25 5 BAB 4 5 METODE PENELITIAN 4.1 Jenis Penelitian Jenis penelitian yang dilakukan adalah True Experimental-Post test only Control Group Design dengan menggunakan rancangan penelitian eksperimental laboratorik secara in vitro dengan menggunakan metode dilusi tabung (Tube Dilution Test) sehingga diketahui efek antifungi ekstrak rimpang kencur terhadap Malassezia furfur. Metode dilusi tabung meliputi tahap pengujian bahan pada media SDB (Sabouraud Dextrose Broth) dan tahap uji streaking pada SDA (Sabouraud Dextrose Agar) dengan olive oil. 4.2 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang pada 15-21 Mei 2018. 4.3 Populasi dan Sampel Penelitian 4.3.1 Populasi Populasi dalam penelitian ini adalah jamur M. furfur biakan murni diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro. 4.3.2 Sampel Penelitian Sampel dalam penelitian ini adalah jamur M. furfur yang diambil dengan menggunakan Simple Random Sampling.
12
Embed
5 BAB 4 5 METODE PENELITIAN - eprints.umm.ac.ideprints.umm.ac.id/39314/5/BAB 4.pdfdengan menggunakan metode . dilusi . tabung (Tube Dilution Test) sehingga diketahui efek antifungi
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
25
5 BAB 4
5 METODE PENELITIAN
4.1 Jenis Penelitian
Jenis penelitian yang dilakukan adalah True Experimental-Post test
only Control Group Design dengan menggunakan rancangan penelitian
eksperimental laboratorik secara in vitro dengan menggunakan metode
dilusi tabung (Tube Dilution Test) sehingga diketahui efek antifungi
ekstrak rimpang kencur terhadap Malassezia furfur. Metode dilusi tabung
meliputi tahap pengujian bahan pada media SDB (Sabouraud Dextrose
Broth) dan tahap uji streaking pada SDA (Sabouraud Dextrose Agar)
dengan olive oil.
4.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biomedik Fakultas
Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang pada 15-21 Mei 2018.
4.3 Populasi dan Sampel Penelitian
4.3.1 Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah jamur M. furfur biakan
murni diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas
Kedokteran Universitas Diponegoro.
4.3.2 Sampel Penelitian
Sampel dalam penelitian ini adalah jamur M. furfur yang
diambil dengan menggunakan Simple Random Sampling.
26
4.3.3 Estimasi dan Jumlah Pengulangan
Penelitian menggunakan 8 kelompok perlakuan ekstrak
rimpang kencur dan 2 kelompok kontrol, sehingga ada 10
kelompok. Berdasarkan rumus Faderer (1991) dengan p adalah
jumlah kelompok dan n adalah jumlah pengulangan, maka:
(p-1) (n-1) ≥ 15
(10-1) (n-1) ≥ 15
9 (n-1) ≥ 15
9n-9 ≥ 15
n ≥ (15+9)/9
n ≥ 2,67 3 (pembulatan)
Keterangan :
p = jumlah kelompok total
n = jumlah pengulangan tiap kelompok
Dari hasil perhitungan diatas, maka diperlukan tiga kali pengulangan
untuk sampel.
4.4 Variabel Penelitian
4.4.1 Variabel Bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah ekstrak rimpang
kencur dalam konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12%,
1,56%, 0,78%, 0,39% dan 0%.
27
4.4.2 Variabel Tergantung
Variabel tergantung pada penelitian ini adalah jumlah
koloni M. furfur pada Sabouraud Dekstrosa Agar (SDA) setelah
diberi ekstrak rimpang kencur dalam berbagai konsentrasi.
4.5 Definisi Operasional
No. Variabel Definisi Operasional Cara
Pengukuran
Indikator
penilaian
Skala
Variabel Bebas
1. Ekstrak
rimpang
kencur
(Kaempferia
galanga L.)
Ekstrak rimpang kencur
adalah rimpang kencur
yang telah dideterminasi
di Materia Medica yang
dikeringkan kemudian
diekstraksi dan
dimaserasi dengan
larutan etanol 96 % dan
diambil filtratnya dengan
penyaring kemudian
diuapkan dalam rotary
evaporator sehingga
menghasilkan ekstrak
rimpang kencur.
Ekstrak
rimpang
kencur diukur
menggunakan
mikro pipet
sesuai dengan
konsentrasi
pada pada
setiap tabung.
Konsentrasi:
1. 0 %
2. 0,39 %
3. 0,78%,
4. 1,56%,
5. 3,125%,
6. 6,25%,
7. 12,5%,
8. 25%,
9. 50%,
10. 100%.
Kategorik
(Ordinal)
Variabel Tergantung
2. KHM (Kadar
Hambat
Minimum)
Konsentrasi ekstrak
Kaempferia galanga L.
terendah yang mampu
menghambat
pertumbuhan jamur M.
furfur yang ditandai
dengan kejernihan dalam
tabung.
Membandingk
an kejernihan
setiap tabung
dengan
kontrol negatif
dengan latar
belakang
kertas putih.
a. Jernih
b. Tidak
jernih
(keruh)
Kategorik
(Nominal)
3. KBM (Kadar
Bunuh
Minimum)
Kadar terkecil ekstrak
rimpang kencur
(Kaempferia galanga L.)
yang mampu membunuh
99,9% jamur dari
goresan hasil dilusi cair
pada SDA.
Penghitungan
dengan
Colony
Counter.
Jumlah koloni
jamur
Numerik
(Rasio)
28
4.6 Alat dan Bahan Penelitian
4.6.1 Alat dan Bahan Pembuatan Ekstrak Rimpang Kencur Kaempferia
galanga L.
1. Alat
a. Pisau
b. Blender
c. Kain saring
d. Timbangan digital
e. Gelas erlenmeyer
f. Evaporator
g. Labu evaporasi
h. Water bath
i. Pendingin spiral
j. Vacum
k. Water pump
l. Bak untuk menampung aquades
m. Selang plastik
n. Cawan
o. Oven
2. Bahan
a. Rimpang kencur (Kaempferia galanga L.)
b. Etanol 96%
c. Aquadest
29
4.6.2 Alat dan Bahan Uji Kepekaan Ekstrak Kaempferia galanga L.
1. Alat
a. Tabung reaksi steril
b. Mikropipet 1 ml
c. Lampu spirtus
d. Vortex
e. Colony counter
f. Ose Lengkung
g. Label
h. Inkubator
i. Spektrofotometer
2. Bahan
a. Perbenihan cair jamur Malassezia furfur
b. Ekstrak rimpang kencur
c. Sabouraud Dextrose Broth (SDB)
d. Sabouraud Dextrose Agar (SDA)
e. Olive oil
4.7 Prosedur Penelitian
4.7.1 Sterilisasi Alat
Sterilisasi alat dengan cara:
a. Mencuci semua peralatan dengan sabun hingga bersih dan
membiarkannya hingga kering.
b. Alat-alat yang dapat disterilkan dalam autoklaf dibungkus
dengan kertas sampul dan dimasukan dalam autoklaf pada
30
suhu 121oC dengan tekanan 15 atm selama 15 menit.
Sedang alat yang tidak dapat disterilkan dengan autoklaf
disterilkan dengan alkohol 70% selama 20 menit.
4.7.2 Pembuatan Media Sabouraud Dextrose Agar (SDA) dengan olive
oil
a. Menimbang SDA sebanyak 39 gram dan 0,6 ml olive oil,
lalu ditambahkan aquades sebanyak 600 ml.
b. SDA direbus dengan suhu 200°C sampai tercampur lalu
disterilisasi dalam autoklaf pada tekanan 15 atm pada suhu
121°C 15 menit.
c. SDA yang telah disterilisasi dituangkan ke dalam masing-
masing cawan petri sebanyak 20 ml (Setyarini dan
Krisnansari, 2011; Tiwari et al., 2011).
4.7.3 Pembuatan Media Sabouraud Dextrose Broth (SDB) dengan olive
oil
a. Timbang bahan sebanyak kebutuhan, lalu tambahkan
aquades dan olive oil sesuai kebutuhan dan diaduk secara
merata.
b. SDB direbus sampai tercampur rata.
c. SDB yang sudah direbus disterilisasi dalam autoklaf pada
suhu 121°C selama 15 menit.
d. SDB yang telah disterilisasi dituangkan ke dalam masing-
masing tabung (Sharma et al., 2012).
31
4.7.4 Pembuatan Perbenihan Cair
Pembuatan perbenihan cair jamur M. furfur memerlukan
kepadatan 106 CFU/ml sebagai syarat Dilusi Tabung. Caranya
adalah dengan menggunakan 0,5 McFarland Standard yang
diencerkan 100 kali (Tiwari et al., 2011).
4.7.5 Pembuatan Ekstrak Kaempferia galanga L.
a. Rimpang kencur dicuci bersih kemudian dikupas kulitnya dan
dipotong dengan ketebalan 2-5 mm.
b. Potongan rimpang kencur dimasukkan ke dalam oven hingga
kering atau kadar air ≤ 10% pada suhu 40 - 50°C.
c. Rimpang kencur yang telah dikeringkan kemudian dihaluskan
dengan blender hingga menjadi seperti serbuk kemudian
ditimbang sebagai sampel kering.
d. Sampel kering yang berupa serbuk rimpang kencur yang telah
ditimbang dimasukkan ke dalam gelas erlenmeyer.
e. Direndam dengan larutan etanol 96% dengan 3 kali
penggantian selama 3 hari.
f. Ekstrak cair yang telah dikumpulkan diuapkan dengan rotary
evaporator pada suhu 40-50ºC.
g. Kemudian maserat dipanaskan di atas water bath pada suhu
tidak lebih dari 50ºC dengan tujuan untuk mendapatkan
ekstrak kental (Riasari et al., 2016).
32
4.7.6 Uji Kepekaan Ekstrak Rimpang Kencur Terhadap M. furfur
Metode yang digunakan untuk tes ini adalah metode dilusi
tabung. Pada penelitian ini beberapa macam konsentrasi ekstrak
Kaempferia galanga L. diinokulasi dengan perbenihan cair jamur
M. furfur. Proses selanjutnya diinkubasikan selama 72 jam pada
suhu 37ºC dengan cara sebagai berikut:
Hari ke-1 :
a. Sediakan 10 tabung; beri nama sesuai nomor urut. Masukkan 1
ml Sabouraud Dextrose Broth (SDB) pada tabung 3 s.d. 9 dan
2 ml ekstrak Kaempferia galanga L. pada tabung 1 serta 2 ml
jamur pada tabung 10.
Gambar 4.1
Penuangan SDB dan Pengisian Tabung Kontrol
b. Masukkan masing-masing 1 ml ekstrak ke dalam tabung 2 dan
3.
Gambar 4.2
Memasukkan 1 ml Ekstrak Ke Tabung 2 dan Tabung 3
33
Konsentrasi ekstrak rimpang kencur
Tabung 2 1 ml (100%)
Tabung 3 2 ml (50%)
c. Campurlah hingga rata larutan broth dengan ekstrak
Kaempferia galanga L. pada tabung 3, kemudian pindahkan 1
ml ke dalam tabung 4.
Gambar 4.3
Memindahkan 1 ml Larutan Ke Tabung Selanjutnya
Konsentrasi ekstrak rimpang kencur
Tabung 3 1 ml (50%)
Tabung 4 2 ml (25%)
d. Lakukan hal yang sama terhadap tabung 4, 5, 6, 7, 8 dan 9.
e. Pada tabung 9 setelah larutan tercampur rata dibuang 1 ml.
f. Dari pengenceran diatas, maka konsentrasi awal antijamur dari
masing-masing tabung adalah:
Gambar 4.4
Konsentrasi Awal Ekstrak Kaempferia galanga L.
34
g. Setelah itu tabung 2 sampai 9 ditambahkan perbenihan cair
jamur 1 ml.
h. Dengan demikian, volume masing-masing tabung menjadi 2
ml sehingga konsentrasi akhir antijamur berubah seperti
gambar berikut ini:
Gambar 4.5
Konsentrasi Akhir Masing-Masing Tabung
Kemudian semua tabung diinkubasikan ke dalam inkubator
pada suhu 37ºC selama 72 jam.
Pada hari ke-4 tabung dikeluarkan dari inkubator, akan
didapatkan KHM dengan cara melihat kejernihan tabung,
kemudian dari masing-masing tabung diambil 1 ose dan
diinokulasikan atau digoreskan pada medium agar Sabouraud
Dextrose Agar. Lalu diinkubasikan lagi 72 jam pada suhu 37oC.
Pada hari ke-7 Sabouraud Dextrose Agar dikeluarkan dari
inkubator kemudian dilakukan pengamatan kuantitatif pada
masing-masing konsentrasi dengan cara menghitung jumlah koloni
jamur dengan colony counter sehingga didapatkan data KBM
(Kumala, 2009; Shams-Ghahfarokhi et al., 2006). Pengamatan
dilakukan oleh peneliti dan dikonfirmasi oleh analis laboratorium.
35
4.8 Skema Alur Penelitian
Mengamati kekeruhan tabung untuk menentukan KHM
Penghitungan jumlah koloni jamur (KBM)
Analisis hasil
Pembuatan ekstrak rimpang
kencur (Kaempferia galanga L.)
Pengisian tabung kontrol (tabung 1 dan 10) dan pengenceran ekstrak rimpang
kencur (Kaempferia galanga L.) dan SDB dalam tabung 2-9 dengan