavage 3. Elution (pH acide)
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012) 22
Génération d’un AcM recombinant humain IgG1, à partir d’un phage sélectionné
ADNc
Vecteur avec séquences huC1 et huC
TransfectionLignée cellulaire (CHO, NS1…)
AcM, HuIgG1,
Clonage
Phage sélectionné
huVLhuVH
PCR
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Phage display: génération de fragments d’Ac mutés
**** *
1. Phage parental
**
2. Mutagenèse
scFv ou Fab
Purificationde l’ADN wt
3. Banque de Phages mutants
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012) 24
Phage display: sélection de fragments d’Ac de forte affinité
2. Lavage1. Adsorption sur l’Ag (faible densité)
*
*
Banque dephages mutés
3. Elution
*
Phage mutésélectionné(forte affinité)
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Ingénierie moléculaire: anticorps humains
1984 : AcM chimériques souris/homme (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6851, 1984)
1988 : Expression de fragments d’anticorps (fragment Fv simple chaîn, e Fv) dans E. coli (Skerra & Plückthun, Science, 240: 1038 ; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879, 1988 ; Bird et al., Science, 242: 423, 1988)
1989 : AcM humanisés (Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029, 1989)
1989 : Banques combinatoires de phages exprimant des fragments d’Ac humains (Fab’, scFv) («Phage display») (Huse et al., Science, 246, 1275, 1989)
1994 : Production d’AcM humains par des souris transgéniques (Lonberg et al., Nature, 368: 856, 1994; Green et al., Nat Genet, 7: 13, 1994) ou trans-chromosomiques (Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 722, 1994)
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012) 26
Génération d’AcM humains: utilisation de souris transgéniques humanisées contenant les gènes d’Ac humains
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
2. Insertion des gènes codant une partie des chaînes lourdes et légères humaines (YAC) (lignée B). Croisement (AxB) => souris « humanisée »
3. Production d’hybridomes après immunisation
1. Invalidation des gènes DJ & J(chaînes H & L) de souris (lignée A)
4. Clonage de l’AcM humain et expression dans des cellules eucaryotes (CHO, NSO …)
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Immunogénicité des Ac recombinants
1.Ac chimériques: Dépend de l’Ac chimérique: pas, peu ou fortement immunogène (Homologie plus ou moins forte avec les VH/V humains?)
2. Ac humanisés:Peu immunogène mais dépend également de l’Ac considéré
Pour tous les Ac recombinants:
1. Rôle de la voie d’injection?2. Rôle des doses injectées et de leur nombre/fréquence?3. Rôle de l’antigène ciblé?4.Test de détection des HAMA utilisé!
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Les 27 AcM utilisés en clinique en 2012 (FDA+EMEA)
- 2 AcM sont des IgG de souris (une IgG1, une IgG2a)
- 4 AcM sont des IgG1 humaines chimériques
- 9 AcM sont des IgG humanisées (dix IgG1 dont deux
Fab, deux IgG4, une IgG2/4)
- 9 AcM sont des IgG humaines (sept IgG1, deux IgG2)
- 1 Ac bi-spécifique (rat IgG2b/souris IgG2a)
- 2 Fab (un chimérique PEGylé, un humanisé)
* Juin 2012
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Les AcM utilisés en clinique (FDA+EMEA+ Chine) 33 AcM sont/ont été sur le marché* et ont généré des revenus de
près de quarante milliards d’Euros en 2011:
- 8 AcM dans les maladies inflammatoires/auto-immunes
- 1 AcM dans les maladies infectieuses (VRS)
- 3 AcM dans la transplantation
- 1 AcM dans les maladies cardio-vasculaires
- 1 AcM dans une maladie neuro-dégénérative (SEP)
- 1 AcM dans l’asthme allergique
- 15 AcM en oncologie
- 1 Acm en ophtalmologie (DMLA)
- 1 AcM dans les maladies osseuses
- 1 AcM en hématologie (HPN) * Juin 2012
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Génération et ingénierie de fragments d’Ac
1989: Isolement de domaines VH ayant de fortes affinités à partir de banques de domaines VH exprimés dans E. coli (Ward et al, Nature, 341:544)
1993: Ac intracellulaires (“Intrabodies”) (Marasco et al, PNAS, 90:7889) et fragments Fc à usage thérapeutique (Debré et al, Lancet, 342:945)
1993: Ingénierie moléculaire de formats bispécifiques: “diabodies” (Holliger et al, PNAS, 90:6444), “triabodies”….
1993: Découverte d’Ac de Camelidæ dépourvus de chaînes légères (Hamers-Casterman et al, Nature, 363:446)
2008: Régression tumorale chez des patients cancéreux après injection de très faibles doses de fragments d’Ac bispécifiques (Bargou et al, Science, 321:974)
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Expression de «single chain Fv (scFv)» à la surface de cellules de mammifères
Espaceur
VHa VLaL Tag(GGGGS)3
P/O
Stop
TM ± région ICExpression (« Hooking »)
Expression + transduction (« T-bodies »)
VHa
VLa
Espaceur
Tag
scFv-TM-IC
TM ± IC
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Anticorps bispécifique de lama VHH: ciblage du RFcIII/CD16 et d’un antigène associé aux tumeurs (ACE)
VHH Ab
bispécifique
Cellule NK
ACE
Cellule tumorale
RFcIII
VHH (anti-ACE) - huC VHH (anti-RFcIII) - huCH1
Fab-like (bispécifique)
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
L’expression intracellulaire d’un scFv anti-ras neutralisant à l’aide d’un vecteur viral induit la régression tumorale dans des souris nude (HCT 116)
VHa
VLa
Espaceur
Tag
scFv
Utilisation de fragments scFv comme «intrabodies»
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Anticorps monoclonaux optimisés:
ingénierie de la région Fc (IgG1)
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012) 42
Fonctions effectrices des IgG dépendantes des récepteurs pour la région Fc des IgG (RFc)
* Fixation aux RFc activateurs (I, IIA, III):* La cytotoxicité dépendante d’anticorps (ADCC)(cellules NK, monocytes, neutrophiles)* La phagocytose de particules opsonisée (DC, (macrophages)* L’endocytose de complexes immuns (monocytes, DC, macrophages, neutrophiles, lymphocytes B)* La sécrétion de cytokines et chimiokines
* Fixation aux RFc inhibiteurs (IIB) : blocage de l’activation cellulaire induite par d’autres récepteurs (BCR, RFc, RFc activateurs…) (lymphocytes B, mastocytes, monocytes…)
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Stratégies d’ingénierie de la région Fc :
1. Criblage et sélection d’anticorps IgG1 ayant une région Fc mutée
2. Modification de la glycosylation de la région Fc des anticorps IgG1
Anticorps monoclonaux optimisés: ingénierie de la région Fc (IgG1)
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Sélection de mutants IgG1 ayant une fixation accrue au RFcIIIA et présentant une plus forte ADCC
Stratégie: mutagenèse dirigée de tous les acides aminés exposés aux solvants dans les domaines CH2 et CH3 d’une IgG1 humaine (anti-HER2/Neu, trastuzumab)
* Numérotation «Eu» (Shields et al., J. Biol. Chem., 2001)
WT
AICC
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Stratégies d’ingénierie de la région Fc :
1. Criblage et sélection d’anticorps IgG1 ayant une région Fc mutée
2. Modification de la glycosylation de la région Fc des anticorps IgG1
Anticorps monoclonaux optimisés: ingénierie de la région Fc (IgG1)
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Glc NAcMannoseGalactoseFucose 1,6NeuAc 2,6
m/z
CpmG0
G1
G1F
G2F(courtesy of L. Krummen, Genentech, Inc., USA)
Hétérogénéité de la glycosylation des AcM
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
L’absence de fucose ou un contenu faible en fucose (20-35%),
La présence de galactose et/ou de galactose et d’acide sialique à l’extrémité de/des GlcNAc terminales,
La présence d’une GlcNAc intercalaire,
accroissent la fixation aux RFc et augmente l’ADCC des IgG1 monoclonales humaines
Ingénierie de la glycosylation (IgG1 humaines)
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Les anticorps monoclonaux optimisés
* Optimisation des propriétés pharmaco-cinétiques
* Meilleure bio-distribution et ciblage (notamment au site de la tumeur)
* Meilleure capture de drogues, vecteurs viraux, et haptènes radio-marqués au voisinage de la cellule-cible (dans la plupart des cas, des cellules tumorales)
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
Les nouveaux défis des anticorps monoclonaux
- Un, deux, trois AcM (bio-terrorisme, oncologie…)?
- Les anticorps conjugués aux drogues (immunoconjugués): le grand retour de la “magic bullet”?
- Nouvelles utilisations: anticorps intra-cellulaires, fragment d’Ac à la surface de cellules effectrices (« T-bodies ») ou cibles (« Hooking »): AcM et thérapie cellulaire?
- Qu’est ce qu’un biosimilaire?!
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)
AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)