AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN KOMPONEN BIOAKTIF PADA … · perlu dilakukan, di antaranya ialah uji aktivitas antioksidan dan uji kualitatif komponen bioaktifnya. ... asam amino bebas.

1

AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN KOMPONEN BIOAKTIF

PADA KEONG MAS (Pomacea canaliculata Lamarck)

IGNASIUS SUNUTRI SUSANTO

C34063436

DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2010

2

RINGKASAN

IGNASIUS SUNUTRI SUSANTO. C34063436. Aktivitas Antioksidan dan

Komponen Bioaktif pada Keong Mas (Pomacea canaliculata Lamarck).

Dibimbing oleh NURJANAH dan ASADATUN ABDULLAH.

Keong mas (Pomacea canaliculata Lamarck) merupakan hama padi yang

merugikan bagi dunia pertanian. Keong mas selain dimanfaatkan sebagai bahan

pangan dan pakan, juga dimanfaatkan sebagai obat tradisional untuk penyakit

kulit, liver dan ayan. Kajian ilmiah mengenai khasiat keong mas bagi kesehatan

manusia masih belum banyak dilakukan, sehingga pengujian ilmiah lebih lanjut

perlu dilakukan, di antaranya ialah uji aktivitas antioksidan dan uji kualitatif

komponen bioaktifnya.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan rendemen, kandungan

zat gizi (air, lemak, protein, abu dan abu tidak larut asam), aktivitas antioksidan

dan komponen bioaktif yang terkandung dalam keong mas. Pengujian yang

digunakan meliputi analisis proksimat, uji kuantitatif aktivitas antioksidan dengan

metode DPPH, dan uji fitokimia.

Keong mas pada penelitian ini berasal dari perairan sawah padi Desa

Carang Pulang, Kelurahan Cikarawang, Kecamatan Darmaga, Kabupaten Bogor.

Rendemen cangkang dan isi cangkang keong mas berturut-turut sebesar 27,10%

dan 48,35%, sangat potensial dan ekonomis untuk dimanfaatkan lebih lanjut.

Rendemen operkulumnya sebesar 1,46%. Isi cangkangnya mengandung air

sebesar 81,19%, protein sebesar 10,30%, lemak sebesar 0,51%, abu sebesar

4,07%, abu tidak larut asam sebesar 0,30% dan karbohidrat sebesar 3,93%.

Ekstrak kasar keong mas memiliki aktivitas antioksidan yang terlihat dari

nilai IC50 yang diperoleh. Nilai IC50 dari ekstrak kloroformnya sebesar

3458,37 ppm, ekstrak etil asetatnya sebesar 1662,36 ppm dan ekstrak metanolnya

sebesar 1270,47 ppm. Ekstrak kasar keong mas ini mengandung 5 dari

9 komponen bioaktif yang diuji, yaitu alkaloid, steroid, flavonoid, karbohidrat dan

asam amino bebas. Komponen-komponen bioaktif ini diduga memiliki banyak

aktivitas fisiologis yang positif bagi kesehatan tubuh manusia, sehingga keong

mas dapat dimanfaatkan sebagai salah satu alternatif bahan baku pembuatan

produk nutraceutical.

i

AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN KOMPONEN BIOAKTIF

PADA KEONG MAS (Pomacea canaliculata Lamarck)

IGNASIUS SUNUTRI SUSANTO

C34063436

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan

di Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan

Institut Pertanian Bogor

DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2010

ii

Judul : AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN KOMPONEN

BIOAKTIF PADA KEONG MAS

(Pomacea canaliculata Lamarck)

Nama : Ignasius Sunutri Susanto

NRP : C34063436

Departemen : Teknologi Hasil Perairan

Menyetujui,

Dosen Pembimbing I Dosen Pembimbing II

Ir. Nurjanah, MS Asadatun Abdullah, S.Pi, M.Si, M.S.M

NIP. 1959 1013 1986 01 2 002 NIP. 1983 0405 2005 01 2 001

Mengetahui,

Ketua Departemen Teknologi Hasil Perairan

Dr. Ir. Ruddy Suwandi, MS, M.Phil

NIP. 1958 0511 1985 03 1 002

Tanggal Lulus : ……………………….

iii

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi dengan judul ”Aktivitas

Antioksidan dan Komponen Bioaktif pada Keong Mas (Pomacea canaliculata

Lamarck)” adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun

kepada Perguruan Tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip

dari karya yang telah diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan

dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Bogor, Maret 2010

Ignasius Sunutri Susanto

C34063436

iii

iv

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas

berkat dan rahmat-Nya, penulis dapat menyelesaikan penyusunan skripsi ini

dengan baik.

Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk mendapatkan Gelar

Sarjana di Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Skripsi

hasil penelitian ini berjudul “Aktivitas Antioksidan dan Komponen Bioaktif pada

Keong Mas (Pomacea canaliculata Lamarck)”.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah

membantu dan memberi dukungan kepada penulis selama penyusunan skripsi ini,

terutama kepada:

1. Ir. Nurjanah, MS dan Asadatun Abdullah, S.Pi, M.Si, M.S.M sebagai dosen

pembimbing yang telah memberikan bimbingan dan arahan kepada penulis

dengan penuh kesabaran.

2. Ir. Anna C. Erungan, MS sebagai dosen penguji yang telah memberikan

banyak masukan pada penulis.

3. Dr. Ir. Ruddy Suwandi, MS, M.Phil. sebagai Ketua Departemen Teknologi

Hasil Perairan.

4. Dr. Ir. Agoes Mardiono Jacoeb Dipl. Biol, sebagai Ketua Program Studi

Departemen Teknologi Hasil Perairan.

5. Keluarga terutama Bapak dan Mbak Ariek, yang telah memberikan bantuan

doa, semangat dan materil pada penulis selama penelitian dan penyusunan

skripsi ini.

6. Sabri Sudirman, Azwin Apriandi, Laili Izzati, Aulia Azka, Made Suhandana

dan Fauziah Naryuningtyas, yang telah membantu penulis dalam pelaksanaan

penelitian ini.

7. Bu Siti, Bu Emma, Bu Ika dan Mbak Lastri yang telah banyak membantu

penulis selama melakukan penelitian di laboratorium.

8. Kak Alim, Kak Rijan, Kak Dila, Kak Dede, Kak Luh Putu Ari, Kak Teta, Kak

Dewi dan Kak Ary Aprilan atas bantuan, masukan, dan nasihatnya dalam

penyusunan proposal penelitian ini dahulu.

iv

v

9. Teman-teman THP 43, terutama Nanda Tika, Molly Hesamestyna, Patmawati

Wahyudi, Hilda Dasa Indah dan Zehra Khalisi yang telah memberikan

semangat dan bantuan dalam penelitian awal dan penyusunan skripsi ini.

10. Adik-adik THP 44, terutama Suhana Sulastri yang telah membantu penulis

dalam mengumpulkan sampel pada penelitian awal.

11. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu di sini, penulis

mengucapkan terima kasih banyak atas bantuan dan kerjasamanya dalam

penulisan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penulisan

skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat

membangun dari berbagai pihak dalam proses penyempurnaan laporan penelitian

ini. Semoga tulisan ini dapat bermanfaat bagi semua pihak yang memerlukan.

Bogor, Maret 2010

Ignasius Sunutri Susanto

C34063436

v

vi

DAFTAR RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Kota Probolinggo, Propinsi Jawa

Timur pada tanggal 2 Maret 1988 sebagai anak ketiga dari tiga

bersaudara pasangan Martinus Sukarjo dan Bernadet Suprapti

(Almh.).

Penulis memulai jenjang pendidikan formal di SDK

Mater Dei Probolinggo (tahun 1994-2000), selanjutnya penulis

melanjutkan pendidikannya di SLTPK Mater Dei Probolinggo (tahun 2000-2003).

Pendidikan menengah atas ditempuh penulis di SMAN 1 Probolinggo dan lulus

pada tahun 2006. Pada tahun yang sama, penulis diterima sebagai mahasiswa di

Institut Pertanian Bogor melalui Jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB).

Selama masa perkuliahan, penulis aktif dalam berbagai organisasi

kemahasiswaan, seperti Paduan Suara Mahasiswa Institut Pertanian Bogor Agria

Swara sebagai anggota divisi PSDM (Pengembangan Sumber Daya Manusia)

tahun 2008-2009 dan 2009-2010, UKM Keluarga Mahasiswa Katolik IPB sebagai

anggota, dan OMDA Forum Mahasiswa Probolinggo (FMP) sebagai anggota.

Penulis juga aktif sebagai asisten praktikum m.k. Fisika TPB tahun ajaran

2007-2008 dan 2008-2009, asisten praktikum m.k. Biokimia Hasil Perairan tahun

ajaran 2008-2009 dan 2009-2010, asisten praktikum m.k. Teknologi Penanganan

dan Transportasi Biota Perairan tahun ajaran 2009-2010, asisten praktikum

m.k. Fisiologi, Formasi, dan Degradasi Hasil Perairan tahun ajaran 2009-2010,

asisten praktikum m.k. Biotoksikologi Hasil Perairan tahun ajaran 2009-2010,

asisten praktikum m.k. Pengetahuan Bahan Baku Industri Hasil Perairan tahun

ajaran 2009-2010 dan asisten praktikum m.k. Teknologi Pengolahan Hasil

Perairan tahun ajaran 2009-2010. Penulis juga aktif dalam kepanitiaan berbagai

kegiatan mahasiswa di Institut Pertanian Bogor.

Sebagai salah satu syarat meraih gelar sarjana, penulis melakukan

penelitian yang berjudul ” Aktivitas Antioksidan dan Komponen Bioaktif pada

Keong Mas (Pomacea canaliculata Lamarck)” di bawah bimbingan

Ir. Nurjanah, MS dan Asadatun Abdullah, S.Pi, M.Si, M.S.M.

vi

vii

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR ISI …………………………………………………………….. vii

DAFTAR TABEL ……………………………………………………..... ix

DAFTAR GAMBAR …………………………………………………… x

DAFTAR LAMPIRAN ………………………………………………… xi

1 PENDAHULUAN …………………………………………………..... 1

1.1 Latar Belakang …………………………………………………..... 1

1.2 Tujuan …………………………………………………………….. 3

2 TINJAUAN PUSTAKA ……………………………………………... 4

2.1 Deskripsi dan Klasifikasi Keong Mas (Pomacea canaliculata

Lamarck) ……………………………………………………….… 4

2.2 Pengendalian dan Pemanfaatan Keong Mas ..…………………..... 8

2.3 Antioksidan ………………………….……………………............ 10

2.3.1 Fungsi antioksidan …………………..…………………….. 11

2.3.2 Jenis-jenis antioksidan ……………...……………………... 14

2.3.3 Mekanisme kerja antioksidan ……………………………... 16

2.4 Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH ..…………….... 18

2.5 Antioksidan BHT (Butylated Hydroxytoluene) …………………... 21

2.6 Ekstraksi Komponen Bioaktif ……………………………………. 22

2.7 Komponen Bioaktif ………………………………………………. 23

2.7.1 Alkaloid ………………………………………………….... 24

2.7.2 Steroid/triterpenoid ………………………………………... 26

2.7.3 Flavonoid ………………………………………………….. 27

2.7.4 Saponin ……………………………………………………. 28

2.7.5 Fenol hidrokuinon ………………………………………..... 29

2.7.6 Karbohidrat ………………………………………………... 30

2.7.7 Gula pereduksi …………………………………………….. 31

2.7.8 Peptida …………………………………………………….. 32

2.7.9 Asam amino ………………………………………………... 33

3 METODOLOGI ……………………...…..…………………………... 35

3.1 Waktu dan Tempat …………………………….....….………….… 35

3.2 Bahan dan Alat ………………………......……..….……………... 35

3.3 Metode Penelitian ……………………………….………………... 36

3.3.1 Pengambilan dan preparasi sampel …………………........... 36

vii

viii

3.3.2 Analisis proksimat ..…………….…..…………………….... 37

1) Analisis kadar air (AOAC 2005) ………………………. 37

2) Analisis kadar lemak (AOAC 2005) …………………… 37

3) Analisis kadar protein (AOAC 1980) ………………….. 38

4) Analisis kadar abu (AOAC 2005) ……………………… 39

5) Analisis kadar abu tidak larut asam menurut

SNI 01-3836-2000 (BSN 2000) ………………………… 39

3.3.3 Analisis aktivitas antioksidan ………………………............ 39

1) Ekstraksi bahan aktif (Quinn 1988 dalam

Darusman et al. 1995) …………………...…………….. 39

2) Uji aktivitas antioksidan (DPPH) (Blois 1958 dalam

Hanani et al. 2005) ……………………………………. 44

3.3.4 Uji fitokimia (Harborne 1984) …………………………….. 45

4 HASIL DAN PEMBAHASAN …………………………………….... 47

4.1 Karakteristik Keong Mas …………………………………………. 47

4.1.1 Rendemen …………………………………………………. 48

4.1.2 Kandungan gizi ……………………………………………. 50

1) Kadar air ……………………………………………….. 51

2) Kadar lemak …………………………………………… 52

3) Kadar protein ………………………………………….. 53

4) Kadar abu ……………………………………………… 54

5) Kadar abu tidak larut asam ……………………………. 54

6) Kadar karbohidrat ……………………………………... 55

4.2 Ekstraksi Komponen Bioaktif Keong Mas ……………………….. 56

4.2.1 Ekstrak kasar ………………………………………………. 56

4.2.2 Komponen bioaktif pada ekstrak kasar ……………………. 58

1) Alkaloid ………………………………………………... 60

2) Steroid …………………………………………………. 62

3) Flavonoid ………………………………………………. 63

4) Karbohidrat ……………………………………………. 65

5) Asam amino ……………………………………………. 66

4.3 Aktivitas Antioksidan …………………………………………….. 67

5 KESIMPULAN DAN SARAN ……………………………………… 75

5.1 Kesimpulan ……………………………………………………….. 75

5.2 Saran ………………………………………………………………. 75

DAFTAR PUSTAKA …………………………………………………… 76

LAMPIRAN ……………………………………………………………... 83

viii

ix

DAFTAR TABEL

Nomor Teks Halaman

1. Komposisi kimia keong mas ……………………..….……….. 9

2. Komposisi asam amino tepung keong mas ….……………….. 10

3. Jenis-jenis pelarut yang umum digunakan dalam ekstraksi ….. 23

4. Hasil pengamatan karakteristik fisik cangkang, isi cangkang

dan operkulum keong mas …………………………………… 47

5. Hasil uji proksimat keong mas ………………………………. 51

6. Hasil uji fitokimia ekstrak kasar keong mas …………………. 60

7. Hasil uji aktivitas antioksidan ………………………………... 70

ix

x

DAFTAR GAMBAR

Nomor Teks Halaman

1. Keong mas (Pomacea canaliculata Lamarck) ……..…………... 4

2. Perbedaan keong mas jantan dan betina ...……………………… 6

3. Siklus hidup keong mas ………………………………………… 7

4. Reaksi inisiasi dan propagasi ………………………………….... 11

5. Reaksi terminasi ……………………………………………….... 12

6. Skema umum autooksidasi asam lemak tidak jenuh …………… 13

7. Reaksi antioksidan senyawa fenolik dengan radikal peroksi ....... 15

8. Reaksi penghambatan oleh antioksidan primer terhadap radikal

lipid …………………………………………………………….. 16

9. Antioksidan bertindak sebagai prooksidan pada konsentrasi

tinggi …………………………………………………………… 17

10. Absorbansi maksimum DPPH pada λ = 517 nm ………………. 19

11. Struktur kimia radikal bebas (1) dan bentuk non radikal (2)

DPPH …………………………………………………………... 20

12. Struktur kimia butylated hydroxytoluene (BHT) ………………. 21

13. Mekanisme reaksi BHT dengan radikal bebas ………………..... 22

14. Struktur kimia asam amino …………………………………….. 33

15. Diagram alir proses ekstraksi keong mas ……………………..... 42

16. Keong mas yang diambil dari sawah padi Desa Carang Pulang… 47

17. Rendemen cangkang, isi cangkang dan operkulum keong mas … 49

18. Ekstrak kasar keong mas ……………………………………….. 57

19. Rendemen ekstrak kasar keong mas …………………………..... 57

20. Perubahan warna yang mengindikasikan reaksi peredaman

DPPH …………………………………………………………… 69

21. Grafik hubungan konsentrasi BHT dengan persen inhibisinya .... 70

22. Grafik hubungan konsentrasi ekstrak kasar keong mas dengan

rata-rata persen inhibisinya ……………………………………… 71

23. Nilai rata-rata IC50 ekstrak kasar keong mas ……………………. 72

x

xi

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Halaman

1. Lokasi pengambilan keong mas ...………………………….….. 84

2. Proses pengambilan keong mas dalam transek (1 x 1) m2 …...... 84

3. Cangkang, isi cangkang dan operkulum keong mas …………... 84

4. Perhitungan rendemen keong mas ……….……………………. 85

5. Perhitungan analisis proksimat keong mas …………………..... 85

6. Data rendemen ekstrak kasar keong mas ……………………… 86

7. Perhitungan pembuatan larutan stok dan pengencerannya ..…... 87

8. Perhitungan persen inhibisi dan IC50 ..………………………… 89

9. Gambar hasil uji fitokimia ekstrak keong mas ..………………. 92

10. Gambar-gambar selama proses ekstraksi ...……..…………….. 93

xi

1

1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Keong mas atau golden apple snail (GAS) merupakan moluska air tawar

yang berasal dari dataran hujan di sepanjang Sungai Paraguay dan Parana yang

memotong Paraguay, Brazil, Bolivia dan Argentina. Di Asia, keong mas pertama

kali dikenal sebagai hama padi di Taiwan sejak tahun 1979, dan kini telah menjadi

hama padi paling merugikan di negara-negara penyedia beras, seperti Filipina,

Vietnam, Thailand dan Indonesia (Joshi 2005).

Keong mas awalnya hanya menyerang 12 distrik sawah padi di wilayah

Jawa Barat-Indonesia pada tahun 1995, dan empat tahun kemudian meningkat

menjadi 16 distrik (Joshi 2005). Areal persawahan yang telah diberi treatment

moluskosida, jumlah keong mas masih tetap meningkat. Hal ini diperkuat oleh

pernyataan Nurjanah et al. (1996) yang menyatakan bahwa keong mas memiliki

daya tahan yang tinggi terhadap pestisida ataupun moluskosida hingga dosis yang

cukup tinggi. Akibat segala kerusakan yang ditimbulkan oleh spesies ini, maka

keong mas dikategorikan sebagai salah satu dari 100 spesies asing invasi yang

paling merugikan di dunia (the world’s 100 worst invasive alien species)

(Joshi 2005).

Pandangan mengenai keong mas yang hanya sebagai suatu hama

merugikan dan hewan yang tidak memiliki manfaat, tidaklah sepenuhnya benar.

Sampai saat ini, keong mas telah dimanfaatkan menjadi sumber pakan dan pangan

di negara-negara penghasil beras yang diserang hama GAS. Keong mas diberikan

sebagai pakan pada ternak itik, ayam broiler, burung puyuh, budidaya ikan patin,

ikan gabus, ikan sidat, udang, kepiting dan lobster air tawar. Pemberian pakan

berbasis protein keong mas pada ternak burung puyuh (Coturnix coturnix) dan

budidaya ikan gabus (Chana striata) serta ikan sidat (Anguilla sp.), memberikan

pertumbuhan yang baik pada hewan-hewan budidaya tersebut (Sulistiono 2007).

Pemanfaatan keong mas saat ini tidak terbatas sebagai bahan pangan dan

pakan saja, tetapi juga sebagai obat untuk penyakit liver (Sulistiono 2007).

Nurjanah et al. (1996) menambahkan bahwa keong mas juga digunakan sebagai

obat untuk penyakit kulit dan penyakit ayan. Kajian ilmiah lebih mendalam

2

mengenai khasiat keong mas bagi kesehatan manusia masih belum banyak

dilakukan. Semuanya ini masih merupakan pembuktian empiris dari pengalaman

para pengguna, sehingga perlu dilakukan pengujian ilmiah lebih lanjut terhadap

keong mas. Pengujian ilmiah yang perlu dilakukan khususnya uji aktivitas

antioksidan dan uji kualitatif komponen bioaktifnya, mengingat keong mas

berpotensi untuk digunakan sebagai bahan baku produk nutraceutical.

Antioksidan adalah komponen yang dapat menunda atau mencegah

oksidasi lipid, asam nukleat, atau molekul-molekul lain, dengan cara menghambat

inisiasi atau propagasi reaksi oksidasi berantai (Wang 2006). Rohman dan

Riyanto (2005) mendefinisikan antioksidan sebagai senyawa yang dapat

menghambat reaksi radikal bebas dalam tubuh yang dapat menyebabkan penyakit

karsinogenesis, kardiovaskuler dan penuaan. Musthafa et al. (2000) menyatakan

bahwa penyebab yang mendasari berbagai macam keadaan patologis termasuk

penyakit aterosklerosis pada umumnya dan penyakit jantung koroner pada

khususnya adalah radikal bebas. Radikal bebas merupakan senyawa oksigen

reaktif yang sitotoksik, dapat berdampak negatif terhadap membran sel, DNA dan

protein seperti halnya enzim yang ada dalam tubuh.

Tubuh tidak memiliki sistem pertahanan antioksidan yang berlebihan,

sehingga apabila terjadi paparan radikal bebas berlebih, maka

tubuh membutuhkan antioksidan eksogen (berasal dari luar tubuh)

(Waji dan Sugrani 2009). Penyakit liver yang diduga terjadi karena rusaknya sel-

sel hati akibat oksidasi radikal bebas, dapat diobati dengan keong mas karena

senyawa antioksidan yang dikandungnya dapat meregenerasi sel-sel hati yang

rusak akibat oksidasi tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa keong mas sangat

berpotensi untuk dimanfaatkan sebagai bahan baku produk nutraceutical yang

mampu mencukupi kebutuhan antioksidan eksogen tubuh manusia, sehingga

proses oksidasi oleh radikal bebas dalam tubuh dapat ditanggulangi.

Uji kualitatif untuk mengetahui komponen bioaktif yang terkandung dalam

keong mas juga perlu dilakukan. Komponen-komponen bioaktif yang terkandung

dalam tubuh keong mas ini, diduga memiliki banyak manfaat biologis bagi

kesehatan tubuh manusia. Pengujian ini mutlak diperlukan sebagai langkah awal

untuk mengetahui potensi pemanfaatan keong mas ke depan sebagai produk

3

nutraceutical, sehingga penggunaannya tidak hanya terbatas sebagai obat penyakit

kulit, liver, atau ayan saja.

1.2 Tujuan

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan rendemen, kandungan

zat gizi (air, lemak, protein, abu, dan abu tidak larut asam), aktivitas antioksidan

dan komponen bioaktif yang terkandung dalam keong mas (Pomacea canaliculata

Lamarck) dari Desa Carang Pulang, Bogor.

4

2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Deskripsi dan Klasifikasi Keong Mas (Pomacea canaliculata Lamarck)

Keong mas atau golden apple snail (GAS) merupakan salah satu jenis

moluska air tawar yang berasal dari dataran hujan di sepanjang Sungai Paraguay

dan Parana yang memotong Paraguay, Brazil, Bolivia dan Argentina. Di Asia,

keong mas pertama kali dikenal di Taiwan pada tahun 1979 dan saat ini

telah tersebar luas di seluruh penjuru benua Asia. Seiring dengan proses

penyebarannya, keong mas kini telah menjadi salah satu hama padi yang paling

berbahaya di negara-negara penghasil beras di Asia, seperti Filipina, Vietnam,

Thailand dan Indonesia (Joshi 2005).

Klasifikasi keong mas (Pomacea canaliculata) menurut Lamarck (1822)

adalah sebagai berikut (Pennak 1989; Cazzaniga 2002):

Filum : Molusca

Kelas : Gastropoda

Subkelas : Prosobranchiata

Ordo : Mesogastropoda

Famili : Ampullariidae

Genus : Pomacea

Spesies : Pomacea canaliculata

Bentuk morfologi keong mas dapat di lihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Keong mas (Pomacea canaliculata Lamarck)

Keong mas hidup di kolam, sawah beririgasi dan kanal. Keong mas

membenamkan diri pada tanah lembab selama musim kering. Keong mas dapat

bertahan hidup hingga 6 bulan dengan melakukan estivasi dengan cara menutup

5

operkulum dan membenamkan diri dalam tanah. Keong mas menjadi aktif

kembali ketika tanah tempat hidupnya tergenang air. Keong mas dapat bertahan

hidup pada kondisi lingkungan yang keras, seperti pada perairan tercemar atau

perairan yang memiliki kandungan oksigen terlarut yang rendah. Hal ini

dikarenakan keong mas memiliki insang (ctenidium) dan organ menyerupai paru-

paru, sehingga memungkinkan keong mas dapat bertahan hidup di dalam dan di

luar air. Keong mas akan melakukan migrasi jika tinggi permukaan air hanya

setengah dari tinggi cangkangnya (DA-PhilRice 2001; Joshi 2005).

Keong mas memiliki karakteristik khusus yang dapat digunakan untuk

membedakan antara keong mas dengan keong-keong jenis lain yang hidup pada

habitat yang sama. Keong mas dewasa memiliki cangkang berwarna coklat dan

daging berwarna putih krem hingga emas kemerah-merahan atau oranye. Ukuran

tubuhnya sangat beragam dan bergantung pada ketersediaan makanan. Ukuran

diameter cangkang keong mas dapat mencapai 4 cm dengan berat 10-20 gram

(Ardhi 2008). Tahap keong mas memiliki sifat destruktif adalah ketika ukuran

cangkangnya sebesar 10 mm (sebesar biji jagung) hingga 40 mm (sebesar bola

ping pong) (DA-PhilRice 2001). Keong mas memiliki umbilicus terbuka.

Operkulum yang menutupi lubang aperture terbuat dari kitin dan merupakan

operkulum tipe konsentris (Pennak 1989).

Keong mas jantan dan betina memiliki beberapa perbedaan fisik yang

dapat dilihat langsung oleh mata biasa. Perbedaan tersebut terletak pada bentuk

operkulum dan lengkungan cangkang. Keong mas betina memiliki operkulum

berbentuk cekung (a1), sedangkan operkulum berbentuk cembung (a2) dimiliki

oleh keong mas jantan. Cangkang keong mas betina dewasa melengkung ke arah

dalam (b1), sedangkan cangkang keong mas jantan dewasa melengkung ke arah

luar (b2) (DA-PhilRice 2001). Pada sebuah sawah, jumlah keong mas betina

diduga memiliki jumlah dua kali lebih banyak. Hal ini mengindikasikan bahwa

keong mas jantan tidak memiliki daya tahan hidup selama daya tahan hidup keong

mas betina (Joshi 2005). Perbedaan antara keong mas jantan dan betina dapat

dilihat pada Gambar 2.

6

Gambar 2. Perbedaan keong mas jantan dan betina (Sumber: DA-PhilRice 2001)

Keong mas merupakan hewan herbivora yang sangat rakus dan bersifat

nocturnal. Keong mas dapat menghancurkan semaian padi yang baru ditanam

selama masih terdapat air dalam sawah tersebut. Keong mas memotong pangkal

semaian padi muda dengan menggunakan gigi radula dan mengunyah pelepah

daun padi yang lunak (Joshi 2005). Istilah hewan herbivora tidaklah cocok bila

disematkan pada keong mas karena hewan ini juga memakan keong-keong jenis

lain, seperti Biomphalaria glabrata (Paulinyi dan Paulini 1972) dan Bulinus sp.

yang merupakan inang perantara parasit trematoda yang menyebabkan penyakit

gatal dan schistosomiasis (Sulistiono 2007), serta memiliki sifat kanibalisme,

sehingga keong mas lebih cocok dikategorikan sebagai hewan omnivora.

Keong mas biasanya bertelur pada malam hari dan menempelkan telur-

telurnya pada beberapa tanaman, daun-daunan dan benda-benda keras seperti

batu, pancang dan ranting yang tidak terendam air. Telur-telurnya berwarna

merah cemerlang, kemudian berubah menjadi merah muda cerah ketika akan

menetas. Telur-telur ini akan menetas setelah 7-14 hari (DA-PhilRice 2001).

Seekor keong mas betina dewasa mampu menghasilkan telur 50-500 butir dalam

satu kali bertelur atau 1000-1200 butir dalam sebulan. Telur-telur tersebut

mempunyai tingkat kemampuan menetas (hatching rate) hingga 80%

(DA-PhilRice 2003; Joshi 2005). Siklus hidup keong mas dapat dilihat pada

Gambar 3.

7

Gambar 3. Siklus hidup keong mas (Sumber: DA-PhilRice 2001)

Kemampuan telur-telur keong mas untuk menetas sangat dipengaruhi oleh

kelembaban udara, tingkat oksigen di udara, keberadaan predator terestrial dan

kanibalisme keong mas dewasa. Jika telur-telur tersebut terendam air, maka

keberhasilan telur-telur tersebut untuk menetas akan berkurang. Telur-telur

tersebut dapat bertahan jika lama waktu telur-telur tersebut tercelup air cukup

pendek. Akan tetapi, jika waktu tercelupnya cukup lama dan terjadi berulang kali,

maka tingkat toleransi telur-telur tersebut akan menurun. Air diduga dapat

mengurangi ketersediaan oksigen di sekitar telur sehingga berpengaruh pada

pertumbuhan embrio (Horn et al. 2008).

Kanibalisme terjadi ketika telur-telur tersebut dimakan oleh keong-keong

dewasa. Kanibalisme ini tidak terbatas pada tindakan memakan telur-telur saja,

tetapi keong-keong dewasa tersebut juga memakan juvenil-juvenil keong mas

yang baru menetas. Kanibalisme ini terjadi karena keong-keong dewasa

membutuhkan nutrisi lebih saat terjadi defisiensi nutrisi di habitatnya. Defisiensi

nutrisi yang terjadi diduga terkait dengan defisiensi protein ataupun kalsium.

Kalsium sangat dibutuhkan oleh keong-keong untuk pembentukan dan

perkembangan ukuran cangkang (Horn et al. 2008).

Keong mas di sawah memberikan risiko bahaya pada kesehatan petani,

karena keong mas merupakan inang parasit cacing nematoda Angiostrongylus

cantonensis (Parastrongylus cantonensis) atau rat lung worm yang dapat

menyebabkan eosinophilic meningoencephalitis atau meningitis pada

manusia. Selain itu, keong mas juga merupakan inang cacing Catadiscus

8

pomaceae (Joshi 2005). Catadiscus pomaceae merupakan trematoda yang hidup

pada saluran pencernaan Pomacea canaliculata. Genus Catadiscus ini biasanya

ditemui pada hewan amfibi dan reptil, serta parasit pada moluska. Jika dilihat dari

siklus hidup cacing ini, keong mas menjadi terinfeksi oleh encysted metacercariac

yang terdapat pada tanaman atau substrat lain, ketika keong tersebut sedang

makan (Hamann 1992). Keong mas harus dimasak sampai matang terlebih dahulu

sebelum dikonsumsi untuk mematikan cacing-cacing parasit tersebut (Joshi 2005).

2.2 Pengendalian dan Pemanfaatan Keong Mas

Pemanfaatan keong mas, baik dibidang penyediaan pangan maupun pakan,

merupakan salah satu bentuk usaha pengendalian keong mas yang merupakan

hama berbahaya bagi sektor pertanian, khususnya pertanian padi. Penggunaan

moluskosida dalam mengendalikan keong mas, justru malah membunuh

organisme non-target, seperti ikan ataupun organisme bermanfaat lainnya

yang hidup pada habitat yang sama dengan keong mas (Joshi 2005).

Nurjanah et al. (1996) menambahkan bahwa keong mas memiliki resistensi tinggi

terhadap pestisida ataupun moluskosida dalam dosis tinggi sekali pun. Fakta

tersebut menunjukkan bahwa usaha pengendalian populasi keong mas yang tidak

melibatkan senyawa kimia, seperti pestisida dan moluskosida mutlak diperlukan.

Beberapa bentuk pengendalian keong mas tanpa menggunakan bahan

kimia, diantaranya pemanfaatan predator atau musuh alami dari keong mas, yaitu

semut merah yang memakan telur-telur keong mas, tikus yang memakan daging

keong, ikan mas hias atau koi, serta itik-itik karnivora yang memakan daging serta

keong-keong muda (DA-PhilRice 2001; Ako dan Tamaru 2006). Hasil penelitian

Aditya dan Raut (2005) menunjukkan bahwa lintah jenis Glossiphonia weberi

juga merupakan predator potensial keong mas di India. Lintah-lintah ini mampu

membunuh maksimum 3 ekor keong per hari.

Pemanfaatan tanaman beracun juga diterapkan untuk mengendalikan

populasi keong mas, seperti gugo (Entada phaseikaudes K Meer), sambong

(Blumea balsamifera), gabihan (Monochoria vaginalis), tembakau (Nicotina

tabacum L), calamansi (Citrus microcarpa Bunge), makabuhay (Tinospora

rumphii Boerl) dan buah paprika merah. Bagian tanaman ini, seperti daun dan

buah, diletakkan pada kanal yang dibuat untuk menjebak keong mas agar

9

terperangkap dalam kanal tersebut dan memakan tanaman beracun itu

(DA-PhilRice 2001).

Pengumpulan keong-keong di areal persawahan juga termasuk salah satu

usaha pengendalian hama keong mas ini. Keong-keong yang terkumpul biasanya

diolah menjadi bahan pangan ataupun pakan bagi ternak. Pengolahannya sebagai

bahan pangan telah banyak dilakukan, seperti fortifikasi daging keong mas dalam

pembuatan kerupuk keong mas (Nurjanah et al. 1996), fortifikasi daging keong

mas dalam pembuatan cracker “chicharon” (DA-PhilRice 2001; Joshi 2005);

pembuatan kecap, sate keong, pepes keong, sambel keong, dendeng dan menu

keong lainnya (Sulistiono 2007). Keong mas juga digunakan sebagai obat

penyakit kulit, penyakit kuning, penyakit liver dan ayan (Nurjanah et al. 1996;

Sulistiono 2007). Daging keong mas sebanyak 100 gram mengandung energi

sebesar 83 kalori, fosfor 61 mg, sodium 40 mg, potasium 17 mg, riboflavin 12

mg, niacin 1,8 mg, vitamin C, zinc, tembaga, mangan dan iodium

(DA-PhilRice 2001). Komposisi kimia keong mas dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Komposisi kimia keong mas

Komposisi Kimia Daging Lumat

Segar1)

Daging Segar

2) Daging Segar

3)

Kadar air (%) 84,70 82,37 77,60

Kadar protein (%) 9,33 8,69 12,20

Kadar lemak (%) 0,91 0,78 0,40

Kadar abu (%) 1,43 1,47 3,20

Kadar serat kasar (%) 3,10 6,68 -

Karbohidrat (%) 0,10 - 6,60 Sumber: 1) Nurjanah et al. (1996)

2) Kamil et al. (1998)

3) DA-PhilRice (2001)

Pemanfaatan keong mas sebagai pakan ternak juga telah banyak

dikembangkan. Dalam bentuk segar, keong mas digunakan sebagai pakan sumber

protein untuk ternak itik, ayam broiler, burung puyuh, budidaya ikan patin, ikan

gabus, ikan sidat, udang, kepiting dan lobster air tawar. Pemberian pakan berbasis

protein keong mas pada ternak burung puyuh (Coturnix coturnix) dan budidaya

ikan gabus (Chana striata) serta ikan sidat (Anguilla sp.), memberikan

pertumbuhan yang baik pada hewan-hewan budidaya tersebut (Sulistiono 2007).

10

Daging keong mas yang akan digunakan untuk fortifikasi tepung ikan

(pakan), harus diolah terlebih dahulu menjadi tepung keong mas atau tepung siput

murbei. Hasil penelitian Kamil et al. (1998) menunjukkan bahwa tepung keong

mas memiliki kadar air 8,03-8,73%, kadar protein 65,50-70,67%, kadar lemak

1,27-1,43%, kadar abu 9,13-10,47%, kadar serat kasar 8,19-9,59%, dan kadar

garam 0,56-1,69%. Kadar asam amino esensial tepung keong mas yang paling

tinggi adalah leusin (44,8 mg/g protein) dan terendah adalah metionin

(10,54 mg/g protein). Jenis asam amino esensial yang paling defisien adalah

triptofan, sedangkan lisin yang biasanya menjadi asam amino pembatas, ternyata

pada tepung keong mas ini memiliki skor kimia yang cukup (41,29 mg/g protein)

dan tidak menjadi asam amino pembatas, sehingga dapat digunakan sebagai

suplemen pakan yang kurang lisin. Komposisi asam amino esensial pada tepung

keong mas dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Komposisi asam amino tepung keong mas

Jenis Asam Amino Kandungan

% mg/g protein

Arginin 4,3962 43,962

Histidin 1,3822 13,822

Isoleusin 2,3479 23,479

Leusin 4,4812 44,812

Lisin 4,1290 41,290

Metionin 1,0540 10,540

Fenilalanin 2,0372 20,372

Tirosin 1,9742 19,742

Treonin 2,4245 24,245

Valin 2,6055 26,055 Sumber: Kamil et al. (1998)

2.3 Antioksidan

Antioksidan adalah komponen yang dapat menunda atau mencegah

oksidasi lipid, asam nukleat, atau molekul-molekul lain, dengan cara menghambat

inisiasi atau propagasi reaksi oksidasi berantai (Wang 2006). Rohman dan

Riyanto (2005) mendefinisikan antioksidan sebagai senyawa yang dapat

menghambat reaksi radikal bebas dalam tubuh yang dapat menyebabkan penyakit

karsinogenesis, kardiovaskuler dan penuaan. Tubuh tidak memiliki sistem

pertahanan antioksidan yang berlebihan, sehingga apabila terjadi paparan radikal

11

berlebih, maka tubuh membutuhkan antioksidan eksogen (berasal dari luar tubuh)

(Waji dan Sugrani 2009).

2.3.1 Fungsi antioksidan

Antioksidan digunakan untuk melindungi komponen-komponen makanan

yang bersifat tidak jenuh (mempunyai ikatan rangkap), terutama lemak dan

minyak. Antioksidan dapat pula digunakan untuk melindungi komponen-

komponen lain seperti vitamin dan pigmen, yang juga banyak mengandung ikatan

rangkap dalam strukturnya (Siagian 2002). Musthafa dan Lawrence (2000)

menambahkan bahwa antioksidan juga pada akhirnya berfungsi untuk menetralisir

atau meredam dampak negatif dari radikal bebas.

Mekanisme kerja antioksidan pada umumnya dapat dimengerti setelah

mekanisme proses oksidasi lemak dalam bahan makanan atau pada sistem

biologis dipahami dengan baik. Oksidasi lemak terdiri atas 3 tahapan utama, yaitu

inisiasi, propagasi dan terminasi. Pembentukan radikal asam lemak, yaitu suatu

senyawa turunan asam lemak yang bersifat tidak stabil dan sangat reaktif akibat

dari hilangnya satu atom hidrogen, terjadi pada tahap inisiasi (1). Tahap

selanjutnya, yaitu propagasi, radikal asam lemak akan bereaksi dengan oksigen

membentuk radikal peroksi (2). Radikal peroksi lebih lanjut akan menyerang

asam lemak menghasilkan hidrogen peroksida dan radikal asam lemak baru (3)

(Siagian 2002). Reaksi inisiasi dan propagasi dapat dilihat pada Gambar 4.

Inisiasi : RH R• + H

• (1)

Propagasi : R• + O2 ROO

• (2)

: ROO• + RH ROOH + R

• (3)

Gambar 4. Reaksi inisiasi dan propagasi (Sumber: Siagian 2002)

Hidrogen peroksida yang terbentuk bersifat tidak stabil dan akan

terdegradasi lebih lanjut menghasilkan senyawa-senyawa karbonil rantai pendek

seperti aldehida dan keton yang bertanggung jawab atas flavor makanan berlemak.

Tanpa adanya antioksidan, reaksi oksidasi lemak akan mengalami terminasi

melalui reaksi antar radikal bebas membentuk kompleks yang non radikal (4)

(Siagian 2002). Reaksi terminasi dapat dilihat pada Gambar 5.

12

Terminasi : ROO• + ROO

• non radikal (4)

: R• + ROO

• non radikal

: R• + R

• non radikal

Gambar 5. Reaksi terminasi (Sumber: Siagian 2002)

Antioksidan dibagi menjadi 4 tipe berdasarkan fungsinya (Siagian 2002;

Hariyatmi 2004), yaitu:

1. Tipe pemutus rantai reaksi pembentuk radikal bebas, dengan cara

menyumbangkan atom H, contohnya vitamin E.

2. Tipe pereduksi yang mampu mentransfer atom H atau oksigen dan bersifat

pemulung, contohnya vitamin C.

3. Tipe pengikat logam yang mampu mengikat zat prooksidan (Fe2+

dan Cu2+

),

contohnya flavonoid, asam sitrat dan EDTA.

4. Antioksidan seluler yang mampu mendekomposisi hidrogen peroksida

menjadi bentuk stabil, contohnya pada manusia dikenal SOD, katalase,

glutation peroksidase.

Antioksidan umumnya ditambahkan pada lemak, minyak, atau makanan

yang banyak mengandung lemak. Penambahan ini bertujuan untuk mencegah

terjadinya ketengikan pada makanan. Penyebab ketengikan pada lemak atau

minyak tersebut adalah senyawa-senyawa yang merupakan produk akhir dari

reaksi autooksidasi. Reaksi autooksidasi merupakan suatu reaksi berantai dimana

inisiator dan propagatornya adalah radikal bebas (Rita et al. 2009). Pembentukan

radikal bebas ini dapat dipengaruhi oleh faktor-faktor yang dapat mempercepat

reaksi, seperti cahaya, panas, peroksida lemak atau hidrogen peroksida, logam-

logam berat (Cu, Fe, Co, dan Mn), logam porifirin (hematin, hemoglobin,

mioglobin, dan klorofil), serta enzim-enzim lipoksidase (Winarno 2008).

Penghilangan atau deaktivasi radikal bebas asam lemak maupun radikal bebas

peroksi akan menghentikan atau memutuskan reaksi oksidasi yang terjadi pada

tahap awal. Hal ini diharapkan akan memperlambat pembentukan senyawa-

senyawa yang dapat menimbulkan ketengikan (Rita et al. 2009). Antioksidan

sebaiknya ditambahkan ke lipid seawal mungkin untuk menghasilkan efek

maksimum. Antioksidan hanya akan benar-benar efektif bila ditambahkan seawal

13

mungkin selama periode induksi, yaitu suasana periode awal oksidasi lipid terjadi

dimana oksidasi masih berjalan secara lambat dengan kecepatan seragam

(Trilaksani 2003). Reaksi autooksidasi asam lemak dapat dilihat pada Gambar 6.

Gambar 6. Skema umum autooksidasi asam lemak tidak jenuh (Sumber: Fennema 1996)

Peranan antioksidan pada kesehatan manusia sangatlah banyak. Hasil

penelitian Musthafa dan Lawrence (2000) menunjukkan bahwa antioksidan

berperan dalam menghambat proses aterosklerosis, yang merupakan komplikasi

dari penyakit diabetes mellitus dan sangat berperan untuk menyebabkan terjadinya

penyakit jantung koroner. Musthafa et al. (2000) menyatakan bahwa penyebab

yang mendasari berbagai macam keadaan patologis termasuk penyakit

aterosklerosis pada umumnya dan penyakit jantung koroner pada khususnya

adalah radikal bebas. Radikal bebas merupakan senyawa oksigen reaktif yang

sitotoksik, dapat berdampak negatif terhadap membran sel, dinukleotida (DNA)

dan protein seperti halnya enzim yang ada dalam tubuh. Hasil penelitian

Musthafa et al. (2000) ini memberikan informasi bahwa radikal bebas dapat

digunakan sebagai predictor aterosklerosis pada umumya dan aterosklerosis pada

14

penyakit diabetes ataupun penyakit jantung koroner pada khususnya. Antioksidan

juga berperan dalam menekan proliferasi (perbanyakan) sel kanker, karena

antioksidan berfungsi menutup jalur pembentukan sel ganas (blocking agent)

(Trilaksani 2003). Selain itu, antioksidan juga berperan sebagai agen antiaging

yang melindungi kulit dari proses pengrusakan oleh paparan sinar matahari dan

radikal bebas, yang dapat menimbulkan keriput dan penuaan pada kulit

(Suryowinoto 2005).

2.3.2 Jenis-jenis antioksidan

Antioksidan terdapat secara alami dalam tubuh, tetapi tubuh tidak

memiliki sistem pertahanan antioksidan yang berlebihan, sehingga apabila terjadi

paparan radikal berlebih, maka tubuh membutuhkan antioksidan eksogen

(Waji dan Sugrani 2009). Secara umum, antioksidan dibedakan menjadi dua

kategori dasar, yaitu antioksidan alami dan antioksidan sintetik. Saat ini,

ketertarikan masyarakat pada antoksidan alami meningkat tajam baik untuk

digunakan dalam bahan pangan ataupun sebagai material obat menggantikan

antioksidan sintetik. Hal ini dikarenakan antioksidan sintetik justru berpotensi

menyebabkan penyakit kanker (Wang 2006).

Antioksidan alami antara lain tokoferol, lesitin, fosfatida, sesamol,

gosipol, karoten dan asam askorbat yang banyak dihasilkan oleh tumbuhan.

Antioksidan alam yang paling banyak ditemukan dalam minyak nabati adalah

tokoferol yang mempunyai keaktifan vitamin E dan terdapat dalam bentuk α, β, γ,

δ-tokoferol. Tokoferol ini mempunyai banyak ikatan rangkap yang mudah

dioksidasi sehingga akan melindungi bahan dari oksidasi. Kandungan tokoferol

yang terdapat dalam minyak yang dimurnikan akan menurun. Dalam beberapa

lemak tertentu, tokoferol mengendap, tetapi lemak tersebut tetap tidak mudah

tengik karena terdapat suatu senyawa yang dapat mengaktifkan tokoferol yang

mengendap tersebut (Winarno 2008).

Antioksidan alami tidak hanya terbatas pada antioksidan yang dihasilkan

oleh tumbuhan saja, tetapi juga antioksidan yang terdapat dalam tubuh manusia

dan hewan, seperti glutathione (GSH) dan jaringan thiol lainnya, heme protein,

koenzim Q, bilirubin dan urates, serta beberapa antioksidan enzim seperti

superoxide dismutase (SOD), katalase (CAT), glutathione peroxidase

15

(GSH-POD) dan glutathione-S-transferase (GST) (Vattem dan Shetty 2006).

Pada buah-buahan, juga terdapat antioksidan enzim, diantaranya SOD, CAT,

GSH-POD, guaiacol peroxidase (G-POD), ascorbate peroxidase (AsA-POD),

monodehydroascorbate reductase (MDAR), dehydroascorbate reductase

(DHAR) dan glutathione reductase (GR). Antioksidan enzim ini mempunyai

kapasitas untuk menetralisir dan menurunkan kelebihan radikal bebas yang

terbentuk karena kondisi stres. Antioksidan enzim berperan sebagai katalis yang

dapat bekerja pada satu atau lebih dari tiga fase pembentukan radikal bebas, yaitu

inisiasi, propagasi dan terminasi (Wang 2006).

Antioksidan sintetik yang banyak digunakan adalah senyawa-senyawa

fenol yang biasanya agak beracun. Penambahan antioksidan ini harus memenuhi

beberapa syarat, yaitu tidak berbahaya bagi kesehatan, tidak menimbulkan warna

yang tidak diinginkan, efektif dalam konsentrasi rendah (0,01-0,02%), larut dalam

lemak, dapat tahan pada kondisi pengolahan pangan pada umumnya, mudah

didapat dan ekonomis. Bahan makanan yang memakai antioksidan,

penggunaannya harus dicantumkan (Siagian 2002; Winarno 2008). Empat macam

antioksidan yang sering digunakan adalah butylated hydroxyanisole (BHA),

butylated hydroxytoluene (BHT), propylgallate (PG), dan nordihidroquairetic

acid (NDGA) (Winarno 2008).

Kombinasi beberapa antioksidan sintetik dapat menimbulkan sinergisme.

BHA yang dikombinasikan dengan PG akan lebih efektif daripada yang

digunakan secara terpisah, tetapi kombinasi BHT dengan PG menimbulkan

sinergisme negatif. Cara kerja antioksidan sintetik ini agak berbeda dengan

antioksidan alami. Antioksidan sintetik berfungsi sebagai donor hidrogen yang

diperlukan oleh radikal bebas, terutama radikal peroksi (ROO•) untuk membentuk

hidrogen peroksida (ROOH) (Siagian 2002; Winarno 2008). Reaksi pendonoran

hidrogen oleh senyawa fenolik pada radikal peroksi disajikan pada Gambar 7.

ROO• + AH2 ROOH + AH

•

AH• + AH

• A + AH2

Gambar 7. Reaksi antioksidan senyawa fenolik dengan radikal peroksi (Sumber: Siagian 2002)

16

2.3.3 Mekanisme kerja antioksidan

Antioksidan memiliki dua fungsi berdasarkan cara kerjanya. Fungsi

pertama merupakan fungsi utama dari antioksidan yaitu sebagai pemberi atom

hidrogen. Antioksidan (AH) yang mempunyai fungsi utama tersebut sering

disebut sebagai antioksidan primer. Senyawa ini dapat memberikan atom

hidrogen secara cepat ke radikal lipida (R•, ROO

•) atau mengubahnya ke bentuk

lebih stabil, sementara turunan radikal antioksidan (A•) tersebut memiliki keadaan

lebih stabil dibanding radikal lipida. Fungsi kedua merupakan fungsi sekunder

antioksidan, yaitu memperlambat laju autooksidasi dengan berbagai mekanisme di

luar mekanisme pemutusan rantai autooksidasi dengan pengubahan radikal lipida

ke bentuk lebih stabil (Trilaksani 2003).

Penambahan antioksidan (AH) primer dengan konsentrasi rendah pada

lipid dapat menghambat atau mencegah autooksidasi lemak dan minyak.

Penambahan tersebut dapat menghalangi reaksi oksidasi pada tahap inisiasi

maupun propagasi. Radikal-radikal antioksidan (A•) yang terbentuk pada reaksi

tersebut relatif stabil dan tidak mempunyai cukup energi untuk dapat bereaksi

dengan molekul lipid lain membentuk radikal lipid baru. Radikal-radikal

antioksidan dapat saling bereaksi membentuk produk non radikal antioksidan

(Trilaksani 2003). Reaksi penghambatan radikal bebas oleh antioksidan pada

tahap inisiasi dan propagasi dapat dilihat pada Gambar 8.

Inisiasi : R• + AH RH + A

•

(radikal lipid)

Propagasi : ROO•

+ AH ROOH + A•

Gambar 8. Reaksi penghambatan oleh antioksidan primer terhadap radikal lipid (Sumber: Trilaksani 2003)

Konsentrasi antioksidan yang ditambahkan dapat berpengaruh pada laju

oksidasi. Pada konsentrasi tinggi, aktivitas antioksidan grup fenolik sering lenyap

bahkan antioksidan tersebut justru menjadi prooksidan. Pengaruh jumlah

konsentrasi pada laju oksidasi dipengaruhi oleh struktur antioksidan, kondisi dan

sampel yang akan diuji (Trilaksani 2003). Reaksi antioksidan konsentrasi tinggi

yang justru bertindak sebagai prooksidan dapat dilihat pada Gambar 9.

17

AH + O2 A• + HOO

•

AH + ROOH RO• + H2O + A

•

Gambar 9. Antioksidan bertindak sebagai prooksidan pada konsentrasi tinggi (Sumber: Trilaksani 2003)

Mekanisme antioksidan dalam menghambat oksidasi atau menghentikan

reaksi berantai pada radikal bebas dari lemak yang teroksidasi, dapat disebabkan

oleh 4 macam mekanisme reaksi (Rita et al. 2009), yaitu:

1. pelepasan hidrogen dari antioksidan.

2. pelepasan elektron dari antioksidan.

3. adisi asam lemak ke cincin aromatik pada antioksidan.

4. pembentukan senyawa kompleks antara lemak dan cincin aromatik dari

antioksidan.

Studi lebih lanjut mengamati bahwa ketika atom hidrogen labil pada suatu

antioksidan tertentu diganti dengan deuterium, antioksidan tersebut menjadi tidak

efektif. Hal ini menunjukkan bahwa mekanisme penghambatan dengan

pemberian hidrogen lebih baik dibanding pemberian elektron. Beberapa peneliti

percaya bahwa pemberian hidrogen atau elektron merupakan mekanisme utama,

sementara pembentukan kompleks antara antioksidan dengan rantai lipid adalah

reaksi sekunder (Trilaksani 2003).

Antioksidan digolongkan menjadi 3 kelompok, yaitu antioksidan primer,

sekunder dan tersier. Antioksidan primer disebut juga antioksidan endogenous

atau enzimatis. Suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan primer apabila

dapat memberikan atom hidrogen secara tepat kepada senyawa radikal, kemudian

radikal antioksidan yang terbentuk segera berubah menjadi senyawa yang lebih

stabil. Antioksidan primer ini bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa

radikal bebas, sebelum radikal bebas ini sempat bereaksi. Contoh antioksidan ini

adalah superoxide dismutase (SOD), katalase (CAT) dan glutathione peroxidase

(GSH-POD) (Suryowinoto 2005).

Antioksidan sekunder (antioksidan eksogenous) berfungsi menangkap

senyawa radikal bebas serta mencegah terjadinya reaksi berantai. Contoh

antioksidan sekunder adalah vitamin C dan esternya, vitamin E, beta

karoten, asam urat, asam sitrat, bilirubin, serta albumin (Trilaksani 2003;

18

Suryowinoto 2005). Antioksidan sekunder ini sering ditambahkan pada lemak

dan minyak sebagai kombinasi dengan antioksidan primer. Kombinasi tersebut

dapat memberi efek sinergis sehingga menambah keefektifan kerja antioksidan

primer. Antioksidan sekunder ini bekerja dengan satu atau lebih mekanisme

berikut (Trilaksani 2003):

a. memberikan suasana asam pada medium (sistem makanan),

b. meregenerasi antioksidan utama,

c. mengkelat atau mendeaktifkan kontaminan logam prooksidan,

d. menangkap oksigen, dan

e. mengikat singlet oksigen dan mengubahnya ke bentuk triplet oksigen.

Kelompok antioksidan tersier berperan dalam memperbaiki kerusakan

sel-sel dan jaringan yang disebabkan oleh radikal bebas. Contoh kelompok

antioksidan ini adalah sistem enzim DNA-repair dan metionin sulfoksidan

reduktase yang berfungsi memperbaiki DNA pada inti sel. Adanya enzim-enzim

yang dapat memperbaiki DNA ini, diharapkan dapat berguna untuk mencegah

penyakit kanker (Suryowinoto 2005).

2.4 Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH

Metode uji DPPH merupakan salah satu metode yang paling banyak

digunakan untuk memperkirakan efisiensi kinerja dari substansi yang berperan

sebagai antioksidan (Molyneux 2004). Metode pengujian ini berdasarkan pada

kemampuan substansi antioksidan tersebut dalam menetralisir radikal

bebas. Radikal bebas yang digunakan adalah 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

(DPPH) yang memiliki rumus molekul C18H12N5O6 dan Mr=394,33

(Molyneux 2004; Vattem dan Shetty 2006). Metode uji aktivitas antioksidan

dengan menggunakan radikal bebas DPPH banyak dipilih karena metode ini

sederhana, mudah, cepat, peka dan hanya memerlukan sedikit sampel

(Hanani et al. 2005). Kapasitas antioksidan pada uji ini bergantung pada struktur

kimia dari antioksidan. Pengurangan radikal DPPH bergantung pada jumlah grup

hidroksil yang ada pada antioksidan, sehingga metode ini memberikan sebuah

indikasi dari ketergantungan struktural kemampuan antioksidan dari antioksidan

biologis (Vattem dan Shetty 2006).

19

Radikal bebas DPPH merupakan radikal sintetik yang stabil pada suhu

kamar dan larut dalam pelarut polar seperti metanol dan etanol (Molyneux 2004;

Suratmo 2009). Sifat stabil ini dikarenakan radikal bebas ini memiliki satu

elektron yang didelokalisir dari molekul utuhnya, sehingga molekul tersebut tidak

reaktif sebagaimana radikal bebas lain. Delokalisasi ini akan memberikan sebuah

warna ungu gelap dengan absorbansi maksimum pada 517 nm dalam larutan

etanol ataupun metanol (Molyneux 2004; Amrun dan Umiyah 2005; Vattem dan

Shetty 2006). Absorbansi maksimum DPPH pada panjang gelombang 517 nm

terbukti dari grafik spektra sinar tampak (360-720 nm) yang diuji oleh Amrun dan

Umiyah (2005), seperti yang terlihat pada Gambar 10.

Gambar 10. Absobansi maksimum DPPH pada λ = 517 nm (Sumber: Amrun dan Umiyah 2005)

Absorbsi maksimum dari radikal DPPH dalam larutan etanol ataupun

metanol pada 517 nm dipertimbangkan sebagai sebuah kekurangan utama dari

pengujian ini, karena dapat mengendapkan sebagian besar protein dan

menurunkan aktivitas dari sebagian besar fenolik hidroksida monovalen.

Ketergantungan pada jumlah grup hidroksil juga berakibat pada perbedaan

kecepatan kinetik dari reaksi antara antioksidan dan radikal DPPH, serta

menyebabkan fluktuasi pada waktu reaksi secara signifikan, sehingga disarankan

untuk setiap sampel yang berbeda diperlukan standarisasi waktu reaksi dan model

kinetik yang berbeda (Vattem dan Shetty 2006).

Ketika sebuah antioksidan mampu mendonorkan hidrogen yang beraksi

dengan radikal DPPH, reaksi ini akan memberikan peningkatan kompleks non

radikal dan menurunkan radikal DPPH yang ditandai dengan terbentuknya warna

kuning. Penurunan pada absorbsi dapat diukur secara spektrofotometrikal dan

dibandingkan dengan sebuah kontrol etanol atau metanol untuk mengkalkulasikan

aktivitas scavenging radikal bebas DPPH (Vattem dan Shetty 2006). Ketika

20

DPPH menerima elektron atau radikal hidrogen, maka akan terbentuk molekul

diamagnetik yang stabil. Interaksi antioksidan dengan DPPH baik secara transfer

elektron atau radikal hidrogen, akan menetralkan karakter radikal bebas dari

DPPH. Jika semua elektron pada radikal bebas DPPH menjadi berpasangan,

maka warna larutan berubah dari ungu tua menjadi kuning terang dan absorbansi

pada panjang gelombang 517 nm akan hilang. Perubahan ini dapat diukur secara

stokiometri sesuai dengan jumlah elektron atau atom hidrogen yang ditangkap

oleh molekul DPPH akibat adanya zat antioksidan (Suratmo 2009). Struktur

kimia DPPH dalam bentuk radikal bebas (1) dan bentuk kompleks non radikal (2)

dapat dilihat pada Gambar 11.

Gambar 11. Struktur kimia radikal bebas (1) dan bentuk non radikal (2) DPPH (Sumber: Molyneux 2004)

Ada tiga tahap reaksi antara DPPH dengan zat antioksidan, yang dapat

dicontohkan dengan reaksi antara DPPH dengan senyawa monofenolat

(antioksidan). Tahap pertama meliputi delokalisasi satu elektron pada gugus yang

tersubstitusi para dari senyawa tersebut, kemudian memberikan atom hidrogen

untuk mereduksi DPPH. Tahap berikutnya meliputi dimerisasi antara dua radikal

fenoksil, yang akan mentransfer radikal hidrogen dan akan bereaksi kembali

dengan radikal DPPH. Tahap terakhir adalah pembentukan kompleks antara

radikal aril dengan radikal DPPH. Pembentukan dimer maupun kompleks antara

zat antioksidan dengan DPPH tergantung pada kestabilan dan potensial reaksi

dari struktur molekulnya (Suratmo 2009).

Salah satu parameter yang biasa digunakan untuk menginterpretasikan

hasil dari pengujian DPPH adalah efficient concentration 50 value (EC50 value)

atau biasa dikenal dengan inhibition concentration 50 value (IC50 value). Nilai ini

dapat didefinisikan sebagai konsentrasi substrat yang dapat menyebabkan

21

berkurangnya 50% aktivitas DPPH. Semakin kecil nilai IC50 berarti aktivitas

antioksidannya semakin tinggi. Suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan

sangat kuat apabila nilai IC50 kurang dari 0,05 mg/ml, kuat apabila nilai IC50

antara 0,05-0,10 mg/ml, sedang apabila nilai IC50 berkisar antara 0,10-

0,15 mg/ml, dan lemah apabila nilai IC50 berkisar antara 0,15-0,20 mg/ml

(Blois 1958 dalam Molyneux 2004).

2.5 Antioksidan BHT (Butylated Hydroxytoluene)

Butylated hydroxytoluene (BHT) merupakan salah satu contoh antioksidan

jenis sintetik, yang berperan sebagai senyawa yang mudah bereaksi dengan

oksigen (Rita et al. 2009). BHT (2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol) memiliki

rumus molekul C15H24O dan Mr=220,36. BHT dapat meleleh pada suhu 69,44 oC

dan mendidih pada suhu 265 oC. Bentuknya berupa butiran putih dan stabil pada

kondisi penggunaan dan penyimpanan yang normal, tidak panas dan tidak lembab

(Scholar Chemistry 2008). Struktur kimia dari BHT dapat dilihat pada

Gambar 12.

Gambar 12. Struktur kimia butylated hydroxytoluene (BHT) (Sumber: Herawati dan Akhlus 2006)

BHT banyak ditambahkan pada produk pangan sebagai antioksidan yang

berfungsi untuk mencegah ketengikan. Bahan pangan yang biasa diberi tambahan

BHT adalah lemak, minyak, atau bahan makanan yang mengandung asam lemak

tak jenuh tinggi. Salah satu contohnya minyak kelapa sawit. Menurut Herawati

dan Akhlus (2006), penambahan 200 ppm BHT mampu menahan kadar peroxida

pada RBD minyak kelapa sawit dibawah 2 meq/kg selama 210 menit, sedangkan

tanpa menggunakan BHT diperoleh 2 meq/kg hanya dalam waktu 30 menit. Hasil

penelitian Hanani et al. (2005) menunjukkan bahwa BHT memiliki IC50 pada

konsentrasi 3,81 ppm, sehingga antioksidan sintetik BHT dapat dikategorikan

22

sebagai antioksidan yang memiliki aktivitas yang kuat. Mekanisme reaksi BHT

dengan radikal bebas dengan cara mendeaktifasi senyawa radikal tersebut dapat

dilihat pada Gambar 13.

Gambar 13. Mekanisme reaksi BHT dengan radikal bebas (Sumber: Herawati dan Akhlus 2006)

BHT dapat menyebabkan kematian 50% (LD50) hewan uji tikus secara oral

pada konsentrasi 980 mg/kg, dan pada kelinci secara dermal sebesar 500 mg/Mild

(Scholar Chemistry 2008). Penambahan BHT dalam bahan makanan diduga dapat

menyebabkan kanker dan mutasi gen pada manusia, sehingga penggunaannya

mulai dilarang di Jepang dan negara-negara Eropa seperti Rumania, Swedia dan

Australia (Rita et al. 2009).

2.6 Ekstraksi Komponen Bioaktif

Ekstraksi merupakan proses penarikan komponen zat aktif suatu bahan

dengan menggunakan pelarut tertentu. Tujuan dari proses ini adalah untuk

mendapatkan bagian-bagian tertentu dari bahan yang mengandung komponen-

komponen aktif (Harborne 1984). Proses ekstraksi berdasarkan media

pengekstraknya dapat dibedakan menjadi empat tipe, yaitu solvent extraction,

supercritical fluids extraction, steam destilation dan headspace techniques

(Beek 1999). Metode ekstraksi yang umum dilakukan adalah solvent extraction.

Proses dasar ekstraksi komponen bioaktif dari suatu bahan, umumnya

terdiri dari 3 tahap. Tahap awal, pelarut yang diasumsikan memiliki solubilitas

yang cukup akan merusak membran permukaan bahan dan melarutkan komponen

bioaktif yang bebas (tidak berikatan dengan komponen lain). Tahap kedua,

pelarut akan masuk ke dalam material sampel dan memutus matrix effect

(komponen bioaktif yang berikatan dengan komponen-komponen lain), sehingga

23

kompenen bioaktif akan terbebas dan larut dalam pelarut. Tahap kedua ini juga

menyebabkan membran menjadi lebih bersifat permeabel. Tahap akhir,

komponen bioaktif yang terdapat pada bagian terdalam bahan akan berdifusi

secara berlahan karena membran menjadi lebih bersifat permeabel (Beek 1999).

Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstraksi tipe

solvent extraction atau ekstraksi yang menggunakan pelarut dengan metode

maserasi. Metode ini dipilih karena cukup mudah diterapkan dan murah, pelarut

yang digunakan tidak terlalu banyak, serta dapat memberikan hasil ekstrasi yang

baik dan selektif. Walaupun begitu metode ini juga memiliki kekurangan, yaitu

komponen bioaktif harus mampu larut dalam pelarut tanpa adanya pengadukan

atau pemanasan yang lambat (Beek 1999).

Proses ekstraksi yang dilakukan merupakan proses ekstraksi bertingkat

yang merupakan salah satu bentuk ekstraksi tipe solvent extraction.

Salamah et al. (2008) mendefinisikan ekstraksi bertingkat sebagai proses ekstraksi

yang dilakukan secara berturut-turut dimulai dengan pelarut non polar, pelarut

yang kepolarannya menengah (semipolar) dan pelarut polar. Pelarut-pelarut yang

dapat digunakan dalam proses ekstraksi bertingkat ini dapat dilihat pada Tabel 3.

Kekurangan dari proses ekstraksi bertingkat adalah rendemen ekstrak yang

diperoleh lebih kecil dibandingkan dengan proses ekstraksi tunggal. Hal ini

dibuktikan oleh penelitian Prabowo (2009).

Tabel 3. Jenis-jenis pelarut yang umum digunakan dalam ekstraksi

Jenis Pelarut Titik Beku (oC) Titik Didih (

oC)

Air 0 100

Etanol -98 65

Etanol -117 78

Propanol -127 97

Aseton -95 56

Etil asetat -84 77

Heksana -98 69

Benzena 6 80

Kloroform -63 61 , Sumber: Lehninger (1988)

2.7 Komponen Bioaktif

Komponen bioaktif merupakan kelompok senyawa fungsional yang

terkandung dalam bahan pangan dan dapat memberikan pengaruh biologis.

24

Sebagian besar komponen bioaktif adalah kelompok alkohol aromatik seperti

polifenol dan komponen asam (phenolic acid). Komponen bioaktif tidak terbatas

pada hasil metabolisme sekunder saja, tetapi juga termasuk metabolit primer yang

memberikan aktivitas biologis fungsional, seperti protein dan peptida

(Kannan et al. 2009). Penapisan komponen bioaktif ini dapat dilakukan dengan

metode uji fitokimia yang meliputi komponen karbohidrat, gula pereduksi,

peptida, asam amino (metabolit primer), alkaloid, steroid, flavonoid, saponin dan

fenol hidrokuinon (metabolit sekunder) (Harborne 1984; Harborne 1999).

Fitokimia atau fitonutrien, merupakan cabang ilmu yang mempelajari

senyawa organik yang dibentuk dan ditimbun oleh tumbuhan, yaitu mencakup

struktur kimia, biosintesis, perubahan serta metabolisme, penyebaran secara alami

dan fungsi biologis. Senyawa fitokimia tidak hanya terdapat pada tumbuhan

(phytoo) saja, tetapi juga terdapat pada jaringan tubuh hewan (zoo). Fitokimia

biasanya lebih merujuk pada senyawa yang ditemukan pada tumbuhan ataupun

hewan yang tidak dibutuhkan untuk fungsi normal tubuh, tetapi memiliki efek

yang menguntungkan bagi kesehatan atau memiliki peran aktif dalam pencegahan

penyakit (metabolit sekunder). Senyawa ini berbeda dengan apa yang diistilahkan

sebagai nutrisi dalam pengertian tradisional karena ketiadaan senyawa ini tidak

akan menyebabkan penyakit defisiensi, asalkan tetap mengkonsumsi pangan

yang mengandung zat gizi seperti karbohidrat, protein dan lemak

(Astawan dan Kasih 2008).

2.7.1 Alkaloid

Komponen alkaloid merupakan golongan senyawa organik yang paling

banyak ditemukan di alam. Alkaloid umumnya dapat didefinisikan sebagai

substasi dasar yang memiliki satu atau lebih atom nitrogen yang bersifat basa dan

tergabung dalam suatu sistem siklis, yaitu cincin heterosiklik. Alkaloid biasanya

tidak berwarna dan sebagian besar berbentuk kristal dengan titik lebur

tertentu, tetapi ada pula yang berbentuk amorf atau cairan pada suhu ruang.

Secara organoleptik, alkaloid akan terasa pahit di lidah (Harborne 1984;

Kutchan 1995; Putra 2007).

Menurut Hegnauer, senyawa alkaloid diklasifikasikan menjadi

3 kelompok, yaitu alkaloid sesungguhnya, protoalkaloid dan pseudoalkaloid.

25

Alkaloid sesungguhnya adalah racun, senyawa tersebut menunjukkan aktivitas

fisiologis yang luas, hampir tanpa terkecuali bersifat basa, lazim mengandung

nitrogen dalam cincin heterosiklis, diturunkan dari asam amino dan biasanya

terdapat dalam tanaman sebagai garam asam organik. Protoalakaloid merupakan

amin yang relatif sederhana dimana nitrogen-nitrogen asam amino tidak terdapat

dalam cincin heterosiklik. Pseudoalkaloid tidak diturunkan dari prekursor asam

amino dan biasanya bersifat basa (Lenny 2006).

Alkaloid dikategorikan sebagai hasil metabolisme sekunder, dimana

kelompok molekul ini merupakan substansi organik yang tidak bersifat vital bagi

organisme yang menghasilkannya (Kutchan 1995). Dari segi biogenetik, alkaloid

diketahui berasal dari sejumlah kecil asam amino yaitu ornitin dan lisin yang

menurunkan alkaloid alisiklik; fenilalanin dan tirosin yang menurunkan alkaloid

jenis isokuinolin; dan triftopan yang menurunkan alkaloid indol (Lenny 2006).

Reaksi utama yang mendasari biosintesis senyawa alkaloid adalah reaksi

Mannich, dimana menurut reaksi ini suatu aldehid berkondensasi dengan suatu

amina menghasilkan suatu ikatan karbon-nitrogen dalam bentuk imina atau garam

iminium, diikuti oleh serangan suatu atom karbon nukleofilik yang dapat berupa

suatu enol atau fenol. Biosintesis alkaloid juga melibatkan reaksi rangkap

oksidatif fenol dan metilasi. Jalur poliketid dan jalur mevalonat juga ditemukan

dalam biosintesis alkaloid (Lenny 2006; Putra 2007).

Alkaloid kerap kali bersifat racun pada manusia, tetapi ada pula yang

memiliki aktivitas fisiologis pada kesehatan manusia sehingga digunakan secara

luas dalam pengobatan (Harborne 1984). Beberapa contoh senyawa alkaloid yang

telah umum dikenal dalam bidang farmakologi, diantaranya adalah nikotin

(stimulan pada syaraf otonom), morfin (analgesik), kodein (analgesik dan obat

batuk), atropin (obat tetes mata), skopolamin (sedatif menjelang operasi), kokain

(analgesik), piperin (antifeedant), quinin (obat malaria), vinkristin (obat kanker),

ergotamin (analgesik untuk migrain), reserpin (pengobatan simptomatis disfungsi

ereksi), mitraginin (analgesik dan antitusif), serta vinblastin (antineoplastik dan

obat kanker) (Putra 2007).

Fungsi alkaloid sendiri dalam tumbuhan sejauh ini belum diketahui secara

pasti, beberapa ahli pernah mengungkapkan bahwa alkaloid diperkirakan sebagai

26

pelindung tumbuhan dari serangan hama dan penyakit, pengatur tumbuh, atau

sebagai basa mineral untuk mempertahankan keseimbangan ion (Putra 2007).

Hasil penelitian Porto et al. (2009) menunjukkan bahwa komponen alkaloid pada

daun Psychotria brachyceras yaitu brachycerine, memiliki aktivitas antioksidan

dan berperan sebagai pelindung dari radiasi sinar UV (UV-B dan UV-C).

2.7.2 Steroid/triterpenoid

Triterpenoid merupakan komponen dengan kerangka karbon yang tersusun

oleh 6 unit isoprene dan dibuat secara biosintesis dari skualen (C30 hidrokarbon

asiklik). Triterpenoid memiliki struktur siklik yang kompleks, sebagian besar

terdiri atas alkohol, aldehid, atau asam karboksilat. Triterpenoid tidak berwarna,

jernih, memiliki titik lebur tinggi dan merupakan komponen aktif yang sulit

dikarakterisasi. Pengujian yang telah digunakan secara luas untuk mendeteksi

triterpenoid adalah dengan pereaksi Liebermann-Burchard, yang memberikan

warna biru-hijau pada triterpenoid dan steroid. Triterpenoid dapat digolongkan

menjadi 4 grup komponen, yaitu triterpenoid sebenarnya, steroid, saponin

dan cardiac glycoside. Triterpenoid umumnya memiliki rasa yang pahit

(Harborne 1984). Hasil penelitian Setzer (2008) menunjukkan bahwa sejumlah

produk triterpenoid alami memiliki aktivitas antitumor karena memiliki

kemampuan menghambat kinerja enzim topoisomerase II, dengan cara berikatan

dengan sisi aktif enzim yang nantinya akan mengikat DNA dan membelahnya.

Hal ini menyebabkan enzim menjadi terkunci dan tidak dapat mengikat DNA.

Steroid merupakan golongan triterpena yang tersusun atas sistem cincin

cyclopetana perhydrophenanthrene. Steroid pada mulanya dipertimbangkan

hanya sebagai komponen pada substansi hewan saja (sebagai hormon seks, asam

empedu, dan lain sebagainya), akan tetapi akhir-akhir ini steroid juga ditemukan

pada substansi tumbuhan (Harborne 1984). Prekursor pembentukan steroid

adalah kolesterol atau fitosterol. Menurut Bose et al. (1997), profil steroid yang

terdapat pada hemolimfa Achatina fulica (salah satu jenis gastropoda hermaprodit

air tawar) meliputi progesterone, 17-β-estradiol, testosterone, 4-androstene-dione

dan cortisol. Progesterone terkandung lebih banyak pada fase jantan dan

menurun pada fase betina, dimana saat itu laju konversi kolesterol menjadi

17-β-estradiol dan 4-androstene-dione lebih tinggi dibandingkan dengan profil

27

steroid yang lain. Jumlah steroid yang terdapat pada hemolimfa ini diyakini

sebagai hasil mekanisme biosintesis aktif dari gastropoda tersebut. Sumber dari

steroid reproduksi ini jelas berasal dari gonad dan kelenjar reproduksi tambahan.

Hasil penelitian Silva et al. (2002) menunjukkan bahwa komponen steroid

yang diekstrak dari daun Agave attenuata memiliki aktivitas anti-inflamasi,

walaupun aktivitas ini diikuti dengan efek hemolitik yang tidak diinginkan.

Komponen steroid dapat meningkatkan aktivitas hemolitik karena steroid

memiliki afinitas lebih tinggi dari kolesterol pada membran eritrosit.

2.7.3 Flavonoid

Flavonoid merupakan golongan terbesar dari senyawa polifenol, karena itu

larutan ekstrak yang mengandung komponen flavonoid akan berubah warna jika

diberi larutan basa atau ammonia. Flavonoid mengandung sistem aromatik

konjugasi dan dapat menunjukkan pita penyerapan yang kuat pada spektrum

wilayah UV dan sinar tampak (Harborne 1984; Astawan dan Kasih 2008).

Flavonoid umumnya merupakan komponen larut air (polar). Komponen

ini dapat diekstrak dengan etanol 70% dan tertinggal pada lapisan aqueous, diikuti

dengan pemisahan ekstrak menggunakan petroleum ether. Flavonoid pada

tanaman berikatan dengan gula sebagai glikosida dan adapula yang berada dalam

aglikon. Flavonoid dapat dikelompokan menjadi 9 kelas, yaitu anthosianin,

proanthosianidin, flavonol, flavon, glikoflavon, biflavonil, chlacone dan aurone,

flavanon, serta isoflavon (Harborne 1984). Komponen flavonoid pada tanaman

yang dikonsumsi oleh hewan herbivora, dapat tersimpan dalam tubuh hewan

tersebut. Contohnya adalah quercetin yang tersimpan dalam sayap kupu-kupu

setelah melewati proses pencernaan makanan (Harborne 1999).

Flavonoid sangat efektif untuk digunakan sebagai antioksidan (Astawan

dan Kasih 2008). Hal ini terbukti dari hasil penelitian Bernardi et al. (2007) yang

menunjukkan bahwa seluruh komponen flavonoid yang diisolasi dari Hypericum

ternum memiliki aktivitas antioksidan, walaupun kapasitas peredaman radikal

bebas DPPH oleh masing-masing komponen flavonoid tersebut berbeda-beda.

Komponen flavonoid tersebut merupakan turunan dari quercetin (dari yang terkuat

ke yang paling lemah), yaitu guaijaverin, hyperoside, isoquercitrin dan quercetin-

3-metil-eter.

28

Senyawa flavonoid dapat mencegah penyakit kardivaskuler dengan cara

menurunkan laju oksidasi lemak. Beberapa penelitian menunjukan bahwa

flavonoid dapat menurunkan hiperlipidemia pada manusia. Pada kasus penyakit

jantung, penghambatan oksidasi LDL oleh flavonoid dapat mencegah

pembentukan sel-sel busa dan kerusakan lipid (Astawan dan Kasih 2008). Selain

itu, flavonoid juga memiliki fungsi sebagai antibakteri, anti-inflamasi, antitumor,

antialergi, dan mencegah osteoporosis. Hal ini terbukti dari beberapa penelitian

yang telah dilakukan. Hasil penelitian Sukadana (2009) menunjukkan bahwa

komponen flavonoid yang diisolasi dari buah belimbing manis memiliki aktivitas

antibakteri pada bakteri Gram positif (S. aureus) pada konsentrasi 500 ppm dan

bakteri Gram negatif (E. coli) pada konsentrasi 100 ppm. Hasil penelitian

Al-Meshal et al. (1985) menunjukkan bahwa fraksi flavonoid yang diisolasi dari

tumbuhan Catha edulis Forsk memiliki aktivitas anti-inflamasi pada dosis

200 mg/kg. Aktivitas anti-inflamasi ini juga dimiliki oleh komponen flavonoid

tergeranilasi dari ekstrak daun sukun yang diisolasi oleh Syah et al. (2006), yaitu

2-geranil-2’,4’,3,4-tetrahidroksidihidrokalkon, dimana komponen ini telah

diketahui memiliki efek biologis yang potensial sebagai inhibitor 5-lipooksigenase

yang berperan dalam proses alergi, inhibitor katepsin K yang merupakan enzim

sistein protease yang terlibat dalam proses terjadinya osteoporosis, serta sebagai

obat antitumor yang telah dipatenkan.

2.7.4 Saponin

Saponin merupakan glikosida yang apabila dihidrolisis secara sempurna

akan menghasilkan gula dan satu fraksi non-gula yang disebut sapogenin atau

genin. Gula-gula yang terdapat dalam saponin jumlah dan jenisnya bervariasi,

diantaranya glukosa, galaktosa, arabinosa, ramnosa, serta asam galakturonat dan

glukoronat. Sapogenin sendiri dapat dibedakan menjadi dua jenis, yaitu

sapogenin triterpenik dan steroidik (Muchtadi 1989).

Saponin merupakan agen aktif permukaan dengan sifat yang menyerupai

sabun. Saponin larut dalam air, sedikit larut atau tidak sama sekali dalam etanol

dan metanol pekat yang dingin. Kehadirannya dapat dideteksi dengan mudah

karena komponen ini mampu membentuk busa dan dapat menyebabkan hemolisis

sel darah. Hemolisis darah merah oleh saponin ini merupakan hasil interaksi

29

antara saponin dengan senyawa-senyawa yang terdapat pada permukaan membran

sel, seperti kolesterol, protein dan fosfolipid. Saponin terkadang bersifat racun

pada ternak (saponin pada alfalfa) dan memiliki rasa yang manis (glycyrrhizin

pada akar kayu manis) (Harborne 1984; Muchtadi 1989).

Komponen saponin berperan dalam mereduksi kolesterol dan melawan

kanker kolon. Saponin juga memiliki aktivitas antimikroba, merangsang sistem

imun, dan mengatur tekanan darah (Astawan dan Kasih 2008). Hasil penelitian

Cui et al. (2004) menunjukkan bahwa ekstrak air dari tumbuhan herbal Dioscorea

nipponica Mak. yang biasa digunakan sebagai obat penyakit cardiovascular

(penyakit jantung, hyperlipaemia, dan tonsilitis) ternyata mengandung komponen

furostanol saponin yang tergolong dalam steroidal saponin, yaitu

26-O-β-D-glucopyranosyl-furost-5(6),20(22)-dien-3β,26-diol. Selain untuk

kesehatan, saponin juga dapat digunakan sebagai agen bioaktif pengendali

nyamuk. Hasil penelitian Wiesman dan Chapagain (2003) menunjukkan bahwa

ekstrak saponin yang diisolasi dari Quillaja saponaria dan Balanites aegyptiaca

mampu digunakan sebagai agen pengendali nyamuk Aedes aegypti dan Culex

pipiens, tetapi aman bagi mamalia.

2.7.5 Fenol hidrokuinon

Komponen fenolat merupakan struktur aromatik yang berikatan dengan

satu atau lebih gugus hidroksil, beberapa mungkin digantikan dengan gugus metil

atau glikosil. Komponen fenolat bersifat larut air selama komponen tersebut

berikatan dengan gula membentuk glikosida, dan biasanya terdapat dalam vakuola

sel. Flavonoid merupakan kelompok yang terbesar di antara komponen fenolat

alami yang strukturnya telah diketahui, tetapi fenol monosiklik sederhana,

fenilpropanoid dan fenolat quinon terdapat dalam jumlah sedikit (Harborne 1984;

Harborne 1999).

Pigmen quinon alami berada pada kisaran warna kuning muda hingga

hitam. Quinon mengandung kromatofor dasar yang sama dengan kromatofor

benzoquinon, yang terdiri dari dua grup karbonil yang berkonjugasi dengan dua

ikatan rangkap karbon-karbon. Untuk tujuan identifikasi, quinon dapat dibagi

menjadi empat kelompok, yaitu benzoquinon, naftaquinon, antraquinon, dan

isoprenoid quinon. Tiga kelompok pertama umumnya terhidrolisis dan memiliki

30

sifat fenol, sedangkan isoprenoid quinon terdapat pada respirasi seluler

(ubiquinon) dan fostosintesis (plastoquinon) (Harborne 1984).

Hasil penelitian Escudero et al. (2008) menunjukkan bahwa komponen

polifenol yang diisolasi dari daun Piper aduncum L. memiliki aktivitas

antioksidan dan menurunkan kandungan hidrogen peroksida secara in-vivo.

Komponen polifenol tersebut meliputi asam gallat, asam klorogenat, katekin, dan

quercetin yang dilaporkan memiliki nilai IC50 1-8 ppm.

2.7.6 Karbohidrat

Karbohidrat merupakan komponen organik kompleks yang dibentuk

melalui proses fotosintesis pada tanaman, dan merupakan sumber energi utama

dalam respirasi. Karbohidrat berperan dalam penyimpanan energi (pati),

transportasi energi (sukrosa), serta pembangun dinding sel (selulosa). Karbohidrat

berperan dalam interaksi hewan dan tumbuhan, perlindungan dari luka dan

infeksi, serta detoksifikasi dari substansi asing (Harborne 1984). Karbohidrat

mempunyai struktur, ukuran dan bentuk molekul yang berbeda-beda. Karbohidrat

umumnya aman untuk dikonsumsi (tidak beracun). Rumus kimia karbohidrat

umumnya Cx(H2O)y (Fennema 1996).

Karbohidrat yang terdapat pada hewan umumnya berbentuk glikogen, dan

dapat dipecah menjadi D-glukosa. Karbohidrat dalam tubuh hewan dapat

dibentuk dari beberapa asam amino dan sebagian dari gliserol lemak, tetapi

sebagian besar karbohidrat diperoleh dari bahan makanan yang dimakan sehari-

hari, terutama bahan makanan yang berasal dari tumbuhan (Winarno 2008).

Karbohidrat yang memiliki berat molekul rendah, umumnya mempunyai

banyak kegunaan. Komponen tersebut aktif secara optis, merupakan komponen

alifatik polihidroksi, yang biasanya sangat larut air. Komponen ini sukar untuk

mengkristal bahkan dalam keadaan murni sekalipun, dan biasanya diisolasi

dengan mereaksikannya dengan komponen lain (Harborne 1984). Pada tubuh

manusia, karbohidrat berguna untuk mencegah ketosis, pemecahan protein tubuh

yang berlebihan, kehilangan mineral dan berguna untuk membantu metabolisme

lemak dan protein (Winarno 2008).

Karbohidrat umumnya dapat dikelompokan menjadi tiga kelompok

berdasarkan ukuran molekulernya, yaitu monosakarida, oligosakarida, dan

31

polisakarida. Monosakarida merupakan suatu molekul yang dapat terdiri dari

5-6 atom C (fruktosa, glukosa), oligosakarida merupakan polimer dari

2-10 monosakarida (sukrosa), dan polisakarida merupakan polimer yang terdiri

lebih dari 10 monomer monosakarida yang membentuk rantai lurus ataupun

bercabang (Harborne 1984; Winarno 2008).

2.7.7 Gula pereduksi

Gula pereduksi merupakan kelompok gula atau karbohidrat yang mampu

mereduksi senyawa pengoksidasi. Monosakarida akan segera mereduksi

senyawa-senyawa pengoksida seperti ferisianida, hidrogen peroksida, atau ion

kupri (Cu2+

). Gula dioksidasi pada gugus karbonil dan senyawa pengoksidasi

menjadi tereduksi pada reaksi ini. Sifat gula pereduksi ini dapat berguna dalam

analisis gula, dengan mengukur jumlah dari senyawa pengoksidasi yang tereduksi

oleh suatu larutan gula tertentu, dapat dilakukan pendugaan konsentrasi gula.

Prinsip tersebut berguna dalam menganalisis kandungan gula dalam darah dan air

seni untuk diagnosa diabetes mellitus (Lehninger 1988).

Sifat pereduksi dari suatu molekul gula ditentukan oleh ada atau tidaknya

gugus hidroksil (OH) bebas yang reaktif. Gugus hidroksil yang reaktif pada

glukosa (aldosa) biasanya terletak pada karbon nomor satu (anomerik), sedangkan

pada fruktosa (ketosa) terletak pada karbon nomor dua. Sukrosa tidak mempunyai

gugus OH bebas yang reaktif karena keduanya sudah saling terikat, sedangkan

laktosa mempunyai gugus OH bebas pada atom C nomor satu pada gugus

glukosanya (Winarno 2008).

Salah satu metode untuk mengukur jumlah gula pereduksi ini dapat

digunakan larutan Fehling. Larutan Fehling merupakan larutan alkali

tembaga (II) yang mengoksidasi aldosa menjadi aldonat, dalam prosesnya akan

tereduksi menjadi tembaga (I) yang mengendap sebagai Cu2O yang berwarna

merah bata. Reagen lain yang dapat digunakan dalam mengukur jumlah gula

pereduksi adalah reagen Nelson-Somogyi dan Benedict. Aldosa termasuk gula

pereduksi, begitu juga dengan ketosa. Ketosa dalam suasana alkali larutan

Fehling, akan terisomerasi menjadi aldosa, sehingga dalam reagen Benedict

yang tidak alkali hanya komponen aldosa yang dapat terdeteksi, tetapi ketosa

tidak (Fennema 1996).

32

2.7.8 Peptida

Peptida merupakan ikatan kovalen antara dua atau lebih molekul asam

amino melalui suatu ikatan amida substitusi. Ikatan ini dibentuk dengan menarik

unsur H2O dari gugus karboksil suatu asam amino dan gugus α-amino dari

molekul lain, dengan reaksi kondensasi yang kuat. Dua molekul asam amino

yang diikat oleh sebuah ikatan peptida disebut dipeptida, tiga molekul asam amino

yang diikat oleh dua ikatan peptida disebut tripeptida, dan begitu seterusnya.

Istilah oligopeptida digunakan untuk kelompok yang memiliki ≤ 10 residu asam

amino. Jika terdapat banyak asam amino yang bergabung dengan cara demikian,

maka akan menghasilkan struktur yang disebut polipeptida. Transisi dari

polipeptida menjadi protein tidak banyak dijelaskan, tetapi batasan pengertian

protein umumnya diasumsikan sebagai rantai peptida yang memiliki berat

molekul sekitar 10 kDa atau mengandung kurang lebih 100 residu asam amino

(Lehninger 1988; Belitz et al. 2009).

Peptida dengan panjang bermacam-macam dibentuk oleh hidrolisis

sebagian dari rantai polipeptida yang panjang dari protein, yang dapat

mengandung ratusan asam amino (Lehninger 1988). Pembentukan ikatan peptida

memerlukan banyak energi, sedangkan untuk hidrolisis praktis tidak memerlukan

energi. Reaksi keseimbangan ini lebih cenderung untuk berjalan ke arah hidrolisis

daripada sintesis (Winarno 2008).

Beberapa peptida menunjukkan aktivitas biologis yang nyata. Salah

satunya adalah peptida pendek enkefalin, hormon yang dibentuk dalam pusat

sistem syaraf. Hormon ini berperan sebagai analgesik alami dalam tubuh yang

dapat meniadakan rasa sakit ketika molekul-molekul ini berikatan dengan reseptor

spesifik pada sel tertentu dalam otak, yang biasanya berikatan dengan morfin,

heroin dan jenis candu lainnya (Lehninger 1988). Hasil penelitian

Kannan et al. (2009) menunjukkan bahwa hidrolisat peptida dari kulit padi yang

memiliki berat molekul < 5 kDa memiliki aktivitas antikanker. Fraksi peptida

tersebut memiliki nilai IC50 sekitar 750 ppm setelah diujikan pada sel kanker

kolon (HCT-116) dan sel kanker payudara (HTB-26).

33

2.7.9 Asam amino

Asam amino merupakan unit struktural dasar dari protein. Asam amino

dapat diperoleh dengan menghidrolisis protein dalam asam, alkali, ataupun enzim.

Sebuah asam amino tersusun atas sebuah atom α-karbon yang berikatan secara

kovalen dengan sebuah atom hidrogen, sebuah gugus amino, dan sebuah gugus

rantai R. Semua asam amino berkonfigurasi α dan mempunyai konfigurasi L,

kecuali glisin yang tidak mempunyai atom C asimetrik. Hanya asam amino L

yang merupakan komponen protein (Fennema 1996; Winarno 2008). Struktur

kimia asam amino secara umum dapat dilihat pada Gambar 14.

Gambar 124. Struktur kimia asam amino (Sumber: Fennema 1996)

Perbedaan antar asam amino alami, hanya terletak pada gugus rantai R

yang berikatan dengan atom α-karbon. Sifat-sifat fisiko-kimia dari asam amino,

seperti kelarutan, reaksi kimia, pontensial ikatan hidrogen, sangat bergantung

pada gugus rantai R tersebut (Fennema 1996). Gugus rantai R ini dapat berupa

alifatik, aromatik, residu heterosiklik, atau gugus fungsional lainnya yang

berikatan (Belitz et al. 2009).

Asam amino dalam kondisi netral (pH isolistrik) berada dalam bentuk ion

dipolar atau disebut juga zwitter ion. Pada asam amino yang dipolar, gugus amino

mendapat tambahan sebuah proton dan gugus karboksil terdisosiasi. Derajat

ionisasi dari asam amino sangat dipengaruhi oleh pH. Gugus karboksilnya tidak

terdisosiasi, sedangkan gugus aminonya menjadi ion pada pH yang rendah

(misalnya pH 1,00). Gugus karboksil terdisosiasi pada pH tinggi (misalnya

pH 11,00), sedangkan gugus aminonya tidak (Winarno 2008).

Asam amino dapat diklasifikasikan berdasarkan derajat interaksi gugus

rantai R dengan air menjadi dua kelompok besar (Fennema 1996;

Belitz et al. 2009), yaitu:

34

1) Asam amino polar (hidrofilik), yaitu asam amino yang larut dalam air dan

dibedakan menjadi asam amino polar bermuatan (Arg, Asp, Glu, His dan

Lys), serta asam amino polar tak bermuatan (Ser, Thr, Asn, Gln dan Cys).

2) Asam amino non polar (hidrofobik), yaitu asam amino yang memiliki

tingkat kelarutan terbatas dalam air. Asam amino ini memiliki gugus

rantai R alifatik (Ala, Ile, Leu, Met, Pro dan Val) atau aromatik (Phe, Trp

dan Tyr).

35

3 METODOLOGI

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian dilaksanakan mulai bulan November 2009 sampai

Februari 2010. Sampel diambil dari sepetak sawah di Desa Carang Pulang,

Kelurahan Cikarawang, Kecamatan Darmaga, Kabupaten Bogor. Proses preparasi

sampel dan penghitungan rendemen dilakukan di Laboratorium Karakteristik

Bahan Baku. Proses ekstraksi (maserasi) dilakukan di Laboratorium Bioteknologi

Hasil Perairan 1. Proses evaporasi ekstrak dilakukan di Laboratorium

Penelitian 1, Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam. Analisis kadar abu, kadar abu tak larut asam, uji aktivitas antioksidan dan

uji fitokimia dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan,

Bioteknologi Hasil Perairan 2 dan Biokimia Hasil Perairan, Departemen

Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Analisis kadar

air, kadar lemak, dan kadar protein dilakukan di Laboratorium Konservasi Satwa

Langka dan Harapan, Pusat Antar Universitas (PAU), Institut Pertanian Bogor.

3.2 Bahan dan Alat

Bahan utama yang dibutuhkan untuk penelitian ini adalah keong mas

(Pomacea canaliculata Lamarck). Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk analisis

proksimat meliputi akuades, kjeltab jenis selenium, larutan H2SO4 p.a. pekat,

asam borat (H3BO3) 2% yang mengandung indikator bromcherosol green-methyl

red (1:2) berwarna merah muda, larutan HCl 0,10 N, pelarut lemak

(n-heksana p.a.), larutan HCl 10% dan larutan AgNO3 0,10 N. Bahan-bahan yang

diperlukan dalam proses ekstraksi dan evaporasi meliputi pelarut kloroform p.a.,

pelarut etil asetat p.a., pelarut metanol p.a. dan es batu. Bahan-bahan yang

dibutuhkan untuk uji aktivitas antioksidan, yaitu ekstrak keong mas, kristal

1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), metanol p.a., antioksidan sintetik BHT

(butylated hydroxytoluena) sebagai pembanding dan es. Bahan-bahan yang

dibutuhkan untuk uji fitokimia meliputi pereaksi Wagner, pereaksi Meyer,

pereaksi Dragendroff (uji alkaloid), kloroform, anhidra asetat, asam sulfat pekat

(uji steroid), serbuk magnesium, amil alkohol (uji flavonoid), air panas, larutan

HCL 2 N (uji saponin), etanol 70%, larutan FeCl3 5% (uji fenol hidrokuinon),

36

peraksi Molisch, asam sulfat pekat (uji Molisch), pereaksi Benedict (uji Benedict),

pereaksi Biuret (uji Biuret) dan larutan Ninhidrin 0,10% (uji Ninhidrin).

Alat-alat yang diperlukan dalam penelitian ini meliputi transek (1x1) m2,

pisau, sudip, cawan porselen, timbangan digital, alumunium foil, gegep, desikator,

oven, kompor listrik, tanur pengabuan, kertas saring Whatman 42 bebas abu,

kapas bebas lemak, labu lemak, kondensator, tabung Soxhlet, penangas air, labu

Kjeldahl, destilator, labu Erlenmeyer, buret, pipet volumetrik, pipet mikro, gelas

ukur, blender, orbital shaker, rotary vacuum evaporator, corong kaca, botol gelas,

gelas piala, tabung reaksi, spektrofotometer UV-VIS, pipet tetes, vortex dan

sendok plastik.

3.3 Metode Penelitian

Penelitian ini terdiri dari beberapa tahapan, yaitu tahap pengambilan

sampel, tahap perhitungan rendemen, tahap analisis kimia keong mas berupa

analisis proksimat (kadar air, lemak, protein, abu, dan abu tak larut asam), tahap

pembuatan ekstrak kasar keong mas, uji kuantitatif aktivitas antioksidan dan uji

fitokimia.

3.3.1 Pengambilan dan preparasi sampel

Pengambilan sampel keong mas dilakukan di sebuah areal sawah padi

Desa Carang Pulang, Kelurahan Cikarawang, Kecamatan Darmaga, Kabupaten

Bogor berukuran (19 x 7) m2. Lokasi tempat pengambilan sampel ini dapat dilihat

pada Lampiran 1. Pengambilan sampel dilakukan dengan mengumpulkan keong-

keong dalam sepetak sawah menggunakan transek berukuran (1 x 1) m2 di setiap

titik pada petak sawah tersebut (Lampiran 2). Keong-keong tersebut kemudian

dimasukan dalam wadah plastik. Setelah sampel diperoleh, pertama-tama

dilakukan identifikasi dan dilanjutkan dengan pengambilan secara acak 30 ekor

keong dari seluruh keong mas yang terkumpul untuk diukur berat totalnya. Tiga

puluh ekor keong mas ini merupakan jumlah minimum yang harus diambil untuk

mewakili populasi keong mas yang terdapat pada sawah tersebut. Sampel

kemudian dihitung rendemennya (cangkang, isi cangkang dan operkulum) dengan

rumus:

Rendemen % =Bobot contoh (g)

Bobot total (g)× 100%

37

Seluruh keong mas yang telah dikeluarkan dari cangkangnya, dibagi

menjadi dua bagian. Bagian pertama merupakan bagian yang akan diuji kadar air,

lemak, protein, abu, dan abu tidak larut asam. Bagian kedua merupakan bagian

yang akan dikeringkan dan nantinya akan diekstrak untuk diuji aktivitas

antioksidan dan fitokimia.

3.3.2 Analisis proksimat

Analisis proksimat merupakan suatu analisis yang dilakukan untuk

memprediksi komposisi kimia suatu bahan, termasuk di dalamnya analisis kadar

air, lemak, protein, abu dan abu tidak larut asam.

1) Analisis kadar air (AOAC 2005)

Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah

mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 105 oC selama 1 jam.

Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator (kurang lebih 15 menit) dan

dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Cawan tersebut ditimbang kembali

hingga beratnya konstan. Sebanyak 5 gram contoh dimasukkan ke dalam cawan

tersebut, kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 105 oC selama 5 jam atau

hingga beratnya konstan. Setelah selesai, cawan tersebut kemudian dimasukkan

ke dalam desikator dan dibiarkan sampai dingin dan selanjutnya ditimbang

kembali.

Perhitungan kadar air :

Kehilangan berat g = berat sampel awal g − berat setelah dikeringkan (g)

Kadar air berat basah =Kehilangan berat (g)

Berat sampel awal (g)× 100%

2) Analisis kadar lemak (AOAC 2005)

Contoh seberat 5 gram (W1) dimasukkan ke dalam kertas saring pada

kedua ujung bungkus ditutup dengan kapas bebas lemak dan selanjutnya

dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian sampel yang telah dibungkus

dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya (W2) dan

disambungkan dengan tabung Soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam

ruang ekstraktor tabung Soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak

(n-heksana p.a.). Kemudian dilakukan refluks selama 6 jam. Pelarut lemak yang

ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat

38

destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan

sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan

dalam oven pada suhu 105 oC, setelah itu labu didinginkan dalam desikator

sampai beratnya konstan (W3).

Perhitungan kadar lemak:

% Kadar lemak =W3 − W2

W1× 100%

Keterangan : W1 = Berat sampel (gram)

W2 = Berat labu lemak kosong (gram)

W3 = Berat labu lemak dengan lemak (gram)

3) Analisis kadar protein (AOAC 1980)

Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap

yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. Pengukuran kadar protein dilakukan dengan

metode mikro Kjeldahl. Sampel ditimbang sebanyak 0,25 gram, kemudian

dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 100 ml, lalu ditambahkan 0,25 gram selenium

dan 3 ml H2SO4 p.a. pekat. Contoh didestruksi pada suhu 410 oC selama kurang

lebih 1 jam sampai larutan jernih lalu didinginkan. Setelah dingin, ke dalam labu

Kjeldahl ditambahkan 50 ml akuades dan 20 ml NaOH 40%, kemudian dilakukan

proses destilasi dengan suhu destilator 100 oC. Hasil destilasi ditampung dalam

labu Erlenmeyer 125 ml yang berisi campuran 10 ml asam borat (H3BO3) 2% dan

2 tetes indikator bromcherosol green-methyl red yang berwarna merah muda

(1:2). Setelah volume destilat mencapai 40 ml dan berwarna hijau kebiruan, maka

proses destilasi dihentikan. Lalu destilat dititrasi dengan HCl 0,10 N sampai

terjadi perubahan warna merah muda. Volume titran dibaca dan dicatat. Larutan

blanko dianalisis seperti contoh.

Kadar protein dihitung dengan rumus sebagai berikut :

% N = ml HCl − ml blanko × N HCl × 14,007

mg contoh × faktor koreksi alat∗× 100%

*) Faktor koreksi alat = 2,5

% Kadar Protein = % N × faktor konversi∗

*) Faktor Konversi = 6,25

39

4) Analisis kadar abu (AOAC 2005)

Cawan pengabuan dikeringkan di dalam oven selama 1 jam pada suhu

105 oC, kemudian didinginkan selama 15 menit di dalam desikator dan ditimbang

hingga didapatkan berat yang konstan. Sampel sebanyak 5 gram dimasukkan ke

dalam cawan pengabuan dan dipijarkan di atas nyala api hingga tidak berasap lagi.

Setelah itu, dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dengan suhu 600 oC selama 1

jam, kemudian ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan.

Kadar abu ditentukan dengan rumus:

Berat abu g = berat sampel dan cawan akhir g − berat cawan kosong (g)

Kadar abu berat basah =Berat abu (g)

Berat sampel awal (g)× 100%

5) Analisis kadar abu tidak larut asam menurut SNI 01-3836-2000

(BSN 2000)

Abu hasil penetapan kadar abu total dilarutkan dalam 25 ml HCL 10% dan

dididihkan selama 5 menit. Larutan tersebut kemudian disaring dengan kertas

saring Whatman bebas abu dan dicuci dengan air suling sampai bebas klorida

(dengan peraksi AgNO3). Kertas saring Whatman kemudian dikeringkan dalam

oven. Abu yang telah kering kemudian diabukan kembali dalam tanur dengan

menggunakan wadah cawan porselen. Cawan porselen tersebut kemudian

didinginkan dalam desikator dan ditimbang hingga beratnya tetap (BSN 2000).

Kadar abu tidak larut asam ditentukan dengan rumus:

Kadar abu tidak larut asam berat basah =Berat abu (g)

Berat sampel awal (g)× 100%

3.3.3 Analisis aktivitas antioksidan

1) Ekstraksi bahan aktif (Quinn 1988 dalam Darusman et al. 1995)

Pada tahap ini ada beberapa langkah, yaitu persiapan sampel dan ekstraksi

bahan aktif. Pada tahap persiapan sampel, isi cangkang keong mas yang telah

diambil dari areal persawahan segera dikeringkan dengan panas matahari selama

3 hari. Tujuan dari proses pengeringan ini adalah untuk mengurangi kadar air

dalam bahan. Kadar air yang rendah menunjukkan bahwa air tipe III dalam bahan

berada dalam jumlah yang rendah, sehingga proses pembusukan, hidrolisis

komponen bioaktif dan oksidasi dalam sampel selama dilakukannya maserasi

40

dapat dihindari. Bila sebagian air tipe III dihilangkan, maka aw akan turun hingga

0,80 (batas maksimal) sehingga pertumbuhan mikroba dapat dikurangi dan reaksi-

reaksi kimia yang bersifat merusak, seperti hidrolisis atau oksidasi lemak dapat

dihindari. Air tipe ini mudah diuapkan dan dapat dimanfaatkan untuk

pertumbuhan mikroba dan media bagi reaksi-reaksi kimia (Winarno 2008).

Kadar air yang berkurang dalam sampel juga sangat berguna saat

dilakukannya proses evaporasi. Ketika proses ekstraksi dilakukan pada sampel

basah, air akan bermigrasi dari bahan ke dalam lingkungan (pelarut) dalam jumlah

cukup banyak. Air yang memiliki titik didih lebih tinggi dari pelarut, akan sangat

sukar dan lama untuk dipisahkan dari ekstrak dengan menggunakan pemanasan

suhu rendah (sesuai titik didih pelarut). Apabila pemanasan dilakukan dengan

menggunakan suhu tinggi, yaitu suhu 100 oC pada tekanan udara 1 atm

(760 mm Hg), maka komponen bioaktif yang memiliki sifat antioksidan

dikhawatirkan dapat rusak oleh panas. Sampel yang kering diduga akan

menyumbangkan air dalam jumlah yang kecil pada larutan ekstrak.

Isi cangkang keong mas yang telah kering kemudian dihaluskan dengan

blender, sehingga diperoleh tekstur yang halus. Ukuran sampel yang lebih kecil

(bubuk/tepung) diharapkan dapat memperluas permukaan bahan yang dapat

berkontak langsung dengan pelarut, sehingga proses ekstraksi komponen bioaktif

dapat berjalan dengan maksimal.

Langkah selanjutnya adalah ekstraksi bahan aktif. Metode ekstraksi

yang digunakan adalah metode ekstraksi bertingkat (Quinn 1988 dalam

Darusman et al. 1995). Metode ini digunakan tiga macam pelarut berdasarkan

tingkat kepolarannya yaitu kloroform p.a. (non polar), etil asetat p.a. (semi polar)

dan metanol p.a. (polar). Ketiga pelarut ini dipilih karena memiliki titik didih

yang lebih rendah dari titik didih air, sehingga dapat mudah diuapkan saat proses

vacuum evaporasi (500 mm Hg, 50 oC). Pada tekanan udara 1 atm (760 mm Hg),

kloroform memiliki titik didih sebesar 61 oC, metanol sebesar 65

oC dan etil asetat

sebesar 77 oC. Pelarut etanol tidak dipilih untuk menggantikan pelarut metanol

(polar) karena titik didihnya jauh lebih tinggi dibandingkan metanol, yaitu 78 oC

(Lehninger 1988).

41

Menurut Prabowo (2009), kekurangan dari proses ekstraksi bertingkat

adalah rendemen ekstrak yang diperoleh lebih kecil dibandingkan dengan proses

ekstraksi tunggal. Proses ekstraksi bertingkat ini justru dipilih karena penelitian

ini bertujuan untuk menentukan aktivitas antioksidan dan komponen bioaktif yang

terdapat dalam keong mas berdasarkan tingkat kepolarannya. Ekstraksi bertingkat

ini diharapkan dapat memisahkan komponen bioaktif dalam sampel yang sama

berdasarkan tingkat kepolarannya, tanpa harus komponen bioaktif tersebut terlarut

pada pelarut lain yang bukan merupakan pelarutnya. Hal semacam ini diduga

dapat terjadi pada proses ekstraksi tunggal menggunakan metanol. Metanol

merupakan pelarut polar yang juga dapat melarutkan komponen non polar dan

semipolar di dalamnya. Hal yang tidak diinginkan tersebut dapat dihindari

dengan melakukan proses ekstraksi bertingkat yang diawali dengan ekstraksi

menggunakan pelarut non polar (kloroform p.a.) terlebih dahulu, dilanjutkan

dengan pelarut semipolar (etil asetat p.a.) dan terakhir menggunakan pelarut polar

(metanol p.a.).

Sampel sebanyak 25 g yang telah dihancurkan, dimaserasi dengan pelarut

kloroform p.a. sebanyak 100 ml selama 48 jam dengan diberi goyangan

menggunakan orbital shaker 8 rpm. Hasil maserasi yang berupa larutan

kemudian disaring dengan kertas saring Whatman 42 sehingga diperoleh filtrat

dan residu. Residu yang dihasilkan selanjutnya dimaserasi dengan etil asetat p.a.

sebanyak 100 ml selama 48 jam dengan diberi goyangan menggunakan orbital

shaker 8 rpm, sedangkan filtrat ekstrak kloroform yang diperoleh dievaporasi

hingga pelarut memisah dengan ekstrak menggunakan rotary vacuum evapotator

pada suhu 50 oC.

Hasil proses maserasi ke-2 selanjutnya disaring dengan kertas saring

Whatman 42. Residu yang dihasilkan dimaserasi dalam pelarut metanol p.a.

sebanyak 100 ml dan dimaserasi selama 48 jam dengan diberi goyangan

menggunakan orbital shaker 8 rpm. Filtrat ekstrak etil asetat yang diperoleh

dievaporasi sehingga semua pelarut terpisah dari ekstrak menggunakan rotary

vacuum evapotator pada suhu 50 oC.

Hasil maserasi ke-3 dengan pelarut metanol, disaring dengan kertas saring

Whatman 42. Filtrat ekstrak metanol yang diperoleh dievaporasi sehingga semua

42

pelarut terpisah dari ekstrak menggunakan rotary vacuum evapotator pada suhu

50 oC, sedangkan residu yang tersisa dibuang. Proses ini akan menghasilkan

ekstrak kloroform, ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol yang kental. Proses

ekstraksi bertingkat ini ditunjukkan pada Gambar 15.

Gambar 15. Diagram alir proses ekstraksi keong mas (Sumber: Quinn 1988 dalam Darusman et al. 1995)

Proses ekstraksi (maserasi) pada penelitian ini dilakukan selama 2 hari

saja. Hasil penelitian Rita et al. (2009) menunjukkan bahwa semakin lama waktu

ekstraksi, maka berat rendemen ekstrak yang dihasilkan akan semakin besar. Hal

ini dikarenakan semakin lama waktu pengekstraksian, maka jumlah ekstrak yang

mengalami kontak dengan sampel akan semakin banyak sehingga ekstrak yang

dihasilkan akan semakin besar. Namun, lama ekstraksi pada penelitian

Sampel kering

Maserasi dengan kloroform

selama 24 jam

Penyaringan

Residu

Maserasi dengan etil

asetat selama 24 jam

Penyaringan

Evaporasi

Ekstrak kloroform

Maserasi dengan

metanol selama 24 jam

Residu

Penyaringan

Residu

Filtrat

Filtrat Evaporasi

Ekstrak etil asetat

Filtrat Evaporasi

Ekstrak metanol

43

Rita et al. (2009) ini, hanya berkisar 30-90 menit saja. Berbeda dengan hasil

penelitian Salamah et al. (2008) yang menunjukkan bahwa lamanya waktu

ekstraksi (maserasi) selama 1 hari, 2 hari dan 3 hari tidak memberikan pengaruh

yang berbeda nyata terhadap jumlah rendemen ekstrak yang dihasilkan, oleh

karena itu penelitian ini menggunakan lama ekstraksi (maserasi) selama 2 hari

saja.

Penelitian ini menggunakan orbital shaker dalam proses ekstraksi.

Kelemahan dari metode solvent extraction ini adalah komponen bioaktif harus

mampu larut dalam pelarut tanpa adanya pengadukan atau pemanasan yang

lambat (Beek 1999). Kelemahan metode ini dapat diatasi dengan memberikan

perlakuan goyangan, sehingga dalam penelitian ini metode ekstraksi secara

maserasi dikombinasikan dengan memberikan perlakuan goyangan menggunakan

orbital shaker. Orbital shaker dipilih karena alat ini dapat memberikan goyangan

secara orbital yang dapat memberikan efek menyerupai pengadukan pada

campuran pelarut dan sampel, sehingga diharapkan komponen bioaktif yang tidak

dapat terlarut tanpa adanya proses pengadukan dapat terlarut dengan baik.

Pemanasan dalam proses ekstraksi dihindari untuk mencegah rusaknya komponen

bioaktif yang tidak tahan panas di awal penelitian, karena itu proses ekstraksi

dilakukan pada suhu ruang selama 2 hari.

Rotary vacuum evaporator juga digunakan dalam penelitian ini, yaitu pada

proses pemekatan ekstrak keong mas. Rotary vacuum evaporator bekerja

berdasarkan prinsip diagram fase air, yaitu ketika tekanan udara diturunkan maka

titik didih pelarut akan turun. Tekanan yang digunakan adalah tekanan vacuum

(500 mm Hg) sehingga suhu yang dapat digunakan untuk menguapkan air adalah

± 50 oC. Pelarut-pelarut yang digunakan dalam penelitian ini umumnya

mempunyai titik didih di bawah titik didih air, sehingga akan mudah menguap

jika dipanaskan pada suhu 50 oC dengan tekanan vacuum (500 mm Hg). Pada

tekanan vacuum (500 mm Hg) dan suhu di bawah 50 oC, lebih dari 95%

kandungan nutrisi, vitamin, ferment dan komponen bioaktif lainnya dapat

diselamatkan. Pemanasan dengan suhu rendah ini dapat mengurangi terjadinya

oksidasi (Orsat dan Raghavan 2006), oleh karena itu penelitian ini menggunakan

rotary vacuum evaporator pada temperatur 50 oC.

44

2) Uji aktivitas antioksidan (DPPH) (Blois 1958 dalam Hanani et al. 2005)

Ekstrak kasar keong mas dari hasil ekstraksi bertingkat menggunakan

pelarut kloroform p.a. (non polar), pelarut etil asetat p.a. (semi polar), dan pelarut

metanol p.a. (polar), dilarutkan dalam metanol p.a. dengan konsentrasi 200, 400,

600 dan 800 ppm. Antioksidan sintetik BHT digunakan sebagai pembanding dan

kontrol positif, dibuat dengan cara dilarutkan dalam pelarut metanol p.a. dengan

konsentrasi 2, 4, 6 dan 8 ppm. Larutan DPPH yang akan digunakan, dibuat

dengan melarutkan kristal DPPH dalam pelarut metanol p.a. dengan konsentrasi

1 mM. Proses pembuatan larutan DPPH 1 mM dilakukan dalam kondisi suhu

rendah dan terlindung dari cahaya matahari.

Larutan ekstrak dan larutan antioksidan pembanding BHT yang telah

dibuat, masing-masing diambil 4,50 ml dan direaksikan dengan 500 µl larutan

DPPH 1 mM dalam tabung reaksi yang berbeda dan telah diberi label. Campuran

tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit dan diukur

absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada panjang

gelombang 517 nm. Absorbansi dari larutan blanko juga diukur untuk melakukan

perhitungan persen inhibisi. Larutan blanko dibuat dengan mereaksikan 4,50 ml

pelarut metanol dengan 500 µl larutan DPPH 1 mM dalam tabung reaksi. Larutan

blanko ini dibuat hanya satu kali ulangan saja. Setelah itu, aktivitas antioksidan

dari masing-masing sampel dan antioksidan pembanding BHT dinyatakan dengan

persen inhibisi, yang dihitung dengan formulasi sebagai berikut:

% inhibisi =absorbansi blanko − absorbansi sampel

absorbansi blanko× 100%

Nilai konsentrasi sampel (ekstrak ataupun antioksidan pembanding BHT)

dan persen inhibisinya diplot masing-masing pada sumbu x dan y pada persamaan

regresi linear. Persamaan regresi linear yang diperoleh dalam bentuk persamaan

y = a + bx, digunakan untuk mencari nilai IC50 (inhibitor concentration 50%) dari

masing-masing sampel dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x yang

akan diperoleh sebagai IC50. Nilai IC50 menyatakan besarnya konsentrasi larutan

sampel (ekstrak ataupun antioksidan pembanding BHT) yang dibutuhkan untuk

mereduksi radikal bebas DPPH sebesar 50%.

45

3.3.4 Uji fitokimia (Harborne 1984)

Uji fitokimia dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya komponen-

komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak kasar keong mas yang memiliki

aktivitas antioksidan. Uji fitokimia meliputi uji alkaloid, uji steroid/triterpenoid,

flavonoid, saponin, fenol hidrokuinon, Molisch, Benedict, Biuret dan Ninhidrin.

Metode uji ini berdasarkan Harborne (1984).

a. Alkaloid

Sejumlah sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2 N

kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid yaitu, pereaksi Dragendorff, pereaksi

Meyer, dan pereaksi Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi

Meyer terbentuk endapan putih kekuningan, endapan coklat dengan pereaksi

Wagner dan endapan merah hingga jingga dengan pereaksi Dragendorff.

Pereaksi Meyer dibuat dengan cara menambahkan 1,36 gram HgCl2

dengan 0,50 gram KI lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi

100 ml dengan labu takar. Pereaksi ini tidak berwarna. Pereaksi Wagner dibuat

dengan cara 10 ml akuades dipipet kemudian ditambahkan 2,50 gram iodin dan

2 gram KI lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 200 ml dalam

labu takar. Pereaksi ini berwarna coklat. Pereaksi Dragendorff dibuat dengan cara

0,80 gram bismut subnitrat ditambahkan dengan 10 ml asam asetat dan 40 ml air.

Larutan ini dicampur dengan larutan yang dibuat dari 8 gram kalium iodida dalam

20 ml air. Sebelum digunakan, 1 volume campuran ini diencerkan dengan

2,30 volume campuran 20 ml asam asetat glasial dan 100 ml air. Pereaksi ini

berwarna jingga.

b. Steroid/ triterpenoid

Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi

yang kering. Lalu, 10 tetes anhidra asetat dan 3 tetes asam sulfat pekat

ditambahkan ke dalamnya. Larutan berwarna merah yang terbentuk untuk

pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau, menunjukkan reaksi

positif.

c. Flavonoid

Sejumlah sampel ditambahkan serbuk magnesium 0,10 mg dan 0,40 ml

amil alkohol (campuran asam klorida 37% dan etanol 95% dengan volume yang

46

sama) dan 4 ml alkohol kemudian campuran dikocok. Warna merah, kuning atau

jingga yang terbentuk pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid.

d. Saponin (uji busa)

Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil

selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan

adanya saponin.

e. Fenol hidrokuinon (pereaksi FeCl3)

Sebanyak 1 gram sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70%. Larutan

yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan

FeCl3 5%. Warna hijau atau hijau biru yang terbentuk menunjukkan adanya

senyawa fenol dalam bahan.

f. Uji Molisch

Sebanyak 1 ml larutan sampel diberi 2 tetes pereaksi Molish dan 1 ml

asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Uji positif yang menunjukkan adanya

karbohidrat ditandai terbentuknya kompleks berwarna ungu diantara 2 lapisan

cairan.

g. Uji Benedict

Larutan sampel sebanyak 8 tetes dimasukkan ke dalam 5 ml pereaksi

Benedict. Campuran dikocok dan dididihkan selama 5 menit. Warna hijau,

kuning, atau endapan merah bata yang terbentuk menunjukkan adanya gula

pereduksi.

h. Uji Biuret

Sebanyak 1 ml larutan sampel ditambahkan 4 ml pereaksi Biuret.

Campuran dikocok dengan seksama. Larutan berwarna ungu yang terbentuk

menunjukkan hasil uji positif adanya peptida.

i. Uji Ninhidrin

Sebanyak 2 ml larutan sampel ditambah beberapa tetes larutan Ninhidrin

0,10%. Campuran dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Larutan

berwarna biru yang terbentuk menunjukkan reaksi positif terhadap adanya asam

amino.

47

4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Karakteristik Keong Mas

Morfologi keong mas yang diambil dari areal sawah padi Desa Carang

Pulang, Kelurahan Cikarawang, Kecamatan Darmaga, Kabupaten Bogor dapat

dilihat pada Gambar 16.

Gambar 16. Keong mas yang diambil dari sawah padi Desa Carang Pulang

Sampel keong mas yang diperoleh, kemudian dipreparasi untuk

mengeluarkan isi cangkang (daging dan jeroan), serta memisahkannya dari

operkulum yang masih menempel. Bentuk cangkang, isi cangkang dan

operkulum keong mas kemudian diamati karakteristik fisiknya. Hasil pengamatan

karakteristik fisik cangkang, isi cangkang dan operkulum keong mas dapat dilihat

pada Tabel 4. Bentuk cangkang, isi cangkang dan operkulumnya dapat dilihat

pada Lampiran 3.

Tabel 4. Hasil pengamatan karakteristik fisik cangkang, isi cangkang dan

operkulum keong mas

Karakteristik Fisik Cangkang Isi Cangkang Operkulum

Warna

Coklat gelap

dengan pola

garis-garis

hitam.

Daging:

krem kecoklatan.

Jeroan:

Coklat, hitam dengan

bintik-bintik putih

(saluran dan kelenjar

pencernaan) dan

merah muda (gonad).

Coklat gelap.

Tekstur Keras.

Daging: kenyal.

Jeroan:

lunak dan mudah

hancur bila ditekan.

Tipis, keras

tetapi mudah

dipatahkan.

48

Keong mas yang digunakan dalam penelitian ini memiliki warna cangkang

coklat gelap dan terdapat pola garis-garis hitam yang mengarah ke lubang

aperture, umbilicus terbuka dan diameternya pun bervariasi. Komponen

penyusun cangkang keong mas adalah kalsium karbonat. Isi cangkang keong mas

dibagi menjadi 2 bagian, yaitu bagian daging (otot kaki) dan bagian jeroan.

Bagian daging berwarna krem kecoklatan dan teksturnya kenyal, sedangkan

bagian jeroan ada yang berwarna hitam dengan bintik-bintik putih, coklat dan

merah muda. Bagian yang berwarna coklat dan hitam dengan bintik-bintik putih

adalah saluran dan kelenjar pencernaan, sedangkan bagian yang berwarna merah

muda adalah gonad. Bagian jeroan ini bersifat lunak dan mudah hancur bila

ditekan. Operkulum keong mas mengandung kitin, tipe konsentris dan berwarna

coklat gelap. Operkulum keong mas ini tipis dan keras, tetapi mudah untuk

dipatahkan.

Proses karakterisasi ini dilakukan guna mengetahui sifat dari bahan baku

yang digunakan. Sifat bahan baku ini tidak terbatas pada sifat fisik saja, tetapi

juga sifat kimia. Hal ini dikarenakan sifat fisik maupun kimia dari bahan baku

yang digunakan berbeda antara yang satu dengan yang lain. Karakteristik fisik

keong mas yang digunakan dalam penelitian ini telah diamati dan dijelaskan di

atas, sehingga perlu dilakukan pengukuran rendemen dan analisis kandungan gizi

keong mas dengan uji proksimat.

4.1.1 Rendemen

Rendemen merupakan presentase perbandingan antara berat bagian bahan

yang dapat dimanfaatkan dengan berat total bahan. Nilai rendemen digunakan

untuk mengetahui nilai ekonomis suatu produk atau bahan. Semakin tinggi nilai

rendemennya, maka semakin tinggi pula nilai ekonomisnya sehingga

pemanfaatannya dapat menjadi lebih efektif.

Perhitungan rendemen cangkang, isi cangkang dan operkulum keong mas

dapat dilihat pada Lampiran 4. Nilai rendemen cangkang, isi cangkang dan

operkulum keong mas dapat dilihat pada Gambar 17.

49

27,10

48,35

1,46

0

10

20

30

40

50

60

Cangkang Isi cangkang Operkulum

Ren

dem

en

(%

)

Bagian tubuh

Gambar 17. Rendemen cangkang, isi cangkang dan operkulum keong mas

Rendemen isi cangkang keong mas hampir mencapai setengah dari berat

keseluruhan keong mas utuh, yaitu 48,35%. Hal ini menunjukkan bahwa isi

cangkang keong mas sangat potensial bila dimanfaatkan lebih lanjut sebagai

sumber asam amino esensial dalam pangan ataupun pakan nantinya. Hal ini

dibuktikan oleh hasil penelitian Kamil et al. (1998) yang menunjukkan bahwa

tepung keong mas mengadung asam amino esensial yang lengkap. Asam amino

esensial ini sangat dibutuhkan oleh tubuh manusia, salah satunya asama amino

lisin. Jumlah asam amino lisin yang cukup tinggi (41,29 mg/g protein) pada

tepung keong mas, menunjukkan bahwa keong mas juga dapat dimanfaatkan

sebagai suplemen pada bahan pangan atau pakan yang kurang lisin, mengingat

lisin sering menjadi komponen asam amino pembatas dalam pakan ternak.

Rendemen cangkang keong mas yang tidak terlalu besar, yaitu 27,10%,

menunjukkan bahwa bagian cangkang keong mas cukup potensial apabila

dimanfaatkan lebih lanjut. Cangkang keong mas tersusun dari molekul-molekul

kalsium dalam bentuk kalsium karbonat (Suwignyo et al. 2005; Castro dan

Huber 2007), sehingga dapat dimanfaatkan sebagai sumber kalsium setelah

melalui proses pengolahan dan pemurnian terlebih dahulu. Proses pengolahan dan

pemurnian perlu dilakukan untuk menghilangkan pigmen-pigmen pada lapisan

pertama cangkang Gastropoda, yaitu pada lapisan periostrakum yang melindungi

lapisan kalsium karbonat di bawahnya. Kalsium karbonat terdapat pada 3 lapisan

50

di bawah periostrakum, yaitu lapisan prismatik, lapisan lamella dan lapisan

hypostracum (Suwignyo et al. 2005).

Operkulum keong mas mengandung molekul-molekul kitin

(Pennak 1989), akan tetapi rendemennya yang sangat kecil (1,46%) tidak

memungkinkan operkulum tersebut untuk dimanfaatkan dalam industri

pembuatan kitin-kitosan karena tidak akan ekonomis dan efektif. Hal ini

dikarenakan industri pembuatan kitin-kitosan memerlukan bahan baku yang

cukup banyak.

Hasil perhitungan pada Lampiran 4 menunjukkan bahwa cangkang, isi

cangkang dan operkulum memiliki rendemen masing-masing sebesar 27,10%,

48,35% dan 1,46%. Apabila ketiga nilai rendemen tersebut dijumlahkan, maka

jumlahnya tidak mencapai 100%. Hal ini dikarenakan sisa berat yang hilang

selama proses preparasi merupakan berat air yang terkurung dalam cangkang dan

tidak terikat dalam jaringan. Air ini terbuang ketika isi cangkang dikeluarkan dan

ditiriskan terlebih dahulu sebelum ditimbang. Persentasi berat air yang hilang ini

mencapai 23,09%. Air ini terperangkap dalam cangkang saat operkulum menutup

rapat lubang aperture.

4.1.2 Kandungan gizi

Kandungan gizi pada isi cangkang keong mas dapat diketahui melalui

analisis proksimat. Analisis proksimat merupakan suatu analisis yang dilakukan

untuk memprediksi komposisi kimia suatu bahan, termasuk didalamnya

kandungan air, lemak, protein, abu dan karbohidrat. Kadar karbohidrat dalam

keong mas diperoleh melalui perhitungan by difference. Selain analisis proksimat

(kadar air, lemak, protein dan abu), pengujian kadar abu tidak larut asam juga

dilakukan. Pengujian kadar abu tidak larut asam pada sampel keong mas

dilandasi karena keong mas merupakan golongan Gastropoda yang hidup di

perairan tawar berlumpur dan menempel pada substrat. Keong mas diduga

mengandung residu abu tidak larut asam yang berasal dari mineral-mineral dalam

lumpur yang ikut masuk ke dalam saluran pencernaannya, ketika keong mas

sedang melakukan aktivitas makan. Hasil analisis proksimat isi cangkang keong

mas dapat dilihat pada Tabel 5 dan cara perhitungannya dapat dilihat pada

Lampiran 5.

51

Tabel 5. Hasil uji proksimat keong mas (n=2)

Komponen Kandungan (% bb)

Kadar air 81,19

Kadar lemak 0,51

Kadar protein 10,30

Kadar abu 4,07

Kadar abu tidak larut asam 0,30

Kadar karbohidrat 3,93

1) Kadar air

Air merupakan senyawa yang paling berlimpah di dalam sistem hidup dan

mencakup 70% atau lebih dari bobot hampir semua bentuk kehidupan. Hal ini

karena air mengisi semua bagian dari tiap sel, air merupakan medium tempat

berlangsungnya transport nutrien, reaksi-reaksi enzimatis metabolisme, dan

transfer energi kimia (Lehninger 1988). Kandungan air dalam bahan makanan

ikut menentukan daya terima, kesegaran dan daya tahan bahan tersebut

(Winarno 2008).

Analisis kadar air dalam penelitian ini bertujuan untuk mengetahui jumlah

air yang terkandung dalam isi cangkang keong mas. Hasil pengujian ini

menunjukkan bahwa keong mas memiliki kadar air yang cukup tinggi, yaitu

sebesar 81,19%. Nilai ini tidak jauh berbeda dengan nilai kadar air daging keong

mas yang telah diuji oleh Nurjanah et al. (1996) dan Kamil et al. (1998) pada

penelitian-penelitian terdahulu. Nilai tersebut sedikit berbeda dengan nilai kadar

air keong mas yang diuji oleh Departemen Pertanian Filipina, yaitu 77,60%

(DA-PhilRice 2001). Perbedaan ini terjadi diduga karena adanya pengaruh faktor

internal dan faktor eksternal. Faktor internal yang diduga kuat menjadi penyebab

perbedaan ini adalah sifat genetik antara keong mas yang terdapat di Indonesia

berbeda dengan keong mas yang terdapat di Filipina. Faktor eksternal yang

diduga berpengaruh adalah habitat dan kondisi lingkungan yang berbeda. Sifat

genetik, habitat dan kondisi lingkungan yang berbeda ini diduga berpengaruh pada

kadar komponen gizi lain dalam tubuh keong mas, seperti kadar protein dan kadar

lemak. Jika proporsi kedua zat gizi ini berbeda dalam tubuh organisme, maka

kadar air dalam tubuh organisme tersebut pun akan berbeda proporsinya.

Prinsip analisis kadar air yang dilakukan dalam penelitian ini adalah

mengukur berat air bebas yang teruapkan dan tidak terikat kuat dalam jaringan

52

bahan dengan bantuan panas. Air yang teruapkan ini merupakan air tipe III

(Winarno 2008). Air tipe III ini biasa disebut air bebas dan merupakan air yang

hanya terikat secara fisik dalam jaringan matriks bahan seperti membran, kapiler,

serat dan lain sebagainya. Air ini dapat dimanfaatkan untuk pertumbuhan

mikroba dan media bagi reaksi-reaksi kimiawi (Winarno 2008). Tingginya kadar

air tipe III ini pada keong mas, dapat menyebabkan keong mas mudah sekali

mengalami kerusakan (highly perishable) apabila tidak ditangani dengan benar.

Hal ini karena air tipe ini dapat dimanfaatkan untuk pertumbuhan mikroba dan

juga reaksi kimiawi dalam jaringan yang diduga melibatkan enzim, salah satunya

enzim protease seperti katepsin.

2) Kadar lemak

Analisis kadar lemak yang dilakukan dalam penelitian ini bertujuan untuk

mengetahui kandungan lemak yang terdapat pada isi cangkang keong mas.

Lemak sendiri merupakan komponen yang dibentuk dari unit struktural yang

bersifat hidrofobik. Lemak larut pada pelarut organik (non polar) dan tidak larut

dalam air (polar) (Belitz et al. 2009), sehingga penelitian ini menggunakan pelarut

organik n-heksana yang bersifat non polar, untuk mengekstrak lemak dari dalam

bahan (isi cangkang keong mas).

Lemak dapat dikatakan sebagai sumber energi yang lebih efektif

dibandingkan dengan karbohidrat dan protein. Hal ini karena 1 gram lemak dapat

menghasilkan 9 kkal, dimana nilai tersebut lebih besar dibandingakn dengan

energi yang dihasilkan oleh 1 gram karbohidrat atau protein, yaitu 4 kkal. Lemak

juga dapat digunakan sebagai sumber asam lemak esensial dan vitamin (vitamin

A, D, E dan K) (Winarno 2008; Belitz et al. 2009).

Hasil pengujian menunjukkan bahwa keong mas mengandung lemak

dalam kadar yang cukup rendah, yaitu hanya sebesar 0,51%. Nilai ini tidak jauh

berbeda dengan hasil pengujian kadar lemak keong mas yang dilakukan oleh

Nurjanah et al. (1996), Kamil et al. (1998) dan Departemen Pertanian Filipina

(DA-PhilRice 2001), dimana kadar lemak keong mas pada penelitian-penelitian

tersebut berkisar antara 0,40% hingga 0,91%.

Kadar lemak yang rendah dapat disebabkan karena kandungan air dalam

keong mas sangat tinggi, sehingga secara proporsional persentase kadar lemak

53

akan turun drastis. Hal ini sesuai dengan pendapat yang menyatakan bahwa kadar

air umumnya berhubungan terbalik dengan kadar lemak (Yunizal et al. 1998).

Hubungan tersebut mengakibatkan semakin rendahnya kadar lemak, apabila kadar

air yang terkandung dalam bahan jumlahnya cukup tinggi.

Kandungan lemak keong mas ini lebih rendah daripada kandungan lemak

pada daging jenis keong air tawar lainnya dari famili Viviparidae, yaitu sebesar

2,80% (Krzynowek dan Murphy 1987). Perbedaan ini dapat terjadi karena

pengaruh beberapa faktor, yaitu umur, habitat, ukuran dan tingkat kematangan

gonad.

3) Kadar protein

Protein merupakan makromolekul yang dibentuk dari asam amino-asam

amino yang berikatan peptida. Protein berfungsi sebagai bahan bakar dalam

tubuh, serta berperan sebagai zat pembangun dan pengatur. Protein merupakan

sumber asam-asam amino yang mengandung unsur-unsur C, H, O dan N yang

tidak dimiliki oleh lemak ataupun karbohidrat. Molekul protein juga mengandung

fosfor, belerang dan ada pula jenis protein yang mengandung unsur logam seperti

besi dan tembaga (Winarno 2008).

Protein merupakan komponen terbesar setelah air pada sebagian besar

jaringan tubuh (Winarno 2008). Hal ini terbukti dari hasil analisis proksimat

keong mas yang disajikan pada Tabel 4. Nilai kadar protein keong mas

merupakan nilai terbesar kedua setelah kadar air. Komponen lemak, abu, abu

tidak larut asam dan karbohidrat memiliki jumlah yang lebih kecil dibandingkan

protein.

Hasil pengujian kadar protein menunjukkan bahwa keong mas memiliki

protein dalam jumlah sedang, yaitu sebesar 10,30%. Jumlah ini tidak jauh

berbeda dengan kadar protein daging keong mas yang diuji oleh

Nurjanah et al. (1996), tetapi jumlah tersebut sedikit berbeda dengan kadar protein

keong mas yang dikemukakan oleh Kamil et al. (1998) dan Departemen Pertanian

Filipina (DA-PhilRice 2001), yaitu sebesar 8,69% dan 12,20%. Variasi ini dapat

disebabkan oleh beberapa faktor, yaitu habitat, umur, makanan yang dicerna, laju

metabolisme, laju pergerakan dan tingkat kematangan gonad.

54

Walaupun hasil analisis menunjukkan bahwa keong mas mengandung

protein dalam jumlah yang terbilang sedang, akan tetapi hasil penelitian

Kamil et al. (1998) menunjukkan bahwa keong mas mengandung asam amino

esensial yang cukup lengkap, yaitu sebanyak 9 asam amino esensial, kecuali

triptofan (Tabel 2). Asam amino lisin yang biasanya menjadi asam amino

pembatas, ternyata pada tepung keong mas memiliki skor kimia yang cukup

(41,29 mg/g protein), oleh karena itu keong mas dapat dimanfaatkan sebagai

suplemen pada bahan pangan atau pakan yang kurang lisin.

4) Kadar abu

Bahan makanan terdiri dari 96% bahan organik dan air, sedangkan sisanya

merupakan unsur-unsur mineral. Unsur juga dikenal sebagai zat anorganik atau

kadar abu. Dalam proses pembakaran, bahan-bahan organik akan terbakar tetapi

komponen anorganiknya tidak, karena itulah disebut sebagai kadar abu

(Winarno 2008).

Hasil pengujian kadar abu total menunjukkan bahwa keong mas

mengandung mineral dalam jumlah yang cukup tinggi, yaitu sebesar 4,06%. Nilai

tersebut jauh berbeda dengan nilai kadar abu keong mas yang diuji oleh

Nurjanah et al. (1996), Kamil et al. (1998) dan Departemen Pertanian Filipina

(DA-PhilRice 2001). Tinggi rendahnya kadar abu dapat disebabkan oleh

perbedaan habitat dan lingkungan hidup yang berbeda. Setiap lingkungan

perairan dapat menyediakan asupan mineral yang berbeda-beda bagi organisme

akuatik yang hidup di dalamnya. Data kadar abu tersebut menunjukkan bahwa

lingkungan perairan sawah padi di Desa Carang Pulang menyediakan asupan

mineral yang cukup tinggi bagi organisme perairan yang hidup di dalamnya.

Selain itu juga, masing-masing individu organisme juga memiliki kemampuan

yang berbeda-beda dalam meregulasi dan mengabsorbsi mineral, sehingga hal ini

nantinya akan memberikan pengaruh pada nilai kadar abu dalam masing-masing

bahan.

5) Kadar abu tidak larut asam

Abu tidak larut asam adalah garam-garam klorida yang tidak larut asam,

yang sebagian merupakan garam-garam logam berat dan silika. Kadar abu tidak

larut asam yang tinggi menunjukkan adanya kontaminasi residu mineral atau

55

logam yang tidak dapat larut asam pada suatu produk. Kadar abu tidak larut asam

juga dapat digunakan sebagai kriteria dalam menentukan tingkat kebersihan dalam

proses pengolahan suatu produk (Basmal et al. 2003).

Hasil pengujian kadar abu tidak larut asam menunjukkan bahwa keong

mas mengandung residu abu tak larut asam sebesar 0,30%. Nilai kadar abu yang

diperoleh pada penelitian ini masih di bawah 1%, seperti yang disyaratkan oleh

Food Chemical Codex (1991) yang diacu oleh Basmal et al. (2003) untuk produk

kappa-karaginan food grade. Kadar abu tidak larut asam ini diduga berasal dari

material-material abu yang tidak larut asam yang terdapat di perairan tempat

keong mas hidup, seperti pasir, lumpur, silika dan batu. Material tak larut asam

ini ikut masuk ke dalam saluran pencernaan keong mas ketika keong mas sedang

melakukan aktivitas makan, kemudian mengendap di dalamnya karena tidak dapat

diekskresikan. Hal ini dibuktikan oleh penelitian-penelitian terdahulu yang

dilakukan oleh Nurjanah (2009) dan Adriyanti (2009) pada lintah laut

(Discodoris sp.) yang juga termasuk dalam kelas Gastropoda dan hidup menempel

pada substrat dasar. Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa lintah laut

yang telah dibuang jeroannya memiliki kadar abu tidak larut asam yang lebih

rendah daripada lintah laut yang tidak dibuang jeroannya, sehingga dapat

disimpulkan bahwa tempat tertimbunnya material tidak larut asam dalam tubuh

Gastropoda adalah pada bagian jeroannya. Nurjanah (2009) menambahkan bahwa

komponen abu tidak larut asam ini dapat merusak kinerja organ ginjal jika

dikonsumsi dalam jumlah yang besar.

6) Kadar karbohidrat

Karbohidrat merupakan komponen organik yang paling banyak tersebar di

permukaan bumi. Karbohidrat sangat berperan dalam metabolisme hewan dan

tumbuhan. Karbohidrat merupakan salah satu nutrisi dasar dan paling banyak

digunakan sebagai sumber energi utama. Energi yang disumbangkan dari

karbohidrat sebesar 17 kJ/g atau sebesar 4 kkal (Belitz et al. 2009). Karbohidrat

juga mempunyai peranan penting dalam menentukan karakteristik bahan

makanan, seperti rasa, warna, tekstur dan lain-lainnya (Winarno 2008).

Hasil perhitungan kadar karbohidrat dengan metode by difference

menunjukkan bahwa keong mas mengandung karbohidrat sebesar 3,93%. Hasil

56

perhitungan karbohidrat dengan metode by difference ini merupakan metode

penentuan kadar karbohidrat dalam bahan pangan secara kasar, dimana serat kasar

juga terhitung sebagai karbohidrat (Winarno 2008). Pengertian tersebut

menegaskan bahwa nilai kadar karbohidrat keong mas pada penelitian ini relatif

sama dengan kadar karbohidrat keong mas pada penelitian Nurjanah et al. (1996),

tetapi nilai tersebut cukup berbeda dengan hasil perhitungan kadar karbohidrat

yang diperoleh oleh Kamil et al. (1998) dan Departemen Pertanian Filipina

(DA-PhilRice 2001), yaitu sebesar 6,68% dan 6,60%. Variasi ini dapat terjadi

karena perbedaan habitat dan lingkungan hidup, perbedaan ketersediaan bahan

pangan, serta dominasi jenis bahan pangan yang dimakan mengingat keong mas

merupakan hewan omnivora.

Kadar karbohidrat yang terhitung ini diduga berupa glikogen dan

serat kasar. Hal ini dikarenakan karbohidrat yang terdapat pada hewan

umumnya berbentuk glikogen (Winarno 2008). Selain itu, hasil penelitian

Nurjanah et al. (1996) dan Kamil et al. (1998) menunjukkan bahwa keong mas

juga mengandung komponen serat kasar, yang mana komponen ini justru

mendominasi kadar karbohidrat pada keong mas (Tabel 1).

4.2 Ekstraksi Komponen Bioaktif Keong Mas

Ekstraksi merupakan proses penarikan komponen zat aktif suatu bahan

dengan menggunakan pelarut tertentu. Tujuan dari proses ini adalah untuk

mendapatkan bagian-bagian tertentu dari bahan yang mengandung komponen-

komponen aktif (Harborne 1984). Proses ekstraksi pada penelitian ini meliputi

proses pengeringan sampel, penghancuran sampel menjadi bentuk bubuk,

maserasi dalam pelarut dengan penggoyangan menggunakan orbital shaker,

penyaringan dan evaporasi menggunakan rotary vacuum evaporator. Sampel

yang digunakan merupakan keseluruhan isi cangkang (jeroan dan daging) keong

mas. Proses ekstraksi yang dilakukan merupakan ekstraksi bertingkat

menggunakan pelarut kloroform p.a. (non polar), etil asetat p.a. (semipolar) dan

metanol p.a. (polar).

4.2.1 Ekstrak kasar

Proses evaporasi filtrat dari masing-masing hasil maserasi pelarut akan

menghasilkan ekstrak kasar keong mas yang kental dan berbeda tingkat

57

kepolarannya. Selain itu, masing-masing ekstrak juga memiliki karakteristik yang

berbeda-beda pula. Ekstrak kloroform berwarna coklat tua dan pekat, ekstrak etil

asetat memiliki warna coklat tua yang lebih muda dibandingkan warna ekstrak

kloroform, sedangkan ekstrak metanol memiliki warna coklat kehijauan. Ketiga

ekstrak tersebut berbentuk pasta kental dan memiliki aroma khas menyerupai

produk petis. Ekstrak kasar keong mas tersebut dapat dilihat pada Gambar 18.

Gambar 18. Ekstrak kasar keong mas (Kiri-kanan: ekstrak kloroform, etil asetat dan metanol)

Hasil ekstraksi menggunakan tiga jenis pelarut yang memiliki tingkat

kepolaran yang berbeda-beda, akan menghasilkan rendemen ekstrak yang

berbeda-beda pula. Rendemen ekstrak merupakan perbandingan antara jumlah

ekstrak yang dihasilkan dengan jumlah sampel awal yang diekstrak. Rendemen

ekstrak dinyatakan dalam persen, sama halnya dengan nilai rendemen bahan.

Nilai rendemen ekstrak dari masing-masing pelarut dapat dilihat pada diagram

batang Gambar 19. Proses perhitungan rendemen ekstrak dari masing-masing

pelarut dapat dilihat pada Lampiran 6.

Gambar 19. Rendemen ekstrak kasar keong mas

1,590,79

8,21

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Kloroform Etil Asetat Metanol

Ren

dem

en

(%

)

Jenis pelarut

58

Diagram batang di atas menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat memiliki

persentase rendemen terkecil, yaitu 0,79%, sedangkan ekstrak metanol merupakan

ektrak yang memiliki rendemen terbesar, yaitu 8,21%. Data tersebut

menunjukkan bahwa komponen bioaktif yang paling banyak terkandung dalam

jaringan tubuh keong mas merupakan komponen bioaktif yang memiliki sifat

polar karena dapat larut pada pelarut polar, yaitu metanol. Komponen bioaktif

keong mas yang bersifat non polar dan semipolar terdapat dalam jumlah yang

lebih kecil.

Hasil ekstrak yang diperoleh akan sangat bergantung pada beberapa faktor,

yaitu kondisi alamiah senyawa tersebut, metode ekstraksi yang digunakan, ukuran

partikel sampel, kondisi dan waktu penyimpanan, lama waktu ekstraksi, serta

perbandingan jumlah pelarut terhadap jumlah sampel (Harborne 1984;

Darusman et al. 1995; Rita et al. 2009). Hasil penelitian Salamah et al. (2008)

menunjukkan bahwa maserasi dengan jenis pelarut yang berbeda akan

menghasilkan rendemen ekstrak yang berbeda pula. Pernyataan tersebut

mendukung hasil penelitian ini, dimana kadar komponen bioaktif yang bersifat

polar, semipolar dan nonpolar terdapat dalam jumlah yang berbeda-beda. Hal ini

dikarenakan pelarut yang berbeda akan melarutkan senyawa-senyawa yang

berbeda-beda bergantung tingkat kepolarannya dan tingkat ketersediaanya dalam

bahan yang diekstrak.

Kandungan komponen biaktif yang bersifat polar pada filum Molusca

umumnya terdapat dalam jumlah yang lebih banyak dibandingkan komponen-

komponen bioaktif lain yang bersifat non polar dan semipolar. Hal ini terbukti

dari hasil penelitian ini, dimana kadar ekstrak metanol (polar) keong mas terdapat

dalam jumlah yang paling banyak. Pernyataan di atas juga didukung oleh hasil

penelitian Salamah et al. (2008) pada kijing taiwan (Anadonta woodiana Lea.)

dan Nurjanah (2009) pada lintah laut (Discodoris sp.), yang mana ekstrak polar

dari masing-masing komoditas tersebut terdapat dalam jumlah yang lebih banyak

jika dibandingkan dengan ekstrak semipolar dan non polar.

4.2.2 Komponen bioaktif pada ekstrak kasar

Ekstrak kasar keong mas yang diperoleh dari proses ekstraksi tepung

keong mas menggunakan pelarut kloroform p.a. (non polar), pelarut etil asetat p.a.

59

(semipolar) dan pelarut metanol p.a. (polar) diuji kandungan komponen bioaktif

menggunakan metode uji fitokimia. Uji ini akan menunjukkan komponen bioaktif

apa saja yang terlarut pada masing-masing pelarut.

Uji fitokimia dipilih karena uji ini dapat mendeteksi komponen bioaktif

yang tidak terbatas hanya pada metabolit sekunder saja, tetapi juga termasuk

metabolit primer yang memberikan aktivitas biologis fungsional, seperti protein

dan peptida (Kannan et al. 2009). Penapisan komponen bioaktif pada masing-

masing ekstrak dilakukan dengan metode uji fitokimia yang meliputi pengujian

komponen karbohidrat, gula pereduksi, peptida, asam amino (metabolit primer),

alkaloid, steroid, flavonoid, saponin dan fenol hidrokuinon (metabolit sekunder)

(Harborne 1984; Harborne 1999). Uji firokimia yang dilakukan dalam penelitian

ini meliputi uji alkaloid, steroid, flavonoid, saponin, fenol hidrokuinon, uji

Molisch, uji Benedict, uji Biuret dan uji Ninhidrin. Hasil uji fitokimia pada pada

masing-masing ekstrak kasar keong mas dapat dilihat pada Tabel 6.

Hasil pengujian fitokimia pada Tabel 6 menunjukkan bahwa ekstrak

metanol keong mas mengandung komponen bioaktif yang lebih banyak

dibandingkan dua ekstrak lainnya. Komponen bioaktif pada ekstrak metanol

meliputi komponen alkaloid, steroid, flavonoid, karbohidrat dan asam amino.

Komponen bioaktif yang terdeteksi pada ekstrak etil asetat diantaranya komponen

steroid, flavonoid dan karbohidrat, sedangkan ekstrak kloroform hanya

mengandung komponen steroid dan karbohidrat saja. Diagram batang pada

Gambar 20 menunjukkan bahwa ekstrak kloroform memiliki rendemen yang lebih

besar dari ekstrak etil asetat, sehingga dapat ditarik dua hipotesis awal, yaitu

ekstrak kloroform mengandung komponen lain selain kedua komponen bioaktif

yang dikandungnya dan/atau ekstrak kloroform mengandung komponen steroid

atau karbohidrat dalam jumlah yang lebih banyak dibandingkan ekstrak etil asetat.

Hal ini dikarenakan ekstrak yang diperoleh dari proses ekstraksi pada penelitian

ini masih berupa ekstrak kasar, sehingga perlu diuji lebih lanjut menggunakan

kromatografi untuk mengetahui komponen lain apa saja yang terkandung dalam

ekstrak tersebut beserta kadarnya. Hasil uji fitokimia ini menunjukkan bahwa

keong mas mengandung 5 dari 9 komponen yang diuji dengan metode fitokimia

Harborne (1984).

60

Tabel 6. Hasil uji fitokimia ekstrak kasar keong mas

Uji Fitokimia

Jenis Pelarut

Standar (warna) Kloroform

Etil

Asetat Metanol

Alkaloid:

a. Dragendorff

b. Meyer

c. Wagner

-

-

-

-

-

-

+

-

+

Endapan merah atau jingga

Endapan putih kekuningan

Endapan coklat

Steroid/triterpenoid + + + Perubahan dari merah

menjadi biru/hijau

Flavonoid - + +

Lapisan amil alkohol

berwarna

merah/kuning/hijau

Saponin - - - Terbentuk busa

Fenol Hidrokuinon - - - Warna hijau atau hijau biru

Molisch + + + Warna ungu antara 2 lapisan

Benedict - - - Warna hijau/kuning/endapan

merah bata

Biuret - - - Warna ungu

Ninhidrin - - + Warna biru

1) Alkaloid

Komponen alkaloid didefinisikan sebagai substasi dasar yang memiliki

satu atau lebih atom nitrogen yang bersifat basa dan tergabung dalam suatu sistem

siklis, yaitu cincin heterosiklik (Harborne 1984). Komponen alkaloid ini hanya

ditemukan pada ekstrak kasar metanol (polar) keong mas. Alkaloid umumnya

larut pada pelarut organik (non polar), sedangkan beberapa kelompok

pseudoalkaloid dan protoalkaloid larut dalam air (polar) (Lenny 2006). Pelarut

organik yang digunakan dalam penelitian ini adalah pelarut kloroform p.a., tetapi

ekstrak dari pelarut tersebut tidak menunjukkan reaksi positif adanya alkaloid.

Ekstrak yang menunjukkan reaksi positif mengandung alkaloid justru ekstrak

metanol (polar). Hal ini menunjukkan bahwa keong mas tidak mengandung

alkaloid (sesungguhnya) yang bersifat racun, tetapi hanya mengandung

protoalkaloid dan pseudoalkaloid saja. Menurut Hegnauer, protoalakaloid

merupakan amin yang relatif sederhana dimana nitrogen-nitrogen asam amino

tidak terdapat dalam cincin heterosiklik, sedangkan pseudoalkaloid merupakan

61

komponen alkaloid yang tidak diturunkan dari prekursor asam amino dan

biasanya bersifat basa (Lenny 2006).

Alkaloid yang terdapat pada ekstrak metanol keong mas ini dapat

digolongkan sebagai hasil metabolisme sekunder dari keong mas sendiri.

Menurut Kutchan (1995), alkaloid digolongkan sebagai metabolit sekunder karena

kelompok molekul ini merupakan substansi organik yang tidak bersifat vital bagi

organisme yang menghasilkannya, tetapi tidak menutup kemungkinan bahwa

komponen alkaloid pada keong mas ini juga berasal dari tumbuh-tumbuhan yang

dimakan oleh keong mas, mengingat keong mas merupakan hewan omnivora.

Alkaloid diketahui berasal dari sejumlah kecil asam amino yaitu ornitin

dan lisin yang menurunkan alkaloid alisiklik; fenilalanin dan tirosin yang

menurunkan alkaloid jenis isokuinolin; dan triftopan yang menurunkan alkaloid

indol. Reaksi utama yang mendasari biosintesis senyawa alkaloid adalah reaksi

Mannich, dimana menurut reaksi ini suatu aldehid berkondensasi dengan suatu

amina menghasilkan suatu ikatan karbon-nitrogen dalam bentuk imina atau garam

iminium, diikuti oleh serangan suatu atom karbon nukleofilik yang dapat berupa

suatu enol atau fenol (Lenny 2006). Reaksi Mannich ini terjadi juga dalam

jaringan tubuh keong mas yang turut menghasilkan alkaloid. Hasil penelitian

Kamil et al. (1998) menunjukkan bahwa keong mas mengandung asam amino

esensial lisin dan fenilalanin, serta asam amino non esensial tirosin, tetapi tidak

mengandung asam amino esensial triptofan. Informasi tersebut menunjukkan

bahwa komponen alkaloid yang dihasilkan oleh keong mas melalui reaksi

Mannich dalam tubuhnya diduga merupakan alkaloid jenis alisiklik dan

isokuinolin.

Alkaloid kerap kali bersifat racun pada manusia, tetapi ada juga yang

memiliki aktivitas fisiologis pada kesehatan manusia sehingga digunakan secara

luas dalam pengobatan (Harborne 1984). Alkaloid pada ekstrak keong mas ini

diduga juga memiliki sifat antioksidan, sama seperti jenis alkaloid yang

ditemukan oleh Porto et al. (2009) pada daun Psychotria brachyceras yaitu

brachycerine, yang memiliki aktivitas antioksidan dan juga berperan sebagai

pelindung dari radiasi sinar UV (UV-B dan UV-C). Alkaloid jenis isokuinolin

diduga berhubungan erat dengan senyawa alkaloid tipe quinin, dan diduga pula

62

memiliki aktivitas sebagai obat malaria seperti quinin (Putra 2007). Hal ini

menekankan bahwa perlu dilakukan identifikasi lebih lanjut tentang jenis alkaloid

yang terkandung dalam ekstrak metanol dengan menggunakan reagen alkaloid,

kromatografi, atau metode spektra (UV, IR, MS dan NMR) (Harborne 1984).

Ketika jenis alkaloidnya telah diketahui dengan jelas, maka fungsi fisiologisnya

pun dapat ditentukan dengan tepat.

2) Steroid/triterpenoid

Pengujian yang telah digunakan secara luas untuk mendeteksi triterpenoid

adalah dengan pereaksi Liebermann-Burchard, yang memberikan warna biru-hijau

pada triterpenoid dan steroid. Triterpenoid merupakan komponen dengan

kerangka karbon yang tersusun oleh 6 unit isoprene dan dibuat secara biosintesis

dari skualen (C30 hidrokarbon asiklik). Triterpenoid memiliki struktur siklik yang

kompleks, sebagian besar terdiri atas alkohol, aldehid, atau asam karboksilat.

Triterpenoid tidak berwarna, jernih, memiliki titik lebur tinggi dan merupakan

komponen aktif yang sulit dikarakterisasi (Harborne 1984).

Steroid merupakan golongan triterpena yang tersusun atas sistem cincin

cyclopetana perhydrophenanthrene. Steroid pada mulanya dipertimbangkan

hanya sebagai komponen pada substansi hewan saja (sebagai hormon seks,

hormon adrenal, asam empedu, dan lain sebagainya), akan tetapi akhir-akhir ini

steroid juga ditemukan pada substansi tumbuhan (Harborne 1984). Steroid yag

terdeteksi pada ekstrak keong mas ini diduga merupakan hormon adrenal dan

hormon seks (progesterone, 17-β-estradiol, testosterone, 4-androstene-dione dan

cortisol) seperti steroid yang terdeteksi pada Achatina fulica yang juga merupakan

Gastropoda air tawar seperti keong mas (Bose et al. 1997). Steroid ini diduga

memiliki efek peningkat stamina tubuh (aprodisiaka) dan anti-inflamasi.

Aktivitas anti-inflamasi ini ditunjukkan oleh hasil penelitian Silva et al. (2002)

bahwa komponen steroid yang diekstrak dari daun Agave attenuata memiliki

aktivitas anti-inflamasi, walaupun aktivitas ini diikuti dengan efek hemolitik yang

tidak diinginkan.

Komponen triterpenoid yang terdeteksi pada ekstrak kasar keong mas ini

diduga juga memiliki aktivitas antitumor. Hal ini dikarenakan triterpenoid pada

keong mas termasuk triterpenoid alami. Menurut hasil penelitian Setzer (2008),

63

triterpenoid alami memiliki aktivitas antitumor karena mempunyai kemampuan

menghambat kinerja enzim topoisomerase II, dengan cara berikatan dengan sisi

aktif enzim yang nantinya akan mengikat DNA dan membelahnya. Hal ini

menyebabkan enzim menjadi terkunci dan tidak dapat mengikat DNA.

Hasil pengujian fitokimia menunjukkan bahwa komponen

triterpenoid/steroid ini terdeteksi pada ketiga ekstrak kasar keong mas yang

memiliki tingkat polaritas yang berbeda. Prekursor dari pembentukan

triterpenoid/steroid adalah kolesterol yang bersifat non polar (Harborne 1984),

sehingga diduga triterpenoid/steroid dapat larut pada pelarut organik (non polar).

Hal ini menekankan bahwa sangatlah wajar apabila triterpenoid/steroid terdeteksi

pada ekstrak kloroform (non polar) ataupun ekstrak etil asetat (semipolar) keong

mas. Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa triterpenoid/steroid juga

terdeteksi pada ekstrak metanol (polar). Hal ini dapat terjadi mengingat metanol

merupakan pelarut polar, yang juga dapat mengekstrak komponen lainnya yang

bersifat non polar ataupun semipolar. Schimidt dan Steinhart (2001) menyatakan

bahwa kandungan steroid pada ekstrak polar dan non polar tidak menunjukkan

hasil yang berbeda nyata.

3) Flavonoid

Flavonoid merupakan golongan terbesar dari senyawa polifenol, karena itu

larutan ekstrak yang mengandung komponen flavonoid akan berubah warna jika

diberi larutan basa atau ammonia. Flavonoid dapat dikelompokan menjadi

9 kelas, yaitu anthosianin, proanthosianidin, flavonol, flavon, glikoflavon,

biflavonil, chlacone dan aurone, flavanon, serta isoflavon. Flavonoid pada

tanaman berikatan dengan gula sebagai glikosida dan adapula yang berada dalam

aglikon (Harborne 1984).

Hasil pengujian fitokimia menunjukkan bahwa hanya ekstrak etil asetat

dan ekstrak metanol saja yang mengandung komponen bioaktif flavonoid, yang

ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning pada lapisan amil alkohol.

Flavonoid yang larut pada pelarut polar seperti metanol, menunjukkan bahwa

komponen flavonoid bersifat polar. Flavonoid umumnya merupakan komponen

larut air, sehingga dapat diekstrak dengan etanol 70 % dan tertinggal pada lapisan

aqueous (Harborne 1984). Hal ini diduga karena flavonoid berikatan dengan gula

64

sebagai glikosida, sehingga flavonoid memiliki sifat polar dan dapat larut pada

pelarut polar. Gugus gula inilah yang memberikan sifat polar pada flavonoid

karena gula juga bersifat polar (larut air). Sedangkan, flavonoid yang terlarut

pada pelarut semipolar seperti etil asetat, menunjukkan juga bahwa flavonoid

tersebut juga memiliki sifat kurang polar. Hal ini diduga karena flavonoid

tersebut berada dalam bentuk aglikon yang bersifat kurang polar, sehingga terlarut

pada pelarut semipolar.

Flavonoid sangat efektif untuk digunakan sebagai antioksidan

(Astawan dan Kasih 2008), dan hal ini pun terbukti dari hasil penelitian

Bernardi et al. (2007) yang menunjukkan bahwa seluruh komponen flavonoid

yang diisolasi dari Hypericum ternum memiliki aktivitas antioksidan, walaupun

kapasitas peredaman radikal bebas DPPH oleh masing-masing komponen

flavonoid tersebut berbeda-beda. Komponen flavonoid yang terdeteksi pada

ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol keong mas, diduga juga memiliki aktivitas

antioksidan. Ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol keong mas ini telah diuji

aktivitas antioksidannya dengan metode DPPH dan hasilnya menunjukkan bahwa

dua ekstrak tersebut memiliki aktivitas antioksidan walaupun aktivitasnya lemah.

Hal ini ditandai dengan nilai IC50 dari ekstak etil asetat dan ekstrak metanol keong

mas berturut-turut sebesar 1662,36 ppm dan 1270,47 ppm. Flavonoid pada kedua

ekstrak keong mas ini diduga turut memberikan andil dalam aktivitas antioksidan

yang terukur ini. Pembahasan mengenai aktivitas antioksidan dari masing-masing

ekstrak kasar keong mas, dapat dilihat pada subbab selanjutnya.

Senyawa flavonoid dapat mencegah penyakit kardiovaskuler dengan cara

menurunkan laju oksidasi lemak. Beberapa hasil penelitian menunjukan bahwa

flavonoid dapat menurunkan hiperlipidemia pada manusia. Penghambatan

oksidasi LDL pada kasus penyakit jantung oleh flavonoid, dapat mencegah

pembentukan sel-sel busa dan kerusakan lipid (Astawan dan Kasih 2008). Selain

itu, flavonoid juga memiliki fungsi sebagai antibakteri, anti-inflamasi, antitumor,

antialergi, dan mencegah osteoporosis. Hal ini terbukti dari hasil penelitian

Al-Meshal et al. (1985); Syah et al. (2006) dan Sukadana (2009).

65

4) Karbohidrat

Karbohidrat merupakan komponen organik kompleks yang dibentuk

melalui proses fotosintesis pada tanaman, dan merupakan sumber energi utama

dalam respirasi. Karbohidrat berperan dalam penyimpanan energi (pati),

transportasi energi (sukrosa), serta pembangun dinding sel (selulosa)

(Harborne 1984). Karbohidrat mempunyai struktur, ukuran dan bentuk molekul

yang berbeda-beda. Karbohidrat umumnya aman untuk dikonsumsi (tidak

beracun). Rumus kimia karbohidrat umumnya Cx(H2O)y (Fennema 1996).

Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa ketiga ekstra kasar keong mas

positif mengandung karbohidrat. Hasil pengujian ini mendukung hasil analisis

proksimat karbohidrat keong mas, yaitu sebesar 3,93%. Hasil penelitian

Nurjanah et al. (1996) dan Kamil et al. (1998) menunjukkan bahwa hampir

sebagian besar komponen karbohidrat yang terkandung dalam tubuh keong mas

merupakan komponen serat kasar yang juga termasuk dalam golongan

karbohidrat. Komponen serat kasar ini tidak ada yang terlarut pada ketiga pelarut

yang digunakan dan tertinggal sebagai residu selama proses filtrasi, sehingga

karbohidrat yang terdeteksi dari hasil uji fitokimia pada ketiga ekstrak kasar

keong mas bukanlah komponen serat kasar, tetapi komponen glikogen yang

terekstrak pada ketiga pelarut dengan tingkat kepolaran yang berbeda.

Karbohidrat yang terdapat pada hewan umumnya berbentuk glikogen, dan dapat

dipecah menjadi D-glukosa (Winarno 2008).

Karbohidrat yang memiliki berat molekul rendah, umumnya mempunyai

banyak kegunaan. Karbohidrat berperan dalam interaksi hewan dan tumbuhan,

perlindungan dari luka dan infeksi, serta detoksifikasi dari substansi asing

(Harborne 1984). Pada tubuh manusia, karbohidrat berguna untuk mencegah

ketosis, pemecahan protein tubuh yang berlebihan, kehilangan mineral dan

berguna untuk membantu metabolisme lemak dan protein (Winarno 2008).

Hasil positif pengujian kandungan karbohidrat dengan menggunakan

pereaksi Molisch ini tidak diikuti dengan reaksi positif pengujian kandungan gula

pereduksi pada ketiga ekstrak kasar keong mas menggunakan pereaksi Benedict.

Hal ini diduga karena gula pereduksi yang terdapat dalam ketiga ekstrak keong

mas ini didominasi oleh gula pereduksi jenis ketosa, bukan jenis aldosa. Pada

66

pereaksi Benedict yang tidak alkali, komponen aldosa dapat terdeteksi tetapi

komponen ketosa tidak. Ketosa hanya akan terdeteksi pada suasana alkali saja,

seperti pada pereaksi Fehling. Hal ini dikarenakan, ketosa akan terisomerisasi

menjadi aldosa pada suasana alkali dan dapat mereduksi tembaga (II) menjadi

tembaga (I) yang akan mengendap sebagai Cu2O yang berwarna merah

bata (Fennema 1996). Pengujian kandungan gula pereduksi menggunakan

pereaksi Fehling pada ketiga ekstrak keong mas perlu dilakukan untuk

meyakinkan hal tersebut.

5) Asam amino

Asam amino merupakan unit struktural dasar dari protein. Asam amino

dapat diperoleh dengan menghidrolisis protein dalam asam, alkali, ataupun enzim.

Sebuah asam amino tersusun atas sebuah atom α-carbon yang berikatan secara

kovalen dengan sebuah atom hidrogen, sebuah gugus amino, dan sebuah gugus

rantai R. Semua asam amino berkonfigurasi α dan mempunyai konfigurasi L,

kecuali glisin yang tidak mempunyai atom C asimetrik. Hanya asam amino L

yang merupakan komponen protein (Fennema 1996; Winarno 2008).

Hasil pengujian asam amino dengan menggunakan pereaksi Ninhidrin

0,10% menunjukkan bahwa hanya ekstrak metanol keong mas saja yang positif

mengandung komponen asam amino. Hasil pengujian ini didukung oleh hasil

penelitian Kamil et al. (1998) mengenai kandungan asam amino pada tepung

keong (Tabel 2). Asam amino yang terdeteksi ini diduga asam amino-asam amino

yang dihasilkan dari proses hidrolisis protein, serta asam amino-asam amino non

protein (bukan penyusun protein). Asam amino-asam amino yang terlarut pada

pelarut metanol ini merupakan asam amino yang memiliki sifat polar (hidrofilik),

baik yang bermuatan ataupun yang tidak bermuatan, seperti arginin, histidin, lisin

(asam amino polar bermuatan), treonin (asam amino polar tak bermuatan) seperti

yang dikemukakan dalam hasil penelitian Kamil et al. (1998) pada Tabel 2.

Hasil penelitian Kamil et al. (1998) ini juga menunjukkan bahwa keong

mas mengandung asam amino-asam amino non polar, seperti isoleusin, leusin,

valin, fenilalanin dan tirosin (Tabel 2). Hasil pengujian menunjukkan bahwa

ekstrak kloroform (non polar) ataupun ekstrak etil asetat (semipolar) tidak

mengandung asam amino. Hal ini diduga karena asam amino-asam amino non

67

polar ini terdapat dalam jumlah yang sangat kecil pada sampel keong mas yang

digunakan dalam penelitian ini, sehingga tidak terdeteksi oleh pereaksi Ninhidrin

0,10% pada ekstrak kloroform ataupun ekstrak etil asetat.

Hasil positif pada pengujian kandungan asam amino ini tidak didahului

dengan hasil positif pada pengujian peptida menggunakan pereaksi Biuret pada

ketiga ekstrak. Peptida merupakan ikatan kovalen antara dua atau lebih molekul

asam amino melalui suatu ikatan amida substitusi. Ikatan ini dibentuk dengan

menarik unsur H2O dari gugus karboksil suatu asam amino dan gugus α-amino

dari molekul lain, dengan reaksi kondensasi yang kuat (Lehninger 1988;

Belitz et al. 2009). Tidak terdeteksinya komponen-komponen yang berikatan

peptida ini diduga karena komponen-komponen tersebut telah terhidrolisis

sempurna menghasilkan asam amino-asam amino penyusunnya yang terdeteksi

pada uji Ninhidrin ekstrak metanol. Pembentukan ikatan peptida memerlukan

banyak energi, sedangkan untuk hidrolisis praktis tidak memerlukan energi,

sehingga reaksi keseimbangan ini lebih cenderung untuk berjalan ke arah

hidrolisis daripada sintesis (Winarno 2008).

4.3 Aktivitas Antioksidan

Antioksidan adalah komponen yang dapat menunda atau mencegah

oksidasi lipid, asam nukleat, atau molekul-molekul lain, dengan cara menghambat

inisiasi atau propagasi reaksi oksidasi berantai (Wang 2006). Keberadaan

senyawa antioksidan ini dalam suatu bahan dapat dideteksi dengan melakukan uji

aktivitas antioksidan. Uji aktivitas antioksidan pada tiga ekstrak kasar keong mas

yang memiliki tingkat kepolaran yang berbeda, dilakukan dengan menggunakan

metode uji DPPH.

Metode uji DPPH merupakan salah satu metode yang paling banyak

digunakan untuk memperkirakan efisiensi kinerja dari substansi yang berperan

sebagai antioksidan (Molyneux 2004). Metode pengujian ini berdasarkan pada

kemampuan substansi antioksidan tersebut dalam menetralisir radikal bebas.

Radikal bebas yang digunakan adalah 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)

(Vattem dan Shetty 2006). Radikal bebas DPPH merupakan radikal sintetik yang

stabil pada suhu kamar dan larut dalam pelarut polar seperti metanol dan etanol

(Molyneux 2004; Suratmo 2009). Sifat stabil ini dikarenakan radikal bebas ini

68

memiliki satu elektron yang didelokalisir dari molekul utuhnya, sehingga molekul

tersebut tidak reaktif sebagaimana radikal bebas lain. Delokalisasi ini akan

memberikan sebuah warna ungu gelap dengan absorbansi maksimum pada

517 nm dalam larutan etanol ataupun metanol (Molyneux 2004; Amrun dan

Umiyah 2005; Vattem dan Shetty 2006).

Metode uji aktivitas antioksidan dengan menggunakan radikal bebas

DPPH dipilih karena metode ini sederhana, mudah, cepat, peka dan hanya

memerlukan sedikit sampel, akan tetapi jumlah pelarut pengencer yang diperlukan

dalam pengujian ini cukup banyak. Metanol dipilih sebagai pelarut karena

metanol dapat melarutkan kristal DPPH (Molyneux 2004; Suratmo 2009) dan juga

memiliki sifat yang dapat melarutkan komponen non polar di dalamnya,

mengingat ketiga ekstrak yang diuji memiliki tingkat kepolaran yang berbeda-

beda.

Antioksidan pembanding yang digunakan pada penelitian ini adalah

antioksidan sintetik BHT (butylated hydroxytoluene). Larutan BHT pada

penelitian ini dibuat dengan konsentrasi 2, 4, 6 dan 8 ppm melalui proses

pengenceran larutan stok BHT 250 ppm. Konsentrasi larutan ekstrak kasar keong

mas yang diuji dengan metode DPPH ini adalah sebesar 200, 400, 600 dan

800 ppm. Konsentrasi tersebut diperoleh melalui proses pengenceran dari

masing-masing larutan stok ekstrak kasar keong mas 1000 ppm. Perhitungan

pembuatan larutan stok dan proses pengencerannya dapat dilihat pada

Lampiran 7.

Suatu senyawa dapat dikatakan memiliki aktivitas antioksidan apabila

senyawa tersebut mampu mendonorkan atom hidrogennya pada radikal DPPH,

yang ditandai dengan perubahan warna ungu menjadi kuning pucat

(Molyneux 20004). Perubahan warna ini hanya tampak pada larutan BHT yang

diberi larutan DPPH 1 mM dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 oC,

sedangkan pada larutan ekstrak kasar keong mas yang telah diberi perlakuan sama

tidak terlalu menunjukkan perubahan warna yang mencolok. Hal ini diduga

karena konsentrasi ekstrak kasar keong mas yang diuji terlalu kecil dan jauh dari

nilai konsentrasi ekstrak yang dapat meredam radikal DPPH sebanyak 50% (IC50).

Perubahan warna yang mengindikasikan adanya reaksi peredaman radikal bebas

69

DPPH oleh senyawa antioksidan pada larutan BHT dan larutan ekstrak keong

mas, dapat dilihat pada Gambar 20.

BHT + DPPH 1 mM Ekstrak Kloroform + DPPH 1 mM

Ekstrak Etil Asetat + DPPH 1 mM Ekstrak Metanol + DPPH 1 mM

Gambar 20. Perubahan warna yang mengidikasikan reaksi peredaman DPPH

Intensitas perubahan warna yang terjadi pada larutan BHT dan larutan

ekstrak kasar keong mas ini dapat diukur absorbansinya dengan menggunakan

spektrofotometer pada panjang gelombang 517 nm. Setelah itu, perhitungan

persen inhibisi dan IC50 dari antioksidan BHT dan masing-masing ekstrak kasar

keong mas dapat dilakukan. Persen inhibisi adalah kemampuan suatu bahan

untuk menghambat aktivitas radikal bebas, yang berhubungan dengan konsentrasi

suatu bahan. IC50 sendiri merupakan salah satu parameter yang biasa digunakan

untuk menginterpretasikan hasil dari pengujian DPPH. Nilai IC50 ini dapat

didefinisikan sebagai konsentrasi substrat yang dapat menyebabkan berkurangnya

50% aktivitas DPPH. Semakin kecil nilai IC50 berarti aktivitas antioksidannya

semakin tinggi (Molyneux 2004). Perhitungan persen inhibisi dan IC50 dapat

70

y = 14,32x - 20,34

R² = 0,909

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10

% I

nh

ibis

i

Konsentrasi (ppm)

dilihat pada Lampiran 8. Hasil uji aktivitas antioksidan BHT dan masing-masing

ekstrak kasar keong mas dapat dilihat pada Tabel 7.

Tabel 7. Hasil uji aktivitas antioksidan

Sampel % Inhibisi IC50

(ppm)

IC50 Rata-rata

(ppm)

BHT 2 ppm 4 ppm 6 ppm 8 ppm

4,91 12,55 23,67 79,37 89,45

200 ppm 400 ppm 600 ppm 800 ppm

Ekstrak Kloroform

0,19 5,70 8,84 10,93 2912,50 3458,37±771,98

3,99 6,65 9,51 10,74 4004,25

Ekstrak

Etil Asetat

5,04 9,79 17,20 25,09 1547,47 1662,36±162,48

7,32 10,55 14,64 24,71 1777,25

Ekstrak

Metanol

0,66 13,69 24,43 27,47 1222,33 1270,47±68,08

6,27 12,74 25,76 28,14 1318,61

Empat konsentrasi larutan BHT (2, 4, 6 dan 8 ppm) yang digunakan dalam

penelitian ini dipilih berdasarkan hasil penelitian Hanani et al. (2005), dimana

dengan menguji keempat konsentrasi tersebut, diperoleh nilai IC50 BHT sebesar

3,81 ppm. Pada penelitian ini, nilai IC50 BHT yang diperoleh sebesar 4,91 ppm.

Nilai IC50 BHT ini tidak jauh berbeda dengan nilai yang diperoleh

Hanani et al. (2005) dalam penelitiannya, dan tetap menunjukkan bahwa

antioksidan BHT merupakan antioksidan dengan aktivitas yang sangat kuat

(<50 ppm) menurut klasifikasi Blois (1958) dalam Molyneux (2004). Pengujian

aktivitas antioksidan BHT ini menghasilkan hubungan antara konsentrasi BHT

yang digunakan dengan persen inhibisinya, yang dapat dilihat pada Gambar 21.

Gambar 21. Grafik hubungan konsentrasi BHT dengan persen inhibisinya

Tabel 7 menunjukkan bahwa ketiga ekstrak kasar keong mas juga

memiliki aktivitas antioksidan seperti BHT, walaupun aktivitasnya tergolong

71

lemah. Ketiga ekstrak kasar keong mas ini memiliki kekuatan penghambat yang

berbeda-beda antara yang satu dengan yang lainnya. Pengujian aktivitas

antioksidan dari masing-masing ekstrak kasar menghasilkan hubungan antara

konsentrasi ekstrak kasar yang digunakan dengan persen inhibisinya, yang dapat

dilihat pada Gambar 22.

Gambar 22. Grafik hubungan konsentrasi ekstrak kasar keong mas dengan

rata-rata persen inhibisinya, ∆ = ekstrak metanol, □ = ekstrak etil

asetat dan ◊ = ekstrak kloroform

Grafik pada Gambar 21 dan 22 merupakan kurva regresi linear yang

digunakan untuk menentukan nilai IC50 dari BHT dan ketiga ekstrak keong mas.

Persamaan regresi linear secara umum adalah y = a + bx, dimana a merupakan

intersep atau perpotongan dengan sumbu tegak, dan b merupakan kemiringan atau

gradiennya (Walpole 1997). Grafik regresi linear umumnya digunakan untuk

mengetahui hubungan fungsional (pengaruh atau meramalkan pengaruh) antara

variabel yang mempengaruhi (lambang x) dan variabel yang dipengaruhi

(lambang y) (Usman dan Akbar 2008). Variabel yang mempengaruhi pada kedua

grafik (Gambar 21 dan 22) adalah konsentrasi, sedangkan variabel yang

dipengaruhi adalah persen inhibisi (% inhibisi).

Koefisien arah regresi linear dinyatakan oleh huruf b yang juga

menyatakan perubahan rata-rata y untuk setiap perubahan x sebesar 1 bagian.

Huruf a merupakan bilangan konstan (Usman dan Akbar 2008). Grafik pada

Gambar 21 dan 22 menunjukan bahwa konsentrasi dan % inhibisi memiliki

hubungan yang positif dan berkorelasi kuat (r), terihat dari nilai b pada persamaan

y = 0,014x - 0,238

R² = 0,966

y = 0,029x - 0,784

R² = 0,975

y = 0,042x - 3,826

R² = 0,950

0

5

10

15

20

25

30

35

0 200 400 600 800 1000

% I

nh

ibis

i

Konsentrasi (ppm)

72

3458,37

1662,361270,47

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Kloroform Etil Asetat Metanol

Rata

-rata

IC

50

(pp

m)

Jenis pelarut

regresi linearnya yang bernilai positif, serta nilai determinasinya (r2) yang lebih

besar dari 0,90. Hal ini berarti semakin besar konsentrasinya maka semakin besar

pula % inhibisi yang dihasilkan. Hubungan tersebut dibuktikan oleh data

% inhibisi yang meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi BHT atau

ekstrak yang ditambahkan, seperti yang tertulis pada Tabel 7. Hal ini sesuai

dengan hasil penelitian Hanani et al. (2005), yang menyatakan bahwa persentase

penghambatan (persen inhibisi) terhadap aktivitas radikal bebas akan ikut

meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak. Hal serupa juga

terjadi pada hasil pengujian aktivitas antioksidan BHT.

Positif atau negatifnya nilai a tidak akan memberikan pengaruh pada

kemiringan atau arah kurva regresi linear yang dihasilkan, tetapi akan

mempengaruhi besar nilai y yang dihasilkan (Lampiran 8 poin b dan c). Hal ini

dikarenakan nilai a merupakan konstanta yang dapat menambah atau mengurangi

nilai y yang akan diperoleh dan berperan sebagai faktor koreksi. Jika nilai a

positif, maka setiap kenaikan 1 bagian nilai x akan menyebabkan nilai y

bertambah sebanyak a, begitu pula sebaliknya. Positif atau negatifnya nilai a

dapat disebabkan oleh adanya pencilan, adanya asumsi yang tidak terpenuhi, serta

faktor-faktor lainnya.

Salah satu parameter yang biasa digunakan untuk menginterpretasikan

hasil dari pengujian DPPH adalah efficient concentration 50 value (EC50 value)

atau biasa dikenal dengan inhibition concentration 50 value (IC50 value) seperti

yang disebutkan di atas. Nilai ini dapat didefinisikan sebagai konsentrasi substrat

yang dapat menyebabkan berkurangnya 50% aktivitas DPPH (Molyneux 2004).

Nilai rata-rata IC50 ekstrak kasar keong mas dari ketiga pelarut yang digunakan,

dapat dilihat pada Gambar 23.

Gambar 23. Nilai rata-rata IC50 ekstrak kasar keong mas

73

Semakin kecil nilai IC50 berarti aktivitas antioksidannya semakin tinggi

(Molyneux 2004). Diagram batang pada Gambar 23 ini menunjukkan bahwa

ekstrak metanol keong mas memiliki aktivitas antioksidan yang lebih besar dari

dua ekstrak yang lainnya, ditandai dengan nilai IC50-nya yang terkecil, yaitu

1270,47 ppm. Sedangkan, ekstrak kloroform keong mas merupakan ekstrak yang

memiliki aktivitas antioksidan yang paling lemah. Hal ini terbukti dari nilai IC50-

nya yang terbesar, yaitu 3458,37 ppm.

Walaupun rendemen ekstrak etil asetat lebih sedikit dari rendemen

kloroform, tetapi aktivitas antioksidannya lebih kuat. Hal ini diduga karena pada

ekstrak etil asetat terdapat komponen flavonoid yang terdeteksi melalui uji

fitokimia, sedangkan pada ekstrak kloroform tidak. Flavonoid diketahui sangat

efektif untuk digunakan sebagai antioksidan (Astawan dan Kasih 2008).

Peran flavonoid sebagai antioksidan ini terbukti dari hasil penelitian

Bernardi et al. (2007) yang menunjukkan bahwa seluruh komponen flavonoid

yang diisolasi dari tumbuhan Hypericum ternum memiliki aktivitas antioksidan.

Komponen flavonoid pada ekstrak metanol keong mas juga terdeteksi,

akan tetapi aktivitas antioksidannya lebih kuat dari ekstrak etil asetat keong mas.

Hal ini diduga karena pada ekstrak metanol keong mas juga terkandung

komponen alkaloid. Alkaloid juga telah diketahui memiliki aktivitas antioksidan.

Hal ini terbukti dari hasil penelitian Porto et al. (2009), yang menunjukkan bahwa

komponen alkaloid pada daun Psychotria brachyceras yaitu brachycerine,

memiliki aktivitas antioksidan dan berperan sebagai pelindung dari radiasi

sinar UV (UV-B dan UV-C).

Suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat apabila nilai IC50

kurang dari 0,05 mg/ml, kuat apabila nilai IC50 antara 0,05-0,10 mg/ml, sedang

apabila nilai IC50 berkisar antara 0,10-0,15 mg/ml, dan lemah apabila nilai IC50

berkisar antara 0,15-0,20 mg/ml (Blois 1958 dalam Molyneux 2004). Menurut

klasifikasi ini, ketiga esktrak kasar keong mas tersebut memiliki aktivitas

antioksidan yang sangat lemah, karena nilai IC50-nya lebih besar dari 0,20 mg/ml

atau 200 ppm. Hal ini jauh berbeda dengan aktivitas antioksidan BHT.

Data-data pada Tabel 7 menunjukkan bahwa antioksidan BHT memiliki

aktivitas yang lebih kuat dari senyawa-senyawa antioksidan yang terdapat pada

74

ketiga ekstrak kasar keong mas. Hal ini terlihat dari nilai IC50 BHT yang jauh

berbeda dengan nilai IC50 dari masing-masing ekstrak kasar keong mas. Nilai

IC50 antioksidan BHT jauh lebih kecil dari nilai IC50 ketiga ekstrak kasar keong

mas. Hal ini dapat terjadi karena ekstrak keong mas yang digunakan dalam

pengujian ini masih tergolong sebagai ekstrak kasar (crude). Ekstrak kasar ini

masih mengandung senyawa lain yang bukan merupakan senyawa antioksidan.

Senyawa lain tersebut ikut terekstrak dalam pelarut selama proses ekstraksi.

Senyawa-senyawa ini dapat meningkatkan nilai rendemen ekstrak, tetapi tidak

dapat meningkatkan aktivitas antioksidan ekstrak tersebut. Senyawa murni dari

ekstrak kasar ini diduga memiliki aktivitas antioksidan yang lebih tinggi.

Contohnya adalah komponen flavonoid yang terdeteksi pada ekstrak etil asetat

dan ekstrak metanol. Komponen flavonoid murni dari ekstrak keong mas diduga

memiliki aktivitas antioksidan yang jauh lebih tinggi dari ekstrak kasarnya. Hal

ini menunjukan bahwa perlu dilakukan pemurnian pada ekstrak kasar keong mas

tersebut. Setelah ekstrak yang telah dimurnikan tersebut diperoleh, maka

pengujian aktivitas antioksidannya pun perlu dilakukan.

Ekstrak kloroform keong mas yang bersifat non polar tidak sepenuhnya

benar jika dinyatakan memiliki aktivitas antioksidan yang paling lemah, walaupun

hasil pengujian dengan metode DPPH menunjukan bahwa nilai IC50-nya cukup

besar. Hal ini daqpat terjadi apabila pelarut yang digunakan untuk melarutkan

ekstrak, memiliki sifat kepolaran yang berbeda dengan ekstrak tersebut. Pelarut

yang digunakan untuk melarutkan ekstrak dan kristal DPPH pada penelitian ini

adalah metanol yang bersifat polar, sehingga diduga komponen bioaktif yang

bersifat non polar pada ekstrak kloroform tidak terlarut sepenuhnya pada pelarut

ini, baik pada ulangan 1 ataupun ulangan 2. Jumlah komponen bioaktif yang

terlarut pun pada masing-masing ulangan akan berbeda dan pada akhirnya akan

berpengaruh pada nilai IC50 yang dihasilkan dari masing-masing ulangan. Hal ini

terbukti dari nilai IC50 ekstrak kloroform pada Tabel 7, dimana selisih nilai IC50

antara ulangan 1 dan ulangan 2 sangat besar yang tentunya juga akan

memperbesar nilai standar deviasinya. Nilai IC50 akan semakin besar jika ekstrak

yang terlarut pada pelarut yang digunakan semakin sedikit. Hal ini

mengisyaratkan bahwa perlu dilakukan pengujian aktivitas antioksidan dengan

75

menggunakan metode pengujian lainnya yang universal, baik untuk komponen

bioaktif yang bersifat polar, semipolar, ataupun non polar. Metode uji DPPH

merupakan metode pengujian aktivitas antioksidan yang paling cocok bagi

komponen antioksidan yang bersifat polar, karena kristal DPPH hanya dapat larut

dan memberikan absorbansi maksimum pada pelarut etanol ataupun metanol

seperti yang dikemukakan oleh Molyneux (2004); Amrun dan Umiyah (2005);

serta Vattem dan Shetty (2006).

76

5 KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Keong mas (Pomacea canaliculata Lamarck) yang berasal dari perairan

sawah padi di Desa Carang Pulang, Kelurahan Cikarawang, Kecamatan Darmaga,

Kabupaten Bogor memiliki rendemen cangkang (27,10%) dan isi cangkang

(48,35%) yang sangat potensial dan ekonomis untuk dimanfaatkan lebih lanjut,

tetapi rendemen operkulumnya yang cukup kecil (1,46%) tidak ekonomis apabila

dimanfaatkan sebagai bahan baku industri pembuatan kitin dan kitosan. Isi

cangkang keong mas ini mengandung air yang cukup tinggi (81,19%), lemak yang

rendah (0,51%), protein dalam jumlah sedang (10,30%), abu (4,07%), abu tidak

larut asam (0,30%) dan karbohidrat (3,93%).

Ekstrak keong mas mengandung 5 komponen bioaktif yang terdeteksi

melalui uji fitokimia, yaitu komponen alkaloid, steroid, flavonoid, karbohidrat dan

asam amino. Ekstrak keong mas ini memiliki aktivitas antioksidan karena adanya

komponen alkaloid dan flavonoid. Komponen-komponen bioaktif ini selain

memiliki aktivitas antioksidan, diduga juga memiliki banyak aktivitas fisiologis

yang positif bagi tubuh manusia. Hal ini menunjukan bahwa keong mas

berpotensi untuk dapat digunakan sebagai bahan baku pembuatan produk

nutraceutical yang memiliki banyak khasiat bagi kesehatan tubuh manusia.

5.2. Saran

Saran yang dapat diberikan dari hasil penelitian ini adalah perlu dilakukan

penelitian lanjutan berupa identifikasi senyawa-senyawa bioaktif lainnya dalam

ekstrak keong mas dengan GCMS, pemurnian dan pengujian aktivitas antioksidan

ekstrak murni, serta penentuan struktur bangun komponen bioaktif pada ekstrak

murni dengan spektrum UV, IR dan NMR. Pengujian aktivitas antioksidan

menggunakan metode lainnya, seperti metode NBT dan Oxygen Radical

Absorbance Capacity (ORAC) Assay, juga perlu dilakukan. Penentuan komposisi

asam lemak, vitamin dan mineral juga perlu dilakukan. Selain itu, proses

pemisahan pelarut dari ekstrak, hendaknya mengkombinasikan rotary vacuum

evaporator (≤50 oC) untuk memisahkan pelarut dari ekstrak dan oven vacuum

(≤50 oC) untuk menguapkan pelarut yang masih tersisa dalam ekstrak.

77

DAFTAR PUSTAKA

Aditya G, Raut SK. 2005. Feeding of the leech Glossiphonia weberi on the

introduced snail Pomacea bridgesii in India. Aquatic Ecology

(39):465-471.

Ako H, Tamaru C. 2006. Efforts at golden apple snail control in Hawaii.

http://pestalert.applesnail.net/conferences/icam07/hawaii.htm/.

[1 Desember 2009].

Al-Meshal IA, Tariq M, Parmar NS, Ageel AM. 1985. Anti-inflammatory activity

of the flavonoid fraction of khat (Catha edulis Forsk). Agents and

Actions 17:3-4.

Amrun MH, Umiyah. 2005. Pengujian antiradikal bebas difenilpikril hidrazil

(DPPH) ekstrak buah kenitu (Chrysophyllum cainito L.) dari daerah

sekitar Jember. Jurnal Ilmu Dasar 6(2):110-114.

Andriyanti R. 2009. Ekstraksi senyawa aktif antioksidan dari lintah laut

(Discodoris sp.) asal perairan Kepulauan Belitung [skripsi]. Bogor:

Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.

[AOAC] Association of Official Analytical Chemist. 1980. Official Method of

Analysis of The Association of Official Analytical of Chemist.

Arlington: The Association of Official Analytical Chemist, Inc.

___________________________________________. 2005. Official Method of

Analysis of The Association of Official Analytical of Chemist.

Arlington: The Association of Official Analytical Chemist, Inc.

Ardhi Y. 2008. Keong mas, aman dan berkualitas.

http://suaramerdeka.com/v1/index.php/read/cetak/2008/03/10/4147/Ke

ong.Mas.Aman.dan.Berkualitas/. [1 Desember 2009].

Astawan M, Kasih AL. 2008. Khasiat Warna-Warni Makanan. Jakarta: Gramedia

Pustaka Utama.

Basmal J, Syarifudin, Ma’ruf WF. 2003. Pengaruh konsentrasi larutan potasium

hidroksida terhadap mutu kappa-karaginan yang diekstraksi dari

Eucheuma cottonii. Jurnal Penelitian Perikanan Indonesia 9(5):95-103.

Beek TAV. 1999. Modern Methods of Secondary Product Isolation and Analysis.

Di dalam: Walton NJ, Brown DE, editor. Chemical from Plants:

Prespectives on Plant Secondary Products. London: Imperial College

Press. hlm 91-186.

78

Belitz HD, Grosch W, Schieberle P. 2009. Food Chemistry. Ed rev ke-4. Verlag:

Springer.

Bernardi APM, Lopez-Alarcon C, Aspee A, Rech S, Poser GLV, Bride R, Lissp

E. 2007. Antioxidant activity of flavonoids isolated from Hyperincum

ternum. J Chil Chem Soc 52(4):1326-1329.

Bose R, Majumdar C, Bhattacharya S. 1997. Steroids in Achatina fulica

(Bowdich): steroid profile in haemolymph and in vitro release of

steroids from endogenous precursors by ovotestis and albumen gland.

Comp Biochem Physiol 116C(3):179-182.

[BSN] Badan Standardisasi Nasional. 2000. Teh Kering dalam Kemasan,

SNI 01-3836-2000. Jakarta: Badan Standardisasi Nasional.

Castro P, Huber ME. 2007. Marine Biology. Ed ke-6. Boston: The McGraw-Hill

Companies, Inc.

Cazzaniga NJ. 2002. Old species and new concepts in the taxonomy of Pomacea

(Gastropoda: Ampullariidae). Biocell 26(1):71-81.

Cui CB, Xu C, Gu QQ, Chu SD, Ji HH, Jing G. 2004. A new furostanol saponin

from the water-extract of Dioscorea nipponica Mak., the raw material

of the traditional Chinese herbal medicine wei ao xin. Chinese

Chemical Letters 15(10):1191-1194.

[DA-PhilRice] Department of Agricultural-The Philippine Rice Research

Institute. 2001. Management Option for The Golden Apple Snail.

Maligaya: Department of Agriculture-The Philippine Rice Research

Institute.

Darusman LK, Sajuthi D, Sutriah K, Pamungkas D. 1995. Naskah Seminar:

Ekstraksi komponen bioaktif sebagai bahan obat dari karang-karangan,

bunga karang dan ganggang laut di perairan Pulau Pari Kepulauan

Seribu. Buletin Kimia. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Escudero MR, Escudero FR, Remsberg CM, Takemoto JK, Davies NM, Yanez

JA. 2008. Identification of polyphenols and anti-oxidant capacity of

Piper aduncum L. The Open Bioactive Compounds Journal 1:18-21.

Fennema OR, editor. 1996. Food Chemistry. Ed ke-3. New York: Marcel Dekker,

Inc.

Hamann MI. 1992. Catadiscus pomaceae sp. n. (trematoda, Paramphistomatidae)

from Pomacea canaliculata (Lamarck, 1801) (Prosobranchia,

Ampullariidae). Mem. Inst. Oswaldo Cruz 87(1):9-14.

79

Hanani E, Mun’im A, Sekarini R. 2005. Identifikasi senyawa antioksidan dalam

spons Callyspongia sp. dari Kepulauan Seribu. Majalah Ilmu

Kefarmasian 2(3):127-133.

Harborne JB. 1984. Phytochemical methods. Ed ke-2. New York: Chapman and

Hall.

__________. 1999. Classes and Functions of Secondary Products from Plants. Di

dalam: Walton NJ, Brown DE, editor. Chemical from Plants:

Prespectives on Plant Secondary Products. London: Imperial College

Press. hlm 1-25.

Hariyatmi. 2004. Kemampuan vitamin E sebagai antioksidan terhadap radikal

bebas pada lanjut usia. MIPA 14(1):52-60.

Herawati, Akhlus S. 2006. Kinerja BHT sebagai antioksidan minyak sawit pada

perlindungan terhadap oksidasi oksigen singlet. Akta Kimindo 2(1):1-8.

Horn KC, Johnson SD, Boles KM, Moore A, Siemann E, Gabler CA. 2008.

Factors affecting hatching success of golden apple snail eggs: effect of

water immersion and cannibalism. Wetlands 28(2):544-549.

Joshi RC. 2005. Managing Invasive Alien Mollusc Species in Rice. Maligaya:

Department of Agriculture-The Philippine Rice Research Institute.

Kamil, Zahiruddin W, Sumaryanto H. 1998. Pengaruh metode pengolahan

terhadap mutu tepung siput murbei (Pomacea sp.). Buletin Teknologi

Hasil Perikanan 5(2):24-26.

Kannan A, Hettiarachchy N, Narayan S. 2009. Colon and breast anti-cancer

effects of peptide hydrolysates derived from rice bran. The Open

Bioactive Coumpounds Journal 2:17-20.

Krzynowek J, Murphy J. 1987. Proximate Composition, Energy, Fatty Acid,

Sodium, and Cholesterol Content of Finfish, Shellfish, and their

Products. Amerika Serikat: Department of Commerce.

Kutchan TM. 1995. Alkaloid biosynthesis: the basis for metabolic engineering of

medical plants. The Plant Cell 7:1059-1070.

Lehninger AL. 1988. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Thenawidjaja M, penerjemah.

Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principles of Biochemistry.

Lenny S. 2006. Senyawa flavonoida, fenilpropanoida dan alkaloida [makalah].

Medan: Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara.

80

Molyneux P. 2004. The use of stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH)

for estimating antioksidan activity. Songklanakarin J Sci Technol

26(2):211-219.

Muchtadi D. 1989. Aspek Biokimia dan Gizi dalam Keamanan Pangan. Bogor:

Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor.

Musthafa Z, Lawrence GS. 2000. Peran antioksidan dalam penghambatan

aterosklerosis pada tikus wistar diabetes mellitus. Cermin Dunia

Kedokteran 127:32-33.

Musthafa Z, Lawrence GS, Seweang A. 2000. Radikal bebas sebagai predictor

ateroskelrosis pada tikus wistar diabetes mellitus. Cermin Dunia

Kedokteran 127:30-31.

Nurjanah. 2009. Karakterisasi lintah laut (Discodoris sp.) dari perairan pantai

Pulau Buton sebagai antioksidan dan antikolesterol [disertasi]. Bogor:

Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Nurjanah, Fitrial Y, Suwandi R, Daritri ES. 1996. Pembuatan kerupuk keong mas

(Pomacea sp.) dengan penambahan tepung beras ketan dan flavor

udang. Buletin Teknologi Hasil Perikanan 2(2):43-51.

Orsat V, Raghavan GSV. 2006. Dehydration Technologies to Retain Bioactive

Components. Di dalam: Shi J, editor. Functional Food Ingredients and

Nutraceuticals: Processing Technologies. Boca Raton: CRC Press. hlm

173-191.

Paulinyi HM, Paulini E. 1972. Laboratory observation on the biological control of

Biomphalaria glabrata by a species of Pomacea (Ampullariidae).

Bulletin of The World Health Organization (46):243-247.

Pennak RW. 1989. Fresh-Water Invertebrates of The United States. New York:

John Wiley & Sons, Inc.

Porto DD, Henriques AT, Fett-Neto AG. 2009. Bioactive alkaloids from South

American Psychotria and related species. The Open Bioactive

Compounds Journal 2:29-36.

Prabowo TT. 2009. Uji aktivitas antioksidan dari keong matah merah (Cerithidea

obtusa) [skripsi]. Bogor: Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut

Pertanian Bogor.

Putra SE. 2007. Alkaloid: senyawa organik terbanyak di alam. http://www.chem-

is-try.org/artikel_kimia/biokimia/alkaloid_senyawa_organik_terbanyak

di_alam/. [20 Februari 2010].

81

Rita A, Tania SU, Heri H, Albana AM, Rini R. 2009. Produksi antioksidan dari

daun simpur (Dillenia indica) menggunakan metode ekstraksi tekanan

tinggi dengan sirkulasi pelarut. Di dalam: SNTKI 2009. Prosiding

Seminar Nasional Teknik Kimia Indonesia; Bandung, 19-20 Oktober

2009. Bandung: Perhimpunan Teknik Kimia Indonesia. hlm 1-8.

Rohman A, Riyanto S. 2005. Daya antioksidan ekstrak etanol daun kemuning

(Murraya paniculata (L) Jack) secara in-vitro. Majalah Farmasi

Indonesia 16(3):136-140.

Salamah E, Ayuningrat E, Purwaningsih S. 2008. Penapisan awal komponen

bioaktif dari kijing taiwan (Anadonta woodiana Lea.) sebagai senyawa

antioksidan. Buletin Teknologi Hasil Perikanan 11(2):119-132.

Schmidt G, Steinhart H. 2001. Impact of extraction solvents on steroid contents

determined in beef. Journal of Food Chemistry 76:83-88.

Scholar Chemistry. 2008. Material safety data sheet: butylated hydroxyl toluene.

http://www.scholarchemistry.com/msds/BHT.pdf. [19 Januari 2010].

Setzer WN. 2008. Non-intercalative triterpenoid inhibitors of topoisomerase II: a

molecular docking study. The Open Bioactive Compounds Journal

1:13-17.

Siagian A. 2002. Bahan Tambahan Makanan. Medan: Universitas Sumatera

Utara.

Silva BP, Sousa AC, Silva GM, Mendes TP, Parente JP. 2002. A new bioactive

steroidal saponin from Agave attenuata. Z Naturforsch 57C:423-428.

Sukadana IM. 2009. Senyawa antibakteri golongan flavonoid dari buah belimbing

manis (Averrhoa carambola Linn.L). Jurnal Kimia 3(2):109-116.

Sulistiono. 2007. Keong mas, sumber pakan dan obat-obatan.

http://anekaplanta.wordpress.com/2007/12/26/keong-mas-sumber-

pakan-dan-obat-obatan/. [1 Desember 2009].

Suratmo. 2009. Potensi ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum) sebagai

antioksidan. http://fisika.brawijaya.ac.id/bss-ub/PDF%20FILES/BSS_

205_1.pdf. [21 Desember 2009].

Suryowinoto S. 2005. Mengenal beberapa senyawa pada tanaman yang berperan

sebagai antiaging. InfoPOM 6(3):7-11.

Suwignyo S, Widigdo B, Wardiatno Y, Krisanti M. 2005. Avertebrata Air.

Depok: Penebar Swadaya.

82

Syah YM, Achmad SA, Bakhtiar E, Hakim EH, Juliawaty LD, Latip J. 2006. Dua

flavonoid tergeranilasi dari daun sukun (Artocarpus altilis). Jurnal

Matematika dan Sains 11(3):100-104.

Trilaksani W. 2003. Antioksidan: jenis, sumber, mekanisme kerja dan peran

terhadap kesehatan [makalah]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut

Pertanian Bogor.

Usman H, Akbar RPS. 2008. Pengantar Statistika. Jakarta: PT Bumi Aksara.

Vattem DA, Shetty K. 2006. Biochemical Markers for Antioksidan Functionality.

Di dalam: Shetty K, Paliyath G, Pometto AL, Levin RE, editor.

Functional Foods and Biotechnology. Boca Raton: CRC Press. hlm

229-251.

Waji RA, Sugrani A. 2009. Makalah kimia organik bahan alam: flavonoid

(quercetin) [makalah]. Makasar: Program S2 Kimia, FMIPA,

Universitas Hasanuddin.

Walpole RE. 1997. Pengantar Statistik Ed. Ke-3. Sumantri B, penerjemah.

Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama. Terjemahan dari: Introduction to

Statistic 3rd

edition.

Wang SY. 2006. Fruits with High Antioxidant Activity as Functional Foods. Di

dalam: Shi J, editor. Functional Food Ingredients and Nutraceuticals:

Processing Technologies. Boca Raton: CRC Press. hlm 371-413.

Wiesman Z, Chapagain BP. 2003. Laboratory evaluation of natural saponin as a

bioactive agent against Aedes aegypti and Culex pipiens. Dengue

Bulletin 27:168-173.

Winarno FG. 2008. Kimia Pangan dan Gizi. Bogor: M-BRIO Press.

Yunizal, Murtini JT, Dolaria N, Purdiwoto B, Abdulrokhim, Carkipan. 1998.

Prosedur Analisis Kimiawi Ikan dan Produk Olahan Hasil-Hasil

Perikanan. Jakarta: Pusat Penelitian dan Pengembangan Perikanan.

83

LAMPIRAN

84

Lampiran 1. Lokasi pengambilan keong mas

Lampiran 2. Proses pengambilan keong mas dalam transek (1 x 1) m2

Pengukuran Suhu Perairan Pengumpulan Keong Mas

Lampiran 3. Cangkang, isi cangkang dan operkulum keong mas

Cangkang Isi Cangkang

85

Operkulum

Lampiran 4. Perhitungan rendemen keong mas

Berat total : 273 gram

Berat cangkang : 74 gram

Berat isi cangkang : 132 gram

Berat operkulum : 4 gram

a. % Rendemen cangkang = 74 gram

273 gram× 100 % = 27,10%

b. % Rendemen isi cangkang = 132 gram

273 gram× 100 % = 48,35%

c. % Rendemen operkulum = 4 gram

273 gram× 100 % = 1,46%

Lampiran 5. Perhitungan analisis proksimat keong mas

a. Kadar air

% Kadar air U1 = 1,1075 −0,2199 gram

1,1075 gram× 100% = 81,14%

% Kadar air U2 = 1,1141 −0,2089 gram

1,1141 gram× 100% = 81,25%

% Kadar air rata-rata = 81,14% + 81,25%

2= 81,19%

b. Kadar lemak

% Kadar lemak U1 = 0,0106 gram

2,0412 gram× 100% = 0,52%

% Kadar lemak U2 = 0,0103 gram

2,0524 gram× 100% = 0,50%

% Kadar lemak rata-rata = 0,52% + 0,50%

2= 0,51%

c. Kadar protein

% Kadar protein U1 = 19,25−0 ml ×0,09 N×14×6,25

586,500 mg ×2,5× 100% = 10,34%

86

% Kadar protein U2 = 12,70−0 ml ×0,09 N×14×6,25

390 mg ×2,5× 100% = 10,26%

% Kadar protein rata-rata = 10,34% + 10,26%

2= 10,30%

d. Kadar abu

% Kadar abu U1 = 0,210 gram

5,045 gram× 100% = 4,17%

% Kadar abu U2 = 0,200 gram

5,040 gram× 100% = 3,97%

% Kadar abu rata-rata = 4,16% + 3,97%

2= 4,07%

e. Kadar abu tidak larut asam

% Kadar abu tidak larut asam U1 = 0,015 gram

5,045 gram× 100% = 0,30%

% Kadar abu tidak larut asam U2 = 0,015 gram

5,040 gram× 100% = 0,30%

% Kadar abu tidak larut asam rata-rata = 0,30% + 0,30%

2= 0,30%

f. Kadar karbohidrat (by difference)

% Kadar karbohidrat = 100% - (81,19 + 0,51 + 10,30 + 4,07)%

= 3,93%

Lampiran 6. Data rendemen ekstrak kasar keong mas

Jenis

Pelarut Ulangan

Berat Sampel

Kering (g)

Berat Ekstrak

(g)

Rendemen

(%)

Rata-rata

(%)

Kloroform 1 25 0,414 1,66

1,63±0,04 2 25,02 0,400 1,60

Etil Asetat 1 25 0,074 0,30

0,79±0,69 2 25,02 0,320 1,28

Metanol 1 25 2,010 8,04

8,21±0,25 2 25,02 2,100 8,39

a. Ekstrak kloroform

% Rendemen ekstrak U1 = 0,414 gram

25 gram× 100% = 1,66%

% Rendemen ekstrak U2 = 0,400 gram

25,02 gram× 100% = 1,60%

% Rendemen rata-rata = 1,66%+1,60%

2= 1,63%

b. Ekstrak etil asetat

% Rendemen ekstrak U1 = 0,074 gram

25 gram× 100% = 0,30%

87

% Rendemen ekstrak U2 = 0,320 gram

25,02 gram× 100% = 1,28%

% Rendemen rata-rata = 0,30%+1,28%

2= 0,79%

c. Ekstrak metanol

% Rendemen ekstrak U1 = 2,010 gram

25 gram× 100% = 8,04%

% Rendemen ekstrak U2 = 2,100 gram

25,02 gram× 100% = 8,39%

% Rendemen rata-rata = 8,04%+8,39%

2= 8,21%

Lampiran 7. Perhitungan pembuatan larutan stok dan pengencerannya

a. DPPH 0,001 M sebanyak 50 ml (Mr = 394 g/mol)

Konsentrasi = berat DPPH

Mr×

1000

ml Volume

0,001 M = berat DPPH

394 g/mol×

1000

50 ml

berat DPPH = 0,001M ×394

g

mol ×50 ml

1000= 0,0197 g

DPPH sebanyak 0,0197 g dilarutkan dalam metanol p.a. hingga 50 ml.

b. Standar BHT 250 ppm sebanyak 50 ml

Stok BHT 250 ppm = 250 mg

1 L×

1 L

1000 mL× 50 mL

= 12,5 mg = 0,0125 g

BHT sebanyak 0,0125 g dilarutkan dalam metanol p.a. hingga 50 ml.

BHT 2 ppm = V1 × M1 = V2 × M2

= 10 ml × 2 ppm = V2 × 250 ppm

= 10 ml ×2 ppm

250 ppm= 0,08 ml

0,08 ml BHT 250 ppm ditambah metanol p.a. hingga 10 ml.

BHT 4 ppm = V1 × M1 = V2 × M2

= 10 ml × 4 ppm = V2 × 250 ppm

= 10 ml ×4 ppm

250 ppm= 0,16 ml

0,16 ml BHT 250 ppm ditambah metanol p.a. hingga 10 ml.

88

BHT 6 ppm = V1 × M1 = V2 × M2

= 10 ml × 6 ppm = V2 × 250 ppm

= 10 ml ×6 ppm

250 ppm= 0,24 ml

0,24 ml BHT 250 ppm ditambah metanol p.a. hingga 10 ml.

BHT 8 ppm = V1 × M1 = V2 × M2

= 10 ml × 8 ppm = V2 × 250 ppm

= 10 ml ×8 ppm

250 ppm= 0,32 ml

0,32 ml BHT 250 ppm ditambah metanol p.a. hingga 10 ml.

c. Larutan ekstrak 1000 ppm sebanyak 50 ml

Stok ekstrak 1000 ppm = 1000 mg

1 L×

1 L

1000 mL× 50 mL

= 50 mg = 0,05 g

Ekstrak sebanyak 0,05 g dilarutkan dalam metanol p.a. hingga 50 ml.

Ekstrak 200 ppm = V1 × M1 = V2 × M2

= 10 ml × 200 ppm = V2 × 1000 ppm

= 10 ml ×200 ppm

1000 ppm= 2 ml

2 ml ekstrak 1000 ppm ditambah metanol p.a. hingga 10 ml.

Ekstrak 400 ppm = V1 × M1 = V2 × M2

= 10 ml × 400 ppm = V2 × 1000 ppm

= 10 ml ×400 ppm

1000 ppm= 4 ml

4 ml ekstrak 1000 ppm ditambah metanol p.a. hingga 10 ml.

Ekstrak 600 ppm = V1 × M1 = V2 × M2

= 10 ml × 600 ppm = V2 × 1000 ppm

= 10 ml ×600 ppm

1000 ppm= 6 ml

6 ml ekstrak 1000 ppm ditambah metanol p.a. hingga 10 ml.

Ekstrak 800 ppm = V1 × M1 = V2 × M2

= 10 ml × 800 ppm = V2 × 1000 ppm

= 10 ml ×800 ppm

1000 ppm= 8 ml

8 ml ekstrak 1000 ppm ditambah metanol p.a. hingga 10 ml.

89

Lampiran 8. Perhitungan persen inhibisi dan IC50

a. Persen inhibisi dan IC50 pada BHT

Sampel Konsentrasi

(ppm) Absorbansi % Inhibisi Persamaan regresi linear IC50 (ppm)

Blanko 0 1,052

4,91 BHT

2 0,920 12,55

y = 14,32x – 20,34 4 0,803 23,67

6 0,217 79,37

8 0,111 89,45

1) Persen inhibisi

BHT 2 ppm = 1,052−0,920

1,052× 100% = 12,55%

BHT 4 ppm = 1,052−0,803

1,052× 100% = 23,67%

BHT 6 ppm = 1,052−0,217

1,052× 100% = 79,37%

BHT 8 ppm = 1,052−0,111

1,052× 100% = 89,45%

2) IC50

y = 14,32x – 20,34

50 = 14,32x – 20,34

70,34 = 14,32x

x = 4,91 ppm

IC50 untuk BHT adalah 4,91 ppm.

b. Persen inhibisi dan IC50 pada ekstrak kloroform keong mas

Sampel Konsentrasi

(ppm) Absorbansi

%

Inhibisi

Persamaan regresi

linear

IC50

(ppm)

Rataan

IC50

(ppm)

Blanko 0 1,052

2912,50

Kloroform

1

200 1,050 0,19

y = 0,018x – 2,425

3458,37

±

771,98

400 0,992 5,70

600 0,959 8,84

800 0,937 10,93

Kloroform

2

200 1,010 3,99

y = 0,012x + 1,945 4004,25 400 0,982 6,65

600 0,952 9,51

800 0,939 10,74

90

Ulangan 1

1) Persen inhibisi

200 ppm = 1,052−1,050

1,052× 100% = 0,19%

400 ppm = 1,052−0,992

1,052× 100% = 5,70%

600 ppm = 1,052−0,959

1,052× 100% = 8,84%

800 ppm = 1,052−0,937

1,052× 100% = 10,93%

2) IC50

y = 0,018x – 2,425

50 = 0,018x – 2,425

52,425 = 0,018x

x = 2912,50 ppm

IC50 untuk ekstrak kloroform ulangan 1 adalah 2912,50 ppm.

Ulangan 2

1) Persen inhibisi

200 ppm = 1,052−1,010

1,052× 100% = 3,99%

400 ppm = 1,052−0,982

1,052× 100% = 6,65%

600 ppm = 1,052−0,952

1,052× 100% = 9,51%

800 ppm = 1,052−0,939

1,052× 100% = 10,74%

2) IC50

y = 0,012x + 1,949

50 = 0,012x + 1,949

48,051 = 0,012x

x = 4004,25 ppm

IC50 untuk ekstrak kloroform ulangan 2 adalah 4004,25 ppm.

c. Persen inhibisi dan IC50 pada ekstrak etil asetat keong mas

Sampel Konsentrasi

(ppm) Absorbansi

%

Inhibisi

Persamaan regresi

linear

IC50

(ppm)

Rataan

IC50

(ppm)

Blanko 0 1,052

1547,47

Etil Asetat

1

200 0,999 5,04

y = 0,034x – 2,614

1662,36

±

162,48

400 0,949 9,79

600 0,871 17,20

800 0,788 25,09

Etil Asetat

2

200 0,975 7,32

y = 0,028x + 0,237 1777,25 400 0,941 10,55

600 0,898 14,64

800 0,792 24,71

91

Ulangan 1

1) Persen inhibisi

200 ppm = 1,052−0,999

1,052× 100% = 5,04%

400 ppm = 1,052−0,949

1,052× 100% = 9,79%

600 ppm = 1,052−0,871

1,052× 100% = 17,20%

800 ppm = 1,052−0,788

1,052× 100% = 25,09%

2) IC50

y = 0,034x – 2,614

50 = 0,034x – 2,614

52,61 = 0,034x

x = 1547,47 ppm

IC50 untuk ekstrak etil asetat ulangan 1 adalah 1547,47 ppm.

Ulangan 2

1) Persen inhibisi

200 ppm = 1,052−0,975

1,052× 100% = 7,32%

400 ppm = 1,052−0,941

1,052× 100% = 10,55%

600 ppm = 1,052−0,898

1,052× 100% = 14,64%

800 ppm = 1,052−0,792

1,052× 100% = 24,71%

2) IC50

y = 0,028x + 0,237

50 = 0,028x + 0,237

49,763 = 0,028x

x = 1777,25 ppm

IC50 untuk ekstrak etil asetat ulangan 2 adalah 1777,25 ppm.

d. Persen inhibisi dan IC50 pada ekstrak metanol keong mas

Sampel Konsentrasi

(ppm) Absorbansi

%

Inhibisi

Persamaan regresi

linear

IC50

(ppm)

Rataan

IC50

(ppm)

Blanko 0 1,052

1222,33

Metanol 1

200 1,045 0,66

y = 0,046x – 6,227

1270,47

±

68,08

400 0,908 13,69

600 0,795 24,43

800 0,763 27,47

Metanol 2

200 0,986 6,27

y = 0,039x – 1,426 1318,61 400 0,918 12,74

600 0,781 25,76

800 0,756 28,14

92

Ulangan 1

1) Persen inhibisi

200 ppm = 1,052−1,045

1,052× 100% = 0,66%

400 ppm = 1,052−0,908

1,052× 100% = 13,69%

600 ppm = 1,052−0,795

1,052× 100% = 24,43%

800 ppm = 1,052−0,763

1,052× 100% = 27,47%

2) IC50

y = 0,046x – 6,227

50 = 0,046x – 6,227

56,227 = 0,046x

x = 1222,33 ppm

IC50 untuk ekstrak metanol ulangan 1 adalah 1222,33 ppm.

Ulangan 2

1) Persen inhibisi

200 ppm = 1,052−0,986

1,052× 100% = 6,27%

400 ppm = 1,052−0,918

1,052× 100% = 12,74%

600 ppm = 1,052−0,781

1,052× 100% = 25,76%

800 ppm = 1,052−0,756

1,052× 100% = 28,14%

2) IC50

y = 0,039x – 1,426

50 = 0,039x – 1,426

51,426 = 0,039x

x = 1318,61 ppm

IC50 untuk ekstrak metanol ulangan 2 adalah 1318,61 ppm.

Lampiran 9. Gambar hasil uji fitokimia ekstrak keong mas

a. Ekstrak kloroform

93

b. Ekstrak etil asetat

c. Ekstrak metanol

Lampiran 10. Gambar-gambar selama proses ekstraksi

Proses maserasi sampel kering Proses pengadukan dengan orbital shaker

Proses filtrasi hasil maserasi Filtrat hasil filtrasi

94

Rotary vacuum evaporator Vacuum pump

Proses evaporasi filtrat Ekstrak pekat hasil evaporasi