การพัฒนาเครื่องหมาย ISSR เพื่อใช้ ตรวจสอบความหลากหลายทาง...

การพฒนาเครองหมาย ISSR เพอใชตรวจสอบความหลากหลายทางพนธกรรมของไมสกในพนท 5 ลมน า ทางภาคเหนอ

นางสาวกานตรตน สขปาน ภาควชาชววทยาปาไม สาขาวทยาศาสตรชวภาพปาไม คณะวนศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร

OUTLINE

บทน ำ

วตถประสงค

อปกรณและวธกำร

ผลและวจำรณ

สรปและขอเสนอแนะ

ความหลากหลายทางพนธกรรม (Genetic diversity) ความหลากหลายระดบสารพนธกรรม ทเปนองคประกอบภายในสงมชวตชนดหนง ซงบงชถงความแตกตางในรหสพนธกรรม ทควบคมกลไกการท างานของสงมชวตนน ตามสภาวะแวดลอมทแตกตางกนไป

บทน ำ

วธการตรวจสอบความหลากหลายทางพนธกรรมในระดบ DNA ม 2 วธ เครองหมายดเอนเอ (DNA marker) การหาล าดบนวคลโอไทด (DNA Sequencing)

บทน ำ(ตอ)

บทน ำ (ตอ) กำรตรวจสอบควำมหลำกหลำยทำง

พนธกรรม จ ำเปนทจะตองทรำบลกษณะทำงพนธกรรมของสงมชวต โดยใชเครองหมำยดเอนเอ (DNA Marker)

เครองหมำยดเอนเอ(DNA Markers) เปนเครองหมำยบงชควำมเปนเอกลกษณของสงมชวตของพชแตละชนดแตละสำยพนธ โดยมกำรจดเรยงตวของนวคลโอไทดในโมเลกลของดเอนเอทเปนเอกลกษณ เปนควำมแตกตำงหรอโพลมอรฟซม (polymorphisms)

DNA

DNA marker

diversity parameter

บทน ำ (ตอ)

เครองหมำยไอเอสเอสเอำร (inter-simple sequence repeat; ISSR ) เปนกำรประยกตใชเทคนค PCR ในกำรตรวจสอบดเอนเอ โดยใชไพรเมอรเพยง ชนดเดยวเปนกำรตรวจสอบครงละหลำยต ำแหนง

ขอด: คอใชระยะเวลาท าทสน และมราคาถก จงถกน าไปใชเพอการศกษาเกยวกบดเอนเออยางแพรหลาย

ISSR

บทน ำ (ตอ)

ตวอยางการใชเครองหมายดเอนเอบงชความหลากหลายทางพนธกรรม

ความหลากหลายทางพนธกรรม : ประชากร B > ประชากร A > ประชากร C

ก ำหนดให ปรำกฏแถบดเอนเอ

เปน “1” ไมปรำกฏแถบ ดเอนเอเปน “0”

0

1

1 2 3 4 5 500 400 300 200 100

1 1

1 0

0 1

1 1

1 1

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

การประเมนความหลากหลายทางพนธกรรม Gene diversity (h)

P = ความถของแอลลลท 1 q = ความถของแอลลลท 2

Shannon’s Information Index (I)

บทน ำ(ตอ)

H = 1- p 2 - q 2

I = - ∑ Pi ln Pi

Pi = สดสวนความมากมายของจ านวนยนท I เมอเทยบกบจ านวนยนทงหมด (N)

บทน ำ •สก (Tectona grandis Linn.f.) อยในวงศ Lamiaceae •ถนก ำเนด: ถนก ำเนดของสกอยในตอนใตของ ประเทศอนเดย พมำ อนโดนเซย ลำว และไทย ส ำหรบในประเทศไทยนน พบกระจำยไดทวไปตำมปำ เบญจพรรณทำงภำคเหนอและบำงสวนของภำคกลำง

บทน ำ (ตอ)

กำรใชประโยชน :กำรกอสรำงบำนเรอน ตอเรอ แกะสลก

เครองมอกสกรรม

เพอพฒนำเครองหมำย ไอเอสเอสอำร (Inner-Simple Sequence Repeat, ISSR)เพอใชในกำรตรวจสอบควำมหลำกหลำยทำงพนธกรรมของสก

วตถประสงค

ตวอยำงสกทใชศกษำ

เกบตวอยำงจำกพนทลมน ำ

ทง 5 แหลง แหลงละ 30-36 ตวอยำง

รวมทงหมด 163 ตวอยำง

อปกรณและวธกำร

ลมน าวง

ลมน ายม

ลมน าสาละวน

ลมน าปง

ลมน านาน

อปกรณและวธกำร(ตอ)

สกดดเอนเอ (DNA extraction)

ตรวจสอบคณภำพดเอนเอ

คดเลอกไพรเมอรทเหมำะสม

ใชไพรเมอรทคดเลอกไดเพมปรมำณ ดเอนเอดวยเทคนคPCR ของตวอยำงทงหมด

ท ำกำรนบแถบดเอนเอ

วเครำะหผลและประเมนควำมหลำกหลำยทำงพนธกรรมเบองตนของสก

กำรสกดดเอนเอโดยวธ Modified CTAB

อปกรณและวธกำร(ตอ)

+ ไนโตรเจนเหลว Sobital buffer

CTAB buffer

Chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1)

isopropanol 70% ethanol

TE buffer RNase

กำรตรวจสอบคณภำพดเอนเอ

อปกรณและวธกำร(ตอ)

0.8% Agrarose gel TAE buffer 6x loading buffer

Ethidium bromide DNA

ท ำกำรคดเลอกไพรเมอรและเพมปรมำณดเอนเอดวยเทคนค PCR โดยใชเครองหมำย ISSR เพอใชตรวจสอบควำมหลำกหลำยทำงพนธกรรมของสก สมตวอยำงสก จำก 5 แหลงแหลงละ 2 ตวอยำงมำเปนตวแทน

ท ำกำรคดเลอกไพรเมอรจำกทงหมด 24 ไพรเมอร

อปกรณและวธกำร(ตอ)

ขนตอน PCR สวนผสม ปรมำตร

น ำกลน GM Primer DNA รวม

6.7 ml 7.5 ml 0.6 ml 1.0 ml 15 ml

กำรตรวจสอบผลของดเอนเอ

อปกรณและวธกำร(ตอ)

1.5% Agrarose gel

TBE buffer

100 bp DNA Ladder

Ethidium bromide

อปกรณและวธกำร(ตอ)

สกดดเอนเอ (DNA extraction)

ตรวจสอบคณภำพดเอนเอ

คดเลอกไพรเมอรทเหมำะสม

ใชไพรเมอรทคดเลอกไดเพมปรมำณ ดเอนเอดวยเทคนคPCR ของตวอยำงทงหมด ท ำกำรนบแถบดเอนเอ

วเครำะหผลและประเมนควำมหลำกหลำยทำงพนธกรรมเบองตนของสก

ประเมนควำมหลำกหลำยทำงพนธกรรม

Gene diversity (h)

Shannon’s Information Index

โดยใชโปรแกรม Popgene

ประเมนควำมสมพนธแตละพนท โดยใชโปรแกรม TFPGA

อปกรณและวธกำร(ตอ)

ดชนควำมคลำยคลง (similarity index) S = 2Nab/Na + Nb

ผลกำรสกดดเอนเอดวยวธ Modified CTAB

ผลและวจำรณ

ผลการคดเลอกไพรเมอรและเพมปรมาณดเอนเอ

ผลและวจำรณ(ตอ)

รปแบบลำยพมพดเอนเอทไดจำกำรเพมปรมำณดวยเทคนค ISSR ดวยไพรเมอร P-52

สำละวน ยม ปง วง นำน

รปแบบลำยพมพดเอนเอทไดจำกำรเพมปรมำณดวยเทคนค ISSR ดวยไพรเมอร P-04

สำละวน ยม ปง วง นำน

ไพรเมอร ขนำดของแถบ ดเอนเอ

จ ำนวน polymorphic band

จ ำนวน monomorphic

รวม

04 08 10 49 51 52 54 59 61 รวม

700-2000 350-1200 500-2000 350-2100 600-1200 350-2000 800-2000 250-850

500-2000

5 6 6 6 1 10 7 5 8 54

2 1 2 3 2 0 0 1 0

11

7 7 8 9 3 10 7 6 8 65

ผลและวจำรณ(ตอ)

ผลการประเมนความหลากหลายทางพนธกรรมดวยโปรแกรม popgene

ผลและวจำรณ(ตอ)

ประชำกร จ ำนวน polymorphic band %polymorphic

สำละวน 52 80

ยม 42 64.62

ปง 42 64.62

วง 38 58.46

นำน 39 60

ผลและวจำรณ(ตอ)

คาความสมพนธของแตละประชากร

ผลและวจำรณ(ตอ)

สำละวน ยม ปง วง นำน

สาละวน - 0.9744 0.9585 0.9592 0.9617

ยม 0.0259 - 0.9621 0.9797 0.9779

ปง 0.0423 0.0386 - 0.9660 0.9676

วง 0.0417 0.0205 0.0346 - 0.9713

นาน 0.0391 0.0223 0.0330 0.0292 -

ความสมพนธของแตละพนท โดยใชโปรแกรม TFPGA

ผลและวจำรณ(ตอ)

ในการวางแผนจดการดานการอนรกษ ควรมการเพมจ านวนตวอยาง เพอความสมบรณ

การสกดดเอนเอดวยวธการ Modified CTAB มปรมาณดเอนเอ สามารถน าไปใชเพอตรวจสอบความหลากหลายทางพนธกรรมของสกได

จากการคดเลอกไพรเมอร พบวามไพรเมอรทเหมาะสมจ านวน 9 ไพรเมอร ไดแก P04, P08, P10, P49, P51, P52, P54, P59, P61

ลมน าสาละวนมคา H= 0.2631, I =0.3956 ซงเปนพนททมคาความหลากหลายสงสด และลมน าวงมคา H= 0.1776, I =0.2699 มความหลากหลายนอยทสด

ประชากรลมน ายมกบลมน าวงมความความคลายคลงกนมากทสด และประชากรลมน าสาละวนกบปงมความคลายคลงกนนอยทสด โดยมคาเทากบ 0.9797 และ 0.9585 ตามล าดบ

ควรมการเพมจ านวนตวอยาง เพอความถกตองของขอมลในการวางแผนจดการดานการอนรกษตอไป

สรปและขอเสนอแนะ

อำจำรยสธร ดวงใจ อำจำรยทปรกษำโครงงำนและสนบสนนคำใชจำยทงหมด

คณตรภพ ทพยศกด คณมำนพ ผพฒน และกรมอทยำนแหงชำต สตวปำ และ พนธพชทใหควำมอนเครำะหตวอยำงทใชในกำรศกษำครงน

อำจำรยชำครต ณ ตะกวทง อำจำรยทแนะน ำกำรใชโปรแกรมกำรวเครำะหขอมล

นำงสำวสลลลำ บญเทยม ทสกดดเอนตวอยำงทใชศกษำ

ภำควชำชววทยำปำไม

เพอนๆวนศำสตร

บดำ มำรดำ และครอบครว

ขอขอบพระคณ