Page 1
Marcadores MolecularesMarcadores Moleculares
• Introdução e Histórico• Descrição de Marcadores• Comparação entre Marcadores
Moleculares • Classificação de Marcadores
Moleculares• Características do Genoma de
Planta• Aplicações
– diversidade genética– mapeamento e seleção assistida
Page 2
INTRODUÇÃO E HISTÓRICOINTRODUÇÃO E HISTÓRICO
Marcadores MolecularesMarcadores Moleculares
Page 3
Genética• “arte” e seleção inconsciente
– da invenção da agricultura até séc. XIX
• 1900s - Descoberta dos princípios genéticos
• 1920-50 - Melhoramento genético científico– genética quantitativa e biometria– (fenótipo é previsor ruim do valor genético!)
• 1970-80 - Utilização de marcadores genéticos moleculares
Page 4
• Sucesso no melhoramento depende da capacidade de distinguir fatores genéticos herdáveis dos ambientais
• Marcadores genéticos são unidades herdáveis simples
marcadorescromossoma
Page 5
• Polimorfismo de DNA resulta acúmulo de mutações– pontual ou inserção/deleção– macro-rearranjos: translocações,
inversões, deleções
Page 6
1. Mutações pontuais - SNPsA. ATCTCGTGATTCCTAGTCGTA
TAGAGCACTAAGGGATCAGCAT ex. Sítio EcoRI
B. ATCTCGTGATTATAGTCGTATAGAGCACTAATATCAGCAT
2. Pequenas deleções e/ou inserções - InDelsA. ATCTCGTCTAGTCGTA
TAGAGCAGATCAGCAT
B. ATCTCGT---GTCGTATAGAGCA---CAGCAT
Origem do Polimorfismo Origem do Polimorfismo MolecularMolecular
Page 7
Histórico de MarcadoresHistórico de Marcadores
1. Karl Sax (1923): propôs método para localização de QTLsligação entre genes de característica qualitativa (cor de semente) e quantitativa (peso de semente);
Problema: ausência de mutações múltiplas em estoque de elite, baixa viabilidade
2. Hunter & Markert (1957) - marcas bioquímicasdesenvolveram isoenzimas em gel de amido
Page 8
Histórico de MarcadoresHistórico de Marcadores
3. Hubby & Lewotin (1966)demonstraram que 30% de loci de isoenzimas exibiam polimorfismo em populações selvagens de Drosophila;
4. 1970’s - ferramentas molecularesdesenvolvimento de vetores de clonagem; enzimas de restrição; polimerases; ligases; Southern (1977);
Page 9
Histórico de MarcadoresHistórico de Marcadores
5. RFLP proposto por Botstein et al. (1980)descrito para humanos
6. PCR proposto por Mullis & Faloona (1987)
7. VNTR por Jeffrey (1987)
8. RAPD por Rafalski et al. (1990)
Page 10
Histórico de MarcadoresHistórico de Marcadores
9. SSR em plantas por Akkaya et al. (1992)
10. AFLP por Zabeau & Vos (1993)
11. CAPS por Konieczny & Ausubel (1993)
12. SCAR por Paran & Michelmore (1993)
13. Cho et al. (1999) - SNPs em Arabidopsis
Page 11
DESCRIÇÃO DOS MARCADORES MOLECULARES
Page 12
Marcadores Moleculares
• RFLP• VNTR (minissatélite)• RAPD, AP-PCR, DAF• PCR-específico - SSR, ISSR, CAPS,
SCARs• AFLP• SNPs
Page 13
Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP
• RFLP examina diferença em tamanho de fragmentos de restrição de DNA específicos
• Polimorfismo deriva de mutação pontual, inserção, deleção
• Utiliza-se DNA celular total• Requer DNA puro de alto peso
molecular
Page 14
Metodologia de RFLP
1 . Digerir DNA em fragmentos pequenos2. Separação dos fragmentos por gel
eletroforese3. Transferência de fragmentos de DNA
para filtro
Fonte: IPGRI
Page 15
Metodologia de RFLP
4. Visualização dos fragmentos de DNA– sondas marcadas (32P) ou a frio
5. Análise dos resultados– bandas analisadas para alelos e/ou
presença/ausência– diferenças em padrão de bandas reflete
diferenças genéticas
A escolha de sonda/enzima de restrição é crucial
Fonte: IPGRI
Page 16
digestão
1
1
52
34
2
5
43
DNA
Digestão de DNA Genômico e Separação em Gel
Separaçãoem gel
Page 17
Transferência para Membrana de Nylon ou Nitrocelulose
1
2
3
4
5
Page 18
Hibridização em Nylon ou Nitrocelulose
Page 19
Construção de biblioteca genômica ou de cDNA
mRNA ouDNA
cDNA
Clone cDNA Biblioteca de cDNA
Page 21
Hibridização com sonda marcada Exposição em filme de Raios-
X
Page 22
Interpretação de resultados
1
2
3
4
5
6
1 2 3 4 5 6
Sítio alvo para sonda
Sítio de restrição
Inserção
Fonte: IPGRI
Page 23
Sorgo Cana
RFLP em Cana de Açúcar
Page 24
HibridizaçãHibridização com o com
sonda de sonda de sorgosorgo
P1 P1 P2P2
1:1
3:1
Page 25
Hibridização Hibridização com sonda com sonda
de Canade Cana
1:1
3:1
Page 26
6 Kb
AHerança de RFLPs
8 Kb
B
6 Kb
F1
8 Kb
6 Kb 6 Kb
8 Kb
6 Kb
8 Kb 8 Kb
F2
Page 27
13
8
2
56
Análise de Diversidade e Filogenia por RFLP
13 5 6 2 8
11
9
A B C
4
A B C
Page 28
RFLP: sondas de locos único
• DNA Nuclear– biblioteca genômica– biblioteca de cDNA
• DNA Citoplasmático– biblioteca de DNA cloroplástico e
mitocondrial
• Sondas de RFLP são:– locos-específica, co-dominante– espécie-específica
Page 29
RFLP: sondas multi-locus
• Repetições em linha (tandem) - útil– encontrada em vários loci– altamente polimórficas
• Sequência de Minissatélite– VNTR: variable number of tandem
repeats– uso em “DNA fingerprinting”– uso de seqüências repetidas de fago
M13
Page 30
Interpretação dos resultados
A1A1
A1A2
A2A3
A1A1
A1A2
A2A3
Repetição
Sítio de Restrição
Fonte: IPGRI
Page 31
Vantagens e Desvantagens de RFLP
• Reprodutível• Marcadores co-dominantes• Simples
• Trabalhoso• Caro• Uso de sondas radioativas*
Fonte: IPGRI
Page 32
Random Amplification of Polymorphic DNA - RAPD
• Amplifica seqüências anônimas de DNA usando primers arbitrários– 10 bases com >50% G+C
• PCR com um único primer• Método rápido para detecção de
polimorfismos• Marcador dominante• Problemas de reproducibilidade
Page 33
RAPD
AA
Aa
aa
AA Aa aa
Page 34
Interpretação de RAPDs• Marcadores RAPD são anônimos• Dados binários (presença x ausência)• RAPD são dominantes (AA = Aa)• Problemas de co-migração
– mesma banda, mesmo fragmento?– uma banda, um fragmento?
• Questionamento para filogenia– banda homólogas?
Page 35
PCR com primers arbitrários:
acúmulo de siglas!• RAPD
– Random Amplified Polymorphic DNA
• DAF– DNA Amplification Fingerprinting
• AP-PCR– Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction
• MAAP– Multiple Arbitrary Amplicon Profiling (sugerido por
incluir todas as pequenas variações na técnica)
Fonte: IPGRI
Page 36
Diferenças entre ensaios com primers arbitrários
• RAPD– 10mers, gel de agarose corado com
brometo
• DAF– 5mers, gel de acrilamida e reação marcada
32P
• AP-PCR– 10mers, gel de acrilamida e reação
marcada 32P
Page 37
RAPD - resumo
• Rápido• Simples• Baixo custo• Sem uso de radio-isótopos
• Marcador dominante• Problemas de reproducibilidade• Problemas de interpretação
Fonte: IPGRI
Page 38
RAPD - primer OPJ04 - Bananeira
1500 pb
Page 39
RAPD - Feijoeiro
OPAM13
OPY04
Page 40
Sítio de Seqüência Dirigida(Sequence-tagged sites)
• Sequence-Tagged Microssatélites (STMS) ou SSR ou Microssatélites
• Microssatélites ancorados– Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR)
• Sequence-characterized amplified regions (SCARs)
• Cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) – PCR-RFLP
Fonte: IPGRI
Page 41
Microssatélites (SSR)
• Sequence-Tagged Microsatélites (STMS)– também conhecido como microssatélite
ou Simple Sequence Repeat (SSR)
• Normalmente locus simples e multi-alélico
• Co-dominante• Altamente reprodutível
Page 42
Microssatélites
• STMS ou SSRs– Seqüências curtas (1 a 6 bases)
repetidas em tandem – Presentes em procariotos e eucariotos– Presentes em regiões codificantes e não
codificantes– Maioria das repetições são
dinucleotídeos • (AC) n (AG) n (AT)n
Page 43
• Polimorfismo devido a diferenças no número de repetições– Escorregamento da DNA polimerase durante a
replicação– Crossing-over desigual entre cromátides irmãs
• Codominantes• Normalmente locos simples e multi-alélico
Microssatélites
Page 44
Microssatélites (SSR)
• altamente informativo - vários alelos por locos
• detecção por PCR• facilmente transferível entre labs• distribuição homogênea no genoma
Page 45
Microssatélites (SSR)
ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAA CAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA
TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT
CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC
CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACACACACACACACACAC NNNNNNNNN NNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNNNN
Primer REV
Primer FOR
Repetição CA
Page 46
Microssatélites (SSR)
Obtenção de seqüências:• a partir de banco de dados de genoma ou
cDNA• hibridação com biblioteca genômica,
identificação de clones e seqüenciamento• construção de biblioteca enriquecida por
afinidade com seqüência da matriz
Page 47
• Detecção do polimorfismo– Géis de agarose– Géis de acrilamida (detecta diferenças de
até 2pb)• coloração direta: nitrato de prata (barato)• Coloração indireta: marcação radioativa ou
fluorescente
Microssatélites
Page 48
• Problemas– Custo e trabalho envolvidos no
desenvolvimento dos primers• Construção de bibliotecas genômica• sequenciamento • Triagem dos melhores primers
Possibilidade de se usar seqüências depositadas em banco de dados
EST – SSR funcional x SSR genômico
Microssatélites
Page 49
Microssatélites (SSR)
ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAA CAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA
TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT
CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC
CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACACACACACACACACAC NNNNNNNNN NNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNNNN
Primer REV
Primer FOR
Repetição CA
Page 50
Nicotiana tabacum
DNA genômico total
Seqüência microssatélite
Adaptadores
Sonda biotinilada
Bolinha magnética-estratividina
ssDNA
ssDNA
Coluna
Digestão
Ligação Adaptadore
s
Amplificação
Enriquecimento e Seleção
Amplificação após
enriquecimento
Page 51
Enriquecimento e Seleção
Coluna Magnéti
ca
Temperatura ambiente / 20 min
ssDNA
Sonda biotinilada
Biotina IIIII(CT)8ou
Biotina IIIII(GT)8
95°C / 15 min
água
Page 52
Dna TotalDigestãocom RsaI Amplificação
Amplificação apósenriquecimento
Ligação comadaptadores
Nicotiana ripandaN. sylvestrisN. tabacum “Coker 176”N. tabacum “Ky 14 RMI”
Page 53
Vetor
Clonagem
PCR
Sequenciamento
Desenho de primers
Transferência e Southern blot
Transformação e Seleção
Meio LB + amp + X-gal + IPTG
Page 54
N. sylvestris
N. tabacum “Coker 176”
Até 24/02/05 Todas as placas foram testadas
Page 55
Microssatélites (SSR)
Southern blot - clones SSR’s positivos 32P
Amplificação insertos clonados
Page 56
Microssatélites (SSR)
(TC)15(AG)14
Page 57
>ZZFIGCO001g_A04_.g_033_Rome.ab1 CHROMAT_FILE: CGATTGGGCCGACGTCCATGCTCCGGNNCGCATGTCGGCCGCGGGAATTCGATTCTCTTGCTTACGCGTGGACTAGCTTACAATAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGTTTTGGCTGATGCCTTATCTCAAAAGAAGAAACGACCCTATATATAGAAAAGAAAAAAACAGAAAGAATCTATGCACAGTAAAGTAGGTCCCATATGTGGGTCCCTTATACAGTGTATTTACTGTGTATACAATATTTCTACTATATAAACAATGTATCTACTGTTGAGTGGGTCGGCGGCCTCACTGTTGATCATATTCCACGTCTCTCTAATTCTTTCATCTGTTGGATGAAATCTTCCGCATTTTCTACAGCTTCGTCAGATAATATCTTCTCCGATTGAATAGGCTGAGAATCTTCTGCAATATCATCGTTGCTTGTTTCACTTCGCATTAAAGTGTCAGATTTTTCATACTGGTTAATAGATTGAAGTAAGTTTCTTTTTACTTCTTCCAAATACTTATTAATCAATTTCTATAAGATAAACATATAAGTTCAGATCCAGGCACATAATTATAACCATGCGTTTTCACACGTATTTGTCAAAATAAGTCTGCATTTCTCACTTCTTTTTCCTGGTTAAGACCCGTTATACCCTCCAATTATACTTGGAACACCTTTTATCGGCGCTATTTATCCTTTTACTAGCATAGATTCTAAAGGATTTACCACAACTTATAAAAATAAAAGAATAGGTTATACCTTTGTTACCGATCCCGTAACTAGGGGATATAATGGCTTTATTAGATATAAATCCAAAATATATT
(AG)30
Page 58
MicrossatélitesBananeira 3x e 4x
Cir 24.25
Page 59
Microssatélites
Seta: alelos genoma B
Page 60
Microssatélites Ancorados ISSR
• Amplificação de segmentos genômicos flanqueados por repetições
• Anelamento locos-específico• Inter-simple sequence repeats (ISSR)
– ancorados na extremidade 3’ ou 5’
• Marcadores dominantes
Microssatélites mais úteis que minissatélites
Page 61
Microssatélites Ancorados ISSR
NNNNNNNNN CACACACACACACAC NNNNNNNNNNNN CACACACACACACAC NNNNN
NNNNNNNNNGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTG NNNNN
(CA) n NN
(CA) n NNNNNNN (CA) n
NNNNN (CA) n
Repetição CA
ISSR5’ ou 3’ancorado
Page 62
ISSRUBC 811 UBC 816
Nanicão Jangada ControlVariante
Anão N A
Page 63
SCARs• SCARs - sequence-characterised
amplified regions– proposto por Paran & Michelmore (1993)– marcador locus-único derivado de
fragmentos sequenciados de RAPD, ISSR, AFLP
– maior estabilidade - primers específicos– analisado para presença/ausência– possibilidade de simplificação de análise e
automação
Page 64
SCARsR
*
S
clonar
ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAA CAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA
TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT
CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC
CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG
Primer específico Seqüenciar
Page 65
SCAR - FeijoeiroROC20460
Page 66
CAPS ou PCR-RFLP
• CAPS - cleaved amplified polymorphic sequence – marcador locus-específico– produto amplificado por PCR e
analisado por RFLP– seqüência de banco de dados, clones
de cDNA ou genômico– codominante
Page 67
CAPS
ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAA CAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA
TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT
CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC
CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG
A B
Locus Seqüenciado - primers específicos
A B
PCR específico
Digestão com Enzimas Corte
freqüente
A B A B
1
2
locus
Enzimas de RestriçãoAluI HaeIII MboI
Page 70
Amplified Fragment Length Polymorphism - AFLP
• Combinação de RFLP e PCR• Resulta em padrões muito
informativos• Marcador dominante• Método cada vez mais usado
Page 71
DNA genômico digestão com duas enzimas
adaptadores
EcoRIMseI
pré-amplificação
amplificação seletiva
ligação
MseI
EcoRI
Page 72
GAATTCCNCTTAAGCN
NTTAANAATT
ATTCCNGCN
NTNAAT
DNA
digestãoEcoRI MseI
ATTCCNGCN
NTN ATTAAligação
TA
ATTCCNTAAGCN
NTTANAAT
pré-amplificaçãoprimer +1
A
C
amplificaçãoprimer +3
ATTCCATAAGCT
GTTACAAT
AAC
AAC
Page 74
AFLP de cana com 33P
Page 75
AFLP de feijãogel desnaturante corado com
prata
Page 76
Marcadores derivados de Retrotransposons
Page 77
COMPARAÇÃO ENTRE MARCADORES MOLECULARES
Page 78
Escolha de MarcadoresCaracterística RFLP RAPD SSR AFLP ISSR CAPS Polimorfismo Pontual Pontual # Pontual Pontual Pontual
InDel InDel Rep. InDel InDel InDel Nível dePolimorfismo médio médio alto médio médio baixo
Abundância alta m.alta média m.alta média alta
Dominância CoDom Dom CoDom Dom Dom CoDom
[DNA] 10 g 25 ng 50 ng 500 ng 25 ng 25 ng
Seqüência não não sim não não sim
Marcação sim/não não não sim/não não não Repetibilidade alta baixa alta média baixa alta
Page 79
CLASSIFICAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES
Page 80
Classificação por Tipo de Técnica
• Métodos sem uso de PCR• RFLP• VNTR
• Métodos com uso de PCR– PCR com primers arbitrários
• RAPD, AP-PCR, DAF, MAAP;• Polimorfismo de Tamanho de Fragmento Amplificado AFLP;• ISSR
– PCR sítio-específico• CAPS, SCAR• SSRs (microssatélites)• TGGE, SSCP, DGGE
Page 81
Classificação por Número de Cópias da Seqüência Alvo
• Seqüência de poucas cópias - codificante• RFLP
• Seqüência com cópias repetidas• VNTR• SSRs (microssatélites) • ISSR
• Seqüência com número de cópias indefinido • RAPD, AP-PCR, DAF, MAAP;• AFLP;• CAPS, SCAR