-
Algunas referencias en la historia de T. foetus
AÑO AutorPrimer diagnóstico en el mundo
1888 Kunstler (Francia)
Descripción de la enfermedad
1929 Riedmüller, Drescher, Albein (Alemania)
Primer diagnóstico en Argentina
1939 Rosembusch
Relevamiento en Argentina (8.2%)
1940 Gelormini
Diagnóstico, control y epidemiología
1960-1970 Roberts, Stoessel y Villar
Fertilidad de los rodeos
Nº de rodeos revisados
% de rodeos Pos. a Tricho
% de rodeos Pos. a Campy
% de rodeos Pos. a ambas
Baja 181 60 43 19
Desconocida 77 30 18 10
-
Tricomonosis bovina
• Etiología: Tritrichomonas foetus• Afecta : Bovinos (Felinos
-
Porcinos-Equinos- Corzo)• Morfología: Eucariote flagelado,
piriforme --- 8- 18µ x 5-10µ• Movimientos: ondulantes bruscos•
Reproducción: asexual simple-
División binaria• Serotipos: Belfast, Manley y
Brisbane• Metabolismo: anaerobio
aerotolerante
Oxígeno Tiempo generacional
0 % 3.5 hs10 % 26.8 hs20% Sin crec.
-
Métodos de diagnóstico Tritrichomonas foetus
Cultivo ELISA PCR, qPCR
-
-5
0
5
10
15
20
25
30
1 2 3 4 5M
illon
es
Lab 2 Lab 3 Lab 4 Lab 5Lab 6 Lab 7 Lab 8 Lab 9Lab 10 Lab 15 Lab
17
0
2
4
6
8
10
12
14
16
1 2 3 4 5
Mill
ones
Lab 1 Lab 11 Lab 12Lab 13 Lab 16 Lab 17 b
Ensayo Nº1: evaluación del operador y especificidad del
conjugado para detectar especies de Campylobacter fetus
A B C D E F G H I J K L M N Resultado
RC RL RC RL RC RL RC RL RC RL RC RL RC RL RC RL RC RL RC RL RC
RL RC RL RC RL RC RL
L1 N N N N P P N N N N P N N N N P P P P P P P P P P P 14/14
L2 N N N P P N N P N N N N N P N P P P P P N N P P P P 12/14
L3 N N P P N N N N P P P P P P N N N N N N N P P P P N 14/14
L5 P P N N P P P P N N N N N P P N N N N N N N P P P P 14/14
L6 P P P N N N N N N P P P P P P N N N N N N P P P P P P
14/14
L7 P N N N N P N N P P P P P P N N P P P P N N N N P P 14/14
L8 P P P P P P P P N N P P N N N N N N N P P N N N N N 14/14
L9 N N P P N N P P N N P P P P N N N N N N P P P P N N 14/14
L10 N N P P N N N N P P P P P P P P P P P P N N N N N N
14/14
L11 P P P P P P N N P N N P N N P P P P N N N N N N N N
14/14
L12 P P N P P N N N P P N N N N P P N N N N N N P P P P
12/14
L13 N N N N N N P P N N P P N N P P P P P P P P P P N N
14/14
L14 N N N N P P P N N N N P N N P P P P P P P P N N P P
14/14
L15 P P N N N N P P N N N P P P P N N N P P N N N N P P
14/14
L16 P P P N N N P P P P P P P P P P P P N N N N N N N N 13/14
L17 P P N N P P N N N N N P P N N N N N P P P P N N P P 14/14 L18 P
P N N N N N N P P P N N N N P N N P P P P P P P P 14/14
Estandarización de las técnicaspara el diagnóstico de Tritrico y
Campy en laboratorios de red
-
El diagnóstico por cultivo
Especificidad
-
Resultados PCR en muestras positivas a cultivo de Tritrichomonas
en Laboratorios en Red-2014
Año 2014Muestras procesadas
total pos T. foetus pos Tetra sp. S/detLab 1 15 3 (20 %) --- 12
(80%)Lab 2 7 5 (71%) --- 2 (29%)Lab 3 20 9 (45%) 5 (25%) 6 (30%)Lab
4 176 161 (91%) --- 15 (9%)Lab 5 42 9 (21%) 21 (50%) 12 (29%)Lab 6
2 2 (100%) --- ---Lab 7 54 25 (46%) --- 29 (54%)Total 316 214 (68%)
55 (17%) 47 (15%)
-
Campilobacteriosis Genital Bovina
http://www.google.com.ar/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjippDh7ILPAhVCgpAKHRthCMwQjRwIBw&url=http://generalidadesdelaganaderiabovina.blogspot.com/2015_05_01_archive.html&psig=AFQjCNH0qRz892-gv5fjUw_8UvUCYR5LEQ&ust=1473529498326046http://www.google.com.ar/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjIjJf_uIzPAhVDQ5AKHUq8Aw8QjRwIBw&url=http://www.wider.es/casosclinicos/index.php/celulitis-producida-por-campylobacter-fetus-subespecie-fetus-caso-540/?print=print&psig=AFQjCNH_IlpGxo6ksf6rXQDmG2krChxtXQ&ust=1473858945659530http://www.google.com.ar/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjippDh7ILPAhVCgpAKHRthCMwQjRwIBw&url=http://generalidadesdelaganaderiabovina.blogspot.com/2015_05_01_archive.html&psig=AFQjCNH0qRz892-gv5fjUw_8UvUCYR5LEQ&ust=1473529498326046http://www.google.com.ar/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjIjJf_uIzPAhVDQ5AKHUq8Aw8QjRwIBw&url=http://www.wider.es/casosclinicos/index.php/celulitis-producida-por-campylobacter-fetus-subespecie-fetus-caso-540/?print=print&psig=AFQjCNH_IlpGxo6ksf6rXQDmG2krChxtXQ&ust=1473858945659530
-
Clasificación histórica y nomenclatura de subespecies de
Campylobacter fetus
1959 1968 1973Florent Elazhary Véron &
ChantelainVibrio foetusveneralis
Vibrio fetusveneralis
C.fetus subsp. veneralis
Vibrio fetusintermedius
C. fetus subsp. veneralis biovarintermedius
Vibrio foetusintestinalis
Vibrio fetusintestinalis
C. fetus subsp. fetus
1913 – Mc Fadyen & Stockman – Vibrio fetusDe estómago de
feto ovino abortado.
1919 – Smith & Taylor – Vibrio fetusDe estómago de feto
bovino abortado
-
Principal hospedador e importancia clínica de las subespecies de
Campylobacter
Especie Hospedador Enfermedad / o estado comensal
C. fetus subespecie veneralis
Bovino Campylobacteriosis Genital Bovina: infertilidad, muerte
embrionaria temprana y ocacional aborto
C. fetus subespecie fetus
Ovino Campylobacteriosis Genital OvinaTormentas de abortos
Bovino Abortos esporádicos
Hombre Infecciones esporádicas en personas
inmunocomprometidas
Bovino/ Ovino Comensal en el tracto intestinal
-
Etiología: Campylobacter fetus.Afecta : bovinos, ovejas,
humanosMorfología: bacterias Gram -
0.5- 8µ x 0.2-0.5µCaracteristicas: formas curvadas, S o
espiral.
Generalmente 1 flagelo polarCrecimiento: Crecen a 37º C.
MicroaerófilasEspecies: C. fetus subespecie fetus
C. fetus subespecie venerealis
MUESTRAS PARA DIAGNÓSTICO
Esmegma prepucial obtenida mediante raspado
Medios de transporte/cultivo: Lander y TTE
-Cultivo: Baja sensibilidad: i) escasa viabilidad delgermen
fuera del hospedador, ii) sensible a determinadosantibióticos; iii)
gran sensibilidad a las fluctuaciones de Tª.Mala identificación:
heces y comensales
ESPECIE CatalasaH2S 25º 42º
Gli1%
C. f. venerealis + - + V -C. f. fetus + - + V +C. sputorum V + -
+ V
Diagnóstico
-
Especificidad
C. fetus subespecie veneralis C. fetus subespecie fetus
Que subespecie estoy viendo?
-
Tubo Cant. de Bact. IFD PCR
1 ++++++++ Positivo
2 +++++++ Positivo
3 ++++ Positivo
4 40-50 x campo Positivo
5 15-20 x campo Positivo
6 2000 4-5 x campo Positivo
7 1000 1 x campo Positivo
8 500 c/ 4 campos 1 Positivo
9 250 2-3 en total Positivo
10 125 negativo Positivo
11 62 negativo Positivo
12 31 negativo Positivo
13 15 negativo Positivo
14 7 negativo Positivo
15 negativo negativo Negativo
Sensibilidad
Cuantos microorganismos puedo detectar?
-
DIAGNÓSTICOTest Tipo de
identificaciónVentajas Desventajas
Inmuno-fluorescencia
Fenotípica Fácil de realizarEconómicoRápido
Sensibilidad baja,No diferencia de especies
Cultivo Fenotípica Aislamiento de cepa para estudios
genotípicos
Equipos, tiempo, medios adecuados,contaminación
PCR- Hum Genotípica Fácil de hacer, rápido, fácil
interpretación, confiable y reproducible
Equipamiento, contaminación, falsos positivos
PCR- Van Bergen
Genotípica Fácil de hacer, rápido, fácil interpretación,
confiable y reproducible
Equipamiento, contaminación, falsos positivos
ELISA Genotípica Fácil de hacer, rápido, fácil
interpretación
Equipamiento y reactivos (monoclonales)
-
Recolección de muestras para diagnóstico en el macho
• Lavaje• Hisopado• Raspaje• Aspiración seca
-
• Cantidad óptima de raspajes 3-4. Mínimo 2 negativos
consecutivos.
• Intervalos entre muestreos de 7-10 días.
El muestreo y el diagnósticoCon las técnicas Tradicionales
-
https://www.youtube.com/watch?v=G-1StrWaHKA
- VÍDEO DIVULGATIVO
INTA - Técnicas de muestreo para el diagnóstico de enfermedades
venéreas en bovinos
https://www.youtube.com/watch?v=G-1StrWaHKAhttps://www.youtube.com/user/webinta
-
Aislamiento de Campylobacter en muestras prepuciales de
toros
Toma de muestras prepuciales de 570
toros por el método del raspador.
Se cultivaban aquellas que a la MO presentaban Bacterias móviles
con morfología
compatible. Apox. 161
Tambien aquellos que resultaban
positivos en PCR.72
-
Secuencia en el procesamiento de muestras
Toma de muestras prepuciales en medio
de thioglicolato
Llegada al laboratorio > 24hs
Cultivo 24hs a 37ºC y mantenimiento a Tº
ambiente durante 4 días.
Observación diaria en contraste de fase a
400x
Filtración y siembra de microorganismos móviles
compatibles con Campy y PCR +
-
Procedimiento utilizado para el cultivo de muestras
-
Cultivo en Jarra
congelacion
-
Identificación de aislados
Inmunofluorescencia
Maldi Tof
qPCR
-
Identificación bacteriológica a partir de MALDI- Biotyper
Bacteria + Matriz
Cristaliza
Se ioniza con un laser
Las moléculas generadas se leen en
un detector iones
-
Aislados de Muestras Prepuciales
Bacterias móviles filtrables (0,65micras) ,
micoaerófilas67Campylobacter
60
C. sputorum
53
C. hyointestinalis
2
C. Fetus
5
Arcobacter7
A. cryaerophilus
5A. butzleri
219
425
29/161
2351
-
ArcobacterInvestigation of bovine venereal campylobacteriosis in
beef cow herds in New ZealandPor: McFadden, AM; Heuer, C; Jackson,
R; et ál..NEW ZEALAND VETERINARY JOURNAL Volumen: 53 Número: 1
Páginas: 45-52 Fecha de publicación:FEB 2005Campylobacter fetus
subsp venerealis was not cultured from any of the 54 bulls sampled.
Four other species of Campylobacter and related organisms were
cultured, Arcobacter cryaerophilus, Campylobacter jejuni,
Campylobacter fetus subsp fetus and Helicobacter cinaedi.
Campylobacter cryaerophila and Campylobacter fetus subspecies
venerealis as a cause of serial abortions in two cattle herds in
North-Rhine-WestfaliaPor: Parvanta, MFTIERARZTLICHE UMSCHAU
Volumen: 54 Número: 7 Páginas: 364-+ Fecha de publicación: JUL
1999Tissues from aborted bovine fetuses from two cattle herds were
examined microscopically and culturally for the presence of
potential bacterial aborti-facients. An aetiological association
between infection with Arcobacter cryaerophilus was established for
the first time in one of the herds. This indicated the need to use
placental tissue for the direct isolation of C. cryoaerophila
First isolation in Chile of Arcobacter cryaerophilus from a
bovine abortionPor: Fernandez, H; Rojas, X; Gajardo, TARCHIVOS DE
MEDICINA VETERINARIA Volumen: 27 Número: 2 Páginas: 111-114 Fecha
de publicación: 1995Context Sensitive Links Cerrar abstractCerrar
abstractThe first isolation of Arcobacter cryaerophilus in Chile
from the abomasum of an aborted bovine foetus is reported.
Arcobacter
http://apps.webofknowledge.com/full_record.do?product=UA&search_mode=GeneralSearch&qid=1&SID=X2seA6fSfz7juLkAGDH&page=1&doc=40http://apps.webofknowledge.com/full_record.do?product=UA&search_mode=GeneralSearch&qid=1&SID=X2seA6fSfz7juLkAGDH&page=2&doc=52&cacheurlFromRightClick=no
-
Isolation rates of Campylobacter fetus subsp venerealis from
bovine preputial samples via passive filtration on nonselective
medium versus selective medium, with and without transport médium
(2013)Chaban, Bonnie; Guerra, Alvaro Garcia; Hendrick, Steven H.;
et ál..AMERICAN JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH, 74-8, 1066-1069
Filtración Cultivo directo
Agar sangre86%
Agar Skirrow
32%
TEM 24 hsFiltraciónCultivo
Agar sangre40%
Agar Skirrow
35%
Pocos aislados de C. fetus veneralis
-
Desarrollo de una q-PCR para el diagnóstico conjunto de
Tritrichomonas
foetus y Campylobacter foetus veneralis en muestras
prepuciales.
-
Ventajas de la q-PCR
• La Q-PCR permite, empleando un fluorocromo de unión
inespecífica (SYBR Green; Go Taq Green), identificar
fragmentos amplificados de DNA concretos a partir de
la temperatura de fusión ( Tm, melting temperature)
• Es específica para el fragmento amplificado que se está
buscando; y cuyos resultados son obtenidos a partir de la
observación de la curva de disociación de las muestras de
DNA analizadas.9
• Ello permite, a diferencia de PCR convencional, prescindir
del posterior empleo de técnicas de electroforesis para la
visualización de los resultados de todas las muestras
https://es.wikipedia.org/wiki/SYBR_Greenhttps://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Temperatura_de_fusi%C3%B3n_(ADN)&action=edit&redlink=1https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Curva_de_disociaci%C3%B3n&action=edit&redlink=1https://es.wikipedia.org/wiki/PCR_en_tiempo_real#cite_note-Ririe1997-9https://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis
-
• Tb. esta técnica lleva a la obtención de
resultados más rápidos, y/o en el
menor gasto de reactivos empleados
en las técnicas de electroforesis.
• Permite el diagnóstico de ambas
enfermedades es una única muestra.
Ventajas de la q-PCR
-
Métodos
Extracción Diseño de primers
Fluoroforo
• SybrGreen
• Go- Taq
-
Resultados: Curvas de disociación de Trico y Campy
-
Resultados: Muestras con igual cantidad de ADN de Trico y
Campy
-
Resultados: Muestras con diferencias de una dilución base
10.
-
Resultados: Muestras con diferencia de dos diluciónes base
10.
-
Test de concordancia para Campylobacter
qPCR (+) (-) Marginal(+) 72 9 81(-) 1 141 142
Marginal 73 150 223
ACUERDO OBSERVADO 0,96ACUERDO ESPERADO 0,5472
ÍNDICE KAPPA
0,901 ( 0,841 , 0,961 )
Medidas de concordancia - Kappa
Muy buenaI.C 95%
PCR
Fuerza de la concordanciaERROR ESTÁNDAR
0,031
-
Test de concordancia para Trichomonas foetus
qPCR (+) (-) Marginal(+) 41 2 43(-) 3 176 179
Marginal 44 178 222
ACUERDO OBSERVADO 0,98ACUERDO ESPERADO 0,6849
ÍNDICE KAPPA
0,929 ( 0,867 , 0,990 )
Medidas de concordancia - Kappa
Muy buenaI.C 95%
Cultivo
Fuerza de la concordanciaERROR ESTÁNDAR
0,032
-
Test de concordancia para Campylobacter y T. foetus
qPCR (+) (-) Marginal(+) 3 0 3(-) 0 218 218
Marginal 3 218 221
ACUERDO OBSERVADO 1,00ACUERDO ESPERADO 0,9732
ÍNDICE KAPPA
1,000 ( 1,000 , 1,000 )
Medidas de concordancia - Kappa
Muy buenaI.C 95%
PCR
Fuerza de la concordanciaERROR ESTÁNDAR
0,000
-
Valores CT promedios:
• Muestras positivas a Campy(72) : 24.8
• Muestras Positivas a Trico (41): 24.6
• Muestras negativas: 37.7
• Muestras Positivas a Trico y a Campy(5): 23.6
-
Especificidad Trichomonas
Agente CT Resultado
T. foetus 13 Positivo
T. gallinarum 13 Positivo
T. suis 14 Positivo
T. mobilensis 26 Positivo
Tetratrichomonas 35 NEGATIVA
-
Especificidad a Campylobacter:
Campylobacter CT Resultado
C. f. v. intermedius 11.8 Positivo
C. fetus veneralis 13.2 Positivo
C. fetus veneralis 12.5 Positivo
C. fetus fetus NEG NEGATIVO
C. fetus veneralis 12.8 Positivo
C. fetus fetus 32.1 NEGATIVO
C. fetus fetus 31.3 NEGATIVO
C. Hyo Hyo 30.6 NC
C. Hyo Law NEG NEGATIVO
C. C. f. v. intermedius 12.8 Positivo
• 53 cepas de Sputorum Todas NEGATIVAS
• 2 cepas de C. hyo Negativas
-
Etapa 3. Reproducibilidad y solidez técnica Diagnóstico de T.
foetus: qPCR versus Cultivo
qPCR (+) (-) Marginal(+) 30 3 33(-) 9 1179 1188
Marginal 39 1182 1221
ACUERDO OBSERVADO 0,99ACUERDO ESPERADO 0,9428
ÍNDICE KAPPA
0,828 ( 0,732 , 0,925 )
Medidas de concordancia - Kappa
Muy buenaI.C 95%
CULTIVO
Fuerza de la concordanciaERROR ESTÁNDAR
0,049
-
qPCR (+) (-) Marginal(+) 11 25 36(-) 15 1170 1185
Marginal 26 1195 1221
ACUERDO OBSERVADO 0,97ACUERDO ESPERADO 0,9505
ÍNDICE KAPPA
0,338 ( 0,137 , 0,540 ) DébilI.C 95%
IF
Fuerza de la concordanciaERROR ESTÁNDAR
0,103
Etapa 3. Reproducibilidad y solidez técnica Diagnóstico de C.
fetus: qPCR versus IF
-
qPCR (+) (-) Marginal(+) 34 1 35(-) 2 1184 1186
Marginal 36 1185 1221
ACUERDO OBSERVADO 1,00ACUERDO ESPERADO 0,9435
ÍNDICE KAPPA
0,956 ( 0,907 , 1,006 ) Muy buenaI.C 95%
PCR Abril
Fuerza de la concordanciaERROR ESTÁNDAR
0,025
Etapa 3. Reproducibilidad y solidez técnica Diagnóstico de C.
fetus: qPCR versus PCR
-
Muchas Gracias
Muchas Gracias
Algunas referencias en la historia de T. foetusNúmero de
diapositiva 2Métodos de diagnóstico � Tritrichomonas foetusNúmero
de diapositiva 4Número de diapositiva 5Número de diapositiva
6Resultados PCR en muestras positivas a cultivo de Tritrichomonas
en Laboratorios en Red-2014Número de diapositiva 8Clasificación
histórica y nomenclatura de subespecies de Campylobacter
fetusPrincipal hospedador e importancia clínica de las subespecies
de Campylobacter Número de diapositiva
11EspecificidadSensibilidadDIAGNÓSTICORecolección de muestras para
diagnóstico en el machoEl muestreo y el diagnóstico�Con las
técnicas TradicionalesNúmero de diapositiva 17Aislamiento de
Campylobacter en muestras prepuciales de torosSecuencia en el
procesamiento de muestrasProcedimiento utilizado para el cultivo de
muestrasNúmero de diapositiva 21Número de diapositiva 22Número de
diapositiva 23Identificación de aisladosIdentificación
bacteriológica a partir de MALDI- BiotyperAislados de Muestras
Prepuciales ArcobacterIsolation rates of Campylobacter fetus subsp
venerealis from bovine preputial samples via passive filtration on
nonselective medium versus selective medium, with and without
transport médium (2013)�Chaban, Bonnie; Guerra, Alvaro Garcia;
Hendrick, Steven H.; et ál..�AMERICAN JOURNAL OF VETERINARY
RESEARCH, 74-8, 1066-1069 Número de diapositiva 29Ventajas de la
q-PCRVentajas de la q-PCRMétodosResultados: Curvas de disociación
de Trico y Campy Resultados: Muestras con igual cantidad de ADN de
Trico y CampyResultados: Muestras con diferencias de una dilución
base 10. Resultados: Muestras con diferencia de dos diluciónes base
10.Test de concordancia para CampylobacterTest de concordancia para
Trichomonas foetusTest de concordancia para Campylobacter y T.
foetusValores CT promedios: Especificidad TrichomonasEspecificidad
a Campylobacter:Etapa 3. Reproducibilidad y solidez técnica
�Diagnóstico de T. foetus: qPCR versus CultivoEtapa 3.
Reproducibilidad y solidez técnica �Diagnóstico de C. fetus: qPCR
versus IFEtapa 3. Reproducibilidad y solidez técnica �Diagnóstico
de C. fetus: qPCR versus PCRMuchas Gracias