análisis de segregación de marcadores microsatélites en una ...

Universidad Nacional

de Misiones

FCEQyN

Instituto Nacional de

Tecnología Agropecuaria

ANÁLISIS DE SEGREGACIÓN DE MARCADORES

MICROSATÉLITES EN UNA POBLACIÓN DE

MAPEO F2 PARA EL CARÁCTER ALTO OLEICO EN

GIRASOL CULTIVADO (Helianthus annuus var.

macrocarpus)

TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE LICENCIADO EN GENÉTICA

DIEGO ARIEL FERNÁNDEZ

Directora: Dra. María Valeria Moreno.

Co-directora: Lic. Nancy Gabriela Grandón.

Grupo de Biotecnología en Cultivos EEA MANFREDI

CÓRDOBA

2014

Universidad Nacional

de Misiones

FCEQyN

Instituto Nacional de

Tecnología Agropecuaria

ANÁLISIS DE SEGREGACIÓN DE MARCADORES

MICROSATÉLITES EN UNA POBLACIÓN DE

MAPEO F2 PARA EL CARÁCTER ALTO OLEICO EN

GIRASOL CULTIVADO (Helianthus annuus var.

macrocarpus)

TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE LICENCIADO EN GENÉTICA

DIEGO ARIEL FERNÁNDEZ

Grupo de Biotecnología en Cultivos EEA MANFREDI

CÓRDOBA

2014

A mi Mamá, que

siempre me esperó y de

quien aprendí a nunca

bajar los brazos.

"Para ver un mundo dentro de

un grano de arena y el cielo en una

flor silvestre, sostén el infinito en la

palma de tu mano y la eternidad en

una hora."

≈ William Blake ≈

v

AGRADECIMIENTOS

A Valeria y Gaby, mis directoras, no solo por guiarme durante este trabajo

y por atender minuciosamente incontables correcciones, sino también por confiar

en mí, por la paciencia en la enseñanza y por hacerme sentir casi como en

“casa” aconsejando, ayudando y preocupándose en todo lo posible. Gracias por

ser las personas que necesité.

A los chicos del Lab: Caro, siempre alegre y dispuesta a ayudarme; a

Eva, con sus geniales explicaciones de todo sin dejar dudas; y a Pablo, práctico

y técnico para resolver problemas. Gracias por la compañía del día a día y hacer

de la rutina algo agradable y llevadero.

A los amigos de la facu: los primeros, Ale (gracias por estar siempre),

Nati, Vale, Juanchi, Mauri y Julito con quienes compartí mucho de todo…

estudio, congresos, mates, reuniones, comidas y, por supuesto, mucha fiesta! A

Juli, Deni y Adri, personas geniales que me acompañaron los últimos años de

estudio. Y otros tantos que sin duda han estado y formaron parte de todo este

proceso.

A mis mejores amigos Pichi y Gancha con quienes comparto desde chico

tantas historias y buenos momentos. Gracias por ser tan geniales e

incondicionales, por el apoyo durante este último tiempo y el aguante de

siempre.

A Vane, que llegó a mi vida en este último tramo y quien desde entonces

es muy importante para mí. Gracias por ser mi apoyo emocional y mi cable a

tierra, por aguantar mis días malos y alegrarlos… Gracias por darme todo tu

cariño y amor!

Por último, no me queda más que agradecer profundamente a mi familia

por brindarme todo su apoyo de manera incondicional, en especial en esta última

etapa que sin duda fue difícil tanto en lo personal como en lo académico.

Gracias por no dejarme caer cuando más lo necesité. Son fuente de inspiración y

fortaleza. A mi Mamá y Papá, a mis hermanos Guille, Gabi y Cintia, y a mis

sobrinos Agustina, Victoria y Rafael, a quienes amo profundamente.

MUCHAS GRACIAS!!!

vi

RESUMEN

La construcción de mapas de ligamiento constituye una poderosa

herramienta para identificar regiones cromosómicas asociadas a

características de interés agronómico. Para ello, se requiere analizar la

segregación de marcadores polimórficos, la cual se espera que cumpla

con las proporciones 1:2:1 de acuerdo con la Ley de Segregación

Mendeliana. El objetivo del presente trabajo fue analizar la segregación

de 41 marcadores microsatélites polimórficos en una población de mapeo

F2 de girasol cultivado Helianthus annuus var. macrocarpus, proveniente

del cruzamiento entre los parentales contrastantes R285♂ (alto oleico) y

R023♀ (bajo oleico). Con el fin de completar el perfil molecular de la

población F2 segregante conformada por 180 individuos, se analizaron 58

de ellos como parte de esta tesina. La genotipificación se realizó con 30

marcadores SSRs polimórficos y los fragmentos amplificados se

resolvieron en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 6%. De los 30

SSR analizados, nueve fueron descartados por su baja resolución en gel

y los 21 marcadores restantes se analizaron en conjunto con 20 SSRs

genotipificados en paralelo por el Laboratorio de Biotecnología (INTA-EEA

Manfredi). El análisis de segregación de los SSRs en el total de la

población F2 se realizó mediante el cálculo de X2 utilizando el programa

JoinMap 3.0. Los resultados obtenidos revelaron una distorsión de la

segregación (DS) significativa (p≤0,05) en todos los loci, con un marcado

desvío hacia el genotipo parental R285. Con el objeto de determinar la

causa de dicha distorsión, se calculó X2 para las frecuencias alélicas y

genotípicas. Estos resultados mostraron que el 85,4 % de los SSRs

presentaron DS significativa (p≤0,05) tanto alélica como genotípica,

sugiriendo la influencia de la selección gamética y cigótica actuando

simultáneamente. Sin embargo, los marcadores HA806, HA911, HA1938,

HA3349, ORS229 y ORS899 sólo mostraron DS significativa (p≤0,05) en

sus frecuencias alélicas, indicando la influencia de la selección gamética

únicamente. Estos resultados permiten concluir que la población de

vii

mapeo F2 proveniente del cruzamiento entre R285 y R023 no cumple con

la premisa de segregación 1:2:1 para marcadores co-dominantes según la

Primera Ley de Mendel. Por ello, se propone analizar otros cruzamientos

resultantes de parentales contrastantes para el carácter en estudio; como

así también otras poblaciones tales como las líneas endocriadas

recombinantes (RIL), las derivadas de retrocruzamientos (BC) o las

provenientes de cruzamientos recíprocos.

viii

ABSTRACT

Genetic linkage map constructions are a powerful tool to identify

genomic regions associated with interesting agronomic traits. For this

purpose, analyze polymorphic marker segregations is required, which are

expected to keep Mendelian ratio (1:2:1). The aim of this research was to

analyze segregation of 41 polymorphic microsatellite markers on a

segregant population of 180 F2 cultivated sunflower (Helianthus annuus

var. macrocarpus) derived from the cross between parental inbred lines

R285♂ (high oleic acid) and R023♀ (low oleic acid). In order to complete

F2 population molecular profiles, 58 of them were analyzed in this work.

Thirty polymorphic SSRs were genotyped and the PCR fragments were

resolved in 6% polyacrylamide denaturing gels. Only 21 of 30 SSR primer

pairs were used, which were chosen according to their amplification

profiles and analyzed together with 20 SSRs genotyped previously by the

Laboratorio de Biotecnología (INTA- EEA Manfredi). Chi-square-tests

were performed for segregation distortion of each locus using JoinMap

3.0. Results showed significantly distorted segregation (DS) (p≤0.05) in all

loci; deviated towards the male parent genotype R285. To analyze the

reason of the DS, chi-square-tests for allelic and genotypic frequencies

were calculated. These results indicated that 85.4 % of SSR studied

showed significant distortion (p≤0.05) in allelic and genotypic segregation,

suggesting influence of gametic and zygotic selections simultaneously.

However, the markers HA806, HA911, HA1938, HA3349, ORS229 and

ORS899 showed significant DS (p≤0.05) just in allelic frequencies

because they were influenced by gametic selection only. In summary, F2

mapping population derived from the cross between R285 and R023 does

not meet segregation 1:2:1 according to Mendel's First Law for co-

dominant markers. Therefore, we propose to analyze other contrasting

parents crosses for this agronomic trait, as well as recombinant inbred

lines (RIL), those derived from backcross (BC) or of reciprocal crosses.

ix

ÍNDICE

Agradecimientos

Resumen

Abstract

Abreviaturas

1. Introducción

1.1. Descripción botánica

1.2. Origen del girasol cultivado

1.3. Importancia económica

1.4. Producción de girasol en Argentina

1.5. Composición acídica del aceite de girasol

1.6. Síntesis de ácidos grasos

1.7. Genes involucrados en el carácter alto oleico

1.8. Uso de marcadores moleculares en el

mejoramiento genético de girasol

1.9. Mapa de ligamiento y análisis de segregación

1.10. Importancia para el INTA

2. Hipótesis

3. Objetivos

3.1. Objetivo general

v

vi

viii

1

2

2

4

5

5

6

7

8

10

11

13

15

16

16

x

3.2. Objetivos específicos

4. Materiales y Métodos

5. Resultados

6. Discusión

7. Conclusiones

8. Perspectivas Futuras

9. Bibliografía

10. Anexo

Protocolo 1: Cuantificación de ADN por fluorometría

Protocolo 2: Tinción con nitrato de plata y

pretratamiento con ácido nítrico

16

17

22

27

29

30

31

45

45

46

1

ABREVIATURAS

ACC: acetil CoA carboxilasa

ACP: proteína transportadora de

acilos

AG: ácidos grasos

AFLP: Amplified Fragment Lenght

Polymorphisms

BC: retrocruzamientos

CAPS: Cleaved Amplified

Polymorphic Sequences

DS: distorsión de la segregación

FAD: desaturasa de ácido graso

FAS: sintasa de ácidos grasos

g: gramo

GL: grupo de ligamiento

h: hora

HC: hidratos de catbono

ID: identificación del marcador

KAS: ketoacil-ACP sintasa

L: litro

m: metro

M: molar

MAB: retrocruzamiento asistido por

marcadores

MAS: selección asistida por

marcadores

mg: miligramo

min: minuto

mL: mililitro

mM: milimolar

MR: motivo de repetición

ng: nanogramo

p/v: peso/volumen

pb: pares de bases

PC: fosfatidilcolina

QTL: loci de caracteres cuantitativos

RAPD: Random Amplified

Polymorphic DNAs

RE: retículo endoplasmático

RFLP: Restriction Fragment Lenght

Polymorphisms

RIL: líneas endocriadas

recombinantes

s: segundo

SAD: estearoril-ACP desaturasa

SDL: loci de distorsión de la

segregación

SDR: región de distorsión de la

segregación

SNP: Single Nucleotide

Polymorphisms

SSCP: Single-Strand Conformation

Polymorphism

SSR: Simple Sequence Repeat

TILLING: Targeting Induced Local

Lesions In Genomes

tn: tonelada

U: unidad de actividad enzimática

W: watt

X2: prueba de Chi cuadrado

μL: microlitro

μM: micro molar

ºC: grado centígrado

2

1. INTRODUCCIÓN

1.1. Descripción botánica del girasol

El género Helianthus pertenece a la familia Asteraceae, subfamilia

Asteroideae, tribu Heliantheae y contiene 48 especies con distintos

niveles de ploidía (diploides, tetraploides y hexaploides) (Seiler and

Riesberg, 1997). Uno de sus representantes diploides más conocido por

su importancia económica es el girasol cultivado, Helianthus annuus var.

macrocarpus (DC) Cockerell, con 2n=2x=34 cromosomas

(Arumuganathan and Earle, 1991).

El girasol cultivado es de ciclo anual con un desarrollo vegetativo

de 130 a 150 días. Su raíz principal es pivotante y las secundarias se

desarrollan horizontalmente cerca de la superficie, llegando a crecer hasta

varios metros de profundidad. El gran desarrollo radicular que posee lo

hace tolerante tanto al frío como a la sequía. En la etapa de floración, el

tallo de porte erecto puede llegar a medir hasta 3 m de altura

dependiendo de las condiciones del cultivo. Éste es pubescente al inicio y

se vuelve leñoso para formar en su extremo superior el botón floral que

dará lugar a la inflorescencia. La forma cultivada posee un solo capítulo,

aunque a veces se ramifica dando varias inflorescencias. Las hojas son

pecioladas, pubescentes en ambas caras y de bordes aserrados; las

inferiores son opuestas y las superiores alternas. Las flores se reúnen en

una inflorescencia denominada capítulo, aquellas que se disponen al

borde de éste son liguladas y neutras, mientras que las restantes son

bisexuadas. La fecundación alógama es principalmente entomófila, pero

es posible generar descendencia fértil por autogamia (Kugler and Godoy,

1964). La semilla o cipsela es un fruto seco, uniseminado, con pericarpio

separado de la verdadera semilla o “pepita”; la cual contiene la mayor

cantidad de aceite. Cada capítulo puede albergar cerca de 1300 semillas

(Aguirrezábal et al., 2001). (Figura 1).

3

Figura 1. Estructuras de la planta de girasol. (a) Sistema radical. (b) Tallo. (c) Disposición de las hojas. (d) Hoja. (e) Capítulo. (f) Planta multiflora. (g) Botón floral. (h) Semilla. Fuentes: (a) Extraído de http://asb.com.ar/cultivos/girasol/raiz/attachment/gi-a-132/. (b, c, d, g) Fotografías de Grandón, N. G.; (e, f) Fotografías de Cordes, D. (h) Adaptado de http://www.euita.upv.es/varios/biologia/web_frutos/Aquenio.htm

4

1.2. Origen del girasol cultivado

El girasol es originario de la región central de Estados Unidos. Las

poblaciones indígenas cultivaban formas silvestres de las que utilizaban la

semilla para alimento y para extraer el aceite. La especie cultivable, H.

annuus var. macrocarpus, surgió a partir de H. annuus var. annuus por

selección de mutantes menos ramificados y con semillas más grandes.

Esta especie cultivada por los nativos americanos fue llevada a España a

mediados del siglo XVI como planta ornamental. Más tarde, en el siglo

XVIII, el cultivo se extendió desde el oeste de Europa hasta Rusia, donde

adquirió importancia a principios del siglo XIX como planta oleaginosa

(Kugler and Godoy, 1964).

El girasol cultivado comenzó a cobrar importancia en América hacia

el siglo XX. En Argentina, las primeras referencias datan de mediados del

siglo XIX (Figura 2) (Kugler and Godoy, 1964). Este germoplasma

constituyó la base de viveros oficiales y privados para crear, mediante

selección, nuevas variedades adaptadas al país (Bertero de Romano and

Vázquez, 2003).

Figura 2. Centro de origen y distribución del girasol en el mundo. Fuente: ASAGIR, 2008.

5

1.3. Importancia económica

La producción mundial de semilla de girasol es de

aproximadamente 36 millones de tn y tiene cuatro principales

protagonistas: Ucrania (8,3 millones de tn), Federación Rusa (7,9 millones

de tn), Argentina como el único país relevante en el Hemisferio Sur (3,3

millones de tn) y China (2,3 millones de tn) (FAO - FAOSTAT, 2012). El

mercado argentino comercializa el 70,8% de la semilla producida (CIARA-

CEC, 2012). No obstante, una parte significativa del aceite elaborado se

exporta (50% del total) y el resto se refina principalmente para consumo

doméstico y, en menor proporción, para uso industrial (margarinas,

mayonesas, galletitas y otros alimentos). Las harinas proteicas y tortas

resultantes del proceso de extracción de aceite se procesan y transforman

en pellets para la fabricación de alimentos balanceados (CIARA). En el

mercado mundial de aceites, el de girasol es el tercero en orden de

importancia, con Argentina como segundo exportador después de Ucrania

(FAO - FAOSTAT, 2011).

1.4. Producción de girasol en Argentina

Argentina cuenta con ambientes agroecológicos sumamente

favorables para el cultivo del girasol; sin embargo, puesto que éste posee

rusticidad y adaptación a diversos ambientes, se siembra en áreas donde

el suelo y el clima condicionan severamente la productividad de otros

cultivos (Moreno, 2011). En la zona central de Argentina dedicada a la

agricultura, los primeros informes mencionan a H. annuus var.

macrocarpus como una especie inusual (Cabrera, 1974), pero Zuloaga

and Morrone (1999) y Poverene et al. (2002, 2008) demostraron que esta

especie ha aumentado su distribución geográfica alcanzando, en la

actualidad, ocho provincias (Figura 3). El cultivo se extiende desde el

sudeste de la región pampeana hasta la región chaqueña con una

superficie sembrada de aproximadamente 1,3 millones de hectáreas

(MAGyP-SIIA, 2014), siendo Buenos Aires la provincia con mayor

superficie sembrada.

6

Figura 3. Porcentaje de área promedio sembrada de girasol por provincia para la campaña 2013-2014. Fuente: MAGyP-SIIA, 2014.

1.5. Composición acídica del aceite de girasol

El 98% del aceite está constituido por ácidos grasos (AG), los

cuales se encuentran en las células de los granos, principalmente unidos

por enlaces ésteres a una molécula de glicerol formando los triglicéridos.

Estos se pueden clasificar en base a la presencia o ausencia de dobles

enlaces en la cadena de carbonos: AG insaturados o AG saturados,

respectivamente. La nomenclatura incluye el número y la posición de los

dobles enlaces que posee el aceite, como así también el número de

átomos de carbono que conforman la molécula. Los AG saturados más

frecuentes son el palmítico (C16:0) y el esteárico (C18:0), mientras que

los de cadena más larga como araquídico (C20:0), behénico (C22:0) y

lignocérico (C24:0) pueden encontrarse en concentraciones menores al

1%. Dentro de los insaturados, los más frecuentes son el ácido oleico

(C18:1), el linoleico (C18:2) y el linolénico (C18:3) con una, dos y tres

insaturaciones, respectivamente (Aguirrezábal et al., 2002; Izquierdo and

Aguirrezábal, 2010).

El aceite de girasol contiene cerca del 90% de AG insaturados

entre ácido oleico y ácido linoleico. Se ha descripto a éstos como

esenciales para el metabolismo humano, con potentes efectos

0,5 0,6 1,9 2,0

12,0 12,0

21,3

49,7

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

Provincias

Po

rce

nta

je d

e á

rea

sem

bra

da

Entre Ríos

Santiago del Estero

San Luís

Córdoba

Chaco

Santa Fe

La Pampa

Buenos Aires

7

hipocolesterolémicos (Kris – Etherton and Yu, 1997). Asimismo, los altos

niveles de ácido oleico extienden la estabilidad oxidativa y la vida útil del

aceite (Purdy, 1986). En consecuencia, el aumento en la demanda actual

del mercado se ha orientado a alimentos de calidad diferenciada y, por

ende, los programas de mejoramiento de girasol apuntan al desarrollo de

cultivares con mayor contenido de ácido oleico.

1.6. Síntesis de ácidos grasos

La síntesis de aceite en la semilla o grano se produce en las

células embrionarias durante el período comprendido entre la floración y

la madurez fisiológica. Como sustrato se utilizan los hidratos de carbono

(HC) sintetizados principalmente en las hojas y tallos en etapas anteriores

a la floración. Los HC son transportados hasta los granos a través del

floema, principalmente en forma de sacarosa (Aguirrezabal et al., 2002).

La síntesis de novo de los AG ocurre en los cloroplastos, donde la acetil-

CoA carboxilasa (ACC: acetyl-CoA carboxylase) cataliza el primer paso de

la biosíntesis (Figura 4). Dicha enzima forma el malonil-CoA a partir de

acetil-CoA y bicarbonato, constituyendo así la fuente de carbono para

cada ciclo de la biosíntesis. Los AG son producidos por un complejo

proteico de sintetasas (FAS: fatty acid synthase). El malonil-tioéster así

formado, sufre una serie de reacciones de condensación catalizadas por

las enzimas ketoacil-ACP sintetasas (KAS: ketoacyl-ACP synthase);

elongando la cadena hasta 16:0-ACP (complejo palmítico-ACP: acyl

carrier protein o proteína transportadora de grupos acilo) o hasta 18:0-

ACP (complejo esteárico-ACP). Una parte del 16:0-ACP se exporta al

retículo endoplásmico (RE), mientras que el resto son elongados hasta

18:0-ACP y desaturados en la posición Δ9 por la estearoil-ACP desaturasa

(SAD: stearoyl-ACP desaturase) para formar 18:1-ACP que se exportará

al RE. Allí, el oleoil-CoA se incorpora a la fosfatidilcolina (PC) de la

membrana y es desaturado en la posición Δ12 a 18:2-PC por la enzima

oleoil desaturasa (FAD2: fatty acid desaturase-2) generando linoleoil-PC

que puede ser desaturado en la posición Δ15 a 18:3-PC por la linoleoil

8

desaturasa (FAD3: fatty acid desaturase-3). El ensamblaje de los

triglicéridos tiene lugar dentro del RE y utiliza glicerol-3-fosfato y acil-CoA

como sustrato primario (Figura 4). Éstos luego serán transferidos y

almacenados en estructuras subcelulares llamadas cuerpos grasos u

oleosomas (Baud and Lepiniec, 2010).

1.7. Genes involucrados en el carácter Alto Oleico

Los primeros estudios genéticos en líneas de girasol con alto

contenido de ácido oleico reportaron un único gen parcialmente

dominante designado como Ol (Fick, 1984) o dominante (Urie, 1984) que

controla el carácter. Fernández – Martínez et al. (1989) informaron que

existen tres genes complementarios denominados Ol1, Ol2 y Ol3 que

regulan este carácter. Actualmente se sabe que dichos genes

corresponden a una oleato desaturasa microsomal denominada FAD2,

con sus tres isoformas FAD2-1, FAD2-2 y FAD2-3. Dichas enzimas se

encargan de la conversión del ácido oleico en ácido linoleico. FAD2-1 se

expresa exclusivamente en el embrión en desarrollo durante el llenado del

grano, mientras que FAD2-2 y FAD2-3 se expresan en los demás tejidos

durante la formación de los lípidos de membranas (Martínez – Rivas et al.,

2001). La mutación de Ol produce un aumento significativo en la

concentración de C18:1 y es esencial para la producción de fenotipos con

el carácter alto oleico. El gen Ol segrega como dominante en poblaciones

F2 en las que la progenie puede ser asignada de forma inequívoca a las

clases, ya sea dominante (Ol_: alto) o recesivo (olol: bajo) (Urie, 1984,

1985; Pérez – Vich et al., 2002). Sin embargo, las distribuciones

fenotípicas no mendelianas también pueden ocurrir en diferentes fondos

genéticos y esto se debería a la presencia de modificadores. Varias

hipótesis han sido propuestas para describir la herencia de los

modificadores (Urie, 1985). Miller et al. (1987) describieron el locus Ml,

que actúa como un modificador del locus Ol, mientras que Fernández et

al. (1999) sugirieron que Ml es un complejo de genes.

9

Figura 4. Esquema de las reacciones implicadas en la biosíntesis de AG y ensamblaje de triglicéridos en semillas de oleaginosas. ACC: acetil-CoA carboxilasa; ACP: proteína transportadora de grupo acil; CoA: coenzima A; CPT: CDP-colina:1,2-sn-diglicerido colina fosfotransferasa; DGAT: 1,2-sn-diglicerido aciltransferasa; ER: retículo endoplasmatico; FAD2: oleoil desaturasa; FAD3: linoleoil desaturasa; FAE complejo elongasa de AG; FAT: acil-ACP tioesterasa; G3PDH: glicerol-3-fosfato deshidrogenasa; GPAT: glicerol-3-fosfato aciltransferasa; HmACC: acetil-CoA carboxilasa homomérica; KAS: 3-cetoacil-ACP sintasa; LACS: acil-CoA sintetasa de cadena larga; LPAAT: ácido lisofosfatódico aciltransferasa; LPC: lisofosfatidilcolina; MAT: malonil-CoA:proteína transportadora de grupo acil S-maloniltransferasa; PAP: ácido fosfatódico fosfohidrolasa; PC: fosfatidilcolina; PDCT: fosfatidilcolina:diglicerido colinofosfotransferasa; PLA2: fosfolipasa A2; PDAT: fosfolípido:diglicerido aciltransferasa; *: malonil-CoA. Fuente: Baud and Lepiniec, 2010.

10

1.8. Uso de marcadores moleculares en el mejoramiento

genético de girasol

El mejoramiento tradicional se basa en la selección fenotípica de

genotipos superiores dentro de poblaciones segregantes obtenidas a

partir de cruzamientos. Éste a menudo presenta dificultades relacionadas

principalmente con las interacciones genotipo - ambiente (G x E).

Además, las caracterizaciones fenotípicas suelen ser costosas, consumen

mucho tiempo y pueden ser poco eficientes para caracteres cuantitativos

como rendimiento, calidad y tolerancia a estreses bióticos y abióticos. En

consecuencia, el desarrollo y la aplicación de los marcadores moleculares

en el mejoramiento asistido, ha permitido realizar diferentes estudios de

diversidad (Garayalde et al., 2011; Moreno et al., 2013), construcción de

mapas de ligamiento (Poormohammad Kiani et al., 2007; Talia et al.,

2010) y estudios poblacionales y filogenéticos (Iruela et al., 2002; Mian et

al., 2005). Por ello, actualmente se cuenta con una gran variedad de

marcadores moleculares tales como: RFLPs, AFLPs, microsatélites o

SSRs, RAPDs, CAPSs, SSCPs, SNPs (Rafalski, 2002; Delgado, 2006;

Filippi et al., 2014), entre otros. La utilidad de los marcadores depende de

su capacidad para discriminar polimorfismos, de la disponibilidad de

recursos y de la especie en estudio. Es así que, su aplicación al

mejoramiento de girasol se ha centrado principalmente en la tolerancia a

enfermedades (Bert et al., 2004; Ronicke et al., 2005), a estrés abiótico

(Ebrahimi et al., 2008; Poormohammad Kiani et al., 2009) y algunos

caracteres agronómicos importantes como rendimiento y calidad (Pérez –

Vich et al., 2002; Haddadi et al., 2010).

Entre los marcadores disponibles, los microsatélites muestran alta

reproducibilidad y cobertura genómica, herencia co-dominante,

neutralidad y polimorfismo elevado (Kalia et al., 2011). Estos marcadores

consisten en pequeñas secuencias de uno a cuatro pb de largo, repetidas

en tándem. En plantas, se distribuyen con una frecuencia de uno por cada

50.000 pb (Ferreira and Grattapaglia, 1996). La base genética del

11

polimorfismo detectado en los microsatélites se centra en la variabilidad

del número de repeticiones en tándem y, consecuentemente, del tamaño

del microsatélite amplificado en los individuos de una especie (Picca et

al., 2004). Los SSRs se utilizan para evaluar la variabilidad genética en

colecciones de germoplasma, en mapeo e identificación de regiones

relacionadas con caracteres agronómicos deseables, en selección

asistida (MAS: Marker Assisted Selection) y también en retrocruzamiento

asistido por marcadores (MAB: Marker Assisted Backcrossing). Además,

pueden ser empleados para estudios de estructura poblacional,

taxonómicos y análisis filogenéticos (Kalia et al., 2011). En girasol,

distintas iniciativas internacionales dieron lugar al desarrollo de este tipo

de marcadores. Argentina a través de INTA generó la colección

denominada HA, Europa por medio del grupo Cartisol originó la colección

denominada CRS y Estados Unidos, a través de la Universidad de

Oregon, la colección denominada ORS (Talia 2008). En la actualidad, se

dispone de 2.040 marcadores microsatélites públicos para girasol

(Dehemer and Friedt, 1998; Gedil, 1999; Paniego et al., 2002; Tang et al.,

2002; Yu et al., 2003), algunos de los cuales han sido integrados a

distintos mapas genéticos (Al-Chaarani et al., 2002, 2004; Tang et al.,

2002; Yu et al., 2003; Talia et al., 2010).

1.9. Mapa de ligamiento y análisis de segregación

Uno de los principales usos de los marcadores moleculares en la

agricultura ha sido la construcción de mapas de ligamiento para diversos

cultivos. La relación entre estos mapas y los datos fenotípicos del carácter

en estudio permite la detección de QTL (Quantitative Trait Loci); lo cual

constituye una poderosa herramienta para facilitar el progreso de los

programas de mejoramiento. Estos mapas son utilizados para la

identificación de regiones cromosómicas que contienen los genes

controladores de características simples o cualitativas (controladas por

uno o pocos genes) y caracteres cuantitativos, poligénicos o complejos.

12

Construir un mapa de ligamiento consiste en ordenar los

marcadores de acuerdo a sus posiciones relativas en los cromosomas,

indicando las distancias genéticas entre ellos y definiendo los grupos de

ligamiento. Este ordenamiento se realiza en función de la frecuencia de

recombinación o intercambio de material genético entre cromosomas

homólogos durante la meiosis. El porcentaje de recombinación se calcula

en función de la cantidad de progenie recombinante y su valor se utiliza

para estimar la distancia genética entre loci (Collard et al., 2005). Para

ello, se requiere como primer paso el análisis de segregación de los

marcadores polimórficos en la población de mapeo en estudio, la cual se

espera que cumpla con el tipo de segregación 1:2:1, de acuerdo con la

Ley de Segregación Mendeliana.

El análisis de segregación permite conocer la distribución de las

frecuencias genotípicas de los individuos en una población de estudio,

para un locus determinado. Mediante la prueba X2 es posible evaluar si

estos valores son consistentes con las proporciones Mendelianas

esperadas. La distorsión de la segregación (DS) se define como una

desvío de las frecuencias genotípicas observadas respecto de sus valores

esperados (Lu et al., 2002) y está influenciada por varios factores, tales

como la selección gamética y cigótica, la recombinación no homóloga, los

elementos transponibles y los agentes ambientales (Kinoshita, 1993; Xu

et al., 1997; Knox and Ellis, 2002). La DS fue reportada por primera vez

en maíz (Mangelsdorf and Jones, 1926) y, hasta el momento, se ha

registrado en tomate (Paterson et al., 1991 ), cebada (Konishi et al.,

1992), alfalfa (Brummer et al., 1993), lechuga (Kesseli et al., 1994), sorgo

(Pereira et al., 1994), girasol (Quillet et al., 1995), avena (Pawlowshi et al.,

1998) y arroz (Matsushita et al., 2003), entre otros cultivos. Cabe destacar

que la distribución de los marcadores con DS a lo largo de los GL puede

ser de dos tipos: 1- desviaciones numerosas en loci individuales y

distribuidas entre los cromosomas (Reinisch et al., 1994) o 2-

desviaciones agrupadas en una región cromosómica llamada región de

distorsión de la segregación (SDR: Segregation Distortion Region) (Byrne

13

et al., 1995). Estas desviaciones se relacionan con la existencia de loci de

distorsión de la segregación (SDL: Segregation Distortion Loci) que

evidencian el efecto selectivo en distintos momentos originando: 1-

aborto del polen, 2- competencia del tubo polínico (Liedl and Anderson,

1993), 3- fertilización competitiva o 4- selección cigótica (Kärkkäinen et

al., 1996). Los tres primeros corresponden a diferentes tipos de selección

gamética. Tanto ésta como la selección cigótica pueden estar controladas

por SDL que actúan antes y después de la fertilización. Los SDL que se

expresan antes de la fertilización sólo pueden cambiar la relación

genotípica de los cigotos indirectamente, alterando la proporción de

gametos. Mientras que los SDL que se expresan después de la

fertilización afectan la relación genotípica de los cigotos directamente. Se

han observado SDR en maíz (Austin and Lee, 1996; Senior et al., 1996;

Lu et al., 2002), arroz (Xu et al., 1997.), sorgo (Pereira et al., 1994.) y soja

(Liu et al., 2000). Sin embargo, no existen infornes de la presencia de

SDR en girasol.

1.10. Importancia para el INTA

En los últimos años se han realizado diversos trabajos para

explorar los recursos genéticos de germoplasma de girasol del Instituto

Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) mediante el mejoramiento

asistido con el objetivo de caracterizar el banco y detectar las bases

genéticas de caracteres agronómicos importantes (Paniego et al., 2002;

Maringolo, 2007; Fusari et al., 2008, 2012; Talia et al., 2010; Fusari, 2011;

Moreno, 2011; Filippi et al., 2012, 2013;;Zubrzycki et al., 2012; Moreno et

al., 2013). En este sentido, se analizaron 386 marcadores SSR en

parentales contrastantes para el contenido de ácido oleico (R285: alto

oleico y R023: bajo oleico). Se identificó un total de 82 (21,24%)

marcadores polimórficos entre ambas líneas (Grandón et al., 2012). Esta

etapa inicial permitió seleccionar aquellos SSR que se emplearán para

genotipificar una población F2 segregante obtenida a partir del

cruzamiento de los parentales (R285♂ x R023♀) anteriormente citados.

14

La población total está constituida por 180 individuos, de los cuales 122

ya fueron caracterizados para 41 marcadores SSR. Los individuos

restantes (58) fueron analizados como parte de la presente tesina. Esto

permitirá avanzar en el conocimiento del carácter en estudio y, a futuro,

definir estrategias de manejo dentro del programa de mejoramiento de

girasol de INTA.

15

2. HIPÓTESIS

La población de mapeo F2 proveniente del cruzamiento entre los

parentales R285♂ (alto oleico) y R023♀ (bajo oleico), cumple con la

premisa de segregación 1:2:1 para marcadores co-dominantes según la

Primera Ley de Mendel.

16

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo General

Analizar la segregación de un grupo de marcadores microsatélites

polimórficos en una población de mapeo F2 proveniente del cruzamiento

entre los parentales R285 y R023 contrastantes para el carácter alto

oleico.

3.2. Objetivos Específicos

1. Genotipificar 58 individuos de la población de mapeo F2 con

30 marcadores microsatélites polimórficos para ambos parentales.

2. Analizar la segregación de 30 marcadores (mencionados en

el objetivo anterior) junto con otros 20 marcadores (estudiados

previamente) en el total de la población F2 (180 individuos) mediante la

prueba de Chi cuadrado (X2).

17

4. MATERIALES Y MÉTODOS

Se analizaron 58 individuos pertenecientes a la población de

mapeo F2 derivada del cruzamiento de las líneas parentales R285♂ y

R023♀; las cuales se eligieron con base en el análisis químico realizado

por el Laboratorio de Calidad de Granos, INTA - EEA Manfredi (Tabla 1).

Tabla 1. Perfil de ácidos grasos de las líneas parentales

Parental C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 C22:0 C22:1 C24:0

R285 3,14 4,17 87,2 3,1 0,1 0 0,30 0,9 0,09 0,50

R023 6,02 4,21 25,4 62,8 0,1 0 0,15 0,7 0,11 0,26

C16:0: ácido palmítico, C18:0: ácido esteárico, C18:1: ácido oleico, C18:2, ácido linoleico, C18:3: ácido linolénico, C20:0: ácido araquídico, C20:1: ácido eicosanóico, C22:0: ácido behénico, C22:1: ácido erúcico, C24:0: ácido lignocérico. Los valores están expresados en porcentaje (%).

Para la extracción de ADN se muestrearon hojas jóvenes y sanas

de las plantas F2 que fueron liofilizadas por 60 h en liofilizador modelo

FreeZone 7949030 (LABCONCO, Estados Unidos), posteriormente

molidas y almacenadas en heladera. La extracción se realizó a partir de

0,025 g de material vegetal (R285, R023, F1 y F2) utilizando el kit de

extracción NucleoSpin Plant II (Macherey – Nagel, Alemania).

Para comprobar la calidad del ADN se realizó una electroforesis en

gel de agarosa al 0,8%, con buffer TAE 1X, durante 40 min a 5 V/cm en

una cuba horizontal modelo Horizon 11.14 Watman (Biometra, Alemania).

Para la tinción se utilizó el colorante GelRed Nucleic Acid Gel Stain

10000X (Biotium, Estados Unidos). La visualización del ADN se realizó

empleando un digitalizador de imagen (Bio-Rad, Estados unidos) y el

programa Quantity One 1 D (Bio-Rad, Estados Unidos). La cuantificación

se realizó con un fluorómetro Versafluor (BioRad, Estados Unidos);

siguiendo el protocolo 1 (ver Anexo, sección 10). Las curvas de

calibración se realizaron con el estándar de ADN de timo de ternero

(1mg/mL) (BioRad, Estados Unidos).

18

Con el objeto de completar el perfil molecular de los 180 individuos

pertenecientes a la población F2, los 58 individuos restantes se

genotipificaron con 30 marcadores SSRs; de los cuales, 27 corresponden

a la serie HA y tres a la serie ORS (Paniego et al., 2002; Tang et al.,

2002; Talia et al., 2010) (Tabla 2). La mezcla para la Reacción en Cadena

de la Polimerasa (PCR) se realizó según la Tabla 3. Las amplificaciones

se realizaron en un termociclador AB GeneAmp system 9700 (Applied

Biosystems, Estados Unidos) (Tabla 4). La amplificación de los

fragmentos se comprobó en geles de agarosa al 2% con buffer TAE 1X,

durante 30 min a 5 V/cm en una cuba horizontal modelo Horizon 11.14

Watman (Biometra, Alemania). Para la tinción del gel se utilizó el

colorante GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10000X (Biotium, Estados

Unidos). La visualización de los fragmentos amplificados se realizó

mediante un digitalizador de imagen (Bio-Rad, Estados unidos) y el

programa Quantity One 1 D (Bio-Rad, Estados Unidos).

Los fragmentos amplificados se resolvieron por electroforesis

vertical en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 6% (p/v) en cuba

vertical Gibco-BRL modelo S2 (Biometra, Alemania), con buffer TBE 0,5X

en la cuba superior y buffer TBE 1X en la cuba inferior. La electroforesis

se realizó a 50 W, entre 90 y 150 min, dependiendo del tamaño del

fragmento. Para verificar el tamaño de los fragmentos en el gel, se usó un

patrón de peso molecular DNA ladder de 10 pb (Invitrogen, Brasil). Los

geles fueron teñidos con nitrado de plata según el protocolo 2 (ver Anexo,

sección 10).

19

Tabla 2. Marcadores polimórficos amplificados en 58 individuos F2 provenientes

del cruzamiento de R285 x R023

ID del

marcador Forward Reverse MR GL

Alelo en

R285

Alelo

en

R023

HA102 cctcaaaacacatctccctctc gaagaggggtgagggtgaagagg ga - 160 154

HA140 ctagcaaccaacctcattg gtctccttctctttctcggc ga 15 145 158

HA196 ggtgttagagtaaagtatgcc gaggggtttcctttcag ga - 176 179

HA360 ctcacccttcatctccttc caacaaggaaccgataactg ga 116 236 223

HA432 gggtttagtggccagtagttgtc ctttatcccccaccccctcc gt 14 170 165

HA557 caccatcattcaccaaccac cgtcgtcgctattcaccgtc gt - 126 128

HA729 ccaatatcaccatcattcacc ctattcaccgtccccatagg gt - 125 128

HA790 gcaaccggagagtgaggtgg ctcatatcttccgcggatatcg tgg - 145 152

HA806 gatgttccttcctgcac ggttggataatggggcagc ga gt - 186 192

HA969 cagttctcacttgtga catcaataagtggaagacggg tgg - 110 122

HA1108 ggaccttctatttaggaggg gggaacatggaataaggg att 110 185 144

HA1848 catccccttctgaatagaaa taggctcgttaaacttacgg att 17 242 260

HA1938 ccaaaatcgtcgaccttgcgac cgagagggaatgtcatttttg att - 229 226

HA2272 caattttcattccttgagatgagg cacaattgtattaaaagcgac att - 252 228

HA2499 gatatcttatcaccttcctgc gttccaaactgacacagcttc gta - 148 138

HA2500 caaactcacaccatccgtgtgg ggaaattgcaggtgtgtgatg atc - 137 141

HA2714 ccctagtgtatagcaacctttc gtagtgtgtatgagggagatgg ga g 114 223 227

HA2946 gggctggttttcattttagtg ccaatccttgagcaaatcag gt - 135 116

HA3298 catccaaatcgagcgcattc ggaaggatgatagttaggg atc - 134 131

HA3349 gggaatctaacttctatcacc cgtatccggagcataatatggag gt - 259 265

HA3373 gcggcgaagaagaaattgagg ggaaagggttcctgttctcc gt - 183 181

HA3703 caaatgctgattccacacta atggtttcctgtttgaattg - 24 213 215

HA3847 catcacttcaacatgcctcc cctagctcctttatgtaacctc gt 110 140 147

HA3878 tttgtttagcatcatcatcatc gagaccctaaccataacatga atc att 27 199 232

HA4057 aaacccttccgacttatctc taaagagagagcccaacaag gt 23 208 206

HA4149 tcaattcatcgtgcatatcg ccaaagtccaccaaatcttcc ga 217 188 199

HA4239 gaatgatagtgaattgagacagg ctggcatctatatccatggatag att 115 112 109

ORS229 tccgacccgaatcttatgaacc gacccgaatgagacccaaactg - 32 172 166

ORS457 tgcatacccaatctaccagcta aagacgaaggtgcaaccagt ac ct - 228 226

ORS662 cgggttggatatggagtcaa cctttacaaacgaagcacaattc ag 21 230 320

ID: identificación del marcador. GL: grupo de ligamiento de acuerdo a 1Poormohammad

Kiani et al., 2007; 2Talia et al., 2010 y

3Tang et al., 2002. -: sin dato. MR: motivo de

repetición. El tamaño de los alelos se expresa en pb.

20

Tabla 3. Mezcla para la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Componentes Concentración Vol. Final (6,5 µL)

Buffer 10 X 0,60 µL

MgCl2 50 mM 0,18 µL

dNTP 10 mM 0,12 µL

Primers F+R 5 µM 0,15 µL

Taq polimerasa (Invitrogen) 0,5 U/µL 0,05 µL

ddH2O (agua bidestilada) 4,40 µL

ADN 15 ng 1,00 µL

Tabla 4. Programa de amplificación para marcadores SSR en Girasol

Etapa Tiempo

Desnaturalización inicial a 94 ºC 4 min

Touchdown (12 ciclos)

Desnaturalización a 94 ºC

Hibridación a 64 ºC (-1 ºC/ciclo)

Elongación a 72 ºC

45 s

45 s

45 s

Amplificación (35 ciclos)

Desnaturalización a 94 ºC

Hibridación a 52 ºC

Elongación a 72 ºC

45 s

45 s

45 s

Extensión final a 72 ºC 10 min

El análisis de segregación de los marcadores SSR (30 SSRs

amplificados como parte de la presente tesina y 20 SSRs estudiados en

paralelo como actividad dentro del proyecto de mapeo biparental del

grupo de trabajo, Tabla 6) en el total de la población F2 (180 individuos),

se realizó mediante el cálculo de X2, utilizando el programa JoinMap 3.0

(Van Ooijen and Voorrips, 2002). Para ajustar los valores de X2 se

procedió a la eliminación, por medio del programa antes mencionado, de

aquellos individuos cuyos genotipos resultaron idénticos en más del 97 %

de los marcadores analizados. Asimismo, la distorsión de la segregación

para las frecuencias alélicas (p=q) y genotípicas (p2:2pq:q2) se analizó

21

mediante la prueba de X2 con el objeto de determinar la influencia de la

selección gamética y selección cigótica.

Tabla 6. Marcadores SSR estudiados previamente y usados para el análisis en este

trabajo

Marcador Forward Reverse MR GL Alelo en

R285

Alelo en

R023

HA293 ggggacatctcccgtccacc cctcatccatctccatccaatc ga 114 121 113

HA911 caaagttcacctcgtttttc aagtgggaaggtctacgagt ga 28 180 178

HA1155 ctgcaggaattataacaatc taaagaaaaagacacgaaag ga gt 212 96 90

HA2057 cacacatctcttctca gaatccatctttgta att - 117 121

HA2178 gaagtaccacctcca cacgtagtacctccc ga - 156 154

HA2191 ggcaactcaatatcc gggttcttcaaggag ga 116 204 206

HA3288 accatagggactga ctagggttttgaggg ga - 193 218

HA3348 ttcaaacgtcgacac ggtcgcacgttaaaa gt ga ta - 203 185

HA3700 gaaaagattgggagagacct ttcttcttccacccacctat ga 15 172 176

ORS16 gaggaaataaatctccgattca gcaaggactgcaatttaggg - - 125 137

ORS420 tcatggtgtttggtttgtgtc tgccaaattcctcttctttct gt 215 136 132

ORS510 catcgcgtccctctctctaa ccaaccatcacagcaatcag gt 39 248 256

ORS687 accgttacacttattggttatttcatt ggggtttgttgttctgttttg ct 315 166 163

ORS844 acgatgcaaagaatatactgcac catgtttaataggttttaattctaggg ac 39 305 307

ORS878 tgcaaggtatccatattccacaa tatacgcaccggaaagaaagtc ac 310 191 200

ORS887 tcgaaaacgactaatccaactttc gagcatgaacaagaattgacaca ac 39 243 249

ORS899 gccacgtataactgactatgacca cgaatacagactcgataaacgaca ac 316 322 312

ORS1085 gacctcaaggcatgctaacactc actaagtgtgtggacggggaaa ct 312 277 281

ORS1146 ggctcatcacttgcatctattgt tgaagacaccatctccaatgc ag 311 344 380

ORS1265 gggtttagcaaataataggcaca acccttggagtttagggatca ct 39 228 226

GL: grupo de ligamiento de acuerdo a 1Poormohammad Kiani et al., 2007;

2Talia et

al., 2010 y 3Tang et al., 2002. -: sin dato. MR: motivo de repetición. El tamaño de

los alelos se expresa en pb.

22

5. RESULTADOS

Con el objetivo de genotipificar 58 individuos de la población de

mapeo F2 se analizaron 30 marcadores SSR, de los cuales nueve se

descartaron por su baja resolución en el gel de poliacrilamida (HA102,

HA729, HA969, HA2946, HA3298, HA3847, HA4239, ORS457, ORS662).

Los 21 marcadores restantes se analizaron en conjunto con 20 SSRs

estudiados en paralelo por el grupo de trabajo.

En la Figura 4 se observa el perfil de amplificación del marcador

HA4149 para 24 individuos de la población F2 y sus respectivos

parentales. Veintiún individuos resultaron homocigotos para el alelo

detectado en el parental R285 (188 pb), dos resultaron homocigotos para

el alelo detectado en el parental R023 (199 pb) y sólo un individuo (260)

evidenció el genotipo heterocigoto.

Figura 4. Perfil de amplificación de los parentales y de 24 individuos F2 para HA4149 en gel de poliacrilamida 6%. M: patrón de peso molecular. Las flechas indican los alelos en R285 (188 pb) y en R023 (199 pb).

En la Tabla 7 se muestran los valores de X2 obtenidos a partir del

análisis de 41 loci en el total de la población en estudio (se consideró

hasta 11 % de datos faltantes). Es así que, para un valor crítico de

X2=5,991 y un nivel de significación α=0,05, se observó una fuerte DS

respecto a la proporción genotípica esperada (1:2:1) para todos los loci.

23

Tabla 7. Resultados del análisis de segregación de 41 marcadores en 180

individuos de la población F2

Marcador A/A A/a a/a DF X2

HA140 103 50 18 9 114,0

HA196 112 35 28 5 143,6

HA293 112 41 24 3 138,5

HA360 149 9 19 3 333,8

HA432 97 58 22 3 84,6

HA557 112 51 16 1 136,1

HA790 103 51 21 5 107,3

HA806 97 54 17 12 97,6

HA911 86 62 25 7 56,9

HA1108 100 40 25 15 112,0

HA1155 117 36 15 12 178,7

HA1848 100 44 25 11 105,4

HA1938 100 52 12 16 116,4

HA2057 106 44 22 8 123,1

HA2178 102 56 19 3 101,7

HA2191 99 47 26 8 97,3

HA2272 97 50 18 15 101,3

HA2499 106 47 24 3 114,9

HA2500 110 44 25 1 127,0

HA2714 109 41 29 1 124,1

HA3288 108 44 24 4 124,2

HA3348 111 35 31 3 137,0

HA3349 98 60 17 5 92,3

HA3373 105 41 29 5 115,4

HA3700 103 39 18 20 132,3

HA3703 102 55 22 1 98,1

HA3878 98 41 26 15 104,6

HA4057 117 42 21 0 153,6

HA4149 104 52 20 4 109,6

ORS16 107 41 27 5 122,6

ORS229 107 45 12 16 143,4

ORS420 104 51 16 9 118,4

ORS510 113 42 22 3 142,4

ORS687 114 34 17 15 171,1

ORS844 109 33 18 20 158,7

ORS878 99 43 25 13 104,9

ORS887 106 44 21 9 124,8

ORS899 99 49 14 18 114,5

ORS1085 103 46 22 9 113,2

ORS1146 98 46 16 20 113,0

ORS1265 92 47 26 15 83,4

A/A: número de individuos homocigotas para el alelo detectado en R285 para cada marcador. a/a: número de individuos homocigotas para el alelo detectado en R023 para cada marcador. A/a: número de individuos heterocigotos para cada marcador. DF: número de datos faltantes. X

2: valores de Chi cuadrado. Nivel de significación (α)= 0,05.

24

El mismo análisis se llevó a cabo eliminando 41 individuos que

presentaron un porcentaje de similitud genotípica (para todos los loci

estudiados) mayor al 97 %. A pesar que los valores de X2 en general

disminuyeron considerablemente, aún se detectó una distorsión de la

segregación elevada (Tabla 8).

En ambos análisis se observó un fuerte desvío de la distorsión

hacia el genotipo del parental R285. Es por ello que, con el objetivo de

determinar la causa de dicha distorsión, se calculó X2 para las frecuencias

alélicas y genotípicas (Tabla 9). De los 41 marcadores analizados, 35

presentaron una DS significativa (p≤0,05) tanto alélica como genotípica.

No obstante, los seis marcadores restantes (HA806, HA911, HA1938,

HA3349, ORS229 y ORS899) solo mostraron DS significativa en sus

frecuencias alélicas.

25

Tabla 8. Resultados del análisis de segregación de 41 marcadores en 139

individuos de la población F2 (con porcentaje de similitud genotípica

menor o igual al 97 %)

Marcador A/A A/a a/a DF X2

HA140 64 50 18 7 39,8

HA196 71 35 28 5 58,2

HA293 71 41 24 3 53,9

HA360 108 9 19 3 218,9

HA432 58 57 22 2 22,8

HA557 71 51 16 1 53,2

HA790 62 51 21 5 32,7

HA806 56 54 17 12 26,8

HA911 56 51 25 7 21,4

HA1108 60 40 25 14 35,8

HA1155 76 36 15 12 82,4

HA1848 60 44 25 10 32,0

HA1938 59 52 12 16 38,9

HA2057 65 44 22 8 42,3

HA2178 64 54 19 2 35,7

HA2191 58 47 26 8 26,1

HA2272 59 49 18 13 32,9

HA2499 65 47 24 3 37,7

HA2500 71 42 25 1 51,8

HA2714 68 41 29 1 44,8

HA3288 67 44 24 4 43,8

HA3348 70 35 31 3 54,4

HA3349 58 59 17 5 27,0

HA3373 65 41 29 4 40,0

HA3700 62 39 18 20 46,7

HA3703 61 55 22 1 27,7

HA3878 57 41 26 15 29,7

HA4057 78 40 21 0 71,8

HA4149 63 52 20 4 34,5

ORS16 66 41 27 5 42,9

ORS229 66 45 12 16 56,3

ORS420 63 51 16 9 40,0

ORS510 72 42 22 3 56,7

ORS687 74 34 17 14 78,0

ORS844 68 33 18 20 65,6

ORS878 58 43 25 13 30,0

ORS887 65 44 21 9 43,4

ORS899 58 49 14 18 36,4

ORS1085 62 46 22 9 35,7

ORS1146 58 46 16 19 35,9

ORS1265 56 42 26 15 27,4

A/A: número de individuos homocigotas para el alelo detectado en R285 para cada marcador. a/a: número de individuos homocigotas para el alelo detectado en R023 para cada marcador. A/a: número de individuos heterocigotos para cada marcador. DF: número de datos faltantes. X

2: valores de Chi cuadrado. Nivel de significación (α)= 0,05.

26

Tabla 9. Resultados del análisis de distorsión de las frecuencias alélicas y

genotípicas para 41 marcadores analizados en 180 individuos F2

Marcador Frecuencias alélicas X

2

P Q p=q p2:2pq:q

2

HA140 0,75 0,25 84,50 8,53

HA196 0,74 0,26 80,64 40,36

HA293 0,75 0,25 87,50 26,18

HA360 0,87 0,13 190,96 107,46

HA432 0,71 0,29 63,56 7,17

HA557 0,77 0,23 102,97 7,17

HA790 0,73 0,27 76,85 11,22

HA806 0,74 0,26 76,19 *4,77

HA911 0,68 0,32 43,02 *5,69

HA1108 0,73 0,27 68,18 24,95

HA1155 0,80 0,20 123,86 17,33

HA1848 0,72 0,28 66,57 20,89

HA1938 0,77 0,23 94,44 *1,96

HA2057 0,74 0,26 82,05 18,52

HA2178 0,73 0,27 77,84 6,31

HA2191 0,71 0,29 61,97 19,12

HA2272 0,74 0,26 75,65 7,53

HA2499 0,73 0,27 75,98 18,56

HA2500 0,74 0,26 80,73 23,88

HA2714 0,72 0,28 71,51 32,72

HA3288 0,74 0,26 80,18 21,87

HA3348 0,73 0,27 72,32 44,78

HA3349 0,73 0,27 74,98 *2,83

HA3373 0,72 0,28 66,01 31,24

HA3700 0,77 0,23 90,31 16,47

HA3703 0,72 0,28 71,51 9,64

HA3878 0,72 0,28 62,84 24,60

HA4057 0,77 0,23 102,40 21,78

HA4149 0,74 0,26 80,18 9,70

ORS16 0,73 0,27 73,14 29,08

ORS229 0,79 0,21 110,06 *4,96

ORS420 0,76 0,24 90,57 6,08

ORS510 0,76 0,24 93,57 22,30

ORS687 0,79 0,21 114,05 22,62

ORS844 0,78 0,22 103,51 24,37

ORS878 0,72 0,28 65,58 21,55

ORS887 0,75 0,25 84,50 17,13

ORS899 0,76 0,24 89,20 *4,42

ORS1085 0,74 0,26 76,74 16,05

ORS1146 0,76 0,24 84,05 7,76

ORS1265 0,70 0,30 52,80 17,09

p: alelo detectado en R285. q: alelo detectado en R023. X2: Chi cuadrado. *: Sin

distorsión (α=0,05).

27

6. DISCUSIÓN

Del total de 82 marcadores polimórficos detectados entre los

parentales R285 y R023, sólo se analizó la segregación en 41 de ellos

debido a que en un análisis previo con 20 SSRs se observó que el 100%

de los marcadores presentaron DS (datos no publicados). Para analizar la

causa de la distorsión se realizó la prueba de X2 para las frecuencias

alélicas y genotípicas. Es así que, los resultados obtenidos en este trabajo

mostraron DS significativa (p≤0,05) para ambos tipos de frecuencias en

35 marcadores analizados. Estos resultados sugieren la influencia de la

selección gamética y cigótica simultáneamente. Sin embargo, los

marcadores HA806, HA911, HA1938, HA3349, ORS229 y ORS899 sólo

mostraron DS de las frecuencias alélicas indicando que dicha segregación

estaría influenciada por la selección gamética únicamente. Estos

resultados coinciden con los publicados por Zhao et al. (2006) y Wu et al.

(2007) que analizaron la DS de marcadores SSR en poblaciones F2 de

arroz y algodón, respectivamente. Zhao et al. (2006) analizaron la

segregación de 148 marcadores SSR en 90 líneas de arroz, detectando

que el 50% de los marcadores presentaron DS; la cual resultó significativa

(p≤0,05) en 49 marcadores y muy significativa (p≤0,01) en 25 de ellos. De

los 49 SSRs, 36 se desviaron hacia el parental masculino y 13 hacia el

genotipo heterocigoto. Los marcadores con DS tendieron a agruparse en

regiones coincidentes con loci gametofíticos (ga) y genes de esterilidad

dentro de los GL. Esto también fue publicado por Yan (2003), quien

encontró que los loci ga influyen en la DS detectada en poblaciones F2 de

maíz. Cheng et al. (1996) asumen que la DS en un locus marcador se

debería principalmente al ligamiento de dicho marcador con un locus ga

cercano en el mismo cromosoma; aunque también se han sugerido genes

duplicados, anomalías cromosómicas y fertilización competitiva como

posibles causas de la distorsión. De todos modos, no se ha informado la

presencia de este tipo de loci en girasol. Para este cultivo, sólo se dispone

28

de información en cuanto a la DS asociada a regiones genómicas de

viabilidad del polen en híbridos interespecíficos (Quillet et al., 1995).

En cuanto a la distribución de los alelos en los marcadores

analizados, se observó que las desviaciones de las proporciones

mendelianas se dirigieron hacia el alelo detectado en el parental R285.

Esto también fue observado por Zhang et al. (1997) y Liu et al. (2000)

quienes usando los mismos parentales para construir mapas de

ligamiento genético en soja, encontraron que los marcadores con mayor

DS se desviaron hacia la variedad Changnong4. Estos autores postularon

que la principal razón de DS correspondió a la selección gamética. Esta

explicación fue coincidente con la publicada por Shen et al. (1998) y Yang

et al. (2004) en trabajos de mapeo genético en arroz y maíz,

respectivamente. En concordancia con esta idea, se han informado

desviaciones extremas de la segregación hacia alguno de los parentales

(Prince et al., 1993; Lu et al., 2002) o hacia el heterocigoto (Prince et al.,

1993; Kesseli et al., 1994; Kaló et al., 2000; Song et al., 2005) en

diferentes especies de cultivo. Sin embargo, resulta interesante destacar

que la selección gamética es más común que se evidencie en el parental

donador del polen (Song et al., 2006). No así en esta población de estudio

donde la selección parece actuar en contra del parental femenino.

Es posible también que los errores en la genotipificación de los

marcadores y las mutaciones sitio-específicas originen desviaciones

sistemáticas de las proporciones esperadas de segregación (Sibov et al.,

2003); sin embargo, no serían una justificación aceptable en el contexto

de este trabajo dado que se repitió el análisis por triplicado de todos

aquellos individuos cuyo patrón de amplificación fue dudoso. Además, las

mutaciones en el sitio de amplificación de los SSRs podrían generar

alelos nulos pero esto no explicaría el grado de DS detectado para todos

los marcadores analizados.

29

7. CONCLUSIONES

● De los 30 marcadores SSR estudiados, sólo 21 resultaron

informativos para el análisis de segregación en la población F2

● El 85,4 % de los marcadores SSR analizados presentaron

distorsión de las frecuencias alélicas y genotípicas, lo que sugiere la

influencia de selección gamética y cigótica simultáneamente. Mientras

que los marcadores HA806, HA911, HA1938, HA3349, ORS229 y

ORS899 solo mostraron distorsión de las frecuencias alélicas, esto

sugiere la influencia de selección gamética únicamente.

● La población de mapeo F2 proveniente del cruzamiento entre

R285♂ y R023♀ no cumplió con la premisa de segregación 1:2:1 para

marcadores co-dominantes según la Priemera Ley de Mendel.

30

8. PERSPECTIVAS FUTURAS

En base a los resultados obtenidos en el presente trabajo para la

población F2 segregante analizada, se propone abordar dos estrategias.

Por un lado, la caracterización molecular de nuevos parentales

contrastantes para el carácter en estudio con el objeto de determinar el

cruzamiento más adecuado para la construcción de poblaciones F2

segregantes que permitan acceder a un mapa de ligamiento robusto. Por

otro lado, sería pertinente evaluar otros tipos de poblaciones de mapeo

genético como las líneas endocriadas recombinantes (RIL: Recombinant

Inbred Lines), poblaciones derivadas de retrocruzamientos (BC: Back-

Cross) o las provenientes de cruzamientos recíprocos. Asimismo, también

sería viable el estudio del carácter a través de otras metodologías de

abordaje como el mapeo por asociación, el análisis de mutaciones para

genes concretos relacionados al carácter (TILLING: Targeting Induced

Local Lesions in Genomes) o el uso de chips de ADN (microarrays).

31

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10. ANEXO

Protocolo 1: CUANTIFICACIÓN DE ADN POR FLUOROMETRÍA

a) Preparar la solución de trabajo como se detalla más abajo.

b) Agregar 2 mL de solución en la cubeta de cuantificación,

colocarla en el fluorómetro y ajustar a cero. Repetir este paso

cada vez que se lee una muestra nueva.

c) Remover la cubeta y agregar 2 µL de muestra. Mezclar por

inversión varias veces y colocar en el aparato nuevamente.

Registrar la lectura del equipo y repetir los pasos b y c. Hacer

por lo menos dos lecturas de cada muestra.

d) Descartar la solución de trabajo y enjuagar la cubeta con ddH2O

después de cada lectura.

Soluciones utilizadas:

- Solución de trabajo a utilizar para 20 muestras:

ddH2O 36 mL

Buffer TNE (10X) 4 mL

Hoechst #33528 (1 mg/mL) 4 µL

- Solución Buffer TNE (pH 7,2) para un volumen final de 1 L:

NaCl (1,5 M) 175 g

Tris base (0,5 M) 121 g

EDTA (0,001 M) 0,74 g

Enrazar 1L con ddH2O.

46

Protocolo 2: TINCIÓN CON NITRATO DE PLATA Y

PRETRATAMIENTO CON ÁCIDO NÍTRICO (modificado de Creste et al.

2001)

a) 1º Fijación: 10 min en agitación con solución fijadora.

b) 1º Lavado: 1 min en agitación con agua destilada.

c) Pre-tratamiento: 3 min en agitación con ácido nítrico.

d) 2º Lavado: 1 min en agitación con agua destilada.

e) Tinción: 15 min en agitación con nitrato de plata.

f) 3º Lavado rápido: 10 s en agua destilada.

g) 1º Revelado: con hidróxido de sodio en agitación durante 10 s.

h) 2º Revelado: con carbonato de sodio, en agitación hasta que

aparezcan las bandas.

i) 2º Fijación: 5 min en agitación con solución fijadora.

j) 4º Lavado: 5 min en agitación con agua destilada.

Soluciones utilizadas:

- 1º Solución fijadora:

Etanol absoluto 100 mL

Ácido acético 10 mL

Enrazar 1 L con ddH2O.

- Solución de pretratamiento:

Ácido nítrico 15 mL

Enrazar 1 L con ddH2O.

- Solución de tinción:

Nitrato de plata 2 g

Enrazar 1 L con ddH2O.

- Solución de revelado:

Hidróxido de sodio 15 g / Carbonato de sodio 30 g

Formaldehído 540 µL

Enrazar 1 L con ddH2O.

- 2º Solución fijadora:

Ácido acético 50 mL

Enrazar 1 L con ddH2O.