alat sterilisasiAlat sterilisasi baik media maupun peralatan
yang digunakan untuk proses isolasi dan penanaman eksplan yang
sering digunakan adalah autoklaf. Tipe autoklaf yang dapat
digunakan untuk sterilisasi ada bermacam-macam, mulai dari yang
sederhana sampai digital (terprogram). Autoklaf yang sederhana
menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam
autoklaf. Pemanasan air dapat menggunakan kompor atau api Bunsen.
Dengan autoklaf sederhana ini, tekanan dan temperatur diatur dengan
jumlah panas dari api.Kelemahan autoklaf ini adalah bahwa perlu
penjagaan dan pengaturan panas secara manual, selama masa
sterilisasi dilakukan. Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan:
sederhana, harga relatif murah, tidak tergantung dari aliran
listrik yang sering merupakan problema untuk negara-negara yang
sedang berkembang, serta lebih cepat dari autoklaf listrik yang
seukuran dan setaraf.Autoklaf yang lebih komplit menggunakan sumber
energi dari listrik. Alatnya dilengkapi dengan timer dan
thermostat. Bila pengatur automatis ini berjalan dengan baik. Maka
autoklaf dapat dijalankan sambil mengerjakan pekerjaan lain.
Kelemahannya adalah bila salah satu pengatur tidak bekerja, maka
pekerjaan persiapan media menjadi sia-sia dan kemungkinan
menyebabkan kerusakkan total pada autoklaf. Sebagai sumber uap,
juga berasal dari air yang ditambahkan ke dalam autoklaf dan
didihkan.Untuk laboratorium komersial, diperlukan autoklaf dengan
kapasitas besar dan sumber uap biasanya dari boiler yang terpisah.
Autoklaf ini sangat cepat dan dapat diprogam waktu sterilisasi,
serta waktu pendinginan. Setelah sterilisasi bahan atau alat
selesai, temperatur dan tekanan autoklaf diturunkan secara
perlahan-lahan dalam waktu 15-20 menit. Pada autoklaf yang
programmable, panas ini diatur secara atomatis. Tetapi pada
autoklaf yang sederhana hal ini harus diatur secara manual.
Autoklaf
Pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas dan
tekanan dari uap air. Temperature sterilasi biasanya 121o C,
tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square
inci) atau 1 atm.Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan
jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media
antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan.
Sterilisasi media yang terlalu lama menyebabkan :1. Penguraian
gula.2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino.3. Inaktifasi
sitokinin zeatin riboside.4. Perubahan pH yang berakibatkan
depolimerisasi agar.
Autoklaf gas atau listrik portable pada umumnya mempergunakan
sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf,
sedangkan autoklaf besar pada laboratorium komersil pada umumnya
menggunakan uap dari boiler sentral.
Bagian-bagian autoklaf :1. Panci luar.2. Panci dalam tempat
meletakkan botol dengan alur tempat saluran uap.3. Tutup beserta
penunjuk tekanan dan saluran uap.4. Katup pengeluaran uap.5.
Pengunci atau klem.
Sterilisasi Media Mmenggunakan Autoklaf Portable(Pemanasan
menggunakan api)
1. Isi panci luar dengan air, kalau dapat dengan aquadest untuk
menghindarkan pengendapan Ca yang biasa terdapat pada air ledeng,
sebanyak 1 liter untuk autoklaf kecil, dan 1.5 liter untuk autoklaf
besar.2. Botol-botol media yang akan disterilkan, dimasukkan ke
dalam panel-dalam. Susun botol-botol tersebut hingga mencapai
permukaan panel.3. Atur posisi panci dengan memperhatikan alur
tempat saluran uap yang terdapat pada tutup dan lingkaran permukaan
panci-luar .4. Tutup dengan erat. (kencangkan pengunci tanpa
menggunakan alat)5. Biarkan katup pengeluaran uap dalam keadaan
terbuka.6. Letakkan autoklaf di atas kompor gas atau pembakar
Bunsen.7. Panaskan sampai air dalam autoklaf mendidih dan uap mulai
keluar dari katup pengeluaran uap.8. Biarkan uap keluar selama 5
menit (minimum), untuk mengeluarkan udara mengeluarkan udara yang
terperangkap dalam autoclave.9. Tutup katup pengeluaran uap.10.
Amati kenaikan temperature dan tekanan.11. Setelah tekanan mencapai
15 psi, api kompor dikecilkan.12. Jaga keadaan tekanan 15 psi ini
dengan mengatur besar kecilnya api kompor secara manual. Selama
sterilisasi, jangan meninggalkan autoklaf dan mengerjakan hal lain
diruang lain, karena tekanan dapat meningkat sampai melewati batas.
Keadaan ini berbahaya dan dapat menyebabkan kerusakan alat.13.
Setelah waktu sterilisasi tercapai, matikan api kompor.14. Uap
dikeluarkan sedikit-sedikit dengan mengatur katup pengeluaran uap
(buka sedikit-sedikit). Jangan sekali-kali membuka katup dan
membiarkan uap keluar sekaligus. Keadaan ini menyebabkan media atau
air bubble up15. Setelah tekanan turun sampai 0, buka pengunci dan
keluarkan panci yang berisi media.
Sterilisasi Aquadest dan Media MenggunakanAutoklaf Listrik
(Digital Atau Non Digital)
Dalam sterilisasi aquadest, lebih efektif bila digunakan wadah
yang mempunyai volume antara 300 500 ml. Isi wadah tersebut sampai
80% volume, dan tutup dengan kertas, serta kencangkan dengan karet
gelang.Media disterilkan dalam autoklaf. Untuk aquadest sebaiknya
dimasukkan dalam wadah kecil misalnya erlemeyer 250 ml dengan isi
maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Waktu sterilisasi
sama dengan waktu untuk sterilisasi alat-alat waktu 30 menit pada
tekanan 15 psi. atau 1 atm.Untuk media kultur yang tidak mengandung
bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf
pada temperatur 121oC, tekanan antara 15 psi atau 1 atm dengan
waktu antara 20-25 menit tergantung dari volume wadah dan volume
media. Untuk 15-50 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil
berukuran 50-100 ml, sterilisasi dilakukan pada tekanan 15 psi
dengan waktu 20 menit. Untuk 20 botol volume 1 liter membutuhkan
waktu yang lebih lama yaitu 34 menit, 10 botol volume 2 liter
memerlukan waktu 37 menit, 5 botol 4 liter waktu yang digunakan 52
menit. Dengan waktu yang lebih lama. Dalam sterilisasi aquadest dan
media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai,
autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila
tekanan diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan meluap
(bubbled up).Untuk bahan-bahan yang heat-labile dalam bentuk
larutan, sterilisasi dilakukan dengan menyaring larutan melalui
filter yang mempunyai ukuran pori 0.20-0.22 um. Diameter filter
yang bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin
disterilkan. Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang
dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang heat labile antara lain
: GA3, Thiamin-HCL, Ca-panthothenate, Antibiotik: carbenocilin.
Sterilisasi Peralatan Kultur
1. Botol bersih diberi beberapa tetes aquadest dan tutup dengan
kertas atau aluminium foil (jangan terlalu kencang bila menggunakan
al-foil). Untuk botol-botol yang mempunyai tutup yang
autoclaveable, jangan tutup terlalu kencang, karena selama
pemanasan terjadi pemuaian.2. Alat-alat yang perlu disterilkan
sebelum penanaman adalah: pinset, gunting, gagang skalpel, kertas
saring, petri-dish, botol-botol kosong, jarum dan pipet.3.
Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau
ditaruh dalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan
kain tebal sebelum dimasukkan dalam autoklaf. Alumunium foil tidak
direkomendasikan sebagai pembungkus, karena uap tidak dapat masuk
ke dalam bungkusan. Alat-alat sektio seperti pinset, gunting,
gagang skalpel, dan jarum, dibungkus dengan kertas kopi atau kertas
merang. Hindarkan penggunaan Al-foil karena uap sukar masuk kedalam
bungkusan sehingga sterilisasi kurang efektif.4. Petri-dish akan
disterilkan, juga dibungkus dengan kertas kopi atau kertas
merang.5. Temperatur yang digunakan untuk sterilisasi botol kultur
kosong dan alat-alat yang akan digunakan untuk menanam eksplan,
adalah 121o C pada tekanan 15 psi (pound per square inch) atau 1
atm selama 30-60 menit. Penghitungan waktu sterilisasi dimulai
setelah tekanan dan temperatur yang diinginkan tercapai..Alat-alat
yang dipakai ketika penanaman, harus dalam keadaan steril.
Alat-alat logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat
tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan
pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator. Khusus untuk
skalpel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan, namun mata
pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam
temperature tinggi. Oleh karena itu untuk mata pisaunya dianjurkan
cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan
kaporit.
Sterilisasi menggunakan Oven
Botol-botol/tabung reaksi/erlenmeyer yang dipergunakan sebagai
wadah, biasanya disterilkan dalam oven. Botol-botol yang sudah
dicuci bersih, dimasukkan ke dalam oven dan dipanaskan selama 4 jam
pada temperatur 160o C. Setelah disterilkan dapat langsung
digunakan. Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama, maka
sewaktu sterilisasi, mulut botol harus ditutup dengan alumunium
foil.
Sterilisasi GasSterilisasi gas digunakan dalam pemaparan gas
atau uap untuk membunuh mikroorganisme dan sporanya. Meskipun gas
dengan cepat berpenetrasi ke dalam pori dan serbuk padat,
sterilisasi adalah fenomena permukaan dan mikroorganisme yang
terkristal akan dibunuh.Sterilisasi yang digunakan dalam bidang
farmasi untuk mensterilkan bahan-bahan dan menghilangkan dari bahan
yang disterilkan pada akhir jalur sterilisasi, gas ini tidak inert,
dan kereaktifannya terhadap bahan yang disterilkan harus
dipertimbangkan misalnya thiamin, riboflavin, dan streptomisin
kehilangan protein ketika disterilkan dengan etilen oksida.Etilen
oksida bereaksi sebagai bakterisida dengan alkalis asam amino,
hidroksi atau gugus sulfur dari enzim seluler atau protein.
Beberapa lembab dibutuhkan untuk etilen oksida berpenetrasi dan
menghancurkan sel. Kelembaban rendah misalnya minimal 20%, angka
kematian tidak logaritmik (tidak nyata).Tetapi mikroorganisme
muncul peningkatan resistensinya dengan penurunan kelembaban. Dalam
prakteknya, kelembaban dalam chamber pensteril ditingkatkan dari
50-60% dan dipegang untuk suatu waktu pada permukaan dan kelembaban
membran sel sebelum penggunaan etilen oksida.Etilen oksida bersifat
eksplosif ketika dicampur dengan udara. Penghilangan sifat
eksplosif dengan menggunakan campuran etilen oksida dan
karbondioksida. Seperti Carboxide, Oxyfume 20, campuran etilen
oksida dengan hidrokarbon terflouronasi seperti Storoxide
12.Keduanya diluent inert yang mempunyai tekanan uap yang tinggi
dan bereaksi sebagai pembakar etilen oksida keluar dari silinder
masuk ke dalam chamber steril. Komponen terfloronasi mempunyai
keuntungan over karbondioksida yang disimpan dalam wadah yang
ringan dan campuran mengizinkan tekanan parsial tinggi dari etilen
oksida pada chamber pensteril pada tekanan total yang
sama.Sterilisasi gas berjalan lambat waktu sterilisasi tergantung
pada keberadaan kontaminasi kelembaban, temperatur dan konsentrasi
etilen oksida. Konsentrasi minimum etilen oksida dalam 450 mg/L,
271 Psi, konsentrasi ini 85C dan 50% kelembaban relativ dibutuhkan
4-5 jam pemaparan. Di bawah kondisi sama 1000 mg/L membutuhkan
sterilisasi 2-3 jam. Dalam partikel 6 jam pemaparan etilen oksida
digunakan untuk menyiapkan tepi yang aman dan memperbolehkan waktu
untuk penetrasi gas ke dalam bahan sterilisasi.Sisa gas dihilangkan
dengan terminal vakum dilanjutkan oleh pembersihan udara yang
difiltrasi. Cara ini digunakan untuk mensterilkan obat serbuk
seperti penisilin, juga telah digunakan untuk sterilisasi benang,
plastik tube. Penggunaan etilen oksida untuk sterilisasi akhir
peralatan parenteral tertentu seperti kertas karf dan lapisan tipis
polietilen. Semprot aerosol etilen oksida telah digunakan untuk
mensterilkan daerah sempit dimana dilakukan teknik aseptis.Gas yang
biasa digunakan adalah etilen oksida dalam bentuk murni atau
campuran dengan gas inert lainnya. Gas ini sangat mudah menguap dan
sangat mudah terbakar. Merupakan agen alkilasi yang menyebabkan
dekstruksi mikroorganisme termasuk sel-sel spora dan vegetatif.
Sterilisasi dilakukan dalam ruang/chamber sterilisasi.Sterilisasi
menghasilkan bahan toksik seperti etilen klorohidrin yang
menghasilkan ion klorida dalam bahan-bahan. Digunakan untuk
sterilisasi ala-alat medis dan baju-baju medis, bahan-bahan seperti
pipet sekali pakai dan cawan petri yang digunakan dalam
laboratorium mikrobiologi. Residu etilen oksida adalah bahan yang
toksik yang harus dihilangkan dari bahan bahan yang disterilkan
setelah proses sterilisasi, yang dapat dilakukan dengan mengubah
suhu lebih tinggi dari suhu kamar. Juga perlu dilakukan
perlindungan terhadap personil dari efek berbahaya gas
ini.Faktor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi ini termasuk
kelembaban, konsentrasi gas, suhu dan distribusi gas dalam chamber
pengsterilan. Penghancuran bakteri tergantung pada adanya
kelembaban, gas dan suhu dalam bahan pengemas, penetrasi melalui
bahan pengemas, pada pengemas pertama atau kedua, harus dilakukan,
persyaratan desain khusus pada bahan pengemas.Mekanisme aksi etilen
oksidaEtilen oksida dianggap menghasilkan efek letal terhadap
mikroorganisme dengan mengalkilasi metabolit esensial yang terutama
mempengaruhi proses reproduksi. Alkilasi ini barangkali terjadi
dengan menghilangkan hidrogen aktif pada gugus sulfhidril, amina,
karboksil atau hidroksil dengan suatu radikal hidroksi etil
metabolit yang tidak diubah dengan tidak tersedia bagi
mikroorganisme sehingga mikroorganisme ini mati tanpa reproduksi.B.
STERILISASI SECARA MEKANIK
Filter BakteriCara kerja dari sterilisasi ini berbeda dari
metode lainnya karena sterilisasi ini menghilangkan mikroorganisme
melalui penyaringan dan tidak menghancurkan mikroorganisme
tersebut. Penghilangan mikroorganisme secara fisik melalui
penyaring dengan matriks pori ukuran kecil yang tidak membiarkan
mikroorganisme untuk dapat melaluinya.Cara sterilisasi ini untuk
produk berupa cairan yang dapat disaring atau bahan yang tidak
tahan terhadap panas dan tidak dapat disterilkan dengan cara
sterilisasi lain. Teknologi tinggi membran filtrasi meningkatkan
penggunaan sterilisasi filtrasi, khusunya jika digunakan
berpasangan dengan sistem proses aseptik.Keefektifan sterilisasi
filtrasi dapat merupakan fungsi magnitude dari beban
mikroorganisme, selama tersumbat pada penyaring dapt terjadi pada
konsentrasi yang tinggi dari mikroorganisme. Tekanan, laju aliran,
dan karakteristik dari peenyaring adalah parameter yang harus
dikontrol untuk mencapai sterilisasi pada produk yang dapat
diprediksi dan reproduksibel.Ukuran nominal pori penyaring 0,2 ?m
atau kurang dan penyaring dibuat dari berbagai jenis bahan seperti
selulosa asetat, selulosa nitrat, florokarbonat, polimer akrilik,
polikarbonat, poliester, polivinil klorida, vinil, nilon, politef,
dan berbagai tipe bahan lain termasuk memban logam.Larutan dapat
dibebaskan dari organisme vegetatif dan spora bakteri dengan
melalui filter bakteri, filter bakteri tidak membebaskan larutan
dari virus. Bagaimanapun alat ini tidak mengurangi jumlah dan
adanya virus, secara prinsip oleh adsorbsi pada dinding filter dan
penghilangan partikel besar dari bahan yang mengandung
virus.Sterilisasi dengan filter bakteri digunakan untuk larutan
farmasetik atau bahan biologi yang tidak diefektifkan oleh panas.
Berbeda dengan metode filtrasi lain, filter bakteri ditujukan untuk
filtrasi bebas bakteri. Metode sterilisasi ini membutuhkan
penggunaan teknik aseptik yang benar. Sediaan obat yang disterilkan
dengan metode ini dibutuhkan yang mengandung bahan, bakteristatik,
kecuali dinyatakan lain. Larutan yang ditujukan untuk injeksi
intratekal atau merupakan larutan dosis tunggal intravena dengan
volume lebih dari 15 ml, tidak boleh ditambahkan bahan
bakterisida.Paraffin cair dan minyak lain, tidak disterilkan dengan
metode ini karena dapat meningkatkan permeabilitas dari filter
bakteri. Untuk membuat larutan bebas dari bakteri dan steril,
filter dengan berbagai tipe digunakan. Tipe ini termasuk filter
yang terbuat dari silikon murni (diatomaccus atau klesegurh),
porcelin, asbes dan gelas fritled. Karena alat-alat ini mudah
dibersihkan filter seitz yang menggunakan lapisan asbes dan
filter-glass mungkin lebih berguna untuk farmasis.Filter dengan
pori yang lebih kecil menghilangkan bakteri tetapi beberapa
filtrasi sangat lambat untuk tujuan praktis. Dengan meningkatnya
kekentalan dari lilin filter sangat menghasilkan filtrasi yang
efektif, tetapi kekurangannya adalah banyak dari bahan aktif
larutan dihilangkan oleh adsorbsi pada lilin.Bagaimanapun, dengan
mengatur ukuran pori dan kekentalan dari filter sampai optimum.
Filter dapat menjadi sangat efisien dan sangat cepat. Faktor lain
dari filter bakteri yaitu keseimbangan permukaan antara bahan dari
filter dengan bakteri dari larutan, tekanan yang digunakan, waktu
filtrasi, muatan listrik dan filter, pH dari bahan yang disaring
dan absorpsi dari protein dan bahan lain.Filter seitz
Bagian dari filter ini dibuat dari bahan asbestos yang dijepit
pada dasar wadah besi. Keuntungan utama dari filter seitz adalah
lapisan filter dapat dibuang setelah digunakan dan untuk masalah
ini pembersihannya berkurang. Efisiensi dari filter ini tergantung
pada pengembangan serat dan lapisan filter oleh air. Karena larutan
alkohol pekat tidak mengembang, filter ini tidak digunakan untuk
mensterilkan larutan yang mengandung alcohol dengan jumlah besar.
Filter ini mampu dengan kapasitas volume dari 30 ml hingga lebih
100 ml.Kerugian pertama dari filter ini cenderung memberikan
komponen magnesium pada filtrat. Bahan alkalin ini dapat
menyebabkan pengendapan dari alkaloid bebas dari garamnya dan dapat
menginaktifkan bahwa yang sensitiv seperti insulin, ekstrak
pituitary, epinefrin, dan apomorphin. Hal ini dapat diatasi dengan
perawatan pertama dengan filter dengan dibasahkan dengan HCl dan
kemudian dibilas dengan air.Kerugian kedua dari seitz adalah
permukaan serat dari lapisan filtrat, membuat larutan tidak cocok
untuk injeksi. Ini dapat diatasi dengan menempatkan ayakan dari
nilon atau sutra, di bawah lapisan filter sebelum menempatkan
lapisan di dalam filter atau sebuah fritted glass dapat ditempelkan
pada saluran. Kedua untuk menghilangkan serat. Filter seitz juga
cenderung menghilangkan substrat dari filtrate dengan
absorpsi.Filter SwinnySebuah adaptasi dari filter seitz, filter
swinny mempunyai adaptor khusus yaitu terdiri dari lapisan asbes,
bersama dengan layer dan pencuci. Keutamaan untuk digunakan filter
swinny di bungkus dengan kertas dan autoklaf. Bagian yang dipotong
dihubungkan pada spoit werlock dan cairan dimasukkan ke potongan
asbes dengan menggunakan tekanan pada sal spoit.Filter
Fritted-GlassFilter Sintered Fritted-Glass dapat dihancurkan oleh
kandungan dalam serbuk, tombol bulat dari gelas digabungkan bersama
dengan penggunaan panas untuk menempatkan ukuran dari bentuk
potongan. Permeabilitas dari filter berbanding lurus dengan
berkembangnya ukuran. Setelah potongan dibentuk, potongan disegel
dengan pemanasan didalam gelas pirex seperti corong Buchner.Filter
Berkefeld dan MandlerMandler terbuat dari tanah silika murni,
asbestos dan kalsium sulfat. Berkefeld disusun juga dari tanah
silika murni. Masing-masing filter bermuatan negatif. Tersedia
dalam beberapa prioritas berdasarkan permeabilitasnya ke dalam air
dalam Bekerfeld atau Mandler.Filter SelasFilter ini secara kimia,
menjadi resistensi terhadap semua larutan yang tidak menyerang
silika. Karena masing-masing partikel meliputi filter semata-mata
bersama selama proses manufaktur, ada bahaya kecil
partikel-partikel dari filter jauh dalam larutan.Filter
Candles-Pasteur-ChamberlandAda pemanasan dengan Bekerfeld tetapi
dibuat dari pori porselen tak berkaca dengan pori kecil yang
menghasilkan filtrasi lambat.C. STERILISASI SECARA FISIKA1.
Pemanasan Keringa. Udara Panas OvenBahan yang karena karakteristik
fisikanya tidak dapat disterilisasi dengan uap destilasi dalam
udara panas-oven. Yang termasuk dalam bahan ini adalah minyak
lemak, paraffin, petrolatum cair, gliserin, propilen glikol. Serbuk
steril seperti talk, kaolin dan ZnO, dan beberapa obat yang lain.
Sebagai tambahan sterilisasi panas kering adalah metode yang paling
efektif untuk alat-alat gelas dan banyak alat-alat bedah.Ini harus
ditekankan bahwa minyak lemak, petrolatum, serbuk kering dan bahan
yang sama tidak dapat disterilisasi dalam autoklaf. Salah satu
elemen penting dalam sterilisasi dengan menggunakan uap autoklaf.
Atau dengan adanya lembab dan penembusannya ke dalam bahan yang
telah disterilkan.Sebagai contoh, organisme pembentuk spora dalam
medium anhidrat tidak dibunuh oleh suhu sampai 121o C (suhu yang
biasanya digunakan dalam autoklaf bahkan setelah pemanasan sampai
45 menit). Untik alasan ini, autoklaf merupakan metode yang tidak
cocok untuk mensterilkan minyak, produk yang dibuat dengan basis
minyak, atau bahan-bahan lain yang mempunyai sedikit lembab atau
tidak sama sekali.Selama pemanasan kering, mikroorganisme dibunuh
oleh proses oksidasi. Ini berlawanan dengan penyebab kematian oleh
koagulasi protein pada sel bakteri yang terjadi dengan sterilisasi
uap panas. Pada umumnya suhu yang lebih tinggi dan waktu pemaparan
yang dibutuhkan saat proses dilakukan dengan uap di bawah tekanan.
Saat sterilisasi di bawah uap panas dipaparkan pada suhu 121C
selama 12 menit adalah efektif. Sterilisasi panas kering
membutuhkan pemaparan pada suhu 150C sampai 170C selama 1-4
jam.Suhu yang biasa digunakan pada sterilisasi panas kering 160C
paling cepat 1 jam, tapi lebih baik 2 jam. Suhu ini digunakan
secara khusus untuk sterilisasi minyak lemak atau cairan anhidrat
lainnya. Bagaimanapun juga range 150-170C digunakan untuk
streilisasi panas kering dan lain-lain, sebagai contoh :
bahan-bahan gelas, dapat disterilkan pada suhu 170oC. dimana
beberapa serbuk seperti sulfonilamid harus disterilkan pada suhu
rendah dan waktu yang lebih lama.Secara umum, panas kering
digunakan untuk sterilisasi bahan bahan melalui proses pengabuan
dari mikroorganisme. Proses ini merupakan kelanjutan atau
sekumpulan proses yang dilakukan dalam sebuah oven dengan
temperatur sekelilingnya 170C untuk sterilisasi atau 250C untuk
depirogenisasi. Panas kering digunakan untuk
sterilisasi/depirogenisasi alat-alat gelas yang akan digunakan
untuk proses produksi secara aseptik.Suhu yang digunakan ini,
terlalu tinggi untuk wadah-wadah plastik. Sama seperti sterilisasi
uap air, prosesnya dapat diprediksi dan hasilnya dapat dikontrol.
Sterilisasi panas kering biasa digunakan untuk depirogenisasi
alat-alat gelas dan bahan-bahan lain yang memiliki kemampuan
bertahan pada suhu yang digunakan. Secara umum, validasi untuk alur
depirogenisasi untuk proses panas kering selalu termasuk proses
sterilisasinya.Panas kering pada temperatur lebih 160oC efektif
menghancurkan mikroorganisme hidup dengan sebuah proses kehilangan
kelembaban secara inversible. Proses ini berjalan relatif lambat,
mengisyaratkan sedikitnya 1 jam pada suhu 160oC tetapi lebih cepat
pada temperatur yang tinggi. Panas kering ini sering merugikan
beberapa produk.Penerapan panas dengan keberadaan lembab lebih
fektif untuk pembunuhan mikroorganisme diisyaratkan 15 menit pada
suhu 121oC.Beberapa bahan yang tidak dapat disterilkan dengan uap,
paling baik disterilkan dengan panas kering,. Misalnya petrolatum
jelly, minyak mineral, lilin, wax, serbuk talk. Karena panas kering
kurang efisien dibanding panas lembab, pemaparan lama dan
temperatur tinggi dibutuhkan. Range luas waktu inaktivasi dalam
temperatur bervariasi telah diterapkan berdasarkan tipe indikator
steril yang digunakan, kondisi kelembaban dan faktor lain.Jumlah
air dalam sel mikroba diketahui mempengaruhi resistensinya terhadap
destruksi panas kering. Umumnya, ini diterima bahwa sel mikroba
dalam daerah yang betul-betul kering menunjukkan resistensi
terhadap inaktivasi panas kering. Ini jelas bahwa perhatian harus
diberi untuk mendisain siklus sterilisasi panas kering untuk
produk-produk rumah sakit dan validasi sistematis sterilisasi
dengan metode sterilisasi standar.Oven digunakan untuk sterilisasi
panas kering biasanya secara panas dikontrol dan mungkin gas atau
elektrik gas.Beberapa waktu dan suhu yang umum digunakan pada oven
:* 170C (340 F) sampai 1 jam* 160C (320 F) sampai 2 jam* 150C (300
F) sampai 2,5 jam* 140C (285 F) sampai 3 jamb. Minyak dan penangas
lain
Bahan kimia yang stabil dalam ampul bersegel dapat disterilisasi
dengan mencelupkannya, dalam penangas yang berisi minyak mineral
pada suhu 1620C. larutan jenuh panas dari natrium atau ammonia
klorida dapat juga digunakan sebagai pensterilisasi. Ini merupakan
metode yang mensterilisasi alat-alat bedah. Minyak dikatakan
bereaksi sebagai lubrikan, untuk menjaga alat tetap tajam, dan
untuk memelihara cat penutup.c. Pemijaran langsungPemijaran
langsung digunakan untuk mensterilkan spatula logam, batang gelas,
filter logam bekerfield dan filter bakteri lainnya. Mulut botol,
vial, dan labu ukur, gunting, jarum logam dan kawat, dan alat-alat
lain yang tidak hancur dengan pemijaran langsung. Papan salep,
lumping dan alu dapat disterilisasi dengan metode ini.Dalam semua
kasus bagian yang paling kuat 20 detik. Dalam keadaan darurat ampul
dapat disterilisasi dengan memposisikan bagian leher ampul kearah
bawah lubang kawat keranjang dan dipijarkan langsung dengan api
dengan hati-hati. Setelah pendinginan, ampul harus segera diisi dan
disegel.
2. Panas lembaba) Uap bertekanan
Stelisisasi termal menggunakan tekanan uap jenuh dalam sebuah
autoklaf. Ini merupakan metode sterilisasi yang biasa digunakan
dalam industri farmasi, karena dapat diprediksi dan menghasilkan
efek dekstruksi bakteri, dan parameter-parameter sterilisasi
seperti waktu dan suhu dapat dengan mudah dikontrol dan monitoring
dilakukan sekali dalam satu siklus yang divalidasi.Secara umum,
sterilisasi panas lembab dilakukan pada suhu 121C dibawah tekanan
15 psig. Pada suhu ini konsep letal dilakukan dengan F0 yang juga
dilakukan bila suhu sterilisasi berbeda dari 121C. F0 dari proses
ini tidak jauh pada 121C dengan waktu yang dibutuhkan, dalam menit,
untuk menghasilkan kematian yang setara dengan hasil pada 121C pada
waktu tertentu.Penggunanaan uap bertekanan atau metode sterilisasi
yang paling umum memuaskan dan efektif yang ada. Ini adalah metode
yang diinginkan untuk sterilisasi larutan yang ditujukan untuk
infeksi pada tubuh, pembawa pada sediaan mata, bahan-bahan gelas.
Untuk penggunaan darurat, pakaian dan alat kesehatan dan
benda-benda karet. Kerugian yang paling prinsip dan penggunaan uap
ini adalah ketidaksesuaiannya untuk penggunaan pada bahan sensitif
terhadap panas dan kelembaban.Metode ini tidak dapat digunakan
untuk sterilisasi misalnya, produk yang dibuat dari basis minyak
dan serbuk. Uap jenih pada 120C mampu membunuh secara cepat semua
bentuk vegetatif mikroorganisme hidup dalam waktu menit. Uap jenuh
ini dapat menghancurkan spora vegetatif yang tahan terhadap
pemanasan tinggi. Keefektifan sterilisasi uap bertekanan tergantung
pada 4 sifat dari uap jenuh kering yaitu : Suhu Panas tersembunyi
yang berlimpah Kemapuan untuk membentuk kondensasi air Kontraksi
volume yang timbul selama kondensasiWaktu yang dibutuhkan untuk
mensterilkan larutan saat suhu 121oC selama 12 menit, ditambah
waktu tambahan untuk larutan dalam wadah untuk mencapai 121C
setelah termometer pensteril menunjukkan suhu ini. Secara umum
larutan dalam botol 100-200 ml akan membutuhkan kurang 5 menit
botol 500 ml antara 10-15 menit.Panas lembab merupakan bentuk uap
jenuh di bawah tekanan yang merupakan cara sterilisasi yang paling
banyak digunakan. Penyebab kematian dengan cara sterilisasi panas
terhadap lembab berbeda dengan cara panas kering, kematian
mikroorganisme oleh panas lembab adalah hasil koagulasi protein
sel, berbeda dengan cara panas kering, kematian mikroorganisme yang
paling penting adalah proses oksidasi.USP menentukan sterilisasi
uap sebagai penerapan uap jenuh di bawah tekanan paling kurang 15
menit dengan temperatur minimal 121oC dalam jaringan tekanan.
Bentuk yang paling sederhana dari autoklaf adalah home pressure
cooker.b). Uap panas pada 100oCUap panas pada suhu 100oC dapat
digunakan dalam bentuk uap mengalir atau air mendidih. Metode ini
mempunyai keterbatasan penggunaan uap mengalir dilakukan dengan
proses sterilisasi bertingkat untuk mensterilkan media kultur.
Metode ini jarang memuaskan untuk larutan yang mengandung
bahan-bahan karena spora sering gagal tumbuh dibawah kondisi ini,
bentuk vegetatif dari kebanyakan bakteri yang tidak membentuk
spora. Temperatur suhu titik mati bervariasi, tetapi tidak ada
bentuk non spora yang bertahan.Dalam prakteknya, 2 metode uap
mengalir digunakan, suatu perpanjangan pemaparan uap selama 20-60
menit akan membunuh semua bentuk vegetatif bakteri tapi tidak akan
menghancurkan spora. Untuk meyakinkan penghancuran spora,
sterilisasi berjeda yang juga disebut sterilisasi tidak berlanjut.
Penjedahan dan bertahap adalah tindalisasi digunakan. Dengan metode
ini bahkan dipaparkan pada uap mengalir pada periode waktu
bervariasi dari 20-60 menit setiap hari selama 3 menit.Antara
pemaparan bahan terhadap uap yang disimpan pada suhu kamar atau
pada inkubator pada 37oC. prinsip dari metode ini adalah pada saat
waktu pertama kali pemaparan pada uap membunuh bakteri vegetatif
tapi tidak sporanya. Tapi pada saat bahan disimpan pada inkubator
atau pada suhu ruangan selam 24 jam, banyak spora akan tumbuh ke
dalam bentuk vegetatif bentuk spora yang telah tumbuh ini akan
dimatikan pada pemanasan hari ke dua. Kesuksesan dari proses ini
tergantung pada spora yang berkembang ke bentuk vegetatif selama
masa istirahat.c). Pemanasan dengan bakterisidaIni menghadirkan
aplikasi khusus dari pada uap pans pada 100oC. adanya bakterisida
sangat meningkatkan efektifitas metode ini. Metode ini digunakan
untuk larutan berair atau suspensi obat yang tidak stabil pada
temperatur yang biasa diterapkan pada autoklaf.Larutan yang
ditumbuhkan bakterisida ini dpanaskan dalam wadah bersegel pada
suhu 100oC selama 20 menit dalam pensterilisasi uap atau penangas
air. Bakterisida yang dapat digunakan termasuk 0,5%, fenol, 0,5%
klorbutanol, 0,2% kresol atau 0.002% fenil merkuri nitrat saat
larutan dosis tunggal lebih dari 15 ml larutan obat untuk injeksi
intratekal atau gastro intestinal sehingga tidak dibuat dengan
metode ini.d). Air mendidihPenangas air mendidih mempunyai kegunaan
yang sangat banyak dalam sterilisasi jarum spoit, penutup karet,
penutup dan alat-alat bedah. Bahan-bahan ini harus benar-benar
tertutupi oleh air mendidih dan harus mendidih paling kurang 20
menit. Setelah sterilisasi bahan-bahan dipindahkan dan air dengan
pinset yang telah disterilisasi menggunakan pemijaran. Untuk
menigkatkan efisiensi pensterilan dari air, 5 % fenol, 1-2%
Na-carbonat atau 2-3% larutan kresol tersaponifikasi yang
menghambat kondisi bahan-bahan logam.3. Cara Bukan Panas
Sinar ultravioletSinar ultraviolet umumnya digunakan untuk
membantu mengurangi kontaminasi di udara dan pemusnahan selama
proses di lingkungan. Sinar yang bersifat membunuh mikroorganisme
(germisida) diproduksi oleh lampu kabut merkuri yang dipancarkan
secara eksklusif pada 253,7 nm .Sinar UV menembus udara bersih dan
air murni dengan baik, tetapi suatu penambahan garam atau bahan
tersuspensi dalam air atau udara menyebabakan penurunan derajat
penetrasi dengan cepat. Untuk kebanyakan pemakaian lama penetrasi
dihindarkan dan setiap tindakan membunuh mikroorganisme dibatasi
pada permukaan yang dipaparkan.Aksi letalKetika sinar UV melewati
bahan, energi bebas ke elektron orbital dalam atom-atom dan
mengubah kereaktivannya. Absorpsi energi ini menyebabkan
meningginya keadaan tertinggi atom-atom dan mengubah
kereaktivannya. Ketika eksitasi dan perubahan aktivitas atom-atom
utama terjadi dalam molekul-molekul mikroorganisme atau metabolit
utamnya, organisme itu mati atau tidak dapat berproduksi. Pengaruh
utamanya mungkin pada asam nukleat sel, yang diperhatikan untuk
menunjukkan lapisan absorpsi kuat dalam rentang gelombang UV yang
panjang.Radiasi pengionRadiasi pengion adalah energi tinggi yang
terpancar dari radiasi isotop radioaktif seperti kobalt-60 (sinar
gamma) atau yang dihasilkan oleh percepatan mekanis elektron sampai
ke kecepatan den energi tinggi (sinar katode, sinar beta). Sinar
gamma mempunyai keuntungan mutlak karena tidak menyebabkan
kerusakan mekanik, namun demikian, kekurangan sinar ini adalah di
hentikan dari, mekanik elektron akselerasi (yang dipercepat)
keuntungan elektron yang dipercepat adalah kemampuannya memberikan
output laju doisis yang lebih seragam.Aksi letal radiasi pengionan
menghacurkan mikroorganisme dengan menghentikan rep-roduksi sebagai
hasil mutasi letal. Mutasi ini disebabkan karena transformasi
radiasi menjadi molekul penerima pada sinar x, menurut teori
langsung. Mutasi ini dapat disebabkan oleh tindakan tidak langsung,
dimana molekul-molekul air diubah menjadi kesatuan yang berenergi
tinggi seperti hidrogen dan ion hidroksil. Semua ini pada akhirnya,
menyebabkan perubahan energi pada asam nukleat dan molekul lain
sehingga hilangnya keberadaannya bagi metabolisme molekul sel
bakteri.Dekstruksi bakteri untuk menghasilkan kondisi steril dapat
dilakukan dengan menggunakan radiasi pengion, dengan efek pada asam
nukleat dari mikroorganisme yang nonreversibel. Pembentukan radikal
bebas dan peroksida yang merupakan senyawa reaktif juga memberikan
kontribusi pada letalitas dari proses sterilisasi ini. Dua tipe
radiasi pengion yang dapat digunakan yaitu radiasi sinar gamma dan
radiasi electron.Sterilisasi dengan radiasi digunakan untuk
alat-alat medis yang sensitive terhadap panas dan jika residu
etilen oksida tidak diharapkan. Pengukuran presisi dari dosis
radiasi, yang tidak berhubungan dengan suhu, adalah merupakan
faktor kontrol dalam sterilisasi radiasi selama dengan waktu
iradiasi. Monitoring dan kotrol proses sangat sederhana, tetapi
kehati-hatian akan keamanan harus dilakukan oleh operator
sterilisasi.Radiasi pengion juga digunakan untuk sterilisasi
bahan-bahan obat dan bahan-bahan formulasi. Kompabilitas dari bahan
yang disterilkan dengan radiasi adalah factor yang harus
diperhatikan sejak bahan-bahan dan alat-alat dipengaruhi oleh
radiasi, mungkin tidak dengan segera dilakukan penanganan tetapi
setelah stabilitas produk dapat dipengaruhi. Untuk bahan-bahan
medis dan plastik, perubahan dari sterilisasi etilen oksida ke
sterilisasi radiasi membutuhkan penentuan efek radiasi jangka
pendek dan jangka panjang, dan kadang membutuhkan modifikasi
produksi bahan plastik dan karet untuk membuatnya sesuai dengan
sterilisasi radiasi.Penerapan untuk sterilisasi iniElektron
dipercepat atau sinar gamma dapat digunakan untuk mensterilkan
produk-produk pilahan dengan suatu proses berkesinambungan.
Kebanyakan prosedur sterilisasi produk lain harus diselenggarakan
dalam batch setrilisasi dengan proses berkesinambungan memerlukan
pengendalian yang tepat, sehingga tidak ada bagian yang lepas dari
keefektifan sterilisasi.Radiasi ionisasi digunakan untuk
sterilisasi industri untuk alat-alat rumah sakit, vitamin,
antibiotik, steroid hormon dan transplantasi tulang dan jaringan
dan alat pengobatan seperti alat untuk suntik plastik, jarum, alat
beda, tube palstik, katter, benang bedah dan cawan Petri. Radiasi
ioniasasi dapat menghasilkan perubahan dalam molekul organik yang
dapat mempengaruhi kemujaraban sediaan atau dapat menginduksi
toksisitas. Radiasi produk juga dapat menghasilakn perubahan warna
dan kerapuhan beberapa wadah gelas dan bahan plastik.Sterilisasi
radiasi dapat dilakukan baik dengan radiasi elektromagnetik dan
radiasi partikel. Radiasi elektromagnetik dan energi foton,
termasuk ultra dari bahan radioaktif seperti kobalt 60 atau sesium
137 adalah yang paling sering digunakan sebagai sumber energi
sterilisasi adhesi elektromagnetik. Radiasi partikel atau molekul
termasuk daftar partikel yang steril.Satu-satunya sekarang yang
digunakan untuk sterilisasi radiasi pada obat-obat rumah sakit dan
laboratorium. Bagaimanapun banyak prosedur sterilisasi industri
manggunakan radiasi, termasuk penjelasan singkatnya. Beberapa
informasi mengenai efek sterilisasi ultraviolet juga
dihadirkan.Prinsip bermuatan negatif sepeti elektron yang
berinteraksi langsung dengan bahan menyebabkan ionisasi seperti
elektron elektromagnetik menyebabkan ionisasi pada mekanisme yang
bervariasi yang menghasilkan perpindahan suatu orbital elektron
dengan mekanisme jumlah tertentu dari energi yang ditransfer dalam
insiden sinar gamma. Perpindahan elektron ini kemudian bentindak
sebagai partikel beta dalam reduksi. Oleh sebab itu baik partikel
maupun elektromagnetik, dipertimbangkan sebagai radiasi ionisasi
yang berbeda dengan radiasi sinar ultraviolet.Kerugian penggunaan
germisida radiasi sinar UV adalah penetrasinya terbatas, pada
panjang gelombang 253,7 nm, diserap oleh banyak bahan dan membuat
penggumpalan organisme dan hal tersebut dilindungi oleh debu dan
puing-puing. Untuk menghindari aksi letal panggunaan radiasi sinar
UV sebagai cara sterilisasi tidak direkomendasikan lemak jika
bahan-bahan yang diradiasi sangat bersih dan bebas yang dapat
melindungi mikroorganisme.KESIMPULAN :Metode sterilisasi yaitu :1.
Metode Kimiaa. Menggunakan bahan kimiaDalam pensterilan digunakan
bahan kimia seperti alkohol 70%, fenol 5%.b. Sterilisasi gasDalam
pensterilan digunakan bahan kimia dalam bentuk gas atau uap,
seperti etilen oksida, formaldehid, propilen oksida, klorin oksida,
beta propiolakton, metilbromida, kloropikrin. Digunakan untuk
sterilisasi bahan yang termolabil seperti bahan biologi, makanan,
plastik, antibiotik. Aksi antimikrobialnya adalah gas etilen oksida
mengadisi gugus SH, -OH, -COOH,-NH2 dari protein dan membentuk
ikatan alkilasi sehingga protein mengalami kerusakan dan mikroba
mati.2. Metode mekanikFiltrasiDigunakan untuk sterilisasi larutan
yang termolabil. Penyaringan ini menggunakan filter bakteri. Metode
ini tidak dapat membunuh mikroba, mikroba hanya akan tertahan oleh
pori-pori filter dan terpisah dari filtratnya. Dibutuhkan
penguasaan teknik aseptik yang baik dalam melakukan metode ini.
Filter biasanya terbuat dari asbes, porselen. Filtrat bebas dari
bakteri tetapi tidak bebas dari virus.3. Metode Fisikaa. Pemanasan
keringPrinsipnya adalah protein mikroba pertama-tama akan mengalami
dehidrasi sampai kering. Selanjutnya teroksidasi oleh oksigen dari
udara sehingga menyebabkan mikrobanya mati.- Udara panas
ovenDigunakan untuk sterilisasi alat gelas yang tidak berskala,
alat bedah, minyak lemak, parafin, petrolatum, serbuk stabil
seperti talk, kaolin, ZnO. Suhu sterilisasi yang digunakan adalah
170oC selama 1 jam, 160oC selama 2 jam, 150oC selam 3 jam.-
Pemijaran langsungDigunakan untuk sterilisasi alat logam, bahan
yang terbuat dari porselen, tidak cocok untuk alat yang berlekuk
karena pemanasannya tidak rata. Suhu yang digunakan 500-600oC dalam
waktu beberapa detik, untuk alat logam sampai berpijar.- Minyak dan
penangas lainDigunakan untuk sterilisasi alat bedah seperti gunting
bedah sebagai lubrikan menjaga ketajaman alat, bahan kimia stabil
dalam ampul. Bahan atau alat dicelupkan dalam penangas dicelupkan
dalam penangas yang berisi minyak mineral pada suhu 160oC. Larutan
natrium atau amonium klorida jenuh dapat digunakan pula sebagai
pengganti minyak mineral.b. Pemanasan basahPrinsipnya adalah dengan
cara mengkoagulasi atau denaturasi protein penyusun tubuh mikroba
sehingga dapat membunuh mikroba.- Uap bertekanan
(autoklaf)Digunakan untuk sterilisasi alat gelas, larutan yang
dimaksudkan untuk diinjeksikan ke dalam tubuh, alat berskala, bahan
karet. Waktu yang dibutuhkan untuk sterilisasi larutan suhu 121oC
adalah 12 menit. Uap jenuh pada suhu 121oC mampu membunuh secara
cepat semua bentuk vegetatif mikroorganisme dalam 1 atau 2 menit.
Uap jenuh ini dapat menghancurkan spora bakteri yang tahan
pemanasan.- Pemanasan dengan bakterisidaDigunakan untuk sterilisasi
larutan berair atau suspensi obat yang tidak stabil dalam autoklaf.
Tidak digunakan untuk larutan obat injeksi intravena dosis tunggal
lebih dari 15 ml, injeksi intratekal, atau intrasisternal. Larutan
yang ditambahkan bakterisida dipanaskan dalam wadah bersegel pada
suhu 100 oC selama 10 menit di dalam pensteril uap atau penangas
air. Bakterisida yang digunakan 0,5% fenol; 0,5% klorobutanol;
0,002 % fenil merkuri nitrat; 0,2% klorokresol.- Air
mendidihDigunakan untuk sterilisasi alat bedah seperti jarum spoit.
Hanya dilakukan dalam keadaan darurat. Dapat membunuh bentuk
vegetatif mikroorganisme tetapi tidak sporanya.c. Cara bukan
panasSterilisasi dengan radiasiPrinsipnya adalah radiasi menembus
dinding sel dengan langsung mengenai DNA dari inti sel sehingga
mikroba mengalami mutasi. Digunakan untuk sterilisasi bahan atau
produk yang peka terhadap panas (termolabil). Ada dua macam radiasi
yang digunakan yakni gelombang elektromagnetik (sinar x, sinar ?)
dan arus partikel kecil (sinar ? dan ?).
HANYA Rp.80rb,MESIN UANG anda jalan OTOMATISCara Praktis Pemula
Bikin Web MESIN UANG dgn 70 Rb
UANG MENCARI ANDACARA CERDIK BISNIS LEWAT INTERNET
Miliki aset di InternetPANDUAN BERBISNIS DI INTERNET
(RECOMMENDED)
Cara Praktis Menghasilkan UangAnda Mau Jadi Jutawan Baru?
Ladang Uang OnlinePELUANG DAHSYAT PASIVE INCOME
HIDUP INI INDAHHEBOH Tinggal Klik UANG NGALIR
KumpulBlogger.com
Pustaka :* Scovilles : The Art of Compounding, Glenn L. Jenkins
et.all., 1957, New York : MC-Graw Hill Book Companies.*
Pharmaceutical Technology, Eugene L. Parrott, 1974, Minneapolis :
Burgess Publishing Company.* Teori dan Praktek Farmasi Industri
(terjemahan), Leon Lachmann et.all., 1998, jakarta : UI-Press.*
Remingtons Pharmaceutical Sciences 18 th Edition, A.R. Gennaro,
1990, Pennsylvania : Mack Publishing Company.* Parenteral Manual
Technology, Michael J. groves, 1988, USA : Interpharm Press Inc.*
Validation of Pharmaceutical Processes (electronic
version),diposkan olehhari mulyakno
santosodi20.59label:sterilisasiKultur jaringan atau biakan jaringan
merupakan teknik pemeliharaanjaringanatau bagian dari individu
secara buatan (artifisial). Yang dimaksud secara buatan adalah
dilakukan di luar individu yang bersangkutan. Karena itu teknik ini
sering kali disebut kultur in vitro, sebagai lawan dari in vivo.
Dikatakan in vitro (bahasa Latin, berarti di dalam kaca) karena
jaringan dibiakkan di dalam tabunginkubasiataucawan
Petridarikacaatau material tembus pandang lainnya. Kultur jaringan
secara teoretis dapat dilakukan untuk semua jaringan, baik
daritumbuhanmaupunhewan(termasukmanusia) namun masing-masing
jaringan memerlukan komposisimediatertentu.Metode kultur jaringan
dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk
tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Bibit yang
dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan,
antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat
diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga tidak terlalu
membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan
jumlah besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit
lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan
dengan perbanyakan konvensional.Tahapan yang dilakukan dalam
perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan adalah:1)
Pembuatan media2) Inisiasi3) Sterilisasi4) Multiplikasi5)
Pengakaran6) AklimatisasiMedia merupakan faktor penentu dalam
perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan
tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang
digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon.
Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan
lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga
bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan
tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi
ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang
digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan
autoklaf.Inisiasi adalah pengambilan eksplan dari bagian tanaman
yang akan dikulturkan. Bagian tanaman yang sering digunakan untuk
kegiatan kultur jaringan adalah tunas.Sterilisasi adalah bahwa
segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat
yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang
juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu
menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan
yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus
steril.Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman
dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di
laminar flow untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan
gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung reaksi yang telah ditanami
ekplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang
steril dengan suhu kamar.Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan
menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses
kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik.
Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan
perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh
bakteri ataupun jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan
gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau
busuk (disebabkan bakteri).Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan
eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng. Pemindahan dilakukan
secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup.
Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan
seranganhamapenyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat
rentan terhadap seranganhamapenyakit dan udara luar. Setelah bibit
mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap
sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara
yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif.Keunggulan inilah
yang menarik bagi produsen bibit untuk mulai mengembangkan usaha
kultur jaringan ini. Saat ini sudah terdapat beberapa tanaman
kehutanan yang dikembangbiakkan dengan teknik kultur jaringan,
antara lain adalah: jati, sengon, akasia, dll.Bibit hasil kultur
jaringan yang ditanam di beberapa areal menunjukkan pertumbuhan
yang baik, bahkan jati hasil kultur jaringan yang sering disebut
dengan jati emas dapat dipanen dalam jangka waktu yang relatif
lebih pendek dibandingkan dengan tanaman jati yang berasal dari
benih generatif, terlepas dari kualitas kayunya yang belum teruji
diIndonesia. Hal ini sangat menguntungkan pengusaha karena akan
memperoleh hasil yang lebih cepat. Selain itu, dengan adanya
pertumbuhan tanaman yang lebih cepat .Tidak Sulit Belajar Kultur
Jaringan
Anggapan orang selama ini bahwa teknik kultur jaringan sangat
sulit dilakukan oleh orang awam dan biayanya sangat mahal tidak
betul. Teknologi ini pada awalnya memang hanya dilakukan di
kalangan perguruan tinggi dengan menggunakan peralatan yang canggih
dan mahal. Tujuan kultur jaringan banyak sekali, diantaranya adalah
untuk mendapatkan tanaman bebas penyakit/virus, mendapatkan tanaman
yang tahan terhadap stres tertentu (stres kekeringan, stres
salinitas, dll). Selain itu juga untuk menyelamatkan tanaman langka
agar tidak punah dan juga untuk memperbanyak tanaman dalam jumlah
banyak. Tujuan terakhir inilah yang rupanya saat ini menarik
perhatian banyak orang.Di negara-negara tetangga kita, kultur
jaringan sudah bukan hal yang asing lagi. Teknologi ini sudah
dikenalkan pada para petani sejak lama, sehingga mereka sangat
leluasa untuk menghasilkan produk2 tanaman yang berkualitas
bagus.Sekarang ini banyak bibit-bibit tanaman hias hasil kultur
jaringan yang masuk keIndonesia, sebut saja : Aglaonema, anthurium,
calladium, anggrek, dll.Tidak SulitBetul sekali apabila dikatakan
kultur jaringan tidak sulit. Pada intinya kita hanya melakukan
isolasi tanaman, bisa bagian protoplasma, sel, jaringan ataupun
organ tanaman yang selanjutnya ditanam dalam kondisi steril di
dalam botol menggunakan media buatan. Tanaman dalam botol itulah
yang kita pelihara hingga saatnya dikeluarkan dan ditanam di
luar.Kultur jaringan hanya butuh ketelatenan dari yang
mengerjakannya, dengan jam terbang yang semakin tinggi maka akan
semakin dirasakan bahwa teknik kultur jaringan sama sekali tidak
sulit.Tidak MahalPeralatan kultur jaringan seringkali menjadi momok
bagi orang awam yang ingin terjun di bidang ini. Menurut mereka,
semua alat-alat yang digunakan dalam proses kultur jaringan
membutuhkan biaya yang sangat mahal. Anggapan tersebut tidak 100%
betul, karena beberapa alat bisa dimodifikasi sehingga dapat
diberdayagunakan seperti alat-alat yang canggih dan mahal tsb. Saat
ini sudah banyak tersedia di pasaran alat-alat kultur jaringan
dengan harga terjangkau, misalnya : dengan uang 1 juta sudah bisa
mendapatkan entkas (alat untuk menanam dalam kondisi
steril)Bahan-bahan kimia untuk membuat media kultur juga sering
dituding menjadi mahalnya teknologi ini. Sebetulnya untuk media
tumbuh bisa disiasati dengan misalnya : membeli media kultur
jaringan jadi di pasaran atau membeli nempil (eceran) di
laboratorium-laboratorium kuljar atau bahkan bisa mencari media
alternatif dari bahan-bahan alami.Nah, sekarang menjadi tidak mahal
lagi bukan?Tahapan Kultur JaringanTahapan dalam kultur jaringan
diawali dengan pemilihan pohon induk yang bagus, sehat dan
berkarakter khusus. Pohon induk tsb nantinya akan dijadikan sebagai
sumber eksplan. Selanjutnya eksplan disterilkan menggunakan zat
tertentu, demikian juga semua peralatan yang akan digunakan perlu
disterilkan dalam autoklaf. Tahap berikutnya adalah mengiris
eksplan dalam ruang steril. Tahap inilah yang perlu teknik-teknik
khusus, beberapa tanaman yang mengeluarkan getah akan lebih bagus
bila diiris dalam larutan pencegah browning. Selanjutnya tanaman
ditanam dalam botol dan dipelihara hingga siap untuk diaklimatisasi
(dipindahkan dari botol ke pot).Pemilihan eksplan perlu mendapat
perhatian karena itulah yang nanti akan menentukan kualitas bibit
yang akan dihasilkan. Paling bagus apabila eksplan berasal dari
jaringan yang masih muda karena sel-selnya masih aktif membelah
(meristematis). Semua bagian tumbuhan dapat dijadikan eksplan,
mulai dari bunga, biji, akar, batang hingga daun.Harapan Untuk
Petani & Pengusaha TanamanUntuk lebih menggairahkan pertanian
diIndonesiadan agar tidak luar negeri minded artinya agar kita
tidak berfikir bahwa tanaman-tanaman dari luar negeri pasti bagus
maka kita harus berani berubah. Sudah saatnya para petani dan
pengusaha tanaman mengetahui bermacam-macam teknologi yang bisa
digunakan untuk meningkatkan hasil tanamannya, baik kuantitas dan
kualitasnya.Laboratorium kultur jaringan fakultas pertanian UPN
Jogjakarta yang berada di ring road utara condongcatur telp
0274-486693 siap untuk mentranfer ilmu tentang teknologi kultur
jaringan pada masyarakat umum dengan metode praktis dan mudah
diikuti. Tidak perlu background pertanian untuk mendalaminya,
bahkan para pensiunanpun akan mudah mengikuti praktek
mandirinya.
BAB IIMANFAAT KULTUR JARINGANPerbanyakan bibit dengan teknik
kultur jaringan, kultur organ, dan embiogenesis somatik dapat pula
diterapkan pada jaringan hewan dan manusia. Tidak seperti pada
tumbuhan, kultur pada hewan dan manusia tidak dapat dikembangkan
menjadi individu baru. Pengadaan bibit tidak tergantung musim Bibit
dapat diproduksi dalam jumlah banyak dengan waktu yang relatif
lebih cepat (dari satu mata tunas yang sudah respon dalam 1 tahun
dapat dihasilkan minimal 10.000 planlet/bibit) Bibit yang
dihasilkan seragam Bibit yang dihasilkan bebas penyakit
(menggunakan organ tertentu) Biaya pengangkutan bibit relatif lebih
murah dan mudah Dalam proses pembibitan bebas dari gangguanhama,
penyakit, dan deraan lingkunganlainnyaKULTUR jaringan adalah
serangkaian kegiatan yang dilakukan untukmembuat bagian tanaman
(akar, tunas, jaringan tumbuh tanaman) tumbuhmenjadi tanaman utuh
(sempurna) dikondisi invitro (didalam gelas).Keuntungan dari kultur
jaringan lebih hemat tempat, hemat waktu, dantanaman yang
diperbanyak dengan kultur jaringan mempunyai sifat samaatau seragam
dengan induknya. Contoh tanaman yang sudah lazimdiperbanyak secara
kultur jaringan adalah tanaman anggrek.
Alat-alatyang dipakai dalam penanaman dalamkultur jaringanharus
dalam keadaan steril. Alat-alat logam dan gelas dapat disterilkan
dalamautoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga
disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan
dalambacticineratorkhusus untuk scapel, gagangnya dapat disterilkan
dengan pemanasan namun pisaunya dapat menjadi tumpul bila
dipanaskan dalam temperatur tinggi. Oleh karena itu untuk bladenya
dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau
larutan kaporit.
Alat-alat kultur jaringan yang perlu disterilisasi sebelum
penanaman adalah; Pinset, Gunting, - Gagang scapel, Kertas saring,
Petridish, Botol-botol kosong, Jarum, Pipet
Autoklafyang dapat digunakan ada bermacam-macam mulai dari yang
sederhana sampai yang Programable. Autoklaf yang sederhana
menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan kedalam
autoklaf. Pemanasan air dapat menggunakan kompor atau api bunsen.
Dengan autoklaf sederhana ini tekanan dan temperatur diatur dengan
jumlah panas dari api. Kelemahan autoklaf ini adalah bahwa perlu
penjagaan dan pengaturan panas selama masa sterilisasi dilakukan
secara manual. Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan: sederhana,
harga relatif murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang
sering merupakan problema untuk negara-negara yang sedang
berkembang, serta lebih cepat dari autoklaf listrik yang seukuran
dan setaraf.
Media dan AquadesMedia dan aquadest yang akan digunakan dalam
kultur jaringan (kuljar)juga disterilisasikan dalam autoklaf. Untuk
aquadest sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya Erlenmeyer
250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif.
Waktu sterilisasi sama dengan waktu untuk sterilisasi alat-alat
yaitu 1 jam pada tekanan 17,5 psi.
Untuk media kulturjaringan (kuljar) yang tidak mengandung
bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf
pada temperatur 121C, tekanan antara 15-17.5 psi dengan waktu
antara 20-25 menit tergantung dari volume wadah dan volume media.
Untuk 15 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran
75ml, sterilisasi dilakukan tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit.
Volume yang lebih besar membutuhkan tekanan yang lebih tinggi
dengan waktu yang lebih lama. Dalam sterilisasi aquadest dan media,
setelah waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai, autoklaf
tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila tekanan
diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan meluap (Bubbled
up).
Untuk bahan-bahan kultur jaringan (kuljar) yang
heat-labile,dalam bentuk larutan, sterilisasi dilakukan dengan
menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori
0.20-0.22 dm. Diameter filter bermacam-macam tergantung dari volume
larutan yang ingin disterilkan. Untuk volume larutan 10 ml,
dipergunakan filter yang dipasang di ujung jarum suntik.Bahan yang
heat labileseperti: GA3, Thiamin-HCI, Ca-panthothenate dan
antibiotik: carbenocillin.
Botol-botol/tabung reaksi/erlenmeyeryang dipergunakan sebagai
wadah kultur jaringan biasanya disterilisasi dalam oven.
Botol-botol yang sudah dicuci bersih dimasukkan dalam oven dan
dipanaskan selama 4 jam pada temperatur 160C. Setelah disterilisasi
dapat langsung digunakan. Bila botol akan disimpan untuk beberapa
lama maka sewaktu sterilisasi, mulut botol harus ditutup dengan
aluminium foil.
EnkasSebelum digunakanenkaskultur jaringan harus disterilisasi
dengan menggunakan hand sprayer berisi spirtus atau campuran
formalin 10% dan alkohol 70% dengan perbandingan 1:1. Setelah enkas
tersebut disemprot kemudian dibiarkan terlebih dahulu kurang lebih
lebih 10 menit, baru kemudian boleh digunakan. Sebab, bila enkas
yang baru disemprot tersebut langsung digunakan. Maka formalin yang
belum kering bila terkena api spirtus dapat meledak sehingga
memecahkan enkas.
LaminarPenggunaaan formalin dalamlaminar air flowdalam kultur
jaringan,
"penggunaan formalin tidak dibenarkan sama sekali, karena uap
formalin dapat terhembus kearah dada sipenabur sehingga berbahaya
bagi kesehatannya. Strerilisasi pada laminar air flow yang
dibenarkan adalah dengan spirtus atau alkohol 70%. "
Sebelum mulai bekerja, permukaan tempat kerja darilaminar air
flow cabinetdilap dengan kapas yang telah dicelup dalam 70% alkohol
atau dalam larutan kaporit. Ada juga tipe laminar air flow cabinet
yang dilengkapi dengan lampu ultra violet. Sebelum kerja, lampu
ultra violet dinyalakan selama beberapa waktu antara 1-2 jam untuk
mematikan kontaminan dipermukaan tempat kerja. Laminar air flow
cabinet harus dijaga sebersih mungkin. Setelah bekerja, permukaan
tempat kerja dibersihkan dengan alkohol 70% atau dengan lampu ultra
violet selama 1-2 jam.AUTOCLAVE ALAT UNTUK STERILISASI ALAT DAN
MEDIUM DALAM KULTUR JARINGAN TUMBUHANAUTOCLAVE ALAT UNTUK
STERILISASI ALAT DAN MEDIUM DALAM KULTUR JARINGAN TUMBUHAN
Sterilisasi adalah setiap proses baik fisika, kimia dan mekanik
yang membunuh semua bentuk kehidupan terutama mikroorganisme atau
usaha untuk membebaskan alat dan bahan dari seala bentuk kehidupan
terutama mikrobia.Suatu alat atau bahan dikatakan steril apabila
alat atau bahan tersebut bebas dari mikrobia, baik dalam bentuk
veetatif ataupun spora.Suatu benda atau substansi hanya dapat
dikatakan steril atau tidak steril, tidak akan pernah munkin ada
setengah steril atau hamper steril.Untuk sterilisasi alat dan
medium diunakan sterilisasi dengan mengunakan alat yang disebut
autoclave. Autoclaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam
alat dan medium kultur jaringan tumbuhan denan mengunakan tekanan
15 psi (1,02 atm) dan suhu 121C . Suhu dan tekanan tinggi yang
diberikan kepada alat dan media kultur jarinan tumbuhan yang
disterilkan memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel
dibandingkan dengan udara panas. Biasanya untuk mensterilkan media
diunakan suhu 121C dan tekanan 15 lb/in (SI = 103,4 Kpa) selama 15
menit. Alasan digunakan 121C atau 249,8F adalah karena air mendidih
pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0
psi pada ketinggian di permukaan laut (sea level) air mendidih pada
suhu 100C, sedangkan untuk autoclave yan diletakkan pada ketingian
yang sama, mengunakan tekanan 15 psi maka air akan mendidih pada
suhu 121C. Kejadian ini hanya berlaku untuk sea level, jika
dilaboratorium yang terletak pada ketinggian tertentu, maka
pengaturan tekanan perlu diseting ulang. Misalnya autoclave
diletakkan pada ketinggian 2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan
menjadi 20 psi supaya tercapai suhu 121C untuk mendidihkan air.
Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 121C dan
tekanan 15 psi selama 15 menit.
Autoclave dengan sumber panas menggunakan kompor
Autoclave dengan sumber panas menggunakan listrik
Autoclave dengan sumber panas menggunakan kompor gas dan
listrik
Cara menggunakan autoclaveAutoclave merupakan alat yang terdiri
dari bejana tahan tekanan tinggi yang dilengkapi dengan manometer,
thermometer, dan klep bahaya. Langkah-langkah penggunaan autoclave
adalah sebagai berikut :Pertama kali masukkan aquadest ke dalam
bejana autoclave sampai batas yang ditentukan (tanda batas terdapat
di dalam bejana autoclave) setelah memasukkan aquadest masukkan
ansang ke dalam autoclave.
Setelah itu alat-alat dan media kultur jaringan tumbuhan yang
akan disterilkan dimasukkan ke dalam bejana autoclave (alat seperti
scalpel, pinset, petridisk dibungkus terlebih dahulu dengan
menggunakan kertas payung atau untuk botol kultur, erlenmeyer
bagian mulutnya ditutup dengan menggunakan aluminium foil).
Kemudian autoclave dihubungkan dengan sumber listrik apabila
autoclavenya mengunakan sumber panas dari listrik atau letakkan
autoclave di atas kompor gas untuk autoclave yang menggunakan api
dari kompor gas sebagai sumber panasnya.Pada saat sumber panas
dinyalakan air dalam autoclave lama-kelamaan akan mendidih dan uap
air yan terbentuk mendesak udara yan mengisi autoclave. Setelah
semua udara dalam autoclave diganti dengan uap air, katup uap atau
udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoclave naik. Pada
saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai, maka proses sterilisasi
dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. Setelah proses
sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan
turun perlahan hingga mencapai 0 psi. Autoclave tidak boleh dibuka
sebelum tekanan mencapai 0 psi. Setelah autoclave tekanannya 0 psi
dan sudah dingin maka autoclave baru boleh dibuka. Dan alat ataupun
media kultur jaringan tumbuhan yang disterilisasi dengan mengunakan
autoclave yang sudah steril dipindahkan ke tempat yang steril.
Alat-alat dan media yang bisa disterilisasi menggunakan
autoclave
Adapun alat yang dapat disterilisasi dengan menggunakan
autoclave antara lain petridisk, botol jam, pinset, scalpel.
Setelah dilakukan sterilisasi maka alat-alat tersebut menjadi
steril. Untuk tetap menjaga sterilitas alat-alat tersebut, setelah
diangkat dari dalam autoclave kemudian dimasukkan ke dalam oven
untuk penyimpanannya.I.PENDAHULUAN
A.Latar BelakangKultur jaringan merupakan suatu teknik budidaya
yang dilakukan secara invitro, tanaman dikembangkan dengan cara
dicukupi kebutuhannya secara lengkap dan diperhitungkan secara
tepat kadar kebutuhannya. Dasar dari teknik budidaya kultur
jaringan adalah teori totipotensi sel, suatu teori yang
mengungkapkan bahwa suatu sel mampu berkembang biak menjadi tanaman
yang sempurna apabila diletakkan pada media dan kondisi lingkungan
yang sesuai.Berdasarkan teori tersebut maka dalam kultur jaringan
harus menggunakan media yang sesuai untuk tanaman yang dikulturkan
dan kondisi lingkungan juga harus sesuai. Kondisi lingkungan yang
sesuai meliputi suhu, kelembaban, pencahayaan dan hal yang paling
utama yaitu kondisi harus aseptis. Keadaan yang aseptis merupakan
syarat mutlak dalam kultur jaringan. Kondisi aseptis tidak hanya
sebatas pada kondisi lingkungan, semua bahan dan sesutu yang
berhubungan dengan kegiatan tersebut haruslah dalam kondisi
aseptis.Pelaksanaan teknik kultur jaringan tanaman dilakukan
berdasarkan teori totipotensi sel yaitu kemampuan setiap sel untuk
tumbuh menjadi tanaman sempurna apabila diletakkan pada lingkungan
yang cocok dalam keadaan aseptik.Teknik kultur jaringan akan
berhasil dengan baik apabila semua persyaratan dipenuhi yaitu:
media yang cocok, kondisi atmosfer yang sesuai dan kondisi aseptik.
Kondisi aseptik berlaku untuk eksplan (bahan tanam), ruangan dan
peralatan yang digunakan. Apabila kondisi aseptik tidak dipenuhi,
maka kultur akan gagal karena kontaminasi.Untuk itu perlu dilakukan
sterilisasi peralatan yang akan digunakan. Sterilisasi dilakukan
dengan menggunakan autoclave (pakai kompor atau listrik), dengan
suhu dan tekanan tertentu.
B.Tujuan PraktikumPraktikum ini bertujuan untuk meningkatkan
keterampilan mahasiswa dalam melakukan sterilisasi peralatan dengan
autoclave.
II.METODE PELAKSANAANA.WaktuPraktikum dilakukan pada tanggal 26
November 2012B.Tempat pelaksanaanPraktikum dilakukan di
Laboratorium Agronomi Fakultas PertanianC.Alat dan
Bahan-Autoclave.-Kompor.-Glass ware(botol kultur, erlenmeyer,
petridish).-Dissecting kit (pinset dan skalpel).-Kertas
payung-Alumunium foil-Karet
gelang-Pipet-Pengaduk-Sabun-Air.D.Prosedur Kerja-Glass ware(botol
kultur, erlenmeyer, petridish) dan dissecting kit (pinset dan
skalpel) dicuci bersih dengan sabun, dibilas dengan air lalu
dikeringkan. Setelah kering mulut botol ditutup dengan aluminium
foil dan kertas payung dan diikat dengan karet gelang. Pinset dan
skalpel dibungkus dengan kertas atau aluminium foil.-Glass waredan
dissecting kit disterilisasi dengan autoclave pada suhu 1200C pada
tekanan 15 psi selama 15-30 menit.-Selama sterilisasi autoclave
ditutup rapat sehingga tekanan didalam autoclave naik.-Tekanan
tinggi itu dipertahankan selama 30 menit dengan mengecilkan
api.-Kompor dimatikan setelah proses sterilisasi selesai dan katup
dibuka untuk membuang uap air hingga tekanan 0 psi.-Autoclave
dibuka dan diambil peralatan yang sudah ada di dalamnya
diambil.-Peralatan yang sudah disterilisasi disimpan ditempat yang
bersih.
III.HASIL DAN PEMBAHASANA.HasilNoNama AlatGambarFungsi
1AutoclaveUntuk mensterilisasi peralatan dan media
2Magnetic StirerUntuk mengaduk dan mencampur larutan
3pH meterUntuk mengukur pH
4Timbangan analitik
Untuk menimbang bahan-bahan kimia
NoNama AlatGambarFungsi
5Laminar Air FlowUntuk melakukan penanaman eksplan dalam kultur
jaringan
6ErlenmeyerUntuk menampung larutan
7Beaker glassUntuk menampung dan membuat media
8Botol kulturUntuk tempat kultur (eksplan)
9Gelas ukur
Untuk mengukur larutan
NoNama AlatGambarFungsi
10PinsetUntuk mengambil eksplan
11ScalpelUntuk memotong eksplan
12PipetUntuk mengambil dan memindah larutan
13SuntikanUntuk mengambil larutan dalam jumlah kecil
14Hand sprayerUntuk sterilisasi dengan alcohol
15PetridishUntuk meletakkan eksplan
16Pembakar BunsenUntuk memflamir eksplan, pinset, scalpel dan
mulut botol
17Alumunium foilUntuk menutup mulut botol
18Rak kulturUntuk meletakkan botol kultur yang sudah ditanami
eksplan
19TisuUntuk mengeringkan alat
20Kertas payungUntuk membungkus petridis dan alat-alat dari
logam untuk disterilisasi
21Pengaduk kacaUntuk mengaduk larutan
B.PembahasanRuang dan alat yang digunakan dalam kutur jaringan
harus dalam kondisi steril. Sterilisasi ruang dapat dilakukan
dengan menggunakan lampu UV dan alcohol 90%. Tujuan dari
sterilisasi ruang adalah untuk menghindari kontaminasi yang
disebabkan mikroorganisme yang ada di alat maupun beterbangan di
udara sekitar ruangan. Srerilisasi ruang seperti tersebut mutlak
dilakukan pada ruang penabur atau tempat yang untuk jaringan.
Ruang-ruang yang tidak lebih harus 100% steril karena tidak
berhubungan langsung dengan media maupun jaringan yang akan
ditanam. Peralatan yang akan digunakan juga harus dalam keadaan
steril juga dapat biasanya menggunakan autoclave untuk
sterilisasinya. Tujuan dari sterilisasi alat ini untuk menghindari
terjadinya kontaminasi oleh mikro organisme seperti jamur dan
bakteri, yang menempel pada alat sehingga dapat mengggagalkan
kultur jaringan(Soebardini M dan Slamet Rachadi, 2011).Ada beberapa
persyaratan yang harus dipenuhi jika kita akan menggunakan teknik
kultur jaringan untuk menumbuhkan suatu tanaman. Persyaratan
tersebut adalah adanya peralatan yang mendukung teknik kultur
jaringan dan pengetahuan dasar mengenai teknik kultur jaringan
misalnya teknik aseptik dalam kultur jaringan. Peralatan minimum
yang harus dimiliki oleh suatu laboratorium seperti alat
sterilisasi, laminar atau kotak steril, peralatan untuk membuat
media, bahan-bahan kimia, alat-alat kaca, dan ruang penyimpanan
kultur. Teknik aseptik dalam kultur jaringan berhubungan dengan
cara-cara melakukan sterilisasi. Ada beberapa cara sterilisasi yang
digunakan dalam teknik kultur jaringan adalah sebagai
berikut:Sterilisasi Kering,Sterilisasi ini digunakan untuk
peralatan yang terbuat dari logam, kaca, atau kertas, contohnya
pinset, gagang pisau, batang pengaduk, cawan petri, dan kertas
saring. Dalam sterilisasi ini, alat yang akan disteril harus
dibungkus terlebih dahulu dengan menggunakan aluminium foil atau
kertas. Kemudian peralatan tersebut dmasukkan dalam oven bersuhu
120 0 C, dan waktu yang dibutuhkan minimal 1 jam. Setelah steril,
peralatan disimpan di tempat yang kering dan bersih.Sterilisasi
Basah,Sterilisasi basah sering digunakan untuk peralatan dan
bahan-bahan, seperti media, akuades. Umumnya peralatan yang
disterilkan menggunakan cara ini adalah peralatan logam, kaca, atau
peralatan apapun yang tahan terhadap suhu dan tekanan yang tinggi.
Hal ini karena teknik sterilisasi ini menggunakan Autoclave dengan
tekanan 1,5 atm dan suhu 121 0 C dengan waktu yang dibutuhkan 1-20
menit. Setelah sterilisasi selesai, bahan atau peralatan disimpan
di tempat yang kering dan bersih.Sterilisasi dengan Sinar
Ultraviolet (UV),Sterilisasi ini dilakukan pada laminar air flow
atau kotak alir udara, dengan tujuan agar kotak menjadi steril
sehingga bisa digunakan untuk penanaman. Kotak alir udara
dilengkapi dengan lampu UV. Sebelum lampu UV dinyalakan, permukaan
dalam kotak dibersihkan dengan menggunakan alkohol 70%. Lampu UV
dinyalakan minimal 1 jam sebelum pemakaian, dan pada saat pemakaian
jangan lupa untuk mematikan lampu UV-nya.Sterilisasi dengan Bahan
Kimia,Bahan-bahan yang biasanya digunakan untuk sterilisasi ini
antara lain alkohol, natrium hipoklorit (NaOCl), kalsium hipoklorit
atau kaporit (CaOCl), sublimat (HgCl2), dan hidrogen peroksida
(H2O2).Sterilisasi dengan Menggunakan Filter,Teknik sterilisasi ini
adalah dengan menggunakan sterilisasi filter untuk bahan-bahan yang
tidak tahan terhadap panas seperti antibiotika dan hormon.
Sterilisasi biasanya dilakukan dengan filter ukuran 0,2 m.Ada
beberapa peralatan yang digunakandan fungsinyadalam teknik kultur
jaringan, antara lain :1.Aluminium foil : alat ini digunakan untuk
meletakkan bahan bahan kimia pada saat ditimbang dan juga digunakan
untuk menutup serta membungkus botol erlemeyer agar larutan stok
tidak rusak.2.Plastik dan karet : alat ini digunakan untuk menutup
botol kultur agar mikroba penyebab kontaminasi tidak dapat masuk ke
dalam.3.Petridish : digunakan sebagai tempat untuk meletakkan
eksplan pada saat penanaman.4.Erlenmeyer : digunakan sebagai tempat
untuk menuangkan air suling, sebagai tempat menampung media maupun
stok media. Erlenmeyer juga bisa digunakan sebagai tempat pananaman
karena mempunyai dasar yang lebar dan mulut yang sempit. Sebab
mulut yang lebar memperbesar peluang kontaminasi.5.Keras buram :
alat ini digunakan untuk membungkus alat alat kultur dan petridish
sebelum disterillisasikan.6.Stirrer : digunakan sebagai pengaduk
media hingga media menjadi menjadi homogen secara otomatis.7.Gelas
ukur:untuk mengukur larutan bahan kimia atau larutan stok yang akan
digunakan untuk pembuatan media.8.Gelas piala :digunakan sebagai
tempat untuk pembuatan media Ms.9.Pinset : untuk mengambil eksplan
pada saat eksplan akan ditanam.10.Kertas label : untuk memberi
keterangan pada botol kultur yang digunakan.11.Panci dan pengaduk :
alat ini digunakan untuk memasak media yang akan digunakan serta
untuk mengaduk media.12.Magnetic stirrer : Alat ini berfungsi untuk
menggojog dan pemanas. Alat ini digunakan dalam pembuatan stok
media. Batang pengaduk magnetik dimasukkan ke dalam erlenmeyer,
sehingga pada saat dinyalakan pengaduk akan bergerak memutar.
Sehingga bahan kimia di dalamnya dapat larut dengan cepat dan
baik.13.Bunsen : digunakan untuk membakar dissecting kit, blade dan
pinset pada saat penanaman eksplan.14.Tissue : untuk membersihkan
alat alat kultur dan LAF.15.Sprayer : digunakan sebagai alat
penyemprot yang berisi alkohol 70% dan 90% untuk mensterilkan alat
dan ruang penanaman.16.Corong : untuk menuangkan media ke dalam
botol kultur.17.Pipet tetes : untuk mengambil larutan yang akan
digunakan atau protoplas.18.Scalpel :digunakan sebagai tempat untuk
meletakkan blade.19.Blade : untuk memotong eksplan pada saat
penanaman.20.Botol kutur : sebagai tempat yang berisi media yang
bernutrisi dan juga sebagai tempat pertumbuhan serta perkembangan
eksplan.21.pH meter : digunakan untuk mengukur pH larutan
stok.22.Timbangan analitik : untuk menimbang larutan stok yang akan
digunakan.23.LAF : berfungsi sebagai tempat untuk penanaman
eksplan. LAF harus selalu dalam kondisi steril. Sterilisasi LAF
dapat dilakukan dengan menyemprot dan mengelapnya menggunakan
alkohol 96 % atau formalin 5 % dan disinari dengan sinar UV.24.Rak
kultur : untuk meletakkan botol botol kultur.25.Kompor gas : untuk
memanaskan autoclave dan untuk memasak media.26.Autoclave :
Autoclave digunakan untuk sterilisasi peralatan dan media.
Pemanasan autoclave biasanya digunakan kompor gas. Pengaturan
tekanan dapat dilakukan dengan mengatur katup pada tutup autoclave.
Bila tekanan dalam autoclave naik maka secara otomatis katupnya
akan terbuka untuk mengurangi tekanan. Dengan demikian tekanan akan
dapat dipertahankan disebabkan sebagaian uap keluar (Daisy dan Ari,
2002). Pada praktikum kali ini . untuk sterilisasi alat dibutuhkan
waktu sekitar 30 menit. Suhu dalam autoclave dipertahankan antara
1200C dan tekanan17,5Psi dengan cara membesar atau mengecilkan
nyala api kompor.
Carakerja menggunakan Autocalve,LAF, pH meter, dan Hot Plate
Magnetic Stirer.1.Autoclave:-Botol bersih diberi beberapa tetes
aquadest dan tutup dengan kertas atau aluminium foil (jangan
terlalu kencang bila menggunakan aluminium foil).Untuk botol-botol
yang mempunyai tutup yang autoclaveable, jangan tutup terlalu
kencang, karena selama pemanasan terjadi pemuaian.-Alat-alat yang
perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting, gagang
skalpel, kertas saring, petridish, botol kultur, jarum dan
pipet.-Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas
tebal atau ditaruh dalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus
dengan kain tebal sebelum dimasukkan dalam autoklaf. Alumunium foil
tidak direkomendasikan sebagai pembungkus, karena uap tidak dapat
masuk ke dalam bungkusan. Alat-alat sektio seperti pinset, gunting,
gagang skalpel, dan jarum, dibungkus dengan kertas kopi atau kertas
merang. Hindarkan penggunaan Al-foil karena uap sukar masuk kedalam
bungkusan sehingga sterilisasi kurang efektif.-Petridish akan
disterilkan, juga dibungkus dengan kertas kopi atau kertas
merang.-Temperatur yang digunakan untuk sterilisasi botol kultur
kosong dan alat-alat yang akan digunakan untuk menanam eksplan,
adalah 121C pada tekanan 15 psi (pound per square inch) atau 1 atm
selama 30-60 menit. Penghitungan waktu sterilisasi dimulai setelah
tekanan dan temperatur yang diinginkan tercapai.
2.LAF:-Nyalakan lampu U.V., minimum selama 30 menit, sebelum
laminar air flow digunakan. Hindarkan sinarnya dari badan dan
mata.-Siapkan semua alat-alat steril yang akan dipergunakan.
Alat-alat yang dimasukkan ke dalam Laminar Air Flow Cabinet,
disemprot terlebih dahulu dengan alcohol 70% atau spiritus.-Meja
dan dinding dalam LAF disemprot dengan alkohol 70% atau spiritus
untuk mensterilkan LAF.-Blower pada LAF dihidupkan untuk
menjalankan air flow.-Nyalakan lampu dalam LAF.-LAF sudah siap
untuk digunakan.3.pH meter:-Meletakkan pH-meter pada keadaan
standby on jika tidak dipakai; jangan ditekan off.-Menyiram
electrode dengan aquades perlahan sebelum digunakan. Lalu masukkan
ujung pH meter ke dalam larutan. Menyiram electrode dengan aquades
kembali sesudah digunakan dan letakan pada silinder kembali.-Jangan
dibiarkan elektrode diluar larutan pada waktu yang lama.4.Hot Plate
Magnetik Stirer:-Nyalakan Heater, lalu letakkan bekker glass di
atas heater.-Letakkan stirrer di dalam becker glass.-Masukkan
larutan satu per satu ke dalam bekker glass.-Tunggu beberapa saat
sampai larutan menjadi homogen.IV.PENUTUP
A.KesimpulanBerdasarkan praktikum yang sudah dilakaukan dapat
diketahui, bahwaSterilisasi adalah salah satu prosedur yang
digunakan untuk menghilangkan mikroorganisme. Semua alat alat dan
media yang akan digunakan dalam kultur jaringan harus
disterillisasi dahulu menggunakan autoclave agar mikroba penyebab
kontaminasi hilang dan mati, dan dalam kegiatan kultur jaringan,
semua ruangan dan peralatan kultur harus selalu dalam keadaan
steril.
DAFTAR PUSTAKA
Chatimatun Nisadan Rodinah, 2005.Kultur Jaringan Beberapa
Kultivar Buah Pisang (Musa paradisiacaL.)Dengan PemberianCampuran
Naa Dan Kinetin.Volume 2, Nomor 2, Juli 2005, Halaman
23-36.Rahardja, P. C. 1995.Kultur Jaringan : Teknik Perbanyakan
Tanaman Secara Modern. Penerbit Swadaya, Jakarta.M, Soebardini dan
Slamet Rochdi. 2011. Handout Kultur Jaringan Tanaman Hortikultura.
Fakultas Pertanian Universitas Jenderal Soedirman,
Purwokerto.Murashige, T. 1974. Plant propogation through tissue
culture. Ann. Rev. Plant Physiology.Pierik, R. L. M. 1975. Callus
multiplication ofAunthurium andraenumL. in liquid media.Neth. J.
Agric. Sci.: 229.Sriyanti, Daisy P. dan Ari Wijayani. 2002.Teknik
Kultur Jaringan : Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman
Secara Vegetatif-Modern. Kanisius, Yogyakarta.Suryowinoto, Moeso.
2000.Pemuliaan Tanaman Secara In-Vitro. Kanisius,
Yogyakarta.Widarto, L. 2000.Perbanyakan Tanaman dengan Biji, Stek,
Cangkok, Sambung, Okulasi dan Kultur Jaringan.Kanisius,
Yogyakarta.Dasar Teori.Kultur jaringan merupakan salah satu cara
perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan
teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman
seperti daun, mata tunas,protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan
maupun organ , serta menumbuhkannya dalam keadaan aseptikserta
menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara
aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah
tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat
memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap(Sany
2007: 1). Adapun prinsip-prinsip dalam kultur jaringan sendiri kita
ketahui antara lain (1). Totipotensi Sel: Setiap sel dari manapun
asalnya, akan mampu tumbuh menjadi tanaman sempurna kalau
diletakkan pada lingkungan yang sesuai (Scheleiden & Sachwan,
1901), (2). Regenerasi Tanaman: Proses menuju diferensiasi ke arah
pembentukan organ baru, (3). Bebas Kontaminasi Mikroorganisme, dan
(4). Lingkungan (media) yang sesuai dengan pertumbuhan jaringan.
Dapat dilihat salah satu prinsipadalah terbebas dari kontaminasi
mikroorganisme. Ini artinya kultur jaringan merupakan perbanyakan
tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman, menggunakan
media buatan yang dilakukan di tempat steril.Lingkungan yang sesuai
dapat dipenuhi dengan menentukan media tumbuh yang sesuai dan
penempatan pada kondisi yang terkendaliberkaitan dengan intensitas
dan periodisitas, cahaya, temperatur, dan kelembaban serta
keharusan sterilisasi(Hendaryono & Wijayani 1994: 2).
Sterilisasi merupakan hal yang erat dengan pembuatan medium isolasi
dan pembiakan mikroorganisme secara murni. Pengertian umum
sterilisisasi adalah suatu proses yang berusaha membebaskan bahan
atau alat dari mikroorganisme. Namun perlu diketahui bahwa bahan
atau alat yang telah melalui proses sterilisasi tidak akan
benar-benar bebas dari mikroorganisme. Tujuan utama sterilisasi
adalah untuk meminimalkan gangguan oleh mikroorganisme yang tidak
dikehendaki (kontaminan), sekaligus meminimalkan gangguan akibat
proses sterilisasi itu sendiri sekecil mungkin(Sany 2007: 1).
Sterilisasi dalam segala kegiatan kultur jaringan harus dilakukan
di tempat yang steril, yaitu dilaminar flowdan menggunakan
alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap
peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata
pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur
jaringan pun juga harus dalam keadaan steril.Tidak hanya terbatas
pada peralatan, namun ruangan yang akan digunakan pun harus dalam
kondisi aseptik. Tujuan utama dari sterilisasi ruangan maupun
peralatan kultur pada dasarnya untuk menghindari kontaminasi oleh
mikro organisme yang ada di peralatan maupun di udara bebas sekitar
ruangan. Perlakuan tersebut mutlak dilakukan terutama pada ruang
penabur atau tempat yang digunakan untuk penanaman eksplan (Fardiaz
1992: 2). Faktor-faktor yang perlu diperhatikan untuk keberhasilan
kultur jaringan yaitu bahan sterilisasinya, kandungan unsur kimia
dalam media, hormon yang digunakan, substansi organik yang
ditambahkan dan terang atau gelapnya saat inkubasi. Dari sekian
banyak permasalahan yang harus diteliti dan diperhatikan adalah
komposisi media tumbuh pada kultur jaringan karena sangat besar
pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta
bibit yang dihasilkannya. Teknik aseptik merupakan salah satu kunci
keberhasilan dalam kutur jaringan. Keaseptikan harus dijaga dalam
proses pengkulturan, selain itu juga termasuk sterilisasi bahan
tanaman (eksplan). Pada tahap ini dilakukan berbagai perlakuan
untuk membersihkan kotoran yang ada di permukaan bahan tanaman
(disinfestasi). Selain itu, zat pengatur tumbuh adalah senyawa
organik bukan hara yang dalam jumlah sedikit dapat mendukung,
menghambat dan dapat merubah proses fisiologi tanaman (Daisy 1994:
4).1.2. Tujuan Praktikum ini bertujuan untuk mempelajari cara serta
prinsip-prinsip sterilisasi alat dan bahan dalam teknik kultur
jaringan tumbuhan.BAB IITINJAUAN PUSTAKASterilisasi merupakan suatu
proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada atau di
dalam suatu benda. Sterilisasi basah dapat digunakan
untukmensterilkan bahan apa saja yang dapat tembus uap air dan
tidak rusak bila dipanaskan dengan suhu yang berkisar antara
110-121. Sterilisasi dalam setiap proses baik fisika, kimia dan
mekanik yang membunuh semua bentuk kehidupan terutama
mikroorganisme atau usaha untuk membebaskan alat dan bahan dari
segala bentuk kehidupan terutama mikrobia (Fardiaz 1992: 4).Menurut
Hamdan (2012: 11), bahwa sterilisasi dalam setiap proses yang umum
dilakukan dapatberupa: (a). Sterilisasi secara fisik (pemanasan,
penggunaan sinar gelombang pendek yang dapat dilakukan selama
senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau terurai
akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas,
dipergunakan alat bejana/ruang panas (oven dengan temperatur
170180dan waktu yang digunakan 2 jam yang umumnya untuk peralatan
gelas),(b). Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan
disinfektan, larutan alkohol, larutan formalin), (c). Sterilisasi
secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang akibat
pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan,
misalnya adalah dengan saringan/filter. Sistem kerja filter,
seperti pada saringan lain adalah melakukan seleksi terhadap
partikel-partikel yang lewat (dalam hal ini adalah
mikroba).Autoclaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam
alat dan medium kultur jaringan tumbuhan denan mengunakan tekanan
15 psi (1,02 atm) dan suhu 121C . Sterilisasi dengan autoklaf
adalah salah satu metode sterilisasi dengan uap airdi bawah
tekanan. Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan
media kultur jarinan tumbuhan yang disterilkan memberikan kekuatan
yang lebih besar untuk membunuh sel dibandingkan dengan udara
panas. Biasanya untuk mensterilkan media diunakan suhu 121C dan
tekanan 15 lb/in (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit (Torres 1989:
1).Menurut Yuan (2012: 2), bahwa dalam metode kultur jaringan
diperlukan lingkungan yang steril. Ada beberapa metode sterilisasi
alat dan bahan tanaman. Sterilisasi dapat dilakukan dengan beberapa
cara yaitu dengan pembakaran, pemanasan kering, pemanasan basah,
penyaringan atau secara kimiawi.Sterilisasi dengan
pembakaranyaitualat-alat yang terbuat dari logam dapat disterilkan
dengan cara memanaskan atau membakar di atas lampu spirtus.
Sterilisasi dengan udara panas/keringpadaalat-alat dari gelas
seperti cawan petri, erlenmeyer, tabung piala, botol eksplan,
tabung reaksi dan sebagainya dapat disterilkan dengan udara panas
(oven) pada suhu 130 160oC selama 1 2 jam. Alat-alat ditata tidak
terlalu rapat agar sirkulasi udara antar tumpukan alat dapat
berjalan lancar, sehingga semua alat dapat disterilkan dan dapat
dengan mudah dijaga kesterilannya saat dikeluarkan dari alat
sterilisasi.Sterilisasi dengan uap panas (basah)padabahan atau alat
dapat disterilkan dengan uap panas atau secara basah pada uap panas
biasa atau uap panas dengan tekanan tinggi, secara terus menerus
(kontinyu) atau secara terputus putus (diskontinyu), khususnya
medium pada suhu atau tekanan yang rendah. Untuk sterilisasi dengan
cara ini sering kali menggunakan otoklaf. Sterilisasi medium
biasanya dilakukan pada suhu 121oC dengan tekanan 1 atm selama
15-30 menit, namun untuk medium yang tidak mudah rusak dapat
dilakukan pada suhu atau tekanan yang sedikit lebih tinggi.
Sterilisasi dengan bahan kimiayaitubahan kimia tertentu sering
digunakan untuk sterilisasi alat maupun bahan. Etanol 70% sering
digunakan untuk sterilisasi permukaan pada alat yang sering
dikombinasi dengan pembakaran pada api. NOCl (natrium hipoklorit)
dan formalin juga sering digunakan untuk sterilisasi permukaan atau
disinfestasi permukaan atau disinfeksi permukaan(Torres 1989:
1).Suatu alat atau bahan dikatakan steril apabila alat atau bahan
tersebut bebas dari mikrobia, baik dalam bentuk vegetative ataupun
spora. Suatu benda atau substansi hanya dapat dikatakan steril atau
tidak steril, tidak akan pernah mungkin ada setengah steril atau
hampir steril. Untuk sterilisasi alat dan medium digunakan
sterilisasi dengan mengunakan alat yang disebut autoclave.
Sterilisasi dilakukan untuk membunuh bakteri dan cendawan yang
melekat pada eksplan maupun pada alat serta bahan yang digunakan
dalam penanaman eksplan (Fardiaz 1992: 4).Menurut Pramono (2007:
1), bahwa metode sterilisasi alat dan bahan tanaman juga
dilakukansterilisasi dalam kegiatan kultur jaringan harus dilakukan
di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan
alat-alat yang juga steril. Sterilisasi lingkungan kerja yaitu
sterilisasi yang dilakukan dalam penanaman eksplan agar mendapat
tempat atau ruang yang steril dan bebas dari mikroorganisme. Tempat
untuk menanam dan memindahkan eksplan yaitu disebut Laminar Air
Flow. Dengan dihembuskannya aliran udara halus dari blower melalui
suatu filter HEPA (High Efficiency Particulate Air) dengan
pori-pori kurang dari 0,3 m. Fungsi aliran udara ini yaitu dapat
mencegah kontaminan yang air borne selama penanaman. Sebelum
bekerja, bagian dalam laminar disterilkan dengan alcohol 70% dan
diratakan dengan tissue, kemudian dilanjutkan dengan menyalakan
lampu UV selama 0,5-1 jam untuk mematikan kontaminan di permukaan
tempat kerja.Sterilisasi alat dan media dilakukan pada alat-alat
seperti botol, erlenmeyer, beaker glass, petridish, pinset,
scalpel, gunting, jarum ose, dll sebaiknya sebelum disterilisasi
peralatan dicuci denga detergen kemudian dibilas dengan aquades dan
dikeringkan. Kemudian dibungkus dengan kertas merang. Temperatur
yang digunakan untuk sterilasasi alat-alat dengan autoclave 121C
pada tekanan 17,5 psi selama 20-30 menit. Sterlisasi bahan tanam
yaitu bahan tanam yang ada dilapangan banyak mengandung debu,
kotoran-kotoran dan berbagai kontaminan hidup pada permukaan.
Apabila kontaminan ini tidak dihilangkan maka media yang mengandung
gula, vitamin, dan mineral merupakan sumber energy bagi kontaminan
yang ada. Prinsip sterilasasi eksplan adalah dapat mematikan
kontminan tanpa membunuh eksplan, karena baik kontaminan maupun
eksplan merupakan benda hidup. Berhasilnya teknik sterilsasi
merupakan langkah awal keberhasilan dalam kerja kultur in
vitro(Hadioetomo 1993: 1).BAB IIIMETODOLOGI PRAKTIKUM3.1. Waktu dan
TempatPraktikum ini dilaksanakan pada hari Selasa, tanggal 06
November 2012 pada pukul 09.00 s/d selesai. Bertempat di
Laboratorium Botani Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam di Universitas Sriwijaya Indralaya.3.2.Alat dan
BahanAlat yang digunakan pada praktikum ini adalah aluminium foil,
autoklaf, botol kultur, erlenmeyer, gunting kultur, kertas
pembungkus, lampu bunsen, petridish, pinset dan scapel, sedangkan
bahan yang dibutuhkan adalah aquades dan medium.3.3. Cara Kerja
Disiapkan alat-alat yang berupa aluminium foil, Erlenmeyer,
gunting, petridish, pinset tetes, scapel kemudian dibungkus dengan
kertas pembungkus. Botol kultur ditutup dengan aluminium foil.
Sedangkan bahan-bahan berupa aquades dan medium disterilisasikan
dengan cara dimasukkan dalam botol lalu ditutup dengan aluminium
foil. Disterilisasi alat dan bahan dengan autoklaf pada suhu 121C
dengan tekanan 15 psi selama 20-30 menit.
BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN4.1.HasilBerdasarkan praktikum
didapatkan hasil sebagai berikut :No.Nama AlatGambarKeterangan
1.AutoklafAutoklaf adalah alat sterilisasi untuk alat dan medium
kultur jaringan. Suhunya 121oC, tekanan uap 15 selama 15 menit
2.Magnetic StirerMagnetic stirer memilikifungsi untuk
menggojokdenganpemanas.Denganmenggunakan listrik, alat ini
berfungsi sebagai komporselain digunakansebagai penggojok.
3.Elenmeyer
Alat ini digunakan dalam kultur jaringan tanaman sebagai sarana
menuangkan air suling maupun untuk tempat media dan penanaman
eksplan.
4.Gelas ukurGelas ukur digunakan untuk menakar air suling dan
bahan kimia yang akan digunakan.
5.Pipet tetesPipet tetes digunakan untuk mengambil supernatan
(larutan) protoplas atau untuk menambahkan KOH, HCL, menetralkan
pH.
6.Botol kulturBotol ini digunakan untuktempat menanam
eksplan
7.Gelas piala
Alat ini digunakan untuk menuangkan ataumempersiapkan bahan
kimia dan air suling dalam pembuatan medium
8.Gunting kultur
Alat ini digunakan untuk mengiris bagian tanaman atau
eksplan.
9.Aluminium foilAluminium foil berfungsi untuk menutup botol
kultur.
10.PinsetPinset digunakan untuk memegang atau mengambil irisan
eksplan atau untuk menanam eksplan
11.Cawan petriAlat ini digunakan untuk tempat eksplan
12.Scalpel
Alat ini digunakan untuk mengiris bahan isolasi protoplas
13.Kertas PembungkusKertas digunakanuntuk membungkus alat-alat
yang akan di sterilisasi
4.2. Pembahasan Berdasarkan hasil praktikumyang dilakukan
diketahui beberapa alat-alat seperti erlenmeyer, pipet tetes,
pinset, disseting set, gunting, magnetic stirer, scaple, botol
kultur dan lain-lain. Dari alat-alat yang mempunyai fungsi dan cara
pemakaian yang berbeda, namun disterilisasikan bersama menggunakan
autoklaf.Sterilisasi adalah segala kegiatan dalam kultur jaringan
yang sangat penting dan harus dilakukan ditempat yang steril, yaitu
di laminar flow. Seperti yang diungkapkanWetherell (1976: 1),
bahwalingkungan aseptic sebagai salah satu syarat utama suksesnya
kegiatan kultur jaringan perlu diter