Manual de Instruções para Análise por LC-MS/MS MassChrom ® Amino acids and acylcarnitines from dried blood/derivatized Reagente diagnóstico para determinação semi-quantitativa in vitro de Aminoácidos e Acilcarnitinas em sangue seco por LC-MS/MS/derivatizado Somente para uso em diagnóstico in vitro Artigo 55000
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Amino acids and acylcarnitines from dried blood/derivatized · 2019-05-27 · A tirosinemia tipo 1 leva ao acúmulo de metabólitos tóxicos (especialmente succinilacetona) resultando
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Manual de Instruções para Análise por LC-MS/MS
MassChrom®
Amino acids and acylcarnitines
from dried blood/derivatized Reagente diagnóstico para determinação semi-quantitativa
in vitro de Aminoácidos e Acilcarnitinas em sangue seco
por LC-MS/MS/derivatizado
Somente para uso em diagnóstico in vitro
Artigo 55000
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1 Informações para requisição ...................................................................................... 4
2 Introdução ....................................................................................................................... 6 2.1 .... Informações Gerais ............................................................................................. 6 2.2 .... Uso pretendido .................................................................................................... 7 2.3 .... Príncipio do kit de reagentes ............................................................................ 7
3 Sistema LC-MS/MS .......................................................................................................... 9 3.1 .... Parâmetros do equipamento ........................................................................... 9 3.2 .... Métodos de medição MS/MS ......................................................................... 11 3.3 .... Otimizando os MRMs assim como os experimentos de Perda Neutra e
4 Transições de massa dos analitos e padrões internos .......................................... 14
5 Preparo da amostra .................................................................................................... 17 5.1 .... Coleta e armazenamento das amostras de pacientes ............................ 17 5.2 .... Reconstituição do padrão interno ................................................................ 18 5.3 .... Manuseio dos controles ................................................................................... 18 5.4 .... Procedimento de preparo das amostras ..................................................... 19
5.4.1 .... Preparo da amostra sem placa filtrante - somente para
amino ácidos e acilcarnitinas ........................................................... 19 5.4.2 .... Preparo da amostra com placa filtrante - somente para
amino ácidos e acilcarnitinas ........................................................... 20 5.4.3 .... Preparo da amostra incluindo succinilacetona ............................ 21
5.5 .... Estabilidade das amostras ............................................................................... 22
6 Materiais requeridos, mas não fornecidos .............................................................. 22
7 Resultados e avaliação .............................................................................................. 22
8 Controle de Qualidade .............................................................................................. 23
9 Valores de Cut-off / referência ................................................................................. 23
10 Fatores de conversão ................................................................................................. 25
11 Armazenamento e estabilidade dos reagentes ................................................... 26
12 Descarte de Resíduos .................................................................................................. 27
13 Exemplos de espectros de massa ............................................................................ 28
Caso o sistema HPLC seja incapaz de manter um fluxo constante de 20 µL/min, o método pode
ser realizado alternativamente com um fluxo constante de 100 a 150 µL/min. Contudo, o fluxo
constante causa redução da sensibilidade.
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Figura 4: Cromatograma usando um gradiente de fluxo otimizado
Figura 5: Cromatograma resultante de um fluxo de gradiente NÂO otimizado
Nota:
Use somente o gradiente de fluxo otimizado. O uso de um gradiente de fluxo não otimizado irá
deteriorar a performance do kit de reagentes.
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8
Inte
nsi
tät,
cp
s
1,0e7
0,0
2,0e7
3,0e7
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5,0e7
6,0e7
7,0e7
Zeit, min
0,0
0,33
0,86
0,4 0,2 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 0
5,0e7
4,0e7
3,0e7
2,0e7
2,0e7
6,0e7
0
Zeit, min
Inte
nsi
tät.
cp
s
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3.2 Métodos de medição MS/MS
Fundamentos do método de medição:
Em um espectrômetro de massa as moléculas são analisadas por sua relação massa e carga
(m/z). Para isso, as moléculas devem ser ionizadas. Na tecnologia LC-MS, a ionização por eletro
nebulização ou electrospray tem demonstrado ser um método brando de geração de íons
moleculares.
O espectrômetro de massa em tandem (MS/MS) contém dois espectrômetros de massa
conectados em série. No primeiro espectrômetro (MS 1), os íons são separados por sua relação
massa e carga. Em seguida, os íons atingem uma célula de colisão, onde são dissociados em
fragmentos induzidos pela colisão com um gás inerte (argônio ou nitrogênio). Logo depois, o
segundo espectrômetro (MS 2) analisa a fragmentação característica, outra vez pela relação
m/z.
Na tecnologia MS/MS, vários métodos de medição têm se mostrado confiáveis para diferentes
padrões de fragmentação.
Varredura de Perdas Neutras (Neutral Loss Scan):
Muitos aminoácidos butilados fragmentam na célula de colisão pela perda do ácido fórmico,
com massa de 102 Daltons (ver figura 6). Durante a determinação dos aminoácidos no modo de
varredura de Perdas Neutras, o primeiro e o segundo espectrômetros de massa estão varrendo
num intervalo de 102 unidades de massa. Isso gera um espectro de massa seletivo para muitos
aminoácidos neutros e ácidos.
Figura 6: Fragmentação do íon do éster butírico de fenilalanina pela eliminação do éster butírico de ácido fórmico (Neutral Loss 102).
Entretanto, nem todos os aminoácidos podem ser detectados por esse modo de varredura. Os
aminoácidos citrulina e ornitina, por exemplo, perdem amônia em adição ao ácido fórmico,
logo, esses aminoácidos devem ser detectados com uma varredura de Perdas Neutras de 119
(102 + 17). Por outro lado, a glicina deve ser analisada com varredura de Perdas Neutras de 56 e
arginina em modo 161.
Nós recomendamos que todos os aminoácidos que não possam ser detectados em varredura
de Perdas Neutras 102, sejam quantificados no modo Monitoramento de Reações Múltiplas
(MRM).
Monitoramento de Reações Múltiplas (MRM):
No modo MRM, os dois espectrômetros de massa estão estaticamente ajustados para um valor
de massa específico. O MS 1 seleciona a molécula ionizada de interesse, descartando íons com
massas diferentes. Após a fragmentação da molécula na célula de colisão, o MS 2 detecta o
O
O
NH3+
O
O
NH2+
+
222 (m/z) 120 (m/z) Neutral Loss 102
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fragmento característico gerado. O modo MRM garante tanto maior seletividade quanto alta
sensibilidade.
Basicamente, todos os analitos podem ser detectados no modo MRM. Sua desvantagem é o
tempo consumido na otimização do sistema MS/MS para cada transição de massa.
Varredura do Íon Precursor (Parent Ion Scan):
As acilcarnitinas butiladas formam um fragmento iônico característico de m/z = 85 na célula de
colisão (ver figura 7). Durante a determinação de acilcarnitinas e carnitina livre na varredura do
Íon Precursor, o MS 2 está estaticamente ajustado para m/z = 85, enquanto o MS 1 realiza
varredura das moléculas ionizadas que deram origem ao fragmento. Isto gera um espectro de
massa muito seletivo para as acilcarnitinas.
Figura 7: Fragmentação de acilcarnitinas butiladas pela perda de fragmento iônico característico m/z = 85 R = cadeia alquílica (p. ex.: R = CH3 para acetilcarnitina)
3.3 Otimizando os MRMs assim como os experimentos de Perda
Neutra e Varredura do Íon Precursor (tuning)
É altamente recomendado verificar a acurácia e a resolução de massa do sistema MS/MS. Se a
acurácia e a resolução de massa estiverem fora das especificações do fabricante do
instrumento, uma nova calibração do espectrômetro de massa é recomendada. A seguir, as
transições MRM do analito assim como experimentos de Perda Neutra e Varredura do Íon
Precursor devem ser ajustados como abaixo:
Otimizando os MRMs:
1. Dilua o Tuning Mix (artigo 55099, 55098) com Fase Móvel (artigo 55001) como apropriado
para o dispositivo específico
2. Injete o Tuning Mix diluído ou infuse diretamente pela bomba de seringa (fluxo de 0,02
ml/min)
3. Use o Scan Q1 (MS Scan) para determinar as posições exatas do sinal máximo das massas
em MS1 (precursor/íon pai) (pelo menos um decimal)
4. Determine as posições exatas do sinal máximo das massas em MS2 (produto/íon filho) pela
varredura do íon produto
5. Otimize os parâmetros individuais para cada transição MRM (ex. energia de colisão)
6. Use as transições MRM otimizadas para otimizar a fonte de íon, especialmente a voltagem
do capilar, a temperatura, e os fluxos de gases.
Varredura do Íon Precursor:
1. Dilua o Tuning Mix (artigo 55099) com Fase Móvel (artigo 55001) como apropriado para o
dispositivo específico
(CH3)3N+
O
O
R
OO
R
O
OH
C4H8N(CH3)3 + ++ H2C+
CH CH
O
OH
Fragment-Ion m/z = 85
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2. Injete o Tuning Mix diluído ou infuse diretamente pela bomba de seringa (fluxo de 0,02
ml/min)
3. Use o Scan Q1 (MS Scan) para determinar as posições exatas do sinal máximo das massas
em MS1 (precursor/íon pai), por exemplo da carnitina (m/z 218) (pelo menos um decimal)
4. Use a varredura do íon produto para determinar a posição exata do sinal máximo do
fragmento característico de acilcarnitinas (m/z 85) (pelo menos uma casa decimal)
5. Programe o experimento de varredura do íon precursor de forma que a faixa de medição
desejada (ex. m/z 200 a m/z 500) seja coberta. Use o valor determinado no ponto 4 como
massa MS2.
6. É recomendado determinar os parâmetros individuais (ex. energia de colisão) para analitos
com baixa intensidade na varredura em um experimento separado de MRM (veja acima).
Use estes parâmetros como configurações globais de toda a varredura do íon precursor.
Alternativamente, também é possível, dependendo do instrumento, armazenar faixas de
parâmetros individuais ao invés de valores globais.
Varredura de Perda Neutra:
1. Dilua o Tuning Mix (artigo 55099) com Fase Móvel (artigo 55001) como apropriado para o
dispositivo específico.
2. Injete o Tuning Mix diluído ou infuse diretamente pela bomba de seringa (fluxo de 0,02
ml/min)
3. Programe o experimento de varredura de perda neutra de forma que a faixa de medição
desejada (ex. m/z 140 a m/z 270) seja coberta. Para o valor de perda neutra armazene 102
amu (igual a clivagem do formato de butil) no experimento
4. É recomendado determinar os parâmetros individuais (ex. energia de colisão) para analitos
com baixa intensidade na varredura em um experimento separado de MRM (veja acima).
Use estes parâmetros como configurações globais de toda a varredura de perda neutra.
Alternativamente, também é possível, dependendo do instrumento, armazenar faixas de
parâmetros individuais ao invés de valores globais.
É recomendado ler o manual de operações do sistema LC-MS/MS. Para quaisquer dúvidas
contate o fabricante do instrumento. Um treinamento fornecido pelo fabricante pode ser
requerido conforme necessidade.
3.4 Procedimento inicial
Antes de iniciar uma análise prepare o sistema LC-MS/MS como descrito a seguir:
1. Antes de iniciar uma sequência analítica, as bombas de vácuo do sistema MS/MS devem
estar em operação por no mínimo 8 horas.
2. Limpe o sistema com aproximadamente 10 mL de fase móvel em fluxo de 200 µL/min.
3. Injete repetidamente os controles preparados, até que dois espectros de massa sucessivos
apresentem valores de concentração e intensidade de sinal bem próximos.
4. A corrida analítica pode ser iniciada.
Para o uso apropriado do seu sistema LC-MS/MS, leia o manual do equipamento. Em caso de
quaisquer dúvidas, solicite ao fabricante do dispositivo. Um treinamento no uso do equipamento
com seu fabricante pode ser requerido.
3.5 Desligando o equipamento (Shut down)
Para pausar a operação, desligue a bomba do HPLC e deixe a Fase Móvel no sistema de HPLC.
É improvável que cristais de sal se acumulem nos selos do pistão das bombas de HPLC. As
bombas de vácuo do sistema LC-MS/MS devem permanecer operando o tempo todo. Para
proteger fonte de ionização e a multiplicadora, o sistema MS/MS deverá ser colocado no modo
de repouso (stand-by). Deixe as bombas de vácua do sistema LC-MS/MS ligadas.
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4 Transições de massa dos analitos e padrões internos
As tabelas que seguem mostram as transições de massa recomendadas e os métodos de
medição dos analitos derivatizados (butilados) e padrões internos isotopicamente marcados.
Tabela 2: Transições de massa recomendadas, aminoácidos e metabólito da tirosina (SUAC)
Substância Método de medição Transição de massa
Alanina Neutral Loss Scan 102 146 → 44
Alanina-D4 Neutral Loss Scan 102 150 → 48
Ácido Aspártico Neutral Loss Scan 102 246 → 144
Ácido Aspártico-D3 Neutral Loss Scan 102 249 → 147
Ácido Glutâmico Neutral Loss Scan 102 260 → 158
Ácido Glutâmico-D5 Neutral Loss Scan 102 265 → 163
Leucina Neutral Loss Scan 102 188 → 86
Leucina-D3 Neutral Loss Scan 102 191 → 89
Metionina Neutral Loss Scan 102 206 → 104
Metionina-D3 Neutral Loss Scan 102 209 → 107
Fenilalanina Neutral Loss Scan 102 222 → 120
Fenilalanina-D5 Neutral Loss Scan 102 227 → 125
Tirosina Neutral Loss Scan 102 238 → 136
Tirosina-D4 Neutral Loss Scan 102 242 → 140
Valina Neutral Loss Scan 102 174 → 72
Valina-D8 Neutral Loss Scan 102 182 → 80
Arginina MRM 231 → 70
Arginina-D7 MRM 238 → 77
Citrulina MRM 232 → 113
Citrulina-D2 MRM 234 → 115
Glicina MRM 132 → 76
Glicina-¹³C2-¹5N MRM 135 → 79
Ornitina MRM 189 → 70
Ornitina-D6 MRM 195 → 76
Prolina MRM 172 → 116
Prolina-D7 MRM 179 → 123
Succinilacetona MRM 211 → 109
Succinilacetona-¹³C5 MRM 216 → 114
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Tabela 3: Transições de massa recomendadas, acilcarnitinas e carnitina livre
Substância Método de medição Transição de massa
Carnitina Parent Ion Scan 85 218 → 85
Carnitina-D9 Parent Ion Scan 85 227 → 85
C2-Carnitina Parent Ion Scan 85 260 → 85
C2-Carnitina-D3 Parent Ion Scan 85 263 → 85
C3-Carnitina Parent Ion Scan 85 274 → 85
C3-Carnitina-D3 Parent Ion Scan 85 277 → 85
C4-Carnitina Parent Ion Scan 85 288 → 85
C4-Carnitina-D3 Parent Ion Scan 85 291 → 85
C5-Carnitina Parent Ion Scan 85 302 → 85
C5-Carnitina-D9 Parent Ion Scan 85 311 → 85
C5DC-Carnitina Parent Ion Scan 85 388 → 85
C5DC-Carnitina-D6 Parent Ion Scan 85 394 → 85
C6-Carnitina Parent Ion Scan 85 316 → 85
C6-Carnitina-D3 Parent Ion Scan 85 319 → 85
C8-Carnitina Parent Ion Scan 85 344 → 85
C8-Carnitina-D3 Parent Ion Scan 85 347 → 85
C10-Carnitina Parent Ion Scan 85 372 → 85
C10-Carnitina-D3 Parent Ion Scan 85 375 → 85
C12-Carnitina Parent Ion Scan 85 400 → 85
C12-Carnitina-D3 Parent Ion Scan 85 403 → 85
C14-Carnitina Parent Ion Scan 85 428 → 85
C14-Carnitina-D3 Parent Ion Scan 85 431 → 85
C16-Carnitina Parent Ion Scan 85 456 → 85
C16-Carnitina-D3 Parent Ion Scan 85 459 → 85
C18-Carnitina Parent Ion Scan 85 484 → 85
C18-Carnitina-D3 Parent Ion Scan 85 487 → 85
As massas apresentadas são um ponto inicial para otimizações. A posição exata do sinal de
máxima intensidade pode variar para cada sistema MS e tem que ser determinada pelo tuning
(pelo menos uma posição após o ponto decimal), utilizando a Mistura para Tuning (ordem no.
55099 e 55098), que contém todos os analitos e padrões internos.
A quantificação dos analitos é feita pela comparação da intensidade do sinal com o padrão
interno isotopicamente marcado correspondente. Várias acilcarnitinas de interesse diagnóstico,
para as quais os padrões internos isotopicamente marcados ainda não estão disponíveis,
também podem ser medidas com este kit, através da comparação do sinal com padrões
deuterados que apresentem o mesmo comprimento de cadeia. Acilcarnitinas com
comprimento de cadeia igual mostram aproximadamente o mesmo fator de resposta.
Entretanto, este kit é validado somente para aqueles analitos com padrões internos deuterados
disponíveis, descritos na tabela acima.
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A tabela seguinte mostra algumas acilcarnitinas adicionais, com seus respectivos valores de
transição de massa e padrões internos isotopicamente marcados recomendados. Tais
informações são apenas uma sugestão, representando a prática corrente de muitos laboratórios
de triagem. O kit de reagentes Chromsystems não é validado para esses analitos.
Tabela 4: Acilcarnitinas adicionais sem padrão interno explícito
Substância Transição de massa Padrões internos recomendados
C3DC-Carnitina 360 → 85 C3-Carnitina-D3
C4OH-Carnitina 304 → 85 C4-Carnitina-D3
C4DC-Carnitina 374 → 85 C4-Carnitina-D3
C5:1-Carnitina 300 → 85 C5-Carnitina-D9
C5OH-Carnitina 318 → 85 C5-Carnitina-D9
C8:1-Carnitina 342 → 85 C8-Carnitina-D3
C10:1-Carnitina 370 → 85 C10-Carnitina-D3
C14:2-Carnitina 424 → 85 C14-Carnitina-D3
C14:1-Carnitina 426 → 85 C14-Carnitina-D3
C14OH-Carnitina 444 → 85 C14-Carnitina-D3
C16:1-Carnitina 454 → 85 C16-Carnitina-D3
C16:1OH-Carnitina 470 → 85 C16-Carnitina-D3
C16OH-Carnitina 472 → 85 C16-Carnitina-D3
C18:1-Carnitina 482 → 85 C18-Carnitina-D3
C18:2OH-Carnitina 496 → 85 C18-Carnitina-D3
C18:1OH-Carnitina 498 → 85 C18-Carnitina-D3
C18OH-Carnitina 500 → 85 C18-Carnitina-D3
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5 Preparo da amostra
Atenção: Ao utilizar os reagentes, favor verificar as informações de segurança contidas no
Apêndice I.
5.1 Coleta e armazenamento das amostras de pacientes
Para a coleta e armazenamento de amostras de pacientes, diferentes recomendações estão
disponíveis para países diferentes. A aderência a regulações nacionais é extremamente
recomendada. Por exemplo, na Alemanha, a coleta de sangue para a triagem neonatal deve
ser feita entre 48 e 72 horas após o nascimento (ver “Kinder Richtlinie”), enquanto, de acordo
com o Guia NBS01-A6, 2013 do CLSI, “é preferível para a triagem que a amostra seja coletada
após 24 horas do nascimento”.
O sangue é gotejado em um papel de filtro e seco. É recomendado o uso de papel de filtro
aprovado pelo FDA ou equivalente (ex. Whatman 903). A amostra de sangue deve ser coletada
do calcanhar do recém-nascido. Amostras com EDTA ou heparina não devem ser utilizadas pois
podem levar a resultados falso-negativos ou falso-positivos.
Descrição resumida das etapas da coleta:
1. Limpe a área do calcanhar do recém-nascido destinada à punção com antisséptico. Seque
o calcanhar com cotonete estéril.
2. Perfure o calcanhar com uma lanceta estéril. A ponta da lanceta deve ser menor que 2 mm,
pois, perfurações profundas podem ferir crianças pequenas.
3. Descarte a primeira gota de sangue com um cotonete estéril.
4. Colha a próxima grande gota de sangue com o papel de filtro, aguardando até que a
amostra seja adsorvida no papel e preencha totalmente o círculo delimitado. Não aplique
uma gota de sangue sobre a outra e nem colha em ambos os lados do papel, pois isto
altera o volume de sangue coletado por spot e pode produzir falsos resultados patológicos.
5. Preencha cada um dos círculos remanescentes no papel de filtro com uma única gota de
sangue.
6. Cuidados com o local de punção deve estar de acordo com a prática comum do
hospital/laboratório
7. Deixe o sangue coletado secar por 4 horas, repousando o papel de filtro em uma superfície
horizontal, não-absorvente, em temperatura de +20 a +25°C.
8. Envie as amostras secas em papel de filtro para o laboratório dentro de 24 horas.
Para instruções detalhadas da coleta da amostra, consulte o manual do fabricante do papel de
filtro ou as orientações nacionais padronizadas.
O armazenamento em ambiente de baixa umidade (menor que 30%) em temperatura
ambiente (+20 a +25°C) é adequado, se a análise for realizada dentro de 24 a 48 horas. Baixa
umidade e baixas temperaturas (refrigerado ou abaixo de -18°C) são sugeridos para
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armazenamento superior a 48 horas [14]. Evite temperaturas acima de 37ºC. Isto pode causar a
diminuição de alguns aminoácidos.
Nota:
É responsabilidade individual dos laboratórios usar todas as referências disponíveis e/ou seus
próprios estudos para determinar critérios específicos de estabilidade.
5.2 Reconstituição do padrão interno
O padrão interno (artigo 55004) é utilizado como padrão de calibração para cada amostra e é
rastreável a substâncias de referência isotopicamente marcadas adquiridas de fornecedor
certificado. Após reconstituição, uma quantidade definida de padrão interno é adicionada a
amostra e, então, submetido a todo o procedimento de preparação das amostras.
Antes do preparo de amostras, reconstitua o Padrão Interno (artigo 55004) com 50 mL do
Tampão de Extração. Faça os seguintes procedimentos:
1. Pipete 5 ml do Tampão de Extração (artigo 55008) no frasco original do Padrão Interno
2. Reconstitua por aproximadamente 5 min entre +20 e +25°C, agite suavemente e
repetidamente
3. Transfira o conteúdo do frasco para um balão volumétrico de 50 ml
4. Enxague o frasco do Padrão Interno duas vezes com 5 ml do Tampão de Extração e transfira
o líquido para o balão volumétrico
5. Complete o volume do balão volumétrico para 50 mL com o Tampão de Extração e
homogeneíze.
Evite a exposição direta à luz. A concentração atual depende do lote e poderá ser encontrada
no folheto de informações que acompanha o padrão.
Estabilidade do Padrão interno reconstituído:
O Padrão Interno reconstituído no Tampão de Extração tem a seguinte estabilidade:
Tabela 5: Estabilidade do Padrão Interno após reconstituição
Temperatura de
armazenamento Estabilidade
Outras condições de
armazenamento
+2 a +8°C 3 semanas Protegidas da luz, bem fechadas
5.3 Manuseio dos controles
Os controles (nível I (artigo 0192) e nível II (artigo 0193), disponíveis na forma de spots de sangue
seco em papel de filtro são submetidos a todo o procedimento de preparação das amostras,
assim como as amostras de pacientes. Os controles assim preparados são incluídos em cada
série analítica para monitorar a exatidão e a precisão do sistema.
A embalagem com fechamento tipo zip contêm o material de controle, envelopes com
dissecante e um cartão indicador de umidade. Verifique as condições do cartão indicador de
umidade a cada vez que a embalagem do controle for aberta. Se o indicador apresentar uma
mudança da cor azul para rosa, em 50%, os controles não devem ser mais usados. Tome
cuidado ao remover o material de controle da embalagem de armazenamento abaixo de -
18°C. Para evitar condensação, a embalagem deve ser mantida em temperatura de +20 a +25°
antes de ser aberta. Imediatamente após o uso, coloque o material de controle remanescente
de volta na embalagem com fechamento tipo zip, feche bem e congele abaixo de -18°C.
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Uma fita de registro de temperatura está fixada na embalagem dos controles. Uma mudança
permanente da cor branca para preta indica que a temperatura correspondente no indicador
foi alcançada. Evite temperaturas acima de 37°C. Decréscimo na concentração dos analitos
(aminoácidos) pode ocorrer. Evite exposição direta à luz do solar.
A concentração atual depende do lote e poderá ser encontrada no folheto de informação que
acompanha o controle.
Atenção:
Este produto foi fabricado a partir de pool de sangue total humano testado, fornecendo
resultados negativos para infecções pelo vírus da imunodeficiência (HIV), o vírus da hepatite B
(HBV), o vírus da hepatite C (HCV) e a bactéria Treponema pallidum. Ainda assim, um
potencial risco de infecção não pode ser totalmente excluído. Considerar todos os produtos
contendo material de fonte humana como potencialmente infeccioso e manipulá-lo com o
mesmo cuidado destinado a amostras de pacientes potencialmente infecciosas.
5.4 Procedimento de preparo das amostras
5.4.1 Preparo da amostra sem placa filtrante - somente para amino ácidos e acilcarnitinas
1. Picotagem da amostra:
Faça um picote no papel de filtro, de forma a retirar um disco de 3.2 mm da amostra de
sangue seco e coloque dentro de um poço da placa de 96 poços.
2. Extração de aminoácidos/acilcarnitinas:
Adicione 200 µL de padrão interno reconstituído (ver capítulo 5.2). Sele a placa com a folha
de proteção e agite por 20 minutos a 600 rpm, em +20 a +25°C.
3. Transferência/Evaporação:
Remova a folha de proteção da placa de 96 poços. Transfira o sobrenadante para uma
nova placa de 96 poços. Evapore a 60°C e 600 rpm para secar sobre fluxo de ar.
Importante: Não pode haver umidade remanescente na placa de 96 poços. A umidade
interfere na derivatização.
4. Derivatização (butilação):
Adicione 60 µL do reagente de derivatização. Sele a placa com a folha de proteção e
incube a 60°C e 600 rpm por 15 minutos.
5. Evaporação
Remova a folha de proteção da placa de 96 poços. Evapore a 60°C e 600 rpma para secar
sobre fluxo de ar.
Cuidado: Uma fumaça corrosiva emerge durante a evaporação do reagente de
derivatização! Sempre trabalhe sob exaustor.
6. Reconstituição do eluato
Adicione 100 µl do tampão de reconstituição. Agite a 600 rpm por 1 minuto.
7. Injeção:
Injete 10 µL do eluato no sistema LC-MS/MS.
A precisão e exatidão da análise devem ser monitoradas com a inclusão de controles adicionais
em cada corrida analítica.
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5.4.2 Preparo da amostra com placa filtrante - somente para amino ácidos e acilcarnitinas
1. Picotagem da amostra:
Coloque uma placa de 96 poços com filtro em uma placa de 96 poços. Faça um picote no
papel de filtro, de forma a retirar um disco de 3.2 mm da amostra de sangue seco e
coloque dentro de um poço da placa filtrante.
2. Extração:
Adicione 200 µL de padrão interno reconstituído (ver capítulo 5.2) em cada disco de papel.
Sele a placa filtrante com a folha de proteção (artigo 55011) e agite ambas as placas por
20 minutos a 600 rpm, em +20 a +25°C.
3. Centrifugação/ Evaporação:
Remova a folha de proteção da placa de 96 poços com filtro. Filtre o sobrenadante para a
placa de 96 poços por centrifugação a 3000 x g por 2 minutos. Descarte a placa filtrante e
evapore o eluato a 60°C e 600 rpm para secar sobre fluxo de ar.
Importante: Não pode haver umidade remanescente na placa de 96 poços. A umidade
interfere na derivatização.
4. Derivatização (butilação):
Adicione 60 µL do reagente de derivatização. Selar a placa com a folha de proteção e
incubar a 60°C e 600 rpm por 15 minutos.
5. Evaporação
Remova a folha de proteção da placa de 96 poços. Evapore a 60°C e 600 rpma para secar
sobre fluxo de ar.
Cuidado: uma fumaça corrosiva emerge durante a evaporação do reagente de
derivatização! Sempre trabalhe sob exaustor.
6. Reconstituição do eluato
Adicione 100 µl do tampão de reconstituição. Agite a 600 rpm por 1 minuto.
7. Injeção:
Injete 10 µl do eluato no sistema LC-MS/MS.
A precisão e exatidão da análise devem ser monitoradas com a inclusão de controles adicionais
em cada corrida analítica.
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5.4.3 Preparo da amostra incluindo succinilacetona
1. Picotagem da amostra:
Faça um picote no papel de filtro, de forma a retirar um disco de 3.2 mm da amostra de
sangue seco e coloque dentro de um poço da placa de 96 poços.
2. Extração:
Adicione 200 µL de padrão interno reconstituído (ver capítulo 5.2). Tampe a placa filtrante
com a folha de proteção (artigo 55011) e agite ambas as placas por 20 minutos a 600 rpm,
em +20 a + 25°C.
3. Transferência:
Remova a folha de proteção da placa. Transfira o sobrenadante para uma nova placa de
96 poços.
4. Extração do succinilacetona
Adicione 150 ul de Padrão Interno para succinilacetona (ref. 55044) aos spots de sangue
restantes. Tampe a placa filtrante com a folha de proteção e agite a placas por 30 minutos
a 600 rpm, a 60°C.
Nota: O sobrenadante obtido na etapa 3 pode ser incubado sem a folha protetiva durante a
extração de SUAC encurtando o tempo de evaporação subsequente.
Importante: Assegurar que o sistema mantenha a temperatura de 60°C durante toda a
incubação.
Cuidado: Durante o armazenamento correto a -18°C, o padrão interno para succinilacetona
congela parcialmente. Assegurar que o líquido na garrafa esteja completamente
descongelado e misturado de forma homogênea antes do uso.
5. Transferência / Evaporação:
Remova a folha de proteção da placa de 96 poços. Combine o sobrenadante com o primeiro
sobrenadante em uma nova placa de 96 poços.
Evapore a combinação de sobrenadantes a 60°C e 600 rpm para secar sobre fluxo de ar.
Importante: Cuidado para não secar em excesso as amostras pois isso pode levar a perda de
succinilacetona. Não pode haver umidade remanescente na placa de 96 poços. A umidade
interfere na derivatização.
6. Derivatização (butilação):
Adicione 60 µL do reagente de derivatização. Selar a placa com a folha de proteção e
incubar a 60°C e 600 rpm por 15 minutos.
Importante: Assegurar que o sistema mantenha a temperatura de 60°C durante toda a
incubação.
7. Evaporação
Remova a folha de proteção da placa de 96 poços. Evapore a 60°C e 600 rpm para secar
sobre fluxo de ar.
Importante: Cuidado para não secar em excesso as amostras pois isso pode levar a perda de
succinilacetona.
Cuidado: Uma fumaça corrosiva emerge durante a evaporação do reagente de
derivatização! Sempre trabalhe sob exaustor.
8. Reconstituição do eluato
Adicione 200 µl do tampão de reconstituição. Agite a 600 rpm por 1 minuto.
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9. Injeção:
Injete 10 µL do eluato no sistema LC-MS/MS.
A precisão e exatidão da análise devem ser monitoradas com a inclusão de controles adicionais
em cada corrida analítica.
Atenção:
Use somente os reagentes, placas de 96 poços e folhas de proteção fornecidas no kit.
Variações no preparo das amostras irão alterar a eficiência do kit.
5.5 Estabilidade das amostras
As amostras preparadas para análise como indicado na seção 5.4 possuem a seguinte
estabilidade:
Tabela 6: Estabilidade das amostras preparadas
Temperatura de
armazenamento Estabilidade Outras condições de armazenamento
+20 a +25°C 7 dias Protegidas da luz, frascos de vidro, bem fechadas
+2 a +8°C 14 dias Protegidas da luz, frascos de vidro, bem fechadas
Abaixo de -18°C 3 semanas Protegidas da luz, frascos de vidro, bem fechadas
Amostras descongeladas precisam ser bem homogeneizadas antes da injeção.
6 Materiais requeridos, mas não fornecidos
A determinação de aminoácidos e acilcarnitinas por LC-MS/MS a partir de sangue seco requer os
seguintes materiais adicionais que não são fornecidos no kit de reagentes:
− Espectrômetro de massa em tandem com software de avaliação;
− Sistema de HPLC com bomba, injetor e amostrador automático;
− Picotador automático ou manual, para picotar as amostras, 3.2 mm em diâmetro;
− Agitador termoestável para placas de 96 poços para extração e derivatização das
amostras, ex. Thermo Shaker PST-60HL-4;
− Ventilador de ar quente para evaporação das amostras;
− Presilhas de borracha (elástico) para prender as folhas de proteção às placas de 96
poços;
− Pipeta ou pipeta multicanal, 60-200 µL;
− Ponteiras;
− Exaustor;
− Balão volumétrico com capacidade para 50 mL;
− Papel de filtro para coleta de amostras de sangue do calcanhar.
7 Resultados e avaliação
O padrão interno é utilizado como um calibrador individual para cada amostra, reduzindo assim
os efeitos de matriz ao mínimo. Para este fim, a amostra (controle, paciente) é misturada com
uma quantidade definida de padrão interno. As concentrações dos compostos isotopicamente
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marcados no padrão interno dependem do lote e serão encontradas nos folhetos informativos
que acompanham os padrões.
O volume de sangue utilizado é fundamental para a quantificação bem-sucedida das amostras.
O volume de sangue obtido através do picote de um disco de sangue seco depende do
diâmetro do disco picotado, do hematócrito da amostra e do material do papel de filtro
utilizado.
O Guia NBS01-A6 [14] do CLSI fornece a recomendação que somente papel de filtro que é
pretendido para análise em spot de sangue seco deve ser usado para triagem neonatal. Alguns
papeis de filtro comerciais estão disponíveis, ex. Whatman 903 (GE Healthcare) que preenchem
os requisitos do Guia NBS01-A6, 2013, do CLSI, Apêndice C. A punção usada deve ser de 1/8
polegada (aprox. 3.2 mm de diâmetro). O volume de sangue depende do valor do hematócrito.
O Guia NBS01-A6, 2013, do CLSI usa sangue de doador que teve o valor de hematócrito
ajustado a 0.55, e o CDC usa sangue de doador com valor de hematócrito de 0.50 [15].
Dependendo do valor do hematócrito, o volume de sangue varia levemente entre 3.4 µl para
um hematócrito de 0.55 e 3.1 µl para um hematócrito de 0.45.
Uma vez que o volume de sangue varia de amostra para amostra, este procedimento de
triagem é método de determinação semi-quantitativo. Para confirmar resultados de triagem
positivos, testes diagnósticos adicionais devem ser realizados.
Antes de iniciar a análise quantitativa de amostras de pacientes, é recomendado realizar vários
testes de corrida. Para este propósito, injete os controles preparados repetidamente, até que
dois sucessivos espectros de massa apresentem valores de concentração e de intensidade de
sinal quase idênticos.
Dependendo do software utilizado, os valores dos componentes do padrão interno e o volume
de sangue ou a concentração do padrão interno relacionada à amostra é necessária. Entre
com as concentrações (ver folheto informativo) do padrão interno na tabela de análise.
Se qualquer outro tamanho de perfuração do sangue seco for utilizado (volume da amostra),
as concentrações de amostras relacionadas ao padrão interno devem ser corrigidas.
Para assegurar que as condições do LC-MS/MS não sofreram variações durante a corrida
analítica, os controles preparados devem ser injetados durante a corrida e novamente ao final.
Para o manuseio correto do software, entre em contato com o fabricante, se necessário. Notas
de cálculo manual podem ser encontradas no Apêndice II.
8 Controle de Qualidade
Precisão e acurácia das análises podem ser monitoradas pela inclusão de controles adicionais
em cada corrida analítica (Spots de sangue seco da Chromsystems, artigos 0192, 0193).
9 Valores de Cut-off / referência
Estes valores de cut-off possuem somente propósito de orientação e podem variar dependendo
do grupo de paciente e do sistema MS/MS usado. Cada laboratório de triagem deve determinar
seus próprios valores de cut-off em um estudo piloto em consulta com um especialista em
metabolismo.
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Tabela 7: Valores de cut-off, aminoácidos e metabólito de tirosina (SUAC)
Analito Cut-off [a] Cut-off [b]
Alanina 743 µmol/l 561 µmol/l
Arginina 35 µmol/l 47 µmol/l
Ácido Aspártico 270 µmol/l 147 µmol/l
Citrulina 33 µmol/l 34 µmol/l
Ácido Glutâmico 710 µmol/l 800 µmol/l
Glicina 717 µmol/l 834 µmol/l
Leucina 270 µmol/l 226 µmol/l
Metionina 22 µmol/l 45 µmol/l
Ornitina 350 µmol/l 258 µmol/l
Fenilalanina 92 µmol/l 92 µmol/l
Prolina ---- 441 µmol/l
Tirosina 225 µmol/l 197 µmol/l
Valina 198 µmol/l 191 µmol/l
Succinilacetona ---- 1,16 µmol/l
Tabela 8: Valores de cut-off, acilcarnitinas e carnitina livre
Analito Cut-off [a] Cut-off [b]
C0-Carnitina 60,3 µmol/l 49,8 µmol/l
C0, cutoff baixo 5,2 µmol/l 8,0 µmol/l
C2-Carnitina 47,8 µmol/l 57,3 µmol/l
C3-Carnitina 4,72 µmol/l 4,88 µmol/l
C4-Carnitina 0,81 µmol/l 0,62 µmol/l
C5-Carnitina 0,45 µmol/l 0,46 µmol/l
C5DC-Carnitina 0,34 µmol/l 0,22 µmol/l
C6-Carnitina 0,16 µmol/l 0,13 µmol/l
C8-Carnitina 0,19 µmol/l 0,11 µmol/l
C10-Carnitina 0,26 µmol/l 0,21 µmol/l
C12-Carnitina 0,41 µmol/l 0,56 µmol/l
C14-Carnitina 0,43 µmol/l 0,38 µmol/l
C16-Carnitina 5,06 µmol/l 5,81 µmol/l
C18-Carnitina 2,59 µmol/l 1,58 µmol/l
[a] Valores de cut-off dados como percentil 99.5% foram determinados em um estudo piloto com
aproximadamente 1.500 bebês recém-nascidos realizado no centro de triagem do Hospital Universitário de
Lepzig usando o kit de reagentes 55000.
[b] Valores de cut-off dados como percentil 99.5% foram determinados em um estudo piloto com
aproximadamente 2.500 bebês recém-nascidos realizado na Universidade Médica de Viena,
Departamento de Pediatria e Medicina para Adolescentes, usando o kit de reagentes 55000.
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10 Fatores de conversão
As tabelas seguintes listam os fatores de conversão entre massa e concentração molar e vice-
versa.
Tabela 9: Fatores de conversão, aminoácidos e metabólito da tirosina (SUAC)
Analito mg/l em µmol/l µmol/l em mg/l
Alanina x 11,223 x 0,0891
Arginina x 5,7405 x 0,1742
Ácido Aspártico x 7,5126 x 0,1331
Citrulina x 5,7081 x 0,1752
Ácido Glutâmico x 6,7967 x 0,1471
Glicina x 13,321 x 0,0751
Leucina x 7,6237 x 0,1312
Metionina x 6,7020 x 0,1492
Ornitina x 7,5666 x 0,1322
Fenilalanina x 6,0536 x 0,1652
Prolina x 8,6858 x 0,1151
Tirosina x 5,5191 x 0,1812
Valina x 8,5361 x 0,1172
Succinilacetona x 6,3231 x 0,1581
Tabela 10: Fatores de conversão, acilcarnitinas e carnitina livre
Analito mg/l em µmol/l µmol/l em mg/l
C0-Carnitina x 6,2019 x 0,1612
C2-Carnitina x 4,9203 x 0,2032
C3-Carnitina x 4,6032 x 0,2172
C4-Carnitina x 4,3245 x 0,2312
C5-Carnitina x 4,0776 x 0,2452
C5DC-Carnitina x 3,6319 x 0,2753
C6-Carnitina x 3,8559 x 0,2593
C8-Carnitina x 3,4789 x 0,2874
C10-Carnitina x 3,1701 x 0,3154
C12-Carnitina x 2,9109 x 0,3435
C14-Carnitina x 2,6915 x 0,3715
C16-Carnitina x 2,5023 x 0,3996
C18-Carnitina x 2,3384 x 0,4276
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11 Armazenamento e estabilidade dos reagentes
Fechados, e desde que as condições de transporte e armazenamento sejam cumpridas, os
reagentes são estáveis até a data de validade determinada no rótulo. Transporte e armazene os
reagentes sob as seguintes condições:
Tabela 11: Condições de transporte para os kits de reagente e conjunto de upgrade
Produto Temperatura de transporte
Kit de Reagentes (artigo 55000, 55000/F) +18 a +30°C
Conjunto de Upgrade Succinilacetona (artigo
55111) +18 a +30°C
Imediatamente após o transporte, desempacote os reagentes e armazene individualmente
como determinado abaixo:
Tabela 12: Condições de armazenamento dos reagentes
Produto Condição
Fase móvel (art. 55001) +18 a +30°C
Solução de limpeza (art. 55007) +18 a +30°C
Tampão de extração (art. 55008) +18 a +30°C
Reagente de derivatização (art. 55005) +18 a +30°C
Tampão reconstituição (art. 55006) +18 a +30°C
Placa de 96 poços (art. 55010) +18 a +30°C
Tuning Mix (art. 55099) +2 a +8°C
Padrão Interno (art. 55004) Abaixo de -18°C
Controles nível I e nível II, DBS (arts. 0191, 0192, 0193) Abaixo de -18°C
Padrão Interno para succinilacetona (art. 55044) Abaixo de -18°C
Tuning Mix para succinilacetona (art. 55098) +2 a +8°C
Os reagentes devem ser fechados e armazenados nas condições estabelecidas tão logo sejam
utilizados. Se nada tiver sido previamente determinado, a validade de um reagente em uso
deverá ser de 1 ano após sua abertura, não excedendo o seu respectivo prazo de validade.
Para calibradores e controles, ver os capítulos 5.2 e 5.3 deste manual.
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12 Descarte de Resíduos
A Fase Móvel, Solução de Lavagem, Tampão de Extração, Padrão Interno para succinilacetona,
Tampão de Reconstituição e as soluções de Tuning Mix contêm solventes orgânicos. Descarte os
resíduos destes produtos em um recipiente para solventes orgânicos livres de halogênio.
O Reagente de Derivatização contém solventes orgânicos e halogênios. Descarte os resíduos
destes produtos em um recipiente para solventes orgânicos contendo halogênio.
Os resíduos de amostras de pacientes e amostras preparadas, assim como os controles, devem
ser coletados e descartados como lixo potencialmente infeccioso.
As soluções mencionadas não devem ser descartadas junto com o lixo doméstico. Não circule
no abastecimento principal de água. Descarte de acordo com a diretiva 2008/98/EC e de
acordo com as exigências locais e nacionais. Os contêineres de lixo devem ser armazenados
apropriadamente e o acesso só deve ser permitido a pessoas autorizadas.
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13 Exemplos de espectros de massa
Os gráficos a seguir apresentam vários exemplos de espectros de massa criados usando este
método.
Figura 8: Espectro de um controle na faixa de referência de amino ácidos
Figura 9: Espectro de amostra de paciente com fenilcetonúria (PKU) Concentração do analito: 871 µmol/l fenilalanina (m/z = 222)
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Figura 10: Espectro de um controle na faixa de referência de acilcarnitinas
Figura 11: Espetro de uma amostra de paciente com MCADD Concentração do analito: 6.63 µmol/l carnitina-C8 (m/z = 344)
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Figura 12: Espectro de uma amostra de paciente com VLCADD Concentração dos analitos: 2.61 µmol/l carnitina-C14; 6.84 µmol/l carnitina-C16; 3.56 µmol/l carnitina-C18
Figura 13: Espectro de uma amostra de paciente com acidemia glutária tipo I (GA I) Concentração do analito: 1.15 µmol/l carnitina C5DC (m/z = 388)
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14 Interferentes conhecidos
Favor notar:
− Isoleucina interfere com leucina. A concentração medida na amostra é um somatório
das concentrações dos dois aminoácidos.
− Hidroxiprolina interfere com leucina. O valor padrão da hidroxiprolina é insignificante
comparado ao da leucina. Hidroxiprolina não deve causar qualquer falso aumento da
concentração de leucina durante a análise de rotina.
− Metionina sulfona interfere com tirosina. Metionina sulfona é um produto de degradação
da metionina. A concentração padrão da Metionina em crianças é de
aproximadamente 20 µmol/L e as concentrações máximas esperadas de metionina
sulfona estão dentro dessa faixa. O valor patológico de tirosina é de aproximadamente
300 µmol/L. Desta forma, metionina sulfona não deve causar acréscimos significativos na
concentração de tirosina durante análises de rotina.
− Metionina sulfóxido interfere com metionina. Metionina sulfóxido é um produto da
oxidação da metionina. In vivo, metionina sulfóxido é reduzida novamente a metionina
pela ação da enzima metionina sulfóxido redutase. Logo, em condições in vivo, não
devem existir concentrações patológicas de metionina causadas pelo aumento da
concentração de metionina sulfóxido.
− Asparagina interfere com ornitina. A concentração máxima de asparagina em crianças
é de até 140 µmol/l. Somente concentrações maiores de 300 µmol/l de asparagina
geram uma aumento de 20% na concentração de ornitina. Asparagina não deve causar
nenhum falso aumento nas concentrações de ornitina durante análises de rotina.
− Devido à formação de éster dibutílico, o ácido glutâmico interfere com a carnitina-C2.
Entretanto, os valores padrões de ácido glutâmico em crianças não gera um aumento
significativo da concentração de carnitina-C2. O ácido glutâmico não deve causar
nenhum falso aumento nas concentrações de carnitina-C2 durante análises de rotina.
− Aditivos em materiais plásticos (placas de micro titulação, folhas de proteção) usados na
preparação das amostras, podem interferir consideravelmente com algumas
acilcarnitinas, gerando resultados falso-positivos. Logo, este kit de reagentes da
Chromsystems contém todos os materiais plásticos necessários para a análise,
devidamente testados e classificados como livre de interferentes.
− Em pacientes com dietas parenterais, com substituição de tirosina por acetiltirosina, pode
ocorrer decréscimo na concentração de tirosina. A razão elevada entre as
concentrações de Fenilalanina e Tirosina (Phe/Tyr) pode indicar falsamente
fenilcetonúria, mesmo com a concentração de fenilalanina em valores normais.
− Pacientes em uso de pivalina como antibiótico podem apresentar concentrações
elevadas de C5-Carnitina, devido à formação de pivalilcarnitina (isômero da
isovalerilcarnitina). Embora nenhuma desordem metabólica exista, uma acidemia
isovalérica (IVA) pode ser falsamente indicada.
Para o esclarecimento de quaisquer outras questões envolvendo possíveis interferências, entre
em contato com a assessoria científica da Biosys, através de e-mail ou telefone, ou mande um