INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA Análisis histopatológico en árboles de limón mexicano infectados con Candidatus Liberibacter asiaticus posterior a la aplicación de formulaciones biotecnológicas. TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN RECURSOS Y MEDIO AMBIENTE PRESENTA PAULINA GÁMEZ ROSAS GUASAVE, SINALOA; MÉXICO DICIEMBRE DEL 2014
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Análisis histopatológico en árboles de limón mexicano ...
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN
PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL
UNIDAD SINALOA
Análisis histopatológico en árboles de limón
mexicano infectados con Candidatus Liberibacter
asiaticus posterior a la aplicación de formulaciones
biotecnológicas.
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRÍA EN
RECURSOS Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA
PAULINA GÁMEZ ROSAS
GUASAVE, SINALOA; MÉXICO DICIEMBRE DEL 2014
El presente trabajo de investigación se desarrolló en las instalaciones del
Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo integral Regional (CIIDIR)
Unidad Sinaloa del Instituto Politécnico Nacional (IPN), en el departamento de
Biotecnología Agrícola (BIOTECSIN), en el laboratorio de Virología bajo la dirección
del Dr. Jesús Méndez Lozano y en el Centro de Nanociencias y Micro y
Nanotecnologías (CNMN) del Instituto Politécnico Nacional, en el laboratorio de
Microscopía confocal de Barrido Laser bajo la dirección de la Dra. María de Jesús
Perea Flores. Para la realización de este proyecto se recibió financiamiento de la
Secretaria de Investigación y Posgrado (SIP 20120507) y del Consejo Nacional de
Ciencia y Tecnología (CONACyT) (FINNOVA-173465). El autor agradece al
CONACyT e IPN por las becas otorgadas (Beca BEIFI y Beca Institucional).
DEDICATORIA
A mis padres por apoyarme
incondicionalmente y ser mi pilar principal.
A Elodia por ser mi segunda madre
adoptarme y cuidar de mí durante todo este
tiempo
Alberto, tú sabes lo que ha sido esto para
mí…gracias por no dejarme flaquear.
AGRADECIMIENTOS
Agradezco al Dr. Jesús Méndez por haberme dado la oportunidad de desarrollarme en su laboratorio, por
su paciencia, apoyo, consejos y sobre todo su confianza durante todo este tiempo. A la Dra. María de Jesús
por su amistad y dedicación en este proyecto y por haberme dado seguridad en momentos de duda. A la
Dra. Norma Leyva y al Dr. Antonio Luna por sus aportaciones en el desarrollo de este trabajo.
También quiero agradecer a los chicos de Virología a Erika, por sus risas, amistad y no dejarme morir sola
en nuestras diversas aventuras. A Juanjo por su ayuda en todo momento, recomendaciones y frases
motivacionales. Cindy muchas gracias por tu gran apoyo y esfuerzo en este trabajo que sin ti no estaría
completo y sobre todo por brindarme tu cariño. A Betty, Marielos y Ángela Paulina les agradezco su
tiempo, confianza y el que me hayan aceptado como su amiga. A Gustavo y Marco por los momentos de
alegría que me brindaron en el laboratorio así como sus consejos y apoyo. También quiero agradecer a
Lucy, Emanuel y Roger por su ayuda al inicio de esta aventura.
.
i
I. ÍNDICE GENERAL
I. ÍNDICE GENERAL.................................................................................................. i
INDÍCE DE CUADROS ................................................................................................ v
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................. vi
GLOSARIO ................................................................................................................ viii
RESUMEN ................................................................................................................... x
ABSTRACT ................................................................................................................ xii
I. INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 1
II. ANTECEDENTES ................................................................................................. 3
CITRÍCOS ...................................................................................................... 3 A.
1. Aspectos generales del limón mexicano ........................................................ 3
2. Importancia económica internacional y nacional ............................................ 3
3. Enfermedades de los cítricos ......................................................................... 4
Huanglongbing ............................................................................................... 5 B.
1. Agentes causales de Huanglongbing ............................................................. 5
2. Transmisión del HLB. ..................................................................................... 6
3. Síntomas del HLB en cítricos. ........................................................................ 7
4. Cambios fisiológicos en cítricos inducidos por CLas ...................................... 8
5. Cambios histológicos y estructurales. ............................................................ 9
6. Distribución de HLB en México .................................................................... 11
7. Alternativas para contrarrestar la enfermedad del HLB de cítricos ............. 12
Defensa en plantas ...................................................................................... 13 C.
1. Inducción de defensa en plantas .................................................................. 14
Figura 2. Transmisión en la naturaleza del HLB a través de insectos vectores. ......... 7
Figura 3. Síntomas de HLB en follaje y fruto en naranja dulce. ................................... 8
Figura 4. Cambios histopatológicos en cítricos dulces afectados por el HLB............ 11
Figura 5. Mapa de distribución del HLB en México ................................................... 12
Figura 6. Esquema del huerto experimental en malla sombra.. ................................ 23
Figura 7. Huerto experimental en campo. ................................................................. 25
Figura 8. Acumulación de almidón en follaje de limón mexicano de invernadero. ….35
Figura 9. Acumulación de almidón en follaje de limón mexicano tratado con manejo
nutricional en malla sombra. ...................................................................................... 36
Figura 10. Acumulación de almidón en follaje de limón mexicano tratado con la
formulación FB-3 en malla sombra. ........................................................................... 36
Figura 11. Detección de CLas en tejido foliar sintomático y asintomático de limón
mexicano mediante PCR punto final. ........................................................................ 38
Figura 12. Estructura del sistema vascular en hoja de limón mexicano. ................... 41
Figura 1. Presencia de almidón en follaje de limón mexicano después de 240 días de aplicación de tratamiento y formulaciones biotecnológicas……………………… 41
Figura 14. Acumulación de almidón en xilema observado por MEB.......................... 42
Figura 15. Depuración de imagen confocal para la extracción de datos numéricos. 43
Figura 16. Presencia de almidón en tejido foliar de limón mexicano en malla sombra
240 DPA de las formulaciones biotecnológicas observados a través de una
reconstrucción tridimensional en MCBL. .................................................................. 44
Figura 17. Efecto de distintos tratamientos sobre el tamaño de los gránulos de
almidón de árboles de limón mexicano CLas+.. ......................................................... 45
Figura 18. Efecto de distintos tratamientos sobre el tamaño de los gránulos de
almidón de árboles de limón mexicano CLas+. .......................................................... 46
Figura 19. Presencia de almidón en tejido foliar de limón mexicano en campo 60 DPA
observados a través de una reconstrucción tridimensional en MCBL. ...................... 47
vii
Figura 20. Depuración de micrográficas en MCBL y cuantificación de Calosa en tejido
foliar de árboles de limón mexicano en malla sombra 240 DPA. .............................. 50
Figura 21. Presencia de calosa en hojas de limón mexicano en malla sombra 240
Los análisis estadísticos respecto a las variables de tamaño de cilindro vascular
señalaron que al menos un tratamiento mostro diferencia significativa en el
incremento del tamaño. La comparación de medias mediante el análisis de Tukey
(P≤0.05) indican que alternancia seguido de FB-1 y manejo nutricional, presentaron
mayores variaciones en el área del cilindro vascular (Figura 27). Así mismo en xilema
el análisis de comparación de medias con Tukey (P≤0.05) señaló que al menos un
tratamiento presentó diferencia significativa, se observó que alternancia seguida por
FB-1 y FB-3 presentaron mayores variaciones en el tamaño del xilema (Figura 28).
Por otro lado el análisis estadístico de medias Tukey (P≤0.05) sugiere que no hay
diferencia significativa en el tamaño del floema (Figura 29).
Figura 27. Efecto de las formulaciones biotecnológicas 240 DPA en el tamaño de
cilindro vascular en follaje de limón mexicano afectado por CLas. A, Letras
distintas indican diferencias significativas según la prueba de Tukey (P≤0.05). Las
barras en cada rectángulo indican ± el error estándar. B, gráfico de medias indicando
la formación de grupos homogéneos (letras superiores).
AB
AB
A A
B
0.00
50,000.00
100,000.00
150,000.00
200,000.00
250,000.00
Nutrición FB-1 FB-2 FB-3 Alternancia
X1000
A
B
Alternancia FB-2 FB-1 Nutrición FB-3
Ta
ma
ño
de
cilin
dro
va
sc
ula
r e
n µ
m2
Tratamientos
A AB AB AB
59
A
AB
A
AB
B
0.00
20,000.00
40,000.00
60,000.00
80,000.00
100,000.00
120,000.00
140,000.00
160,000.00
180,000.00
Nutrición FB-1 FB-2 FB-3 Alternancia
Tam
año
de X
ilem
a en
µm
2
A AB AB AB
FB-2 FB-1 Nutrición FB-3Alternancia
X10000
Tratamiento
A
B
Figura 28. Efecto de las formulaciones biotecnológicas 240 DPA en el tamaño
de xilema en follaje de limón mexicano afectado por CLas. A, Letras distintas
indican diferencias significativas según la prueba de Tukey (P≤0.05). Las barras en
cada rectángulo indican ± el error estándar. B, gráfico de medias indicando la
formación de grupos homogéneos (letras superiores).
60
Cambios microestructurales en sistema vascular de follaje y raíz de I.
árboles de limón mexicano infectados por CLas 60 DPA
De manera similar al ensayo en cítricos en malla sombra, se realizó un análisis
cualitativo de la microestructura foliar de árboles afectados por HLB en campo
tratados con las formulaciones FB-1, FB-3 y manejo nutricional a 60 DPA,
adicionalmente se examinó el tejido radicular, bajo el conocimiento de que CLas
puede resguardarse en la raíz, tejido en el cual se almacena almidón principalmente,
donde induce cambios en la microestructura de las células y el metabolismo del
almidón (Johnson, et al., 2013). El estudio óptico de la microestructura del follaje se
complementó con un análisis cualitativo de micrografías en MCBL, mientras que las
observaciones de la estructura de raíz solo fueron realizadas de manera
microestructural. Las micrografías del tejido foliar y radicular de un árbol de limón
mexicano sano presenta estructuras celulares integras tanto en hoja (Figura 24 B-C)
AA
A
A
A
0.00
10,000.00
20,000.00
30,000.00
40,000.00
50,000.00
60,000.00
70,000.00
80,000.00
Nutrición FB-1 FB-2 FB-3 Alternancia
X1000
Tam
año
de fl
oem
a en
µm
2
Alternancia FB-2 FB-1 Nutrición FB-3
Tratamientos
A A A AA
A
B
Figura 29 Efecto de las formulaciones biotecnológicas 240 DPA en el tamaño
de floema en follaje de limón mexicano afectado por CLas. A, Letras distintas
indican diferencias significativas según la prueba de Tukey (P≤0.05). Las barras en
cada rectángulo indican ± el error estándar. B, gráfico de medias indicando la
formación de grupos homogéneos (letras superiores).
61
Figura 30. Microestructura de raíz de limón mexicano. A, corte transversal de raíz sana. B,
Floema con presencia de gránulos de almidón (flechas blancas). C, raíz afectada por HLB. D,
colapso de células del floema. Cor, corteza; Fl, floema; Xi, xilema.
como raíz (Figura 30 A-B), en donde la presencia de almidón fue baja en tejido foliar
y elevada en tejido radicular (Figura 30 B). De manera contraria, el tejido radicular de
un árbol enfermo presentó colapso de floema y nula presencia de almidón (figura 30
C-D).
A diferencia de lo observado en follaje a los 240 DPA en malla sombra, los
resultados de la aplicación de los tratamientos manejo nutricional, FB-1 y FB-3 a los
60 DPA presentaron un escaso progreso en la recuperación de la estructura celular
del floema en follaje, observándose un colapso total (Figura 31 A, D, G), no obstante,
raíz, si presentó una estructura definida del floema en la mayoría de las muestras
analizadas (Figura 31 B, H). El análisis confocal realizado en follaje exhibió
diferentes comportamientos en el arreglo del floema. La estructura del floema en
follaje tratado con nutrición, presentó una apariencia compacta y delimitada (Figura
31 C) a diferencia del follaje tratado con FB-3 y FB-1 en los cuales se observó una
estructura menos uniforme (Figura 31 F,I) no obstante en los tres tratamientos se
XI
10 x 40 x
Xi
A B
XI
FL
Es
XI
FL
Cor
10 x 40 x
C DCor
FL
Cor
62
observó el incremento del xilema tal como en el primer ensayo (Figura 26). Estos
resultados sugieren que a pesar del corto tiempo al que han estado expuestos los
cítricos a la aplicación de las formulaciones biotecnológicas hay un efecto inicial en la
mejora de la estructura celular del sistema vascular.
XI
XI
A B
FL
ES
FL
ES
FL
XI
ES
D F
ME
H
XI
FL
ES
I
XI
FL
C
Fl
XI
G
Fl
XI
E
FL
FlXI
XI
40 x 40 x
40 x
40 x
40 x
40 x
Figura 31 Aspecto del tejido vascular de floema en raíz y follaje de limón mexicano 60
DPA. A-C, manejo nutricional. D-F, aplicación de FB-1. G-I aplicación de FB-3. La primera
columna muestra cortes transversales de follaje. La segunda columna muestra cortes
transversales de raíz. La tercer columna muestra el cilindro vascular de follaje observado por
MCBL. Cor, corteza; Fl, floema; Xi, xilema.
63
Los resultados de ambos ensayos sugieren que la aplicación de formulaciones
biotecnológicas desarrollan el sistema vascular foliar y radicular en los árboles
tratados, lo cual ayuda a estabilizar el transporte de fotoasimilados.
El Huanglongbing afecta la concentración de Zn, Mn y Ca además de repercutir en la
distribución de Fe, Cu, K, en follaje (Tian, et al., 2014). Se ha reportado que las
deficiencias de K se relacionan con desequilibrios en la síntesis de celulosa mientras
que bajas concentraciones de Boro se asocian al colapso de floema (Spann y
Schumann., 2009). Diversos estudios han señalado que la aplicación de Ca, Zn, Cu,
B y otros agentes nutricionales en cítricos como naranja dulce y mandarina
disminuyen los síntomas del HLB, mantienen la producción del fruto e incrementan el
área, largo y ancho de las hojas e intervienen en el desarrollo e integridad de
membranas y paredes celular (Spann y Schumann., 2009; Khairulmazmi, et al.,
2011; Weishou, et al., 2013), estos resultados coinciden con lo observado en el
presente estudio en el cual durante el desarrollo de ambos experimentos se aplicó un
manejo nutricional con micro y macro nutrientes además de que la aplicación de
cada formulación biotecnológica fue acompañada por la aplicación del manejo
nutricional.
Tanto en manejo nutricional como en FB-2 cuyos ingredientes principales son
esporas de Bacillus y extractos vegetales, se observó una estructura celular similar a
las células de follaje sano, no obstante el efecto positivo observado en follaje tratado
con formulaciones a base de hormonas fue mayor. La formulación FB-3, constituida
por hormonas promotoras del crecimiento y salicilato de potasio y FB-1 en la cual se
incluyen reguladores de crecimiento y complejos multienzimaticos, presentaron un
floema de apariencia sana y un incremento en el grosor del cilindro vascular, siendo
el tejido del xilema el de mayor expansión en ambos tratamientos. Por su parte
alternancia, el cual es una combinación en la aplicación de todas los tratamientos
mostro resultados similares a F-B1 y FB-3.
64
Estudios relacionados con la aplicación de GA3 y Ba (una citoquinina) en naranja
clementina y en mandarina satsuna señalaron el incremento en el número de haces
vasculares del xilema y el aumento en la formación de elementos vasculares y la
división en células parénquima (Guardiola, et al., 1991; Mesejo, et al., 2003). De
igual modo, se ha mostrado que la aplicación de jasmonatos induce la respuesta
acído salicilico, el cual desencadena la activación de elementos polifenólicos en
parénquima y de células del cambium (Franceschi, et al., 2002). En diversos estudios
se ha señalado que la aplicación de giberelinas (GA3) y ácido indolacetico (IAA)
estimula cambios en la estructura de las ligninas (uno de los principales
componentes de las paredes celulares), específicamente en los monómeros guacilo
y siringilo (precursores de lignina) y dependiendo de las concentraciones de estos
precursores se forman paredes celulares propias del xilema o del floema (Romano,
et al 1991; Aloni, 1995; McKenzie y Deyholos, 2011). Esto se relaciona con los
resultados en el incremento del floema y xilema, el cual se sugiere proceden de la
diferenciación y crecimiento célular regulado por la aplicación de fitohormonas.
65
VIII. CONCLUSIONES
Existe una asociación entre la concentración de Candidatus Liberibacter
asiaticus y la acumulación de almidón en follaje de limón mexicano.
La formulación FB-1 presentó el mejor efecto en la disminución del tamaño de
los gránulos de almidón (3260.36 µm²) en árboles de limón Mexicano en el
ensayo de malla sombra a los 240 DPA y la menor tendencia en densidad de
gránulos de almidón (0.00397617 gránulos de almidón/µm²).
Las formulaciones biotecnológica FB-1 y FB-3 en campo presentaron una
tendencia a disminuir la acumulación y el tamaño de los gránulos de almidón
en árboles de limón Mexicano en el ensayo de campo abierto a los 60 DPA,
sugiriendo un efecto positivo en la respuesta de los árboles a la enfermedad
en un periodo corto de tiempo.
La formulación FB-1 y el tratamiento alternancia presentaron el mejor
comportamiento en formación de células propias del cilindro vascular,
principalmente en xilema a los 240 DPA en cítricos de malla sombra.
El tratamiento manejo nutricional y las formulaciones biotecnológica FB-1 y
FB-3 en campo presentaron una tendencia a incrementar el tamaño del xilema
y mejorar la estructura celular de floema en raíz 60DPA
Se observó la presencia de calosa en el área del floema de cítricos infectados
por CLas; sin embargo, no se logró elucidar un comportamiento relacionado
con la aplicación de los tratamientos respecto a su acumulación a los 240
DPA en cítricos en malla sombra y tampoco a los 60 DPA en cítricos de
campo.
66
IX. BIBLIOGRAFÍA
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