ACARA I STRELISASI ALAT, PEMBUATAN LARUTAN STOCK DAN PEMBUATAN MEDIA A. Pendahuluan 1. Latar Belakang. Kultur jaringan bila diartikan ke dalam bahasa Jerman disebut Gewebe kultur atau tissue culture (Inggris) atau weefsel kweek atau weefsel cultuur (Belanda). Kultur jaringan atau budidaya In vitro adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, jaringan atau organ yang serba steril, ditumbuhkan pada media buatan yang steril, dalam botol kultur yang steril dan dalam kondisi yang aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap. Media tumbuh untuk eksplan berisi kualitatif komponen bahan kimia yang hampir sama, hanya agak berbeda dalam besarnya kadar untuk tiap-tiap persenyawaan. Media dasar yang sering digunakan dalam kultur jaringan Anthurium sendiri adalah media MS dan modifikasinya. Pada umumnya komposisi utama media tanam kultur jaringan, terdiri dari hormon (zat pengatur tumbuh) dan sejumlah unsur yang biasanya terdapat di dalam tanah yang dikelompokkan ke dalam unsur makro, 1
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
ACARA I
STRELISASI ALAT, PEMBUATAN LARUTAN STOCK DAN
PEMBUATAN MEDIA
A. Pendahuluan
1. Latar Belakang.
Kultur jaringan bila diartikan ke dalam bahasa Jerman disebut
Gewebe kultur atau tissue culture (Inggris) atau weefsel kweek atau
weefsel cultuur (Belanda). Kultur jaringan atau budidaya In vitro adalah
suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma,
sel, jaringan atau organ yang serba steril, ditumbuhkan pada media buatan
yang steril, dalam botol kultur yang steril dan dalam kondisi yang aseptik,
sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan
beregenerasi menjadi tanaman lengkap.
Media tumbuh untuk eksplan berisi kualitatif komponen bahan
kimia yang hampir sama, hanya agak berbeda dalam besarnya kadar untuk
tiap-tiap persenyawaan. Media dasar yang sering digunakan dalam kultur
jaringan Anthurium sendiri adalah media MS dan modifikasinya. Pada
umumnya komposisi utama media tanam kultur jaringan, terdiri dari
hormon (zat pengatur tumbuh) dan sejumlah unsur yang biasanya terdapat
di dalam tanah yang dikelompokkan ke dalam unsur makro, unsur mikro.
Hasil yang lebih baik akan dapat kita peroleh bila, kedalam media
tersebut, ditambahkan vitamin, asam amino, dan hormon, bahan pemadat
media (agar), glukosa dalam bentuk gula maupun sukrosa, air destilata
(akuades), dan bahan organik tambahan
Larutan stok adalah larutan yang konsentrasinya dipekatkan dari
konsentrasi dalam media. Kepekatan tersebut biasanya dinyatakan dalam
kelipatan konsentrasi media, misalnya 10x, 20x, 100x, bahkan 1000x dari
konsentrasi media. Tujuan dibuatnya larutan stok adalah untuk
menghindari penimbangan atau penakaran yang berulang-ulang setiap kali
membuat media tanam bagi eksplan. Selain itu, kadang kali timbangan
1
2
untuk menimbang bahan-bahan dalam jumlah yang sangat kecil tidak
tersedia di laboratorium. Larutan stok sebaiknya disimpan di tempat yang
bersuhu rendah dan gelap.
2. Tujuan
Tujuan dari praktikum acara 1 mengenai Sterilisasi alat, Pembuatan
Larutan Stock, dan Pembuatan Media adalah :
a. Mengetahui metode dan macam strelisasi dalam kultur jaringan yang
meliputi sterilisasi alat, ruang dan eksplan.
b. Mengetahui prosedur sterilisasi alat-alat penanaman (diseksi) dan alat
kaca seperti botol kultur, petridish,erlemayer dan lain-lain.
c. Mengetahui langka-langkah dalam pembuatan media kultur jaringan
terutama dalam pembuatan stock makro nutrien, mikro nutrien, larutan
buffer (Fe-EDTA), vitamin dan Zat Pengatur Tumbuh (ZPT).
3. Waktu dan Tempat Praktikum.
Praktikum kultur jaringan acara 1 mengenai Sterilisasi Alat,
Pembuatan Larutan Stock, dan Pembuatan Media di lakukan pada hari
Senin tanggal 20 dan 27 April 2015 pukul 13.30-15.30 bertempat di
Laboratorium Fisiologi Tumbuhan dan Bioteknologi, Fakultas Pertanian,
Universitas Sebelas Maret, Surakarta.
3
B. Tinjauan Pustaka
Media tumbuh kultur jaringan sangat besar pengaruhnya terhadap
pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang dihasilkannya.
Macam-macam media kultur jaringan telah ditemukan seingga jumlanya
cukup banyak. Nama-nama media tumbuh untuk eksplan ini biasanya sesuai
dengan nama penemunya. Media tumbuh untuk eksplan berisi kualitatif
komponen bahan kimia yang hampir sama, hanya agak berbeda dalam
besarnya kadar untuk tiap-tiap persenyawaan (Daisy 2012).
Larutan stok adalah larutan dengan konsentrasi yang lebih pekat
dibandingkan dengan konsentrasi yang seharusnya. Jika ingin memakainya
tinggal mengambil larutan stok tersebut untuk diencerkan sesuai dengan
formula media kultur. Semua unsur hara, vitamin, hormon, dan gula
dimasukkan ke dalam gelas piala yang bervolume dua liter, lalu ditambahkan
air sampai volume satu liter dan diaduk sampai semua bahan larut
(Edi Sandra 2006)
Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbayakan tanaman
dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan
yang dilakukan di tempat steril. Metode kultur jaringan dikembangkan untuk
membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit
dikembangbiakkan secara generatif. Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan
mempunyai beberapa keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik
dengan induknya, dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga tidak
terlalu membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan
jumlah besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih
terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan
perbanyakan konvensional (Smallcrab 2013)
Alat-alat yang digunakan harus bersih dan steril. Alat yang disteril
adalah pinset, batang skapel, petridish , dan botol kosong untuk media. Alat-
alat tersebut terlebih dahulu dibungkus dengan kertas, baru dimasukkan ke
dalam autoclave dengan suhu 121°C pada tekanan 17,50 psi. Bunsen
4
digunakan untuk mensterilisasi alat pada saat penanaman eksplan. Alat -alat
yang telah disterilisasi disimpan dalam oven (Erlina Setiawati 2003).
Media dikelompokkan menjadi beberapa stok dengan kode sebagai
berikut: (A) nitratos (NH4NO3 41,25 g dan KNO3 47,5 g); (B) sulfatos
, Eosin Methylene Blue Agar (EMBA) (Muhammad Irvan 2013).
komposisi utama media tanam kultur jaringan terdiri dari
komponen berikut: (1) air distilata (akuades) atau air bebas ion sebagai
pelarut atau solven, (2) hara-hara makro dan mikro, (3) gula (umumnya
sukrosa) sebagai sumber energi, (4) vitamin, asam amino dan bahan
organic lain, (5) zat pengatur tumbuh, (6) suplemen berupa bahan-bahan
alami, jika diperlukan dan (7) agar-agar atau gelrite sebagai pemadat
media. Perbedaan komposisi media dapat mengakibatkan perbedaan
13
pertumbuhan dan perkembangan eksplan yang ditumbuhkan secara in vitro
(Endang Yuniastuti 2012).
Keberasilan suatu media agar adalah pembuatan media berada di
ruangan yang tertutup / tidak langsung berhubungan dengan lingkungan
terbuka. Alasan tersebut dilakukan agar media tidak terkontaminasi oleh
bakteri dan jamur dari lingkungan sekitar. Suhu yang digunakan untuk
pembuatan media yang paling cocok adalah suhu ruangan yaitu 30ºC. pH
merupakan faktor yang sangat mempengaruhi suatu keberhasilan dalam
pembuatan medium sehingga kondisi pH yang terlalu basa atau terlalu
asam tidak cocok untuk dijadikan medium mikroba karena mikroba tidak
dapat hidup pada kondisi tersebut. Medium didiamkan atau disimpan
selama 2 x 24 jam untuk menyakinkan bahwa medium masih steril, karena
selain pH sebagai penentu tumbuhnya mikroba, alat dan medium yang
steril juga menentukan. Sel-sel tanaman yang dikembangkan dengan
teknik kultur jaringan mempunyai toleransi pH yang relatif sempit dengan
titik optimal antara pH 5,0 – 6,0.
Keberhasilan pembuatan media yang dibuat pada saat praktikum
dipengaruhi oleh pH yang digunakan yaitu 5,8. Sterilisasi alat yang
digunakan untuk membuat media juga sangat berpengaruh dalam
keberhasilan pembuatan media. Alat yang tidak steril akan mengakibatkan
terjadinya kontaminasi media yang mengakibatkan kegagalan baik dalam
pembuatan media maupun saat mengkultur tanaman. Media yang dibuat
tidak terlalu lembek / cair. Media yang dibuat terlalu cair akan
mengakibatkan sulitnya dalam menanan eksplan. Kegagalan dalam
pembuatan media dapat dipengaruhi oleh banyaknya komposisi media
yang digunakan, adanya kontaminasi dari ruangan, alat yang tidak steril
dan sterilisasi dalam autoklaf tidak berlangsung lama.
Sterilisasi berarti proses pemusnahan bakteri dengan cara
membunuh mikroorganisme. Dalam kegiatan penelitian mikroba,
digunakan alat dan medium yang steril, maka sterilisasi ini adalah usaha
untuk membebaskan alat atau bahan-bahan dari segala macam kehidupan
14
atau kontaminasi oleh mikroba. Sterilisasi ini dapat dilakukan dengan
langkah-langkah sebagai berikut :
a. Sterilisasi Alat-Alat Penanam.
Alat-alat tanam yang disterilisasi meliputi : Pinset, scapel,
Petridish, Botol-botol kultur. Sterilisasi pada alat tanam dilakukan
dengan sterilisasi fisik melalui pemanasan maupun sterilisasi mekanik
dan kimawi. Sterilisasi mekanik dan kimiawi dilakukan dengan
mencuci alat-alat menggunakan sabun yang mengandung bahan
kimiawi.
b. Sterilisasi media tanam
Sterilisasi media tanam dilakukan dengan sterilisasi fisik, yakni
dengan pemanasan menggunakan autoklaf. Media tanam yang telah
dimasukkan dalam botol kultur selanjutnya ditata pada rak autoklaf dan
dimasukkan ke dalam tabung autoklaf. Pada prinsipnya, sterilisasi
autoklaf menggunakan panas dan tekanan dari uap air. Temperature
sterilasi biasanya 121o C, tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5
psi (pound per square inci) atau 1 atm selama 45 menit. selanjutnya
setelah 45 menit media dikeluarkan dan ditata dalam rak kultur diruang
steril.
Fungsi komponen-komponen dari media agar :
a. Air destilata (akuades) atau air bebas ion sebagai pelarut atau solvent
adalah Air merupakan zat terbanyak pada tubuh tumbuhan, oleh karena
itu air juga merupakan bagian terbesar didalam medium kultur. Air
selain sebagai bahan untuk membentuk material tubuh, juga sebagai
medium untuk reaksi-reaksi kimia dan fisika. Air juga berguna untuk
transport dan distribusi zat-zat yang terlarut didalamnya. Pada medium
kultur jaringan digunakan air murni yang sudah mengalami
demineralisasi, deionisasi dan didestilasi dengan gelas dua kali
b. Unsur hara makro adalah hara yang diperlukan tanaman dalam jumlah
besar yang meliputi Nitrogen (N), Fosfor (P), Kalium (K), Kalsium
(Ca), Magnesium (Mg), dan Sulfur (S). Unsur Hara Mikro adalah hara
15
yang diperlukan tanaman dalam jumlah kecil yang meliputi Mangan
(Mn), Kuprum (Cu), Zeng (Zn), dan Ferrum (Fe) (Sudarmono 2008)
c. Gula (umumnya sukrosa) sebagai sumber energi Pada kultur in vitro,
sel dan jaringan tumbuhan belum sempurna dalam melakukan asimilasi
fotoautotrof, sehingga diperlukan gula sebagai sumber karbon dan
enersi. Selain sebagai sumber enersi bagi sel dan jaringan, gula juga
berfungsi sebagai penjaga keseimbangan tekanan osmotik potensial
didalam medium. Gula pada umumnya diberikan pada medium kultur
berupa sukrosa atau komponen-komponennya seperti monosakarida
glukosa atau fruktosa. Sukrosa ternyata lebih berpengaruh dalam
perkembangan kalus, sedangkan pengaruhnya terhadap organogenesis
belum dapat dipastikan.
d. Vitamin
Vitamin ditambahkan pada medium untuk mempercepat pertumbuhan,
diferensiasi kalus. Vitamin berfungsi sebagai kofaktor atau bagian dari
molekul kofaktor dari reaksi-reaksi ensimatis penting, vitamin juga
berfungsi protektif. Vitamin juga mempengaruhi (menstimulasi)
inisiasi, pertumbuhan dan perkembangan akar.
e. BAP adalah hormon Sitokinin yang telah banyak dipakai dalam
pelaksanaan kultur jaringan Zat pengatur tumbuh atau seringkali
disebut hormon pertumbuhan ini terdiri dari banyak jenis yang
dihasilkan secara sintetik ataupun secara fermentasi , jadi hormon
pertumbuhan ini digunakan sesuai dengan keperluan praktikum. BAP
yang diberikan pada media MS memberikan pengaruh pada
pertumbuhan kalus tanaman (Marggy 2013)
f. Agar-agar atau Gelrite sebagai pemadat media
Bahan pemadat yang sering digunakan adalah agar, keuntungan
pemakaian agar adalah: agar membeku pada temperatur 45ºC dan
mencair pada temperatur 100ºC, sehingga dalam kisaran temperatur
kultur agar akan berada dalam keadaan beku yang stabil, tidak dicerna
enzim tanaman, dan tidak beraksi dengan persenyawaan-persenyawaan
16
penyusun media. Kandungan agar sedikit mengandung unsure Ca, Mg,
K dan Na. Kekerasan media meningkat secara linear pada pertambahan
konsentrasi agar, kekerasan media juga dipengaruhi oleh jenis agar
yang dipakai, pH media, dan penambahan arang aktif
17
E. Kesimpulan dan Saran.
1. Kesimpulan
Kesimpulan untuk acara 1 mengenai serilisasi alat adalah :
a. Media itu sendiri adalah adalah suatu tempat yang terdiri dari campuran
zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk
pertumbuhannya. Media terdiri atas bahan dasar dari sumber Karbon
(C), Nitrogen (N), Oksigen (O), Fosfat (PO4), dan unsur sekelumit
(mikronutrient/trace element)
b. komposisi utama media tanam kultur jaringan terdiri dari komponen
berikut: (1) air distilata (akuades) atau air bebas ion sebagai pelarut atau
solven, (2) hara-hara makro dan mikro, (3) gula (umumnya sukrosa)
sebagai sumber energi, (4) vitamin, asam amino dan bahan organic lain,
(5) zat pengatur tumbuh, (6) suplemen berupa bahan-bahan alami, jika
diperlukan dan (7) agar-agar atau gelrite sebagai pemadat media.
c. BAP adalah hormon Sitokinin yang telah banyak dipakai dalam
pelaksanaan kultur jaringan Zat pengatur tumbuh
d. Sterilisasi media tanam dilakukan dengan sterilisasi fisik, yakni dengan
pemanasan menggunakan autoklaf
2. Saran.
Saran untuk praktikum acara 1 mengenai sterilisasi alat adalah
praktikan agar lebih konsentrasi saat melakukan pembuatan media dan
sterilisasi media tanam. Praktikan juga harus bersih dalam membersihkan
botol-botol agar tidak membawa zat yang mengandung kontaminasi.
18
DAFTAR PUSTAKA
AS. Sudarmono 2008. Tanaman Hias Ruangan. Kanisius. Yogyakarta
Dwi Wahyu Ardiana dan Ida Fitiraningsih 2010. Teknik Kultur Jaringan Tunas Pepaya Dengan Menggunakan Beberapa Konsentrasi IBA. Buletin Teknik Pertanian. 15 (2) : 52-55.
Endang Yuniastuti 2012. Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan. UNS Press. Surakarta
Erlina Setiawati 2003. Teknik Kultur Jaringan Gladiol. Buletin Teknik Pertanian. 8(1) : 28-30.
Daisy P Hendaryono. Sriyanti dan Ari Wijayani 2012. Teknik Kultur Jaringan cetakan ke 13. Kanisius. Yogyakarta.
Edi Sandra 2006. Kultur Jaringan Anggrek Skala Rumah Tangga. Penebar swadaya. Bandung.
Marggy Patrichia Matauseya 2013. Pengaruh Zat Pengatur Tumbuh 2,4-D Dan BAP Bagi Pertumbuhan Kalus Kacang Tanah Kulit Putih (Arachis Hypogeae) Dalam Media “Murashige-Skoog”. http://digilib.its.ac.id/public/ITS-Undergraduate-24095-1506100037-Chapter1.pdf. Diakses pada tanggal 28 Mei 2015 pukul 17.00 WIB
Muhammad Irvan Hermawan 2013. Penanaman Media. https://www.academia.edu/6554034/2_Penanaman_Media, diakses pada tanggal 28 Mei 2015 pukul 08.00 WIB.
Smallcrab 2013. Mengenal Kultur Jaringan. http://www.smallcrab.com/others/474-mengenal-kultur-jaringan, diakses pada tanggal 10 Mei 2015 pukul 22.00 WIB.