บทที่ 3 วิธีด ำเนินกำรวิจัย...3.7.2 อำหำรเล ยงเช อ 3.7.2.1 Mueller Hinton Agar (MHA) โดยในอาหาร

21

บทท 3 วธด ำเนนกำรวจย

3.1 ตวอยำงพชทศกษำ ใบพญาสตบรรณ ทน ามาใชในการท าวจย น ามาจากมหาวทยาลยราชภฏร าไพพรรณ ต าบลทาชาง อ าเภอเมอง จงหวดจนทบร

ภำพท 3.1 ตนพญาสตบรรณ

3.2 แบคทเรยทใชในกำรทดสอบ แบคทเรยทใชในการทดสอบไดรบความอนเคราะหจากภาควชาชววทยา คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยราชภฏร าไพพรรณ แสดงดงตารางท 3.1

ตำรำงท 3.1 แบคทเรยทใชในการทดสอบและการตดสแกรม

แบคทเรยทใชในกำรทดสอบ กำรตดสแกรม Bacillus subtilis TISTR 1248 ตดสแกรมบวก Staphylococcus aureus ATCC 25923 ตดสแกรมบวก Escherichia coli ATCC 25922 ตดสแกรมลบ Klebsiella. pneumoniae TISTR 1867 ตดสแกรมลบ Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ตดสแกรมลบ

3.3 สำรเคมทใชในกำรทดสอบ 3.3.1 ชดยอมแกรม

3.3.2 Dimethyl sulfoxide (DMSO) 3.3.3 Ethanol 95% 3.3.4 Gentamicin

22

3.6 เครองมอทใชในกำรทดลอง

3.3.5 McFaland standard number 0.5 3.3.6 Sodium hydroxide (NaOH) 3.3.7 Sulfuric acid ( H2SO4)

3.4 อำหำรเลยงเชอ 3.4.1 Nutrient Agar (NA)

3.4.2 Muleller Hinton Ager (MHA) 3.4.3 Muleller Hinton Broth (MHB)

3.5 วสดและอปกรณ

3.5.1 กรวยกรอง 3.5.2 กระดาษกรอง Whatman number 1 3.5.3 กระดาษอลมนมฟอยด 3.5.4 กระบอกตวงขนาด 100 และ 250 มลลลตร 3.5.5 ขวดสชา 3.5.6 ขวดรปชมพ ขนาด 100 และ 250 มลลลตร 3.5.7 ขวด Duran ขนาด 250, 500 และ 1000 มลลลตร 3.5.8 จานอาหารเลยงเชอขนาดเสนผาศนยกลาง 90 มลลเมตร 3.5.9 บกเกอร ขนาด 50, 100, 250, 500 และ 1000 มลลลตร 3.5.10 ปากคบ 3.5.11 ไมพนส าล เบอร M 3.5.12 หลอดทดลอง ขนาด 10 × 100 และ 16 × 150 มลลลตร

3.5.13 หวงถายเชอ (Loop) 3.5.14 Micropipette ขนาด 20 – 200 และ 100 – 1000 ไมโครลตร 3.5.15 Paraflime 3.5.16 Pipette tip 3.5.17 Microcentrifuge tube

3.6.1 เครองระเหยสญญากาศ (Rotary evaporator) ยหอ WiseBate 3.6.2 เครองนงฆาเชอความดนสง (Autoclave) ยหอ Model MaxXterile 47 3.6.3 เครองอบความรอนแหง (Hot air oven) ยหอModel 600 3.6.4 ตถายเชอ (Laminar air flow) รน BV 124 3.6.5 ตบมเชอ (Incubator) รน Incucell 404 3.6.6 เตาไฟฟา (Hotplate) รน 18715

23

3.7. วธกำรด ำเนนกำรวจย

วธด าเนนงาน 3.7.1 แบคทเรยทใชในกำรศกษำ

1. E. coli ATCC 25922 2. B. subtilis TISTR 1248 3. P. aeruginosa ATCC 27853 4. S. aureus ATCC 25923 5. K. pneumoniae TISTR 1867

3.7.2 อำหำรเลยงเชอ 3.7.2.1 Mueller Hinton Agar (MHA) โดยในอาหาร 1,000 มลลลตร ประกอบดวย

Beef extract powder 2 กรม, Acid digest casein 17.5 กรม, Soluble starch 1.5 กรม และปรบ pH ของอาหารใหมคาเทากบ 7.3 ± 0.1

3.7.2.2 Mueller Hinton Broth (MHB) โดยในอาหาร 1,000 มลลลตร ประกอบดวย Beef extract powder 2 กรม, Acid digest casein 17.5 กรม, Soluble starch 1.5 กรม, Agar 15 กรม และปรบ pH ของอาหารใหมคาเทากบ 7.3 ± 0.1

3.7.2.3 Nutrient agar (NA) โดยในอาหาร 1,000 มลลลตร ประกอบดวย Beef extract powder 3 กรม, Peptone 5 กรม และ Agar 15 กรม

3.7.3 ยำปฏชวนะ Gentamicin

3.7.4 ตวท ำละลำย เอทานอล 95% และเอทลอะซเตท

3.7.5 สถำนทท ำกำรทดลอง หองปฏบตการภาคชววทยา และภาควชาเคม คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยราชภฏร าไพพรรณ

3.7.6 กำรเตรยมใบพญำสตบรรณ น าใบพญาสตบรรณจากบรเวณอาคาร 9 คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลย

ราชภฏร าไพพรรณ อ าเภอทาชาง จงหวดจนทบร มาลางท าความสะอาด จากนนน าไปตากแดดเปนเวลา 5 - 6 ชวโมง หรอจนกวาจะสะเดดน า และน าไปอบในตอบลมรอนทอณหภมประมาณ 50 - 55 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 - 72 ชวโมง หรอจนกวาน าหนกคงท ท าการบดใบพญาสตบรรณใหละเอยดดวยเครองปนไฟฟา

3.6.7 เครองชง 2 ต าแหนง รน MS 16023 3.6.8 เครองชง 4 ต าแหนง รน MS 16025 3.6.9 กลองจลทรรศน ยหอ Model Eclipse E200 3.6.10 เครองปน ยหอ PHILIPS HP-2011 3.6.11 Vortex รน G-506E

24

3.7.7 กำรสกดสำรจำกใบพญำสตบรรณดวยวธกำรหมก (Maceration) (ดดแปลงมาจากวธของณรงคศกด สารใจ, 2553)

3.7.7.1 น าผงใบพญาสตบรรณทไดจากการเตรยมในขอ 3.7.6 มาหอดวยผาขาวบาง ทปราศจากเชอ น าไปใสลงภาชนะทบแสงทมฝาปดและเตมตวท าละลาย โดยตวท าละลายทใชในการทดลองนคอ เอทานอล 95 เปอรเซนต หรอเอทลอะซเตท โดยใชอตราสวนน าหนกแหงตอตวท าละลายเทากบ 1 : 4 และตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 72 ชวโมง และเขยาในระหวางทท าการสกดเปนระยะ

3.7.7.2 กรองดวยกระดาษกรอง เบอร 1 (Whatman Number 1) จากนนน าผงสาร ทเหลออยกลบไปสกดท าซ าดงขอ 3.7.7.1 โดยใชสารละลายปรมาตรเทาเดม

3.7.7.3 น าสารละลายทผานการกรองแลวจากขอ 3.7.7.2 ไประเหยตวท าละลายออกโดยใชเครองกลนระเหยแบบหมนภายใตสญญากาศ (Rotory evaporator) จนไดสารสกดหยาบ (Crude extract) แลวน าไปอบทตอบลมรอนทอณหภม 40 องศาเซลเซยส จนน าหนกคงท

3.7.7.4 ชงน าหนกของตวอยางทได ค านวณหาผลผลตรอยละ (% yield) จากสตร

3.7.7.5 น าสารสกดหยาบท ได เกบไวในขวดสชาทปราศจากเชอ โดยเกบไวในโถดดความชน (Desiccator) ทอณหภมหอง

3.7.8 กำรเตรยมสำรสกดเพอใชทดสอบประสทธภำพกำรยบยงเชอแบคทเรย ชงสารสกดหยาบในขอ 3.7.7.5 ทความเขมขน 0.5, 1, 1.5 และ 2 กรม ละลายดวย

Dimethyl sulphoxide (DMSO) ทความเขมขนต ากวา 5% ปรมาตร 1 มลลลตร จะไดสารสกดทมความเขมขน 500, 1000, 1500 และ 2000 มลลกรมตอมลลลตร ตามล าดบ เกบไวในขวดสชาเพอใชในการทดสอบขนตอไป

3.7.9 กำรเพำะเลยงเชอ เพาะเลยงเชอแบคทเรยทใชในการทดลอง 5 สายพนธ ไดแก S. aureus ATCC 25923,

B. subtilis TISTR 1248, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, และ K. pneumoniae TISTR 1867 ลงบนอาหาร NA จากนนจงน าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 18 - 24 ชวโมง 3.7.10 กำรทดสอบควำมสำมำรถและกำรยบยงกำรเจรญของเชอแบคทเรยดวยวธ Disc diffusion (พกล อนตะปาน, 2556)

3.7.10.1 ถายเชอแบคทเรยทใชทดสอบทง 5 สายพนธ ลงในอาหาร MHB แลวน าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 18 - 24 ชวโมง หลงจากนนน ามาปรบปรมาณของเชอ โดยใหความขนของแบคทเรยมคาเทากบ McFarland Standard Number 0.5 ซงมปรมาณเชอประมาณ 1.5×108 CFU/ml เพอเปนการควบคมประมาณเชอใหเทากนทกครงททดสอบ

ผลผลต (%) = น าหนกสารสกด (เมอแหงเปนผง)

× 100 น าหนกสมนไพรทใช

25

3.7.10.2 ใชไมพนส าล (Cotton swab) ปลอดเชอจมลงในหลอดเพาะเชอทดสอบแตละชนด จากนนน าไปเกลยบนผวหนาอาหาร MHA ใหทวผวหนาอาหารแลววางไวใหผวหนาอาหารแหง

3.7.10.3 น าแผนกระดาษกรอง (Paper disc) ไรเชอขนาดเสนผาศนยกลาง 6 มลลเมตร เตมสารสกดทความเขมขนตางๆ ทง 4 ความเขมขน DMSO และ ยาปฏชวนะ และ Gentamicin ทความเขมขน 10 ไมโครกรมตอดสก ปรมาตร 20 ไมโครลตร แลวผงใหแหงในภาชนะปลอดเชอ จากนนน าไปวางบนผวหนาอาหารทท าการเกลยเชอไวในขอ 3.7.10.2 ดงภาพท 3.2

3.7.10.4 น าจานอาหารไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 18 -24 ชวโมง โดยท าการทดลองซ า 3 ครง แลวบนทกผลการทดลอง โดยวดเสนผานศนยกลางของวงใสการยบยง (Clear zone) ในหนวยมลลเมตร (mm)

ภำพท 3.2 การวางแผนกระดาษกรอง (Paper disc)

3.7.11 กำรเตรยมสำรสกดเพอใชทดสอบกำรเสรมฤทธยำปฏชวนะ (Synergistic effect)

3.7.11.1 ชงสารสกดหยาบ 3 กรม ละลายดวย Dimethyl sulphoxide (DMSO) 3 มลลลตร จะไดสารสกดทมความเขมขน 1,000 มลลกรมตอมลลลตร

3.7.11.2 เตรยมยาปฏชวนะ Gentamicin ทมความเขมขน 40,000 มลลกรมตอมลลลตร แลวเจอจางดวยน าเกลอ 0.85% (0.85% NaCl) ใหมความเขมขนท 1,000 มลลกรมตอมลลลตร ทปรมาตร 3 มลลลตร

Negative control (Dimethyl sulphoxide (DMSO)

สารสกดหยาบ ทความเขมขน 1,000 มลลกรมตอมลลลตร

สารสกดหยาบ ทความเขมขน 500 มลลกรมตอมลลลตร

สารสกดหยาบ ทความเขมขน 2,000 มลลกรมตอมลลลตร

สารสกดหยาบ ทความเขมขน 1,500 มลลกรมตอมลลลตร

Positive control (Gentamicin)

26

3.7.11.3 น าสารสกดทมความเขมขนท 1,000 มลลกรมตอมลลลตร ผสมกบยาปฏชวนะ Gentamicin ทมความเขมขนท 1,000 ไมโครกรมตอมลลลตร แลวใสสารตางๆ ลงในหลอดทดลองขนาดเลก (Microcentrifuge tube) ดงตารางท 3.2 ตำรำงท 3.2 อตราสวนสารสกดหยาบตอยาปฏชวนะ Gentamicin

สำรสกดใบพญำสตบรรณ (เปอรเซนต)

Gentamicin (เปอรเซนต)

ควำมเขมขนของสำรทดสอบตอ Disc สำรสกด (mg/disc) Gentamicin (g/disc)

E100 G0 20 0 E90 G10 18 2 E80 G20 16 4 E70 G30 14 6 E60 G40 12 8 E50 G50 10 10 E40 G60 8 12 E30 G70 6 14 E20 G80 4 16 E10 G90 2 18 E0 G100 0 20

3.7.12 กำรเพำะเลยงเชอ 3.7.12.1 เพาะเลยงเชอแบคทเรยทใชในการทดลอง 5 สายพนธ ไดแก E. coli

ATCC 25922, B. subtilis TISTR 1248, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC 25923 และ K. pneumoniae TISTR 1867 ลงบนอาหารเลยงเชอ NA จากนนจงน าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 18 - 24 ชวโมง

3.7.12.2 เขยโคโลนเชอทเลยงใน NA มาเลยงในอาหารเลยงเชอ MHB แลวน าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 18 - 24 ชวโมง เพอใชในขนตอนตอไป

3.7.13 กำรทดสอบประสทธภำพของสำรสกดใบพญำสตบรรณทควำมเขมขน 1,000 มลลกรมตอมลลลตรรวมกบยำปฏชวนะ (Synergism) (Wie–Shing-lee and Louis, 1975) 3.7.13.1 ท าการถายเชอแบคทเรยทใชทดสอบทง 5 สายพนธ ลงในอาหาร MHB แลวน าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 18 - 24 ชวโมง หลงจากนนน ามาปรบปรมาณของเชอโดยใหความขนของแบคทเรยมคาเทากบ McFarland Standard Number 0.5 ซงมปรมาณเชอประมาณ 1.5×108 CFU/ml เพอเปนการควบคมประมาณเชอใหเทากนทกครงททดสอบ

3.7.13.2 ใชไมพนส าล (Cotton swab) ปลอดเชอจมลงในหลอดเพาะเชอทดสอบแตละชนด จากนนน าไปเกลยบนผวหนาอาหาร MHA

3.7.13.3 น าแผนกระดาษกรองไรเชอขนาดเสนผาศนยกลาง 6 มลลเมตร เตมสารสกดทความเขมขนตางๆ ดงน สารสกดใบพญาสตบรรณทความเขมขน 1,000 มลลกรมตอมลลลตร

27

DMSO, ยาปฏชวนะ Gentamicin ทความเขมขน 1,000 ไมโครกรมตอมลลลตร และสารสกดทความเขมขน 1,000 มลลกรมตอมลลลตรรวมกบยาปฏชวนะ Gentamicin ทความเขมขนตางๆ ปรมาตร 20 ไมโครลตร แลวตากใหแหงในภาชนะปลอดเชอ จากนนน าไปวางบนผวหนาอาหารทท าการเกลยเชอไวในขอ 3.7.13.2

3.7.13.4 น าจานอาหารไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมงบนทกผลการทดลอง โดยวดเสนผาศนยกลางของวงใสการยบยงในหนวยมลลเมตร

3.7.13.5 คดเลอกสารสกดจากใบพญาสตบรรณทใหผลบวกเพอน าไปตรวจสอบ หาคา MIC และ MBC ตอไป

3.7.14 กำรหำคำควำมเขมขนต ำสดของสำรสกดทสำมำรถยบยงกำรเจรญของเชอทดสอบ (Minimum Inhibition Concentration, MIC) ดวยวธ Macro broth dilution (Pukumpuang et al., 2012)

3.7.14.1 เพาะเลยงเชอแบคทเรยทดสอบลงในอาหาร MHB ปรมาตร 5 มลลลตร น าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 18 ชวโมง ปรบความเขมขนเรมตนของแบคทเรย ทใชทดสอบใหมความขนเทากบ Mc Farland Standard Number 0.5

3.7.14.2 ท าการเจอจางสารสกดและยาปฏชวนะ Gentamicin แบบสองเทาล าดบสวน (Two – Fold Serial Dilution) และเตมสารตาง ๆ ลงในหลอดทดลองแตละหลอด ดงตารางท 3.3

ตำรำงท 3.3 ปรมาณสารทเตมในหลอดทดลองในการหาคา MIC

หมายเหต – หมายถง ไมเตม, แตละหลอดทดสอบปรมาตรสดทายเปน 1 มลลลตร หมายถง ดดออกใสหลอดตอไป หมายถง ดดทงไป

3.7.14.3 บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง ตรวจดความขน ของเชอทดสอบในหลอดทดลองดวยตาเปลาเทยบกบหลอดควบคม (หลอดท 9 และ 10)

3.7.15 กำรหำคำควำมเขมขนต ำสดของสำรสกดทสำมำรถคำเชอแบคทเรยทดสอบได (Minimum Bactericidal Concentration, MBC) โดยวธกำร Streak plate

น าหลอดทมความเขมขนต าสดจากขอ 3.7.14.3 ทไมพบการเจรญของแบคทเรย มาเกลยลงบนอาหาร MHA น าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง และท าการบนทกคาความเขมขนต าสดทแบคทเรยไมเจรญ โดยสงเกตจากการเพาะเชอทไมพบการเจรญคอ คา MBC โดยบนทกในหนวยมลลกรมตอมลลลตร

สำร ปรมำณทเตม (มลลลตร) ในหลอดทดลองท

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 สารสกดจากใบพญาสตบรรณ /DMSO/Gentamicin

0.5 0.5 - - - - - - - -

อาหาร MHB - 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1.0 แบคทเรยทใชในการทดสอบ 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 -