2. DER VERGLEICH DER PROKARYONTISCHEN UND EUKARYONTISCHEN ZELLEN Die zelluläre Organisation Prokaryonten (Abb. 2.1.) kein Zellkern Bakterien, Cyanobakterien Eukaryonten (Abb. 2.2.) enthalten echten Zellkern einzellige oder multizelluläre Organismen Abbildung 2.1. Die Struktur einer prokaryontischen Zelle. Genetischer Apparat Prokaryonten ein ringförmiges chromosomales DNA Molekül vorwiegend codierende Regionen verbundene Transkription-Translation (Chromosom-Polysom Komplex) extrachromosomales DNA: Plasmid F-Faktor (F + , F - Zellen) Konjugation Eukaryonten mehr lineare chromosomale DNA Moleküle in der Form des Chromatins vorwiegend nichtcodierende Regionen extrachromosomale DNA: mitochondriale DNA chloroplastische DNA (Pflanzen) Zellulären Organellen Prokaryonten (Abb. 2.1.) Zellwand (Peptidoglykan) Zellmembran Ribosomen keine membranumschlossene Organellen Eukaryonten (Abb. 2.2.) membranumschlossene Organellen (Kompartmentalisation): Nucleus, endoplasmatisches Reticulum, Golgi-Apparat, Lysosomen, Mitochondrium, Peroxisomen
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(Abb. 2.1.) (Abb. 2.2.) ä - aok.pte.huaok.pte.hu/docs/dsg/studium/biologie/Zusammenfassung_der_Themen.… · allgemeine Struktur (Cα-Atom, Aminogruppe, Carboxygruppe, R = Seitenkette)
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2. DER VERGLEICH DER PROKARYONTISCHEN UND EUKARYONTISCHEN ZELLEN
Die zelluläre Organisation Prokaryonten (Abb. 2.1.)
kein Zellkern Bakterien, Cyanobakterien
Eukaryonten (Abb. 2.2.) enthalten echten Zellkern einzellige oder multizelluläre Organismen
Abbildung 2.1. Die Struktur einer prokaryontischen Zelle. Genetischer Apparat Prokaryonten
ein ringförmiges chromosomales DNA Molekül vorwiegend codierende Regionen verbundene Transkription-Translation (Chromosom-Polysom Komplex) extrachromosomales DNA: Plasmid
F-Faktor (F+, F- Zellen) Konjugation
Eukaryonten mehr lineare chromosomale DNA Moleküle in der Form des Chromatins vorwiegend nichtcodierende Regionen extrachromosomale DNA: mitochondriale DNA
chloroplastische DNA (Pflanzen) Zellulären Organellen Prokaryonten (Abb. 2.1.)
Zellwand (Peptidoglykan) Zellmembran Ribosomen keine membranumschlossene Organellen
Der Ursprung der eukaryontischen Zellen (Abb. 2.3.) Endosymbiontentheorie Ursprung der Peroxisomen, des Mitochondriums, der Chloroplasten
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Abbildung 2.3. Der Ursprung von eukaryontischen Zellen.
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3. NUCLEINSÄUREN Allgemeine Eigenschaften
lineare Makromoleküle bestehen aus Nucleotide können genetische Information speichern und exprimieren Nucleotide (= Base + Pentose + Phosphorsäure/n/) (Abb. 3.3.)
Abbildung 3.6. Die Struktur von B-DNA und Z-DNA. RNA (= Ribonucleinsäure) im allgemeinen einzelsträngig Haarnadel und Stamm-Schleife Sekundärstrukturelemente sind möglich (Abb. 3.7.) RNP (= Ribonucleoprotein)
RNA-Typen mRNA (= messenger RNA)
Templat für Proteinsynthese rRNA (= ribosomale RNA)
Bestandteile der Ribosomen prokaryotische 5S, 16S und 23S rRNA-Moleküle eukaryotische 5S, 5.8S, 18S und 28S rRNA-Moleküle
tRNA (= transfer-RNA) transportieren Aminosäuren
pre-mRNA, pre-rRNA Vorläufer von mRNA und rRNA
Ribozyme
katalytische RNA-Moleküle funktionieren in: Auto-Spleißen, RNA-Spaltung, Formation der Peptidbindung.
u.s.w.
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Abbildung 3.7. Sekundärstruktur von eukaryotischen 18S rRNA. (Doppelsträngige
Regionen sind nummeriert.)
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4. PROTEINE
Allgemeine Eigenschaften lineare, unverzweigten Polypeptidketten bestehen aus Aminosäuren funktionelle Unterteilung
Abbildung 5.1. Lineare und Ringstruktur von Glucose: α- und β-Anomere.
Abbildung 5.2. Die Struktur von Maltose.
Oligosaccharide Polysaccharide (Abb. 5.3.)
Cellulose lineare Polysaccharidketten von Glucose Komponent der Zellwand in Pflanzen
Stärke Amylose + Amylopectin Polysaccharid von Glucose speichert Glucose in Pflanzen
Glykogen Polysaccharid von Glucose
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speichert Glucose in Zellen von Säugtieren (am meistens in Leber und Muskel)
Glycosaminoglycane bestehen aus wiederholenden Disaccharideinheiten enthält Derivate von Hexosen befindet sich in der Extrazellulären Matrix verbinden sich mit Proteine (Proteoglycane) z.B. Chondroitinsulfat,
Heparin, Dermatansulfat
Abbildung 5.3. Die Struktur von Cellulose und Stärke Lipide allgemeine Eigenschaften
hydrophobische (wasserhassende) Bindungen löslich nur in organischem Lösmittel
Gruppierung
Triglyceride (Abb. 5.4.A.) Glycerin + 3 Fettsäuren gespeichert als Tröpfchen im Cytoplasma inr Zweck: Energiespeicherung
Phospholipide enthält Phosphorsäure
amphipathische Lipide, die sowohl hydrophobe als auch hydrophile Bereiche besitzen
ihre Funktionen: Componente von Membranen nehmen in Signalübermittlung teil Glycerophospholipide (Abb. 5.4.B.) Sphingomyeline (Abb. 5.5.)
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Glycerin
Glycerin
Fettsäuren
Fettsäuren
A.
B.
Cholin
Phosphatgruppe
(CH ) N3 3+
CH2CH2
CH2CH2
CH2
CH2CH2CH2
H C2
CH2 CH2
O
OOO
O O OC C C
O
O
O O
O O
O P
C
CH
CH
C
R1
R1
R2
R2 R3
-
Abbildung 5.4. Die Struktur von Triglyceride (A.) und Glycerophospholipide (B.).
Abbildung 5.5. Die Struktur von Sphingomyelin
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Glycolipide enthalten Zuckermoleküle – erhöhte Wasserlöslichkeit befinden sich an der exoplasmischen Obrefläche der Membrane dienen als Markers z.B. Cerebroside, Ganglioside
Steroide (Abb. 5.6.) Steroidring-Struktur z.B. Cholesterin (Membrankomponent), Steroidhormone, Gallensäuren,
Vitamin-D3Carotinoide (Abb. 5.7.)
Pigmente (konjugierte Doppelbindungen) z.B. β-Carotin, Retinal, Retinsäure
Abbildung 5.7. Die Struktur von β-Carotin.
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6. IN VIVO UND IN VITRO AMPLIFIKATION VON DNA FRAGMENTEN Restriktionsendonukleasen Infektion von E. coli-Zellen bei Bakteriophage λ
λ-Phage Cosmid Adenoviren, Retroviren (in den Säugetieren) Künstliches Hefechromosom (YAC, yeast artificial chromosome)
DNA-Ligasen
Abbildung 6.2. Konstruktion eines rekombinierten Plasmids.
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Genomische Bibliothek (Abb. 6.3.) Konstruiert in Insertionsvektoren (z.B. λ-Phage)
Hauptschritte: genomische Restriktionsfragmente → Ligation mit λ-Armem → Verpackung → Infektion von E. coli-Zellen → durchmustern (screening) um die Bibliothek (mit molekularer Hybridisierung)
Abbildung 6.3. Konstruktion einer genomischen Bibliothek (A.) und durchmustern für den
gewünschten Klon durch molekulare Hybridisierung. Polymerasekettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) (Abb. 6.4.) In-vitro-DNA-Amplifikation DNA-Synthese-Mischung: Primer, dNTPen, DNA-Matrize, Taq Polymerase
Abbildung 6.4. Das Prinzip von Polymerasekettenreaktion.
real-time PCR
PCR-Reaktion → wachsende Fluoreszenz→Quantifikation von dem Thermozykler (Abb. 6.5.)
Abbildung 6.5. Das Prinzip von real-time PCR. Scritte:1 Polymerisation; 2. Frei Machung von dem fluoreszenzen Frabstoff durch Taq-Polimerase, wachsende Fluoreszenz; 3. Degradation von Sonde, Komplettierung von Polymerisation.
Abbildung 7.1. Das Prinzip der molekularer Hyb Restriktionskartierung (Abb. 7.2.)
Spaltung von DNA mit Restriktionsendonumit Gelelektrophorese → Gröβe-Determina
einzel- strängigeDNA
tion mit rter Sonde
ridisierung (Filter-Hybridisierung).
cleasen (RE) → Abtrennung von DNA-Fragmenten tion → Kartierung von Restriktionsschnittstellen
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Abbildung 7.2. Restriktionskartierung: elektrophoretisches Muster der DNA-Fragmenten (A.) und
Kartierung von Restriktionsschnittstellen der zirkuläre DNA (B.). Southern-Blotting (Abb. 7.3.) identifizieren DNA-Fragmente, die spezifische Sequenzen tragen RE-Spaltung von DNA → Agarose-Gelelektrophorese → Denaturierung → blotten →
Hybridisierung an der Membran → Autoradiographie
Abbildung 7.3. Das Prinzip von „Southern blotting“. DNA-Sequenzierung Maxam-Gilbert Methode (Chemische Sequenzierung)
Base-spezifische Spaltung der DNA → Gröβe-Determination mit PAGE → DNA-Sequenz
angewandt die Reaktion zu stoppen Gröβe-Determination mit denaturierendem PAGE
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kann man automatisieren (Abb. 7.5.)
Abbildung 7.4. Das Prinzip von Sanger-Methode (Kette-Termination-Methode).
Abbildung 7.5. Automatisierte DNA-Sequenzierung.
DNA-Microchips (Abb. 7.6.) = Sequenzierung mit Hybridisierung
Microchip mit Oligonucleotiden von bekannten Sequenzen → Hybridisierung mit der fluoreszenzmarkierten Zielnucleinsäuren → konfokales Lasermikroskop → Komputer → Sequenz wird determiniert (Abb. 7.7.)
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Abbildung 7.6. Das Prinzip der Sequenz-Determination mit Oligonucleotid-chip.
Abbildung 7.7. Vorrichtung für Sequenzierung mit Hybridisierung (Oligonucleotid-Microchip
Technologie) z.B. SNP-chip (detektieren Single-Nucleotid- Polymorphis) cDNA- chip (beobachten Gen-Expression)
Human-Genom-Project Sequenzierung des gesamten menschlichen Genoms
1990 – ist begonnen 2001- ist beendet
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strukturelles und funktionelles Genomik
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8. EXPRESSION VON FREMDEN GENEN Gen-Expression (Abb. 8.1.)
Abbildung 8.1. Schritte der Gen-Expression.
cDNA-Klonierung (Abb. 8.2.) cDNA = komplementäres DNA Molekül zu einem spezifischen RNA Molekül Synthese von cDNA
vorübergehende vs. stabile Expression Transgene Organismen (Abb. 8.3.) = tragen das fremde Gen (Transgen) in all ihren diploiden Zellen Einschleusen des Transgenes
- Microinjektion von dem Transgen in befruchteten Eizellen – Gen-Transfer in embryonalen Stammzellen → Injektion in Blastocoel → chimäre Embryonen→ Züchten → wirkliche transgene Tiere
Abbildung 8.3. Herstellung von transgenen Mäuse mit manipulierten embryonalen Stammzellen.
Abbildung 9.1. Das Prinzip von gezielten Gen-Disruption. Antisense-Oligonucleotiden = komplementär an einer Region von der gezielten RNA Ribozymen = komplementär an einer Region von der gezielten RNA + Endonuklease Aktivität siRNA
= kleine durchgreifende RNA RNA-Interferenz (Abb. 9.3.)
Gen silencing (Gen-Unterdrückung)
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Abbildung 9.2. Ribozym-Spaltung von mRNA.
Abbildung 9.3. Das Prinzip von RNA-Interferenz: Degradation von der Ziel-mRNA durch endogene
(A) oder exogene (B) siRNA. Hinderung von Protein-Funktion - Microinjektion von spezifischem Antikörper - Expression von spezifischem intracellulärem Antikörper - Expression von dominanten hemmenden Proteinen - Peptidomimetiken
- kompetitiver Inhibitor
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10. IDENTIFIZIERUNG VON SPEZIFISCHEN GEN-PRODUKTEN cDNA-Bibliothek
total mRNA (Abtrennung mit Oligo(dT)-Zellulose-Chromatographie) → cDNA-Synthese → Ligation in einen Klonierungsvektor → Transfer in Wirtzelle → durchmustern um die Bibliothek Expression-cDNA-Bibliothek „Immunoscreening”
Northern-Blotting (Abb. 10.1.) = Identifizierung von einer spezifischen RNA in einem komplex RNA-Gemisch Formaldehyd/Agarose Gelelektrophorese → blotten → Hybridisierung → Autoradiographie
Abbildung 10.1. Das Prinzip von Northenr blotting. Immunologische Techniken = identifizieren spezifische Proteine mit ihren Antikörpern Immunocytochemistrie
Immunfluoreszenzmikroskopie Antikörper markiert mit fluoreszierenden Farbstoff sichtbar in Fluoreszenzmikroskop (konfokale Lasermikroskop)
Immunogold Technik für Immun-Elektronenmikroskopie Antikörper markiert mit Goldpartikeln
Immunprezipitation (Abb- 10.2.) Zelle-Extrakt → gemischt mit Antikörper-bedeckt Agarose Perlen → Zentrifugation → SDS-PAGE → Protein wird sichtbar gemacht (z.B. Autoradiographie)
Abbildung 10.2. Immunopräzipitation (an dem Autoradiogramm, das Muster von totalen
Proteingemisch /Specziemen 1/ und das Muster von Immunopräzipitat /Speziemen 2/ sindsind sichtbar.
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Immun-Blotting (Western-Blotting) (Abb. 10.3.) Proteingemisch → SDS-PAGE → blotten → inkubieren die Trägermembran mit spezifischen Antikörper → Antikörper wird sichtbar gemacht (z.B. with Farbenreaktion)
Abbildung 10.3. Das Prizip von Immunoblotting (Western blotting). Funktionelles Genomik =global Analyse von in einer Zelle expressierte RNA und Proteine Transcriptom (RNom) = alle in einer Zelle expressierte RNA Proteom = alle in einer Zelle expressierte Proteine Phosphoproteom = alle in einer Zelle expressierte phosphorilierte Proteine Interactom = alle Interaktionen zwischen den Proteinen in einer Zelle cDNA „chips“ Beobachtung von RNA-Expression Proteomik verwendete Techniken: 2D-Elektrophorese (Protein-Fraktionierung) Massenspektrometrie (Protein-Indentifizierung) medizinische Bedeutung
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11. DER ZELLKERN Ultrastruktur (Abb. 11.1.) Kernmembran/Kernhülle Chromatin Kernmatrix Nucleolus
Abbildung 11.1. Elektronenmikroskopische Struktur des Zellkerns.
Abbildung 11.2. Die Struktur des Kernporenkomplex.
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Nucleo-cytoplasmatischer Transport Protein Import (Abb. 11.3.) nucleäre Proteine: Kernlokalisierungssignal (NLS), Kernexportierungssignal (NES) Shuttle-Proteine (Carrierproteine)
z.B. Importin Proteine, Exportin Proteine Ran•GDP, Ran•GTP
Abbildung 11.3 Import und Export der Kernproteinen: Shuttling-Carrier Modell (Schritte: 1. Formation von Protein mit NLS/Importin/Ran•GDP-Komplex; 2. „Docking“ auf cytoplasmatischen Filament; 3. Translocation durch Kernporenkomplex; 4. Komplex wird dissoziiert; 5. Formation von Protein mit NES/Exportin/Ran•GTP Komplex,6. Translokation zu das Cytoplasma, 7. Komplex wird dissoziiert(GTP-Hydrolyse).
Abbildung 11.4. Export des mRNPs durch dem Kernproteinkomplex. (1. mRNP tritt in die Kernpore
ein; 2. Translokation durch der Pore; 3. Formation von Polysom an der cytoplasmatische Seite des Pores.
12. ORGANISATION DES EUKARYOTISCHES GENOMS DNA-Renaturierung Experiment
genomische DNA → Spaltung mit Ultraschall → Denaturierung mit thermischer Energie → langsame Kühlung → Renaturierung → Messung der Rate von Renaturierung
E. coli-DNA: enthält hauptsächlich singuläre Gene / Einzelkopiegene Säuger-DNA: ∼ 60% Einzelkopiegene
∼ 40% wiederholte DNA-Sequenzen
Abbildung 12.1. Renaturierung-Kurven von E. coli- und Säuger-DANN.. Satelliten-DNA stark-wiederholte DNA-Sequenzen: kurze, tandemartig wiederholte Sequenzen
sie lassen sich von der übrigen zellulären DNA durch eine Gleichgewichtsdichte-gradientenzentrifugation abtrennen (Abb. 12.2.)
Abbildung 12.2. Isolierung von Satelliten DNA durch Cäsiumchlorid-gradientenzentrifugation.
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befinden sich in Centromeren oder Telomeren sie werden nicht transkribiert Minisatelliten-DNA: kurze, wiederholte DNA-Sequenzen
stark polymorphisch → (VNTR = variable number of tandem repeats) genetischer Fingerabdruck (Abb. 12.3.)
Microsatelliten-DNA: sehr kurze, wiederholte Sequenzen (z.B. Trinucleotid-Wiederholungen) genetische Instabilität → dynamische Mutationen → Expansion von Trinucleotid-Wiederholungen, z.B. zerbrechliches-X-Syndrom (fragile X syndrome) Huntington disease
Abbildung 12.3. Genetischer Fingerabdruck Ananlyse mit einer Minisatelliten-DNA Sonde in einem Vaterschaft-Test.
Verstreut-wiederholte DNA-Elemente Kopien verstreut allerorts ins Genom z.B. Alu-Sequenzen Tandemartig Wiederholte Gene identische Kopien eines Gens im gleichen Bereich des Genoms die nichttranskribierte Spacer befinden sich zwischen den transkribierten Bereichen z.B. 45S-Prä-rRNA Gene
Histon Gene Amplifikation der Gene
z.B. rRNA-Gene
Abbildung 12.4. Tandemartig wiederholte Gene. Genfamilien Ähnliche aber nicht identische Kopien z.B. Globin-Genfamilie (α- und β-Globingene) Pseudogene
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Einzelgene Nur 1 Kopie kommt ins haploiden Genom vor z.B. das Insulin Gen Bewegliche DNA-Elemente (Abb. 12.5.) bewegen sich ins Genom, sie können an eine andere Stelle des Genoms überspringen Transposons
Transposition - replikativ - nonreplikativ
Transposase
Retrotransposons werden durch eine RNA-Zwischenstufe transponiert virale Retrotransposons
endogene Retroviren nichtvirale Retrotranspososns
z.B. Alu-Sequenzen
Abbildung 12.5. Der Mechanismus von Transposition (A: nonreplikative Transposition; B:
Abbildung 14.3 . Das FACS-Diagramm einer unsynchronisierten Zellkultur nach DNA-Färbung. Die Dauer von Zellzyklus-Phasen Generationszeit / Zellzyklusdauer = die Zeit die für die Verdopplung der Zellenanzahl einer Kultur benötigt ist S-Phase
[3H]-Desoxythymidin Pulsmarkierung (pulse-chase-labelling) → Autoradiographie → % von Zellen in der S-Phase → Dauer von S-Phase
M-Phase % von mitotische Zellen (mitotischer Index) – Dauer von M-Phase G1-Phase
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Synchronisierung durch mitotisch „shake-off” → [3H]-Desoxythymidin Markierung→ Autoradiographie → erste markierte Zellkerne
G2-Phase unsynchronisierte Zellkultur → [3H]-Desoxythymidin Markierung → erste markierte Chromosomen
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15. REGULIERUNG DES ZELLZYKLUS
Methode für die Untersuchung der Regulierung des Zellzyklus genetische Experimente mit Hefezellen
Mikroinjektion der Froschei mit spezifischen Proteinen, mRNA oder antisense-Oligonucleotiden
Experimente mit Froschei-Extrakte um die Teilung der Zellkerne im experimentelle System zu induzieren
Zellfusionsexperimente Hybridzellen:
S + G1 Zelle → DNA-Synthese in G1-Zellkern → S-Phase-fördernder Faktor (SPF) G1 + G2 Zelle → keine DNA-Replikation S + G2 Zelle → keine / blockierte Replikation in G2 Zelle M + Interphasezelle → das Chromatin kondensiert sich in Interphasekern → M-Pase
Abbildung 15.4. Der Mechanismus der Cdk Regulierung.
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Abbildung 15.5. Regulierung von MPF-Aktivität während des Zellzyklus. Kontrollpunkte in der Regulierung des Zellzyklus (Abb. 15.6.)
G1-Kontrollpunkt DNA Beschädigungen → p53 Tumorsuppressorprotein ↑→ Cdk-Inhibitor ↑→ Halt in G1
G2-Kontrollpunkt nonreplizierte DNA → keine MPF-Aktivierung → kein Eintritt in die Mitose → Halt in
G2 M-Kontrollpunkt
abnormale mitotische Spindel → Cyclin wird nicht abgebaut → Halt in M-Phase
Abbildung 15.6. Kontrollpunkte des Zellzyklus.
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16. Mitosis Eukaryotische Zellteilung Chromosomen werden geformt Mitose: die Zellteilung von somatischen Zellen
Meiose: produziert Keimzellen, wie z.B. Eizellen und Spermien von Menschen Interphase (Abb. 16.1.) G1 – S – G2 mitotischer Apparat (Abb. 16.2.) Centrosom oder Mikrotubuliorganisationszentrum (MTOC) besteht aus die zwei Centriolen und der perizentriolären Matrix dupliziert sich in der S-Phase
Abbildung 16.1. Die Phasen des Zellzyklus.
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Abbildung 16.2. Die Organisation der Mikrotubuli in der Interphase und während der Zellteilung. Die Phasen der mitotischen Zellteilung