aktivitas antikanker pada bakteri endofit dari daun pepaya

ISOLASI BAKTERI ENDOFIT DAN UJI AKTIVITAS ANTIKANKER

DARI DAUN PEPAYA (Carica papaya L) TERHADAP

SEL KANKER PAYUDARA T47D

OUTLINE PENELITIAN TUGAS RISET

Disusun oleh :

Qisthy Hanifati Hazrina

NIM 24030111130066

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA

UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG

November, 2014

HALAMAN PENGESAHAN OUTLINE PENELITIAN

1. a. Judul Penelitian

b. Bidang Ilmu

:

:

Isolasi Bakteri Endofit dan Uji Aktivitas

Antikanker dari Daun Pepaya (Carica Papaya L)

terhadap Sel Kanker Payudara T47D

Biokimia2. Pelaksana Penelitian

a. Nama Lengkapb. Jenis Kelaminc. NIMd. Fakultas/Jurusan

::::

Qisthy Hanifati HazrinaPerempuan24030111130066Sains dan Matematika/Kimia

3. Lokasi Penelitian : Laboratorium Terpadu4. Lama Penelitian : 6 Bulan5. Tanggal Seminar : 28 November 2014

Semarang, 15 Desember 2014 Menyetujui,

Pembimbing I

Purbowatiningrum Ria S . , M.Si NIP 197303141999032002

Pembimbing II,

Dra. Nies S. Mulyani, M.SNIP 195705181986022001

Mengetahui,Koordinator TR Jurusan,

Didik Set i yo Widodo, M.Si NIP 197005211999031001

Kepala Laboratorium,

Dra. Wuryanti, M.SiNIP 195705111987032001

I. PENDAHULUAN

1.1. Latar belakang

Setiap tahun terdapat 100 penderita kanker baru dari 100.000 penduduk di

Indonesia. Kanker merupakan segolongan penyakit yang ditandai dengan

pembelahan sel yang tidak terkendali dan kemampuan sel-sel tersebut untuk

menyerang jaringan biologis lainnya yang bersebelahan (invasi) atau dengan

migrasi sel ke tempat yang jauh (metastasis) (Krishna dan Hayasi, 2000).

Manajemen kanker umumnya menggabungkan pembedahan dan radiasi dengan

pengobatan kemoterapi (Katzung,1995).

Tumbuh-tumbuhan merupakan salah satu sumber obat-obatan kemoterapi

yang potensial. Banyak tanaman Indonesia yang saat ini telah digunakan secara

luas untuk berbagai tujuan pengobatan, selain dikonsumsi sebagai sayur. Salah

satunya adalah daun pepaya (Carica papaya L) yang termasuk ke dalam suku

Caricaceae dan marga Carica. Ekstrak akuades dari daun pepaya menunjukkan

kemampuan aktivitas antikanker dan menghambat perkembangbiakan sel pada

kanker (Moritomo, 2008). Daun pepaya mengandung metabolit sekunder jenis

alkaloid, pseudokarpen kolin, karposida, dan dehidrokarpen (Sheikh dan

Krishnamurthy, 2013). Penelitian Sukardiman 2000 menunjukkan bahwa ekstrak

metanol daun pepaya (Carica papaya L) memiliki aktivitas inhibisi terhadap

enzim DNA Topoisomerase II, yaitu suatu enzim yang berperan penting dalam

proses replikasi, transkripsi, rekombinasi DNA, dan poliferasi dari sel kanker.

Meningkatnya jumlah dan aktivitas enzim tersebut pada sel kanker maka proses

replikasi, transkripsi, dan poliferasi sel kanker juga meningkat, kemudian

menghambat aktivitas enzim tersebut menyebabkan ikatan antara enzim dengan

DNA semakin lama sehingga terjadi Protein Linked DNA Brake (PLDB) dan

kematian secara apoptosis (Hsiag, 1998; Cotran, 1998).

Metabolit sekunder alkaloid dapat di isolasi dari tumbuhan maupun

mikroba endofit yang bersimbiosis dengan tumbuhan pepaya (Dian dkk, 2006).

Mikroba endofit adalah mikroba yang hidup dalam jaringan tanaman, diantara sel

tumbuhan dan bersimbiosis mutualisme dengan inangnya (Kumala dkk, 2006).

Kemampuan mikroba endofit memproduksi senyawa metabolit sekunder sesuai

dengan tanaman inangnya merupakan peluang besar yang dapat diandalkan untuk

memproduksi metabolit sekunder skala besar. Pemanfaatan mikroba endofit

dalam memproduksi senyawa aktif memiliki beberapa kelebihan, antara lain (1)

lebih cepat menghasilkan senyawa dengan mutu yang seragam, (2) dapat

diproduksi dalam skala besar dan (3) kemungkinan diperoleh komponen bioaktif

baru dengan memberikan kondisi yang berbeda (Stierle et al, 1995). Penelitian ini

diharapkan dapat memperoleh data aktivitas antikanker dari metabolit sekunder

yang dihasilkan bakteri endofit asal daun pepaya (Carica papaya L) terhadap

kanker payudara T47D.

1.2. Keaslian Penelitian

Beberapa peneliti sebelumnya telah melakukan uji aktivitas antikanker

dari daun pepaya (Carica Papaya L) diantaranya penelitian yang dilakukan oleh

Sukardiman pada tahun 2006 menguji ekstrak kloroform daun pepaya (Carica

Papaya L) menunjukkan bahwa ekstrak tersebut memiliki aktivitas antikanker

terhadap sel mieloma (Sukardiman, 2006).

Perbedaan penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah ekstrak

yang diuji menggunakan metabolit sekunder dari isolat bakteri endofit yang di

isolasi dari daun pepaya, dilanjutkan menguji aktivitas antikankernya terhadap sel

kanker payudara T47D.

II. Perumusan Masalah

Carica Papaya L merupakan tanaman yang memiliki banyak kegunaan.

Sukardiman et al, 2006 meneliti bahwa ekstrak kloroform daun pepaya

mempunyai aktivitas antikanker terhadap sel kanker mieloma. Oleh karena itu

pada penelitian ini akan dilakukan pengujian aktivitas antikanker menggunakan

metabolit sekunder dari isolat bakteri endofit yang di isolasi dari daun pepaya

(Carica Papaya L) terhadap sel kanker payudara T47D.

III. Tujuan Penelitian

III.1. Memperoleh isolat bakteri endofit yang bersimbiosis dengan tanaman

pepaya (Carica Papaya L).

III.2.Memperoleh metabolit sekunder dari isolat bakteri endofit.

III.3.Memperoleh data kualitatif penapisan fitokimia senyawa metabolit sekunder

hasil produksi bakteri endofit daun pepaya (Carica Papaya L).

III.4.Memperoleh data aktivitas antikanker dari metabolit sekunder hasil produksi

bakteri endofit daun pepaya (Carica Papaya L) terhadap sel kanker

payudara T47D melalui melalui metode apoptosis (Staining Double).

IV.Metode Penelitian

Pada penelitian ini bahan yang dibutuhkan adalah sampel daun pepaya

(Carica Papaya L). Media miikrobiologi yang digunakan adalah media PDA

(Potato Dextrose Agar). Bahan sterilisasi yang digunakan adalah alkohol 70% dan

Kaporit teknis. Pewarna gram yang digunakan adalah kristal violet, lugol, iodin,

alkohol aseton, safranin. Reagen dan bahan kimia untuk uji fitokimia yang

digunakan adalah amonia 25%, kloroform, asam klorida, amil-alkohol, natrium

hidroksida, FeCl 1%, eter, asam sulfat, asam asetat anhidrat, reagen dragendorff,

pereaksi mayer, serbuk Mg. Bahan yang digunakan untuk uji BSLT adalah telur

udang, air laut, DMSO. Bahan yang digunakan untuk uji aktivitas antikanker

adalah larutan baku sel kanker payudara T47D, MK (DMEM/RPMI), PBS, tripsin

EDTA dan DMSO.

Alat yang digunakan adalah sumuran-24, inkubator, shaker, inkas,

Spektrofotometer UV, sentrifuge, autoklaf dan alat-alat standar laboratorium.

Tahapan yang dilakukan pada penelitian ini yaitu, antara lain

Preparasi dan Sterilisasi Sampel : Sampel disterilisasi permukaannya dengan

cara direndam dalam akuades steril, alkohol 70%, dicuci dengan akuades steril

kemudian direndam dalam CaOCl 5,25% dan dibilas dengan akuades steril. Daun

pepaya yang telah steril kemudian ditumbuk untuk mendapatkan ekstraknya.

Isolasi Bakteri Endofit : Ekstrak daun pepaya ditanam pada permukaan media

PDA secara aseptik dan diiinkubasi pada suhu ruang selama tiga hari. Koloni

bakteri yang umbuh kemudian dipisahkan menurut kenampakan morfologisnya

dengan pewarnaan gram.

Pewarnaan Gram : Isolat bakteri endofit di suspensi ke dalam akuades steril,

dioleskan pada kaca steril dan ditetesi pewarana kristal violet, lugol iodin, alkohol

aseton dan safranin. Isolat bakteri yang telah dipisahkan selanjutnya di ukur

pertumbuhannya untuk menentukann waktu panennya.

Pembuatan Kurva Pertumbuhan : Isolat bakteri di inokulasi ke dalam akuades

steril, kemudian dipindahkan dalam Nutrient Brooth (NB), dibagi ke dalam

beberapa botol vial dan disimpan dalam inkubator suhu kamar. Jumlah sel bakteri

dihitung setiap beberapa jam per satu botol vial dengan mengamati kekeruhannya

menggunakan alat spektrofotometer. Jumlah sel kemudian dibuat kurva

pertumbuhan bakteri untuk dipanen pada saat fase akhir stasionernya.

Produksi Metabolit Sekunder : Isolat bakteri endofit diinokulasi pada Nutrient

Brooth (NB) dan di vibrate incubation pada suhu ruang dengan kecepatan 75 rpm

selama 7 hari. Setelah didapatkan kultur isolat bakteri endofit, di sentrifuge pada

suhu 40C selama 15 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Setelah didapatkan

supernatan, di freeze dry dan diperoleh metabolit sekunder padat.

Penapisan Fitokimia : Uji kualitatif senyawa Alkaloid, Saponin, Flavonoid,

Kuinon, Tanin dan Steroid/Triterpenoid dilakukan sesuai prosedur di

Laboratorium Terpadu Undip.

Uji BSLT : Metode yang digunakan adalah metode Meyer. Air laut dituangkan

dalam plat, kemudian dimasukkan telur udang dan diletakkan dibawah lampu UV.

Setelah 48 jam telur menetas menjadi larva. Larva dimasukkan ke dalam larutan

baku sampel dan ditentukan konsentrasi letalitas terbaiknya. Ekstrak aktif dengan

nilai LC50 terbaik siap digunakan untuk uji antikanker.

Uji Aktivitas Antikanker : Kultur sel hasil pembiakan di panen kemudian di

inkubasi dalam sumuran-24. Sel yang tertanam dalam sumuran di cuci dengan

PBS dan dimasukkan sampel stok metabolit sekunder dengan beberapa variasi

konsentrasi, penambahan media, DMSO, dan diinkubasi pada suhu ruang. Setelah

10 jam, sel dicuci dengan PBS pada masing-masing cover slip dan ditetesi etidium

bromida-etidin orange. Pengamatan dilakukan dibawah mikroskop dengan uji

positif sel kanker berwarna hijau dan sel apoptosis berwarna orange.

V.DAFTAR PUSTAKA

Cotran RS, Kumar V, Collin T. 1999. Neoplasia in Robbins Pathologic Basic of

Disease, Sixth Edition, Philadelphia : W.B.Saunders Company, pp 260-

325.

Dian, N., Ruth, M., Apridah, C., Harmastini, S., 2006. Pengkajian Bakteri Endofit

Penghasil Senyawa Bioaktif untuk Proteksi Tanaman. Biodiversitas. Vol.

7, No. 3. Hal 221-224.

Hsiang, Y.H. 1989. Arrest of Replication Fork by Drug-stabilized Topoisomerase

I-DNA Cleavable Complexes as a Mechanism of Cell Killing by

Campthothecin, Cancer Research, 49, 5077-5082.

Katzung, B.G., 1995. Basic and Clinical Pharmacology, 7th edition, Prentice Hall

International, pp. 881.

Krishna, G., Hayasi, M., 2000. In Vivo Rodent Micronucleus Assay : Protocol,

Conduct and Data Interpretation. Journal of Elsevier Science. Vol. 455.

Pages 155-166.

Kumala, S., Utji R., Sudarmono P., Kardono L., B.S., 2006. Isolation of

Endophye from Brucea Javanica L (Merr) and Cytotoxic Evaluation of

their n-butanol from Fermentation Broth. Pakistan Journal of Biologycal

Science Vol. 9, No.5, 825-832.

Moritomo, C., Dang, N. H., Dang, N., 2008. Cancer Prevention and Treating

Composition for Preventing, Ameliorating, or Treating Solid Cancers, e.g.

Lung, or Blood ancer, e.g. Lymphoma, Comprises Components Extracted

from Brewing Papaya, YS Therapeutic Co Ltd .

Sukardiman, Poernomo H., 2000. Penapisan Senyawa Antikanker dari Tanaman

Obat Indonesia dengan Molekul Target Enzim Topoisomerase, Penelitian

DCRG, Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Surabaya.

Sukardiman, Wiwied, E., Putri, P., 2006. Aktivitas Antikanker dan Induksi Fraksi

Kloroform Daun Pepaya (Carica Papaya L) terhadap Kultur Sel Kanker

Mieloma. Media Kedokteran hewan. Fakultas Farmasi Universitas

Airlangga, Surabaya, Vol.22, No.2.

Tietze, H.W., 2002. Terapi Pepaya, PT. Prestasi Pustaka Raya, Jakarta.

- Penanaman pada media padat PDA- Inkubasi 3 hari pada suhu ruang dan pengamatan

- Inokulasi pada media padat PBA- Inkubasi 8 hari pada suhu ruang dan pengamatan

- Pemisahan koloni berdasarkan kenampakan fisik- Pemisahan koloni berdasarkan kenampakan fisik- Pemisahan koloni berdasarkan kenampakan fisik- Pemisahan koloni berdasarkan kenampakan fisik- Pemisahan koloni berdasarkan kenampakan fisik- Pemisahan koloni berdasarkan kenampakan fisik- Pemisahan koloni berdasarkan kenampakan morfologis

- Inokulasi pada media padat PBA- Inkubasi 8 hari pada suhu ruang dan pengamatan- Inokulasi pada media padat PBA- Inkubasi 8 hari pada suhu ruang dan pengamatan- Inokulasi pada media padat PBA- Inkubasi 8 hari pada suhu ruang dan pengamatan- Inokulasi pada media padat PBA- Inkubasi 8 hari pada suhu ruang dan pengamatan- Inokulasi pada media padat PBA- Inkubasi 8 hari pada suhu ruang dan pengamatan

- Penggerusan dengan mortar aseptik- Penambahan akuades steril 1 ml- Penggerusan sampai halus

- Pencucian dengan akuades steril- Perendaman dalam alkohol 70% selama 1 menit- Pembilasan dengan akuades steril- Perendaman dengan CaOCl 5,25% selama 5 menit- Pembilasan dengan akuades steril- Perendaman dalam alkohol 70% selama 1 menit- Pembilasan dengan akuades steril

LAMPIRAN

Skema Penelitian

5.1. Preparasi dan Sterilisasi Sampel

5.2. Isolasi Endofit

Daun Pepaya

Sampel daun pepaya steril

Endapan Filtrat (ekstrak)

Isolat bakteri Endofit tunggal

Koloni Endofit

Ekstrak daun pepaya

- Pengamatan melalui mikroskop dengan perbesaran 1000x

- Pencucian zat warna berlebih dengan air mengalir- Pengeringan- Penambahan safranin- Pendiaman 2 menit

- Pencucian zat warna berlebih dengan air mengalir- Pengeringan





- Pencucian zat warna berlebih dengan air mengalir- Pengeringan- Pencucian isolat dengan alkohol aseton - Pendiaman 30 detik

- Pencucian zat warna berlebih dengan air mengalir- Pengeringan- Penambahan 2-3 tetes pewarna iodin dan pendiaman 1

menit

- Pensuspensian pada akuades steril- Pengolesan pada kaca preparat- Penambahan 2-3 tetes pewarna kristal violet dan

pendiaman 1 menit

5.3. Pewarnaan Gram Isolat

Perubahan warna isolat (ungu)

Isolat Bakteri Endofit tunggal

Perubahan warna isolat (ungu)

Perubahan warna (-) bening (+) ungu

Perubahan warna (-) merah (+) ungu

Preparat

Penampakan mikroskopik isolat

Bakteri gram negatif (Merah)

Bakteri gram positif(Ungu)

- Penanaman pada media cair NB- Penginkubasian pada suhu ruang dengan shaker

kecepatan 75 rpm selama 2 hari

- Pengukuran absorbansi pada panjang gelombang maksimum setiap 2 hingga 4 jam selama 48 jam

- Penginokulasian pada media cair- Penginkubasian dengan inkubator shaker pada

kecepatan 75 rpm selama 7 hari pada suhu 30oC

- Sentrifugasi 4000 rpm pada 4oC selama 15 menit- Pengukuran panjang gelombang maksimum

- Pengeringan dengan freeze dryer

5.4. Kurva Pertumbuhan Endofit

5.5. Produksi Metabolit sekunder

Data Kurva Pertumbuhan

Isolat Endofit Tunggal

Media PDA

Ekstrak kasar

Isolat Endofit Tunggal

Tabung reaksi

Endapan Filtrat

Padatan metabolit sekunder

Isolat endofit tunggal

- Pelembaban dengan 5 ml NH3 25%- Penggerusan- Penambahan 20 ml Kloroform- Penggerusan- Penyaringan

- Pengekstrasian dengan HCl 2N sebanyak 2 kali

- Penambahan reagen Dragendorff

- Penambahan pereaksi Mayer

- Pendidihan dalam 100 ml air selama 5 menit- Penyaringan dalam air panas

- Pengocokan- Pengamatan busa- Penambahan 1 tetes HCl 2N

5.6. Penapisan Fitokimia Metabolit Sekunder

5.6.1. Uji Alkaloid

5.6.2. Uji Saponin

Endapan 10 ml Filtrat

Lapisan HCl Lapisan Kloroform

5 ml Lapisan HCl

Tabung reaksi

5 ml Lapisan HCl

Tabung reaksi

Perubahan warna (merah bata) Perubahan warna (putih)

Padatan Metabolit Sekunder

Tabung reaksi

Endapan 10 ml Filtrat


Mortar

Sampel Busa

- Penambahan NaOH 1M

- Pendidihan dalam 10 ml air selama 5 menit- Pendinginan dan penyaringan

- Penambahan serbuk Mg- Penambahan 1 mL HCl pekat dan 2 ml amilalkohol- Pengocokan kuat- Pendiaman- Pengamatan

- Pendidihan dalam 10 ml air selama 5 menit- Pendinginan dan penyaringan

- Penambahan FeCl3 1%

5.6.3. Uji Flavonoid

5.6.4. Uji Tanin

5.6.5. Uji Kuinon

Perubahan warna (merah)

5 ml filtrat dari saponin

Tabung reaksi


Tabung reaksi

Endapan Filtrat

Perubahan warna (hijau kehitaman)


Tabung reaksi

Endapan Filtrat

Perubahan warna (merah)

- Penambahan 10 butir telur udang- Peletakkan di bawah lampu UV- Pendiaman 48 jam - Pengamatan

- Pengenceran konsentrasi 20, 10 dan 2 g/mL

- Penambahan DMSO- Pendiaman 48 jam - Pengamatan

- Perubahan konsentrasi menjadi 10, 5 dan 1 g/mL

- Inkubasi 24 jam dan pengamatan

- Perhitungan LC50

- Perubahan konsentrasi menjadi 10, 5 dan 1 g/mL

- Inkubasi 24 jam dan pengamatan

5.6.6.Uji Triterpenoid/Steroid

5.7. Uji BSLT

Larva Udang

Metabolit Sekunder

Metanol

Larutan Uji

Larva dan metabolit sekunder

Botol Vial

Larva Mati dan Hidup

Nilai LC50

100 mL Air Laut

Plat

- Maserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam - Penyaringan

Endapan5 mL Filtrat

Steroid membentuk warna (ungu-biru)


- Penguapan hingga kering

Endapan

Triterpenoid membentuk warna (merah)

- Penambahan 2 tetes CH3COOH anhidrat - Penambahan 1 tetes H2SO4 - Pengamatan warna

- Penambahan 50ml DMSO- Pengocokan dengan vortex mixer

- Pengenceran bertingkat hingga mendapatkan satu seri larutan uji dengan konsentrasi 25, 50, 100, 15, 200 dan 300 mg/ml

- Penambahan tripsin EDTA dan inkubasi 3 menit- Penambahan media- Pemindahan ke plat cover slip

- Perhitungan sel dengan mikroskop cahaya - Penambahan media- Pemindahan ke Conical

- Pemindahan sel ke atas cover slip secara merata ke dalam sumuran

- Inkubasi 30 menit- Penambahan MK / RPMI ke dalam sumuran

5.8. Uji Aktivitas Antikanker

5.8.1. Pembuatan Larutan Stok

5.8.2. Preparasi sel kanker payudara T47D

Isolat homogen

5 mg ekstrak kasar

Eppendorf

Isolat homogenIsolat homogen

Larutan stok

Isolat homogen

Sel kanker payudara T47D

Tabung reaksi


Tabung reaksi

Sel kanker terpanen

Plat cover slip

Sel tertanam pada cover slip

Sel kanker terpanen

Conical


Tabung reaksi


Tabung reaksi

- Pembuangan MK dari sumuran- Pencucian dengan PBS- Pemasukan larutan stok sampel- Pemasukan kontrol media DMSO- Inkubasi pada inkubator 5% CO2 selama 10 jam pada

suhu 37oC dan pH 7,4 – 7,7- Panen sel

- Pembuangan MK dari sumuran- Pencucian dengan PBS- Pengangkatan cover slip- Penetesan etidiumbromida-etidin orange- Pengamatan mikroskop

5.8.3. Pengamatan aktivitas antikanker dengan metode staining double

Apoptisis sel kanker

Sel tertanam

Cover slip sumuran

Apoptisis sel kanker

Perubahan warna hijau menjadi orange

aktivitas antikanker pada bakteri endofit dari daun pepaya

Documents